nghiên cứu đặc điểm và vai trò của lactobacillus acidophilus trong chế phẩm probiotic

sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,… Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá trình sản xuất thuốc, không t

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

L ỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:

TS Tr ần Thanh Thủy, người đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và tạo

mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận văn

Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Bình Dương, Ban giám hiệu Trường Trung học phổ thông Bình Phú đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học

tôi trong thời gian học cao học

Quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh–Sinh hóa, Sinh lý trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh và Viện Sinh học nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Trần Thị Minh Định, người đã tận tình giúp đỡ tôi

trong quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài và chỉnh sửa luận văn

em Lê Đình Hưng và em Đặng Thị Tuyết đã nhiệt tình hỗ trợ, động viên tôi trong suốt quá

trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi

Tr ần Thị Ái Liên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực

Tác giả luận văn

Tr ần Thị Ái Liên

2.1.2 Hóa chất0T 330T

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ0T 330T

2.1.4 Môi trường nuôi cấy0T 330T

2.2 Phương pháp nghiên cứu0T 35

2.2.12 Phương pháp khảo sát khả năng chịu