khảo sát hoạt tính kháng phân bào in vitro của gossypol và plumbagin

Nhiều nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư được thực hiện trên thế giới và đã đạt được nhiều hiểu biết về cơ chế phân tử của sự phân bào, cơ chế phân tử của bệnh ung thư,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Phan Kim Ngọc **

Hồ Huỳnh Thùy Dương *

* Khoa Sinh học - Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh

** Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh

Thành phố Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

I NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƯ 2

1 Bản chất của bệnh ung thư 2

2 Sự khác nhau của mỗi loại ung thư: 2

3 Có thể phòng ngừa được nhiều loại ung thư 5

II ĐẠI CƯƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƯ 5

1 Đại cương về khối u và lịch sử nghiên cứu 5

2 Tế bào ung thư 6

3 Sơ lược về cơ sở sinh học phân tử của ung thư 8

III ĐẠI CƯƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƯ 9

1 Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thư 9

2 Sự kháng thuốc của tế bào ung thư 9

3 Độc tính của các thuốc chữa ung thư 10

IV ĐẠI CƯƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 11

1 Đặc điểm của tế bào động vật 11

2 Môi trường nuôi cây tế bào động vật 12

PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 15

I VẬT LIỆU 15

1 Gossypol 15

2 Plumbagin 16

3 Các dòng tế bào ung thư 17

II PHƯƠNG PHÁP 18

1 Phương pháp nuôi cấy tế bào: 18

2 Phương pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay): 18

3 Phương pháp MTT (MTT assay): 19

4 Phương pháp clonogenic (clonogenic assay): 20

5 Phương pháp xử lý thống kê 20

PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 21

I TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 21

II TÁC ĐỘNG CỦA PLUMBAGIN LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 23

PHẦN V: KẾT LUẬN 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một trong những bệnh phổ biến và có tỷ lệ gây tử vong cao trên thế giới cũng như ở Việt Nam Đây là dạng bệnh lý có liên quan đến hiện tượng rối loạn trong quá trình điều hòa sự phân chia tế bào ở các mô trong cơ thể Khối u hình thành do những tế bào ung thư phân chia liên tục không được kiểm soát, ban đầu khối u định vị tại một mô nhưng sau đó tế bào ung thư có thể di căn khắp cơ thể, làm cơ thể suy kiệt và dẫn đến tử vong Ung thư hiện vẫn là vấn đề nan giải của Y học, người ta vẫn chưa tìm ra hoạt chất hay phương pháp nào điều trị hữu hiệu tất cả các dạng ung thư

Nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư là lĩnh vực rất được quan tâm trên thế giới Đã có nhiều tổ chức, viện nghiên cứu ung thư được thành lập ở nhiều quốc gia trên thế giới như: American Association Cancer Research, Australian Cancer Society, British Association for Cancer Research, National Cancer Institute of Canada, European Association for Cancer Research Nhiều nghiên cứu về bệnh ung thư và cách chữa trị ung thư được thực hiện trên thế giới và đã đạt được nhiều hiểu biết về cơ chế phân tử của sự phân bào, cơ chế phân tử của bệnh ung thư, các phương thức hữu hiệu để tiêu diệt hay ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư và gần đây nhất là giải Nobel Sinh lý và Y học năm 2001 cũng là những phát hiện liên quan đến các protein tham gia vào quá trình phân bào và ung thư

Việt Nam là một nước nhiệt đới với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú, trong đó

có thể sẽ có nhiều cây thuốc với những hoạt chất kháng ung thư mạnh có thể ứng dụng vào điều trị Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt chất kháng ung thư ở nước ta không nhiều

Trước tình hình đó, việc phát triển những phương pháp thử nghiệm nhằm xác định hoạt tính kháng ung thư của các chất chiết xuất từ thực vật là cần thiết, từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng của nguồn tài nguyên cây thuốc Việt Nam và làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn Để bước đầu thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng phân bào của 2 hoạt chất gossypol và plumbagin có nguồn gốc từ cây thuốc dân gian được biết là

có khả năng kháng ung thư [11,13] trên hai dòng tế bào ung thư của người trong điều kiện in vitro

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƯ

1 Bản chất của bệnh ung thư

Ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào Khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thư,

tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển của

cơ thể

Đa số người bị ung thư hình thành các khối u Khác với khối u lành tính (chỉ phát triển tại cho thường rất chậm, có vỏ bọc chung quanh), các khối u ác tính (ung thư) xâm lấn vào các tổ chức lành xung quanh giống như hình "con cua" với các càng cua bám vào các tổ chức lành trong cơ thể hoặc giống như rễ cây lan trong đất Các tế bào của khối u ác tính có khả năng di căn tới các hạch bạch huyết hay các tạng ở xa hình thành các khối u mới và cuối cùng dẫn đến tử vong

Đa số ung thư có biểu hiện mãn tính, có quá trình phát sinh và phát triển lâu dài qua nhiều giai đoạn Trừ một số nhỏ ung thư ở trẻ em có lẽ do đột biến gen ở giai đoạn bào thai, còn phần lớn ung thư đều có giai đoạn tiềm tàng lâu dài, có khi hàng chục năm không có dấu hiệu gì trước khi phát hiện thấy dưới dạng các khối u Khi các khối u phát triển nhanh mới có triệu chứng ung thư Triệu chứng đau chỉ xuất hiện khi ung thư ở vào giai đoạn cuối

2 Sự khác nhau của mỗi loại ung thư:

Người ta biết được có đến 200 loại ung thư khác nhau trên cơ thể người Những loại ung thư này tuy có những điểm giống nhau về bản chất nhưng chúng có nhiều điểm khác nhau như sau:

2.1 Khác nhau về nguyên nhân

Qua các nghiên cứu dịch tễ học của R.Doll và Petro trên 80% tác nhân sinh ung thư là bắt nguồn từ môi trường sống, trong đó có 2 tác nhân lớn nhất là: 35% do chế độ ăn uống gây nhiều loại ung thư đường tiêu hóa và khoảng 30% ung thư do thuốc lá (gây ung thư phổi, ung thư đường hô hấp trên )

Các tác nhân khác gồm:

- Tia phóng xạ: có thể gây ung thư máu, ung thư tuyến giáp

- Bức xạ tử ngoại: có thể gây ung thư da

- Virus Epstein - Barr: gây ung thư vòm họng, u lympho ác tính

- Virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) dẫn đến ung thư gan

- Các loại hóa chất được sử dụng trong công nghiệp, trong thực phẩm, trong chiến tranh, các chất thải ra môi trường nước và không khí là tác nhân của nhiều loại ung thư khác nhau

2.2 Khác nhau về tiến triển

Ung thư thường xuất phát từ 2 tổ chức chính của cơ thể:

- Từ các tế bào biểu mô của các tạng, các cơ quan (ung thư biểu mô: carcinoma)

- Từ các tế bào của tổ chức liên kết của cơ thể (sarcoma) Ung thư của cơ quan tạo huyết (máu, hạch lympho) là một dạng đặc biệt của ung thư tể chức liên kết (Hematosarcoma)

Mỗi loại ung thư có hướng tiến triển khác nhau Trong từng loại, mỗi loại ung thư của mỗi cá thể khác nhau, xu hướng tiến triển cũng rất khác nhau

- Có loại ung thư tiến triển rất nhanh (ung thư máu, hạch, ung thư hắc tố, các ung thư liên kết .)

- Có nhiều loại ung thư tiến triển chậm: ung thư da tế bào đáy, ung thư giáp trạng, ung thư cổ tử cung

- Loại ung thư biểu mô thường di căn theo đường bạch huyết đến các hạch khu vực

- Loại ung thư liên kết (xương, phần mềm) thường di căn theo đường máu tới các tạng

ở xa (vào gan, phổi, xương)

Thông thường ung thư càng ở giai đoạn muộn, càng hay có di căn ra hạch khu vực và

di căn xa nhưng đôi khi có di căn rất sớm, thậm chí từ lúc chưa phát hiện thấy u nguyên phát

Tốc độ phát triển của ung thư cũng tùy thuộc vào từng giai đoạn của từng loại Ở những giai đoạn sớm (insitu, giai đoạn 1) ung thư thường tiên triển lâu dài, chậm chạp, nhưng

ở các giai đoạn muộn (giai đoạn 3,4) ung thư tiến triển thường rất nhanh và gây tử vong

Ung thư ở người càng trẻ, thường tiến triển nhanh hơn người già

2.3 Khác nhau về phương pháp điều trị

Trong y văn có nói đến một tỷ lệ rất nhỏ ung thư tự khỏi (1/10.000) Có thể ở những

cơ thể cá biệt, có hệ thống miễn dịch tự điều chỉnh, tiêu diệt được các tế bào ung thư sau khi

đã phát sinh Nhưng trên căn bản nếu không điều trị thì chắc chắn bệnh nhân sẽ sớm dẫn đến

tử vong Càng điều trị ung thư ở giai đoạn sớm, bệnh nhân càng có cơ may trị khỏi bệnh ung thư Ở những giai đoạn muộn hơn cũng cần điều trị để tạm thời ổn định hoặc kéo dài thời gian sống hoặc giảm các triệu chứng của ung thư

Mỗi loại ung thư, mỗi giai đoạn bệnh có phương pháp điều trị khác nhau

- Điều trị phẫu thuật: thường áp dụng cho ung thư ở giai đoạn sớm chưa có di căn

- Điều trị tia xạ: thường áp dụng cho những ung thư ở giai đoạn tương đối muộn hơn Thường phối hợp với phẫu thuật làm thu nhỏ bớt khối u để dễ mổ hoặc diệt những tế bào u tại chỗ và hạch khu vực mà khi mổ nghi ngờ chưa lấy hết hạch, hoặc áp dụng tia xạ cho ung thư

ở các vị trí không thể mổ được

- Điều trị hóa chất: trước đây áp dụng cho những loại ung thư có tính chất toàn thân hay ở giai đoạn muộn, có di căn, nhưng ngày nay số ung thư ở giai đoạn sớm (trên lâm sàng) nhưng tính chất ác tính cao, dễ di căn hoặc nghi có vi di căn (ung thư vú, tinh hoàn, buồng trứng, ung thư rau ) người ta cũng sử dụng hóa trị để phòng ngừa và nâng cao hiệu quả điều trị

- Điều trị miễn dịch: là 1 trong 2 phương pháp điều trị toàn thân, còn đang được nghiên cứu và có nhiều hy vọng Có nhiều thử nghiệm đã áp dụng như điều trị kích thích miễn dịch không đặc hiệu, điều trị bằng interferon, các lymphokin và gần đây là các nghiên cứu dùng kháng thể đơn dòng đã điều trị một số bệnh ung thư có kết quả tốt

2.4.Khác nhau về tiên lượng bệnh

Tiên lượng ung thư phụ thuộc rất nhiều yếu tố trên từng bệnh nhân Những yếu tố chính là:

- Giai đoạn ung thư: càng sớm tiên lượng càng tốt và ngược lại

- Loại ung thư: những ung thư ở bề mặt có tiên lượng tốt hơn (dễ phát hiện, dễ điều trị) như ung thư da, ung thư cổ tử cung, ung thư vú, ung thư giáp trạng, ung thư khoang miệng, ung thư đại trực tràng

Có những ung thư ở các tạng quan trọng khó phát hiện sớm, khó điều trị, tiên lượng thường xấu như ung thư phổi, gan, não, tụy, xương

- Tính ác tính của tế bào ung thư: cùng 1 loại ung thư, cùng giai đoạn lâm sàng nhưng

độ ác tính của chúng khác nhau Độ ác tính càng cao tiên lượng càng xấu

- Thể trạng của người bị ung thư: ở người già ung thư thường tiến triển chậm nhưng thể trạng yếu nên khó thực hiện được phác đồ điều trị 1 cách triệt để nên càng già yếu tiên lượng càng xấu

3 Có thể phòng ngừa được nhiều loại ung thư

Như trên đã đề cập đến tác nhân sinh ung thư chủ yếu là từ môi trường bên ngoài (trên 80%) Tác nhân nội sinh rất ít (chỉ khoảng 1%) Vì vậy, phòng bệnh ung thư có hiệu quả khi ngăn chặn tốt các tác nhân do môi trường tác động vào đời sống con người như: ngừng hút thuốc lá, chế độ dinh dưỡng vệ sinh an toàn hợp lý, chống lạm dụng các hóa chất công nghiệp, chống ô nhiễm môi trường, phòng bệnh nghề nghiệp sẽ làm giảm tỷ lệ mắc ung thư

Một số loại bệnh ung thư có liên quan đến virus đã được người ta áp dụng vaccin để phòng ung thư như vaccin phòng viêm gan B, và người ta đang nghiên cứu vaccin phòng Esptein-Barr gây ung thư vòm họng và u lympho

Ngoài ra các biện pháp điều trị tổn thương tiền ung thư, các biện pháp sàng lọc phát hiện sớm một số ung thư hay gặp (vú, cổ tử cung, khoang miệng, đại trực tràng ) đã thiết thực làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư [1]

II ĐẠI CƯƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƯ

1 Đại cương về khối u và lịch sử nghiên cứu

Nghiên cứu cơ chế sinh bệnh ung thư cần phải đi sâu tìm hiểu về quá trình sinh học của tế bào ung thư và sinh học phân tử của ung thư

1.1 Phân biệt u lành và u ác tính theo đặc tính sinh học

Tế bào biệt hóa cao

Hiếm có phân bào

Phát triển chậm

Không xâm lấn

Ít biệt hóa Luôn có phân bào Phát triển nhanh Xâm lấn lan rộng

Di căn Ảnh hưởng nặng tới cơ thể

1.2 Một số mốc lịch sử nghiên cứu về ung thư

- Xương hóa thạch của loại khủng long cách đây 60 triệu năm có thương tổn ung thư

- Xác ướp người Ai cập ở Gaza cách đây 5000 năm thấy có ung thư xương và ung thư bàng quang

- Thời Hypocrates đã để lại một số bản viết tay mô tả 2 loại ung thư: loại sùi ra ngoài nhiều chân như loài tôm cua gọi là carcinoma và loại phát triển sâu trong thịt gọi là sarcoma

- 1846 R.Virchop (người Đức) mô tả tế bào ung thư máu và đưa ra giả thuyết về nguồn góc ung thư tế bào

- 1953 J.Watson và F Crick dưa ra mô hình chuỗi xoắn kép phân tử DNA mô phỏng các loại gen của tế bào Công trình nhận giải Nobel Sinh học

- 1979 Richard Doll lãnh đạo nhóm nghiên cứu nguyên nhân gây ung thư trên người

từ môi trường sống Trong đó ông và Petro nhấn mạnh vai trò quan trọng của hút thuốc, dinh dưỡng và các ung thư nghề nghiệp

- 1981 Cesar Milstein đã phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (nhận giải Nobel 1987)

- 1981 S.D.Thomas đã thành công ghép tủy xương trên người ứng dụng xạ trị toàn thân và điều trị hóa chất mạnh trong bệnh bạch huyết cấp (nhận giải Nobel năm 1990)

2 Tế bào ung thư

2.1 Nguồn gốc tế bào ung thư

Có một số giả thuyết khác nhau nhằm giải thích các quan sát về quần thể tế bào ung thư

2.7.7 Thuyết đơn dòng tế bào

Là quan niệm kinh điển: khối u sinh ra từ 1 tế bào mẹ nhân lên

Ví dụ: từ bệnh bạch cầu thể tủy trên phụ nữ da đen thấy tế bào đồng nhất thương tổn nhiễm sắc thể 10 Các tế bào ung thư đều tiết men Glucose-6-phosphate dehydrogenase 2.7.2 Thuyết đa dòng tế bào

Khi quan sát về hình thái và chức năng người ta thấy:

- Tổ chức ung thư có nhiều loại tế bào nên chẩn đoán hình thái học dễ nhầm

lẫn

- Về chức năng: nhiều chất chỉ điểm sinh học

2.1.3 Thuyết về kém ổn định gen của tế bào ung thư

Có thể ban đầu là một dòng, do gen tế bào ung thư không ổn định nên có các tế bào biến dị tạo nên hàng loạt các tế bào hỗn hợp

Ví dụ: U lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ Các loại ung thư phổi thể hỗn hợp, ung thư liên kết hỗn hợp

αFP: trong ung thư gan

CA125: trong ung thư buồng trứng

CA25: trong ung thư vú

CEA: trong ung thư đại trực tràng

HCG: trong ung thư nhau, ung thư tinh hoàn

β2Microglobulin, Belcezol: trong đa u tủy xương

3 Sơ lược về cơ sở sinh học phân tử của ung thư

3.1 Phần quy định sinh sản tế bào là DNA của nhân tế bào

Trong ung thư việc thay đổi DNA dẫn đến sinh sản vô tổ chức là hậu quả của quá trình đột biến gen, chứng cớ mạnh mẽ nhất là:

- Những chất gây đột biến gen tế bào chính là những tác động hoá lý gây ung

thư

- Những tác động gây ung thư cũng gây nên đột biến gen

3.2.Các gen gây ung thư (Oncogen)

Cho đến nay đã tìm ra trên 40 loại Có 3 giả thuyết cho việc hình thành Oncogen

- Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăng trưởng (growth factor) Do rối loạn cơ chế điều hành, yếu tố tăng trưởng hoạt hóa mạnh kích thích Oncogen sinh ung thư

- Oncogen là những đoạn DNA bị thương tổn bởi các tác nhân gây bệnh như hóa học, sinh học, vật lý Cơ thể đã sửa chữa những đoạn DNA này nhưng không hoàn chỉnh, nên cùng tác nhân gây ung thư, có người bị ung thư có người không bị ung thư

- Oncogen là do các genome của virus đưa vào cơ thể vì thấy các Oncogen này giống với DNA của virus ví dụ: HPV (cổ tử cung, dương vật), EBV (Burkitt) và HBV (ung thư gan)

Một số gen gây ung thư

Mcc 5q Khuyết đoạn Đa polip trực tràng

Abl 9q +(6; 14) Bạch cầu cấp lympho, ung thư buồng trứng

Myl 6q +(8; 14) U lympho Burkitt, ung thư nguyên bào thần kinh,

Ras 11p Khuyết đoạn U Wilm, carcinoma

p: Nhánh ngắn nhiễm sắc thể q: Nhánh dài nhiễm sắc thể +: Nối đoạn [1] III ĐẠI CƯƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƯ

1 Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thư

Các thuốc chữa ung thư có tác động đến các giai đoạn khác nhau trong quá trình tổng hợp acid nucleic (đặc biệt là DNA) cũng như quá trình tổng hợp protein ở các tế bào ung thư vào các thời kỳ khác nhau của chu trình phân chia tế bào

Ở các mô ung thư của người có khoảng 50% tế bào ở giai đoạn nghỉ không phân chia (G0) Sự phân chia của tế bào có thể phân thành 4 giai đoạn:

- Giai đoạn G1 là thời kỳ sau gián phân Thời gian của giai đoạn này rất khác nhau tùy theo loại tế bào Trong thời kỳ này tế bào sinh ra các protein cần cho tổng hợp DNA

- Giai đoạn s là giai đoạn tổng hợp DNA

- Giai đoạn G2 là giai đoạn tiền gián phân Trong thời kỳ này xảy ra tổng hợp RNA và các protein đặc hiệu của ung thư

- Giai đoạn M là thời kỳ gián phân (thời kỳ phân chia tế bào) Giai đoạn này lại chia thành prophase, metaphase, anaphase và telophase

Các thuốc chữa ung thư không ảnh hưởng đến giai đoạn nghỉ, mà chỉ tác động lên các giai đoạn s, Gọ và M, thậm chí có thuốc chỉ tác động lên một kỳ nào đó của giai đoạn M mà thôi

2 Sự kháng thuốc của tế bào ung thư

Các tế bào ung thư có thể kháng lại các thuốc chữa ung thư cũng như vi khuẩn kháng kháng sinh

Cơ chế tế bào ung thư kháng thuốc có thể là:

- Làm giảm khả năng xâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thư

- Làm giảm hoạt tính của thuốc do làm thay đổi các phân tử thuốc

- Làm biến đổi các protein mục tiêu và các yếu tố cần cho thuốc tác động lên tế bào ung thư

- Làm tăng khả năng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo phân chia tế bào mặc dù bị thuốc tác động

Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu do một loại thuốc nhất định, nhưng cũng như kháng kháng sinh, các tế bào ung thư cũng có hiện tượng kháng chéo thuốc Ví dụ: một dòng tế bào ung thư đã kháng alcaloid của dừa cạn, cũng kháng cả anthracyclin Hiện tượng này gọi là kháng đa thuốc (multidrug resistance)

3 Độc tính của các thuốc chữa ung thư

Các thuốc chữa ung thư có tác dụng độc, ngăn cản sự phân chia các tế bào ung; thư, nhưng đồng thời cũng gây độc cả tế bào lành, do đó chúng thường khá độc

Tác dụng của thuốc chữa ung thư không đặc hiệu như các hóa trị liệu kháng khuẩn Vì vậy trong điều trị ung thư bằng hóa trị liệu thường có nhiều tác dụng phụ có hại nhiều khi khá nặng, đặc biệt là tác hại lên tủy xương, trên các tế bào sinh sản, trên các niêm mạc, da, sự phát triển của tóc, bào thai, trên khả năng sinh miễn dịch

Một trong những cách hiện đại làm tăng tính đặc hiệu của thuốc chữa ung thư là gắn chúng lên các kháng thể đơn dòng

Các biểu hiện độc thường là:

- Rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn mửa

- Rụng tóc

- Trên tủy xương: làm yếu chức năng tủy, hạn chế tạo huyết cầu

- Ảnh hưởng xấu đến buồng trứng và tinh hoàn, dẫn đến vô sinh

- Làm chậm tăng trưởng và phát triển ở trẻ em

- Gây ung thư thứ phát do dùng thuốc

- Gây tổn thương mạch máu và đau khi truyền thuốc tĩnh mạch hay sau khi điều trị một thời gian

- Rối loạn tính cách, hành vi

- Sút cân, người yếu, không còn khả năng làm việc

- Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm Vì vậy người đã dùng thuốc chữa ung thư thì không nên có con nữa [2]

IV ĐẠI CƯƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1 Đặc điểm của tế bào động vật

1.1 Tính cơ học yếu

Tế bào động vật không vách nhưng kích thước tế bào khá lớn (khoảng 10 μm) nên tính bền cơ học yếu Do đó khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi khuấy trộn để tách tế bào, thao tác v.v Trong trường hợp việc nuôi cấy tế bào động vật cần khuấy hay quay thì tốc độ không được quá 100rpm (vòng/phút)

Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động; vật cũng cố gắng sao cho ngắn nhất, thời gian càng kéo dài, tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ Trong bảo quản, di chuyển các mẫu tế bào cũng cố gắng thật nhẹ nhàng

1.2 Tăng trưởng và phân chia chậm

Thời gian tăng gấp đôi số lượng của tế bào động vật trong điều kiện sinh lý là 20-40 giờ Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm

Do đó cần có thời gian dài và khối lượng tế bào lớn khi chúng ta muốn sản xuất chất có hoạt tính từ tế bào động vật

1.3 Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back)

Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất bởi sự gia tăng nồng độ chất này trong môi trường Do đó, việc thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cấy nhất định là rất cần thiết, nhằm tránh sự hoạt động của cơ chế kìm hãm ngược này Trong phòng thí nghiệm, cơ chế ức chế ngược còn có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí làm chết hàng loạt

1.4 Tính chất cần giá đỡ

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia Thông thường tế bào tăng trưởng tốt khi sắn vào bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên

bề mặt của dụng cụ nuôi Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường, sau khi được thuần hóa, có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào nền

1.5 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dung hợp 2 tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma) Hoặc quá

trình biến nạp, ví dụ: chủng tế bào bình thường có thể được cảm ứng thành tế bào có các tính chất của tế bào ung thư thông qua quá trình biến nạp được thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thư hoặc bằng hóa chất

1.6 Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

Các dòng tế bào động vật có thể được bảo quản lạnh sâu -70°C trong một thời gian vô định Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi lại khả năng tăng trưởng và phân chia như ban đầu

1.7.Các đặc tính khác

Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có các đặc điểm khác như kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormon để tăng trưởng và phân chia

2 Môi trường nuôi cây tế bào động vật

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi trường nuôi cây vi sinh vật và tế bào thực vật Trong các công trình đầu tiên về nuôi cây tế bào động vật người ta dùng hỗn hợp dung dịch muôi sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phôi

gà làm môi trường nuôi cấy Do thành phần huyết thanh và chiết phẩm phôi gà rất rất phức tạp, khó ổn định nên người ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần môi trường và ổn định môi trường trong những lần nuôi cấy khác nhau

Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập được thuần hóa với môi trường tổng hợp hoàn toàn, đa số các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp có bổ sung 5 - 10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh) Thông thường huyết thanh

bê được sử dụng phổ biến hơn cả, nhưng có một số loại tế bào cần phải sử dụng huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum: FBS)

Một vài loại môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động vật:

- Môi trường EM (Basal Medium): đây là môi trường cơ bản do H Eagle thiết lập, khi

dùng phải bổ sung; 5-10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lượng tùy loại tế bào Thường sử dụng nuôi cây tế bào Hela, tế bào L

- Môi trường E'MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi trường tối

thiểu, do H.Eagle thiết lập Đây là môi trường BM có chứa nồng độ cao

hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào

- Môi trường D'MEM (Dulbecco - Modified Eagle Medium) là môi trường E'MEM do

Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin cao gấp

4 lần so với môi trường khác để nuôi được nhiều loại tế bào hơn

- Môi trường F10, F12: do R.G, Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong môi

trường này huyết thanh thường được thay bằng 20μg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng

- Môi trường RPMI-1640: được G.E Moore thiết lập tại viện nghiên cứu Roswell Part

Memorial Institute, được dùng để nuôi tế bào và mô bạch huyết

- Môi trường 199: do R,C.Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào mô cơ phôi gà trong

sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt

Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh vì

nó có những vai trò quan trọng như sau:

- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng

- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân

chia

- Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây tổn thương tế bào

- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

- Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ

- Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy

Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của môi trường nuôi cấy) Ngoài ra huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau cũng như còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp không chứa yếu tố ức chế đối với dòng

tế bào nuôi cấy) Vì các lý do đó mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng môi trường nuôi cấy

tế bào động vật không dùng huyết thanh hay dùng với lượng thấp

Có 2 phương pháp điều chế môi trường không có huyết thanh là phương pháp của G Sato và phương pháp của R.G Ham Cả 2 phương pháp này đều thay huyết thanh bằng những yếu tố khác như: kích thích tố, nhân tố tăng trưởng, protein vận chuyển, nhân tố kết dính và kéo dài, các chất dinh dưỡng, khoáng [3]

PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

I VẬT LIỆU

1 Gossypol

Gossypol là một sắc tố vàng loại poliphenol trích từ hột của cây bông Gossypium

hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C Hàm lượng gossypol trong hạt bông biến đổi từ 0.1 - 6.64% tùy theo giống

Trong kỹ nghệ cây bông, gossypol được xem như là phế phẩm có độc tính và thường được khử từ đầu; hột sau khi loại dầu và khử gossypol thường dùng làm thức ăn gia súc

Nhưng hiện nay, sossypol có tầm quan trọng đặc biệt Vào năm 1950, một bác sĩ Trung Hoa đã phát hiện có sự gia tăng bất thường các cặp vợ chồng không có con trong vùng dùng nhiều dầu bông còn chứa gossypol

Những thí nghiệm trên động vật và sau đó trên con người cho thấy gossypol có tính diệt tinh trùng

Về cấu trúc hóa học gossypol gồm 2 đơn vị naptalen đối xứng mang 3 nhóm chức phenol và 1 chức aldehid Công thức nguyên C30H30O8, trọng lượng phân tử là 518.54, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C

Tác dụng sinh học của gossypol:

Năm 1950, người ta phát hiện tác dụng lên tinh trùng của gossypol Nhiều thử nghiệm trên động vật sau đó cho thấy gossypol gây nên:

- Sự giảm bớt tính di động và số lượng của tinh trùng cùng với sự xuất hiện nhiều tinh trùng dị dạng

- Giảm thiểu sự sinh sản

- Làm ngưng trệ testosteron (kích khích tố nam)

Năm 1970, những thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện trên con người tại Trung Quốc cũng cho thây kết quả tương tự Tuy nhiên, sau khi ngưng dùng thuốc 3 tháng thì tinh dịch của người trở lại bình thường về mặt định tính và định lượng

Ngoài ra gossypol còn có nhiều tác dụng khác như :

- Gây co rút ở các loài gặm nhấm

- Kháng khuẩn

- Tác dụng gây độc cho cơ thể: LD50 heo: 550 mg/Kg, LD50 chuột: 2200 mg/Kg Hiện tượng ngộ độc gossypol là sự uễ oãi, nôn mửa, tiêu chảy và khó thở dẫn đến chết vì ngạt thở [5]

Gossypol được thử nghiệm trên bệnh nhân bị ung thư thận (adrenocortical cancer) di căn, kết quả là có 15% trường hợp có đáp ứng Nghiên cứu tác động của gossypol lên tế bào ung thư vú của người nuôi cấy cho thấy gossypol có thể ức chế sự phân bào và thay đổi sự biểu hiện của nhiều protein điều hòa chu trình tế bào (cell cycle) Một thử nghiệm trên bệnh nhân hóa trị liệu chống ung thư vú di căn cho thấy gossypol, ở liều lượng phù hợp, có tác động lên những protein điều hòa chu trình tế bào và tác dụng có lợi lên một số bệnh nhân [13]

2 Plumbagin

Plumbagin là tinh thể màu vàng cam, hình kim, nhiệt độ nóng chảy 77 -78oC, được

chiết xuất từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica, họ Plumbaginaceae

Công thức phân tử :C11H8O3

Trọng lượng phân tử : 188,18

Tính chất hóa học của plumbagin:

- Không tan trong nước

- Tan tốt trong CHCl3, C6H6, AcOH, (CH3)2CO

- Cho màu đỏ máu với FeCl3

- Kết tủa xanh lục với Cu(AcO)2 trong alcol

Tác dụng sinh học của plumbagin:

- Tại Ấn Độ và Châu Phi plumbagin được sử dụng để trị các bệnh đường tiêu hóa, phong ghẻ

- Plumbagin có tác dụng diệt khuẩn, nấm

Plumbagin được sử dụng làm chất bảo quản đối với thức ăn và hoa quả

- Plumbagin có tác dụng mạnh với nhiều loài vi khuẩn Gram (+) , vi khuẩn Gram (-),

nấm, vi khuẩn kháng acid Ví dụ như: Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercuosis,

Dòng tế bào RD được thiết lập bởi R.M McAllister từ khối u cơ ở vùng chậu của một

bé gái 7 tuổi người Cap-ca (Caucasian) vào tháng 2 năm 1968 Các tế bào mọc thành những lớp đơn trong môi trường lỏng và tạo thành cụm tế bào (coloni) trên môi trường E'MEM Agar (Eagle'Minimum Essential Medium) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Fetal Bovine Serum) Tế bào nuôi cấy có 2 dạng, dạng tế bào gần giống tế bào mô ung thư ban đầu, và dạng tế bào trãi rộng có nhiều nhân Tế bào có myoglobin và hoạt tính myosin-ATPase Dòng tế bào RD là dòng tế bào ung thư cơ đầu tiên của người được xác định đặc tính và nghiên cứu chi tiết

3.2 Dòng tế bào HEp2 (Epidermoid carcinoma)

Ký hiệu: ATCC CCL HEp2 (từ Catalogue of American Type Culture Collection,

ATCC)

Dòng tế bào HEp2 đã được thiết lập bởi A.E Moore, L Sabachewsky, và H.W Toolan vào năm 1952, từ những khối u tạo ra ở chuột vừa dứt sữa sau khi đựơc tiêm mô ung thu biểu bì thanh quản của 1 người đàn ông người Cap-ca (Caucasian) 56 tuổi Việc phân lập

in vitro đã được thực hiện ở nhiều phức hợp của nước ối thai bò, dịch chiết phôi, huyết thanh

người và ngựa, và dung dịch muối cân bằng, những

tế bào giống biểu mô này phát triển tốt trong nhiều dạng môi trường nuôi cấy Đây là một dòng tế bào khỏe mạnh có thể chống lại nhiệt độ, thiếu hụt dinh dưỡng, và những thay đổi môi trường mà không mất khả năng sống

II PHƯƠNG PHÁP

1 Phương pháp nuôi cấy tế bào:

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường E'MEM (Eagle ' Minimum Essential Medium)

2 Phương pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay):

Sau một thời gian nuôi cây trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào được tách rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và được cấy vào các giếng của đĩa 24 giếng; mỗi giếng gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 100.000 tế bào) và 400μl môi trường

Tế bào được ủ ở 37.5°C trong 24 giờ Sau đó môi trường cũ được thay bằng môi trường chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc

plumbagin ở nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đôi với dòng tế bào HEp2 Lô đối chứng được xử lý với môi trường chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO Các lô được ủ 72 giờ ở 37.50 C

Sau thời gian ủ, tách rời tế bào trong mỗi giếng bằng dung dịch trypsin/EDTA, hòa tế bào vào 500 μg/ml môi trường và nhuộm bằng trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1 (dịch huyền phù tế bào: thuốc nhuộm), Số lượng tế bào sống (tế bào không bắt màu xanh) được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thư của hoạt chất được tính theo công thức:

Tỷ lệ ức chế (%) = Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm

độ quang OD570 của dung dịch

Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào được tách rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và được cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng; mỗi giếng gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 10.000 tế bào)

Tế bào được ủ ở 37.50 C trong 24 giờ Sau đó môi trường cũ được thay bằng môi trường chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào HEp2 Lô đối chứng được xử lý với môi trường chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO Các lô được ủ 72 giờ ở 37.50

C

Sau thời gian ủ, môi trường xử lý được thay bằng môi trường chứa 0.5 mg/ml MTT Sau 4 giờ ở 37.50 C môi trường chứa MTT được thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl (0.04M) Đo OD570 của các lô thí nghiêm và đối chứng Khả năng ức chế sự phát triển các

dòng tế bào ung thư của hoạt chất được tính theo công thức: [7,8,9,10]

Tỷ lệ ức chế (%) = OD570đối chứng - OD570thí nghiệm

OD570đối chứng 100%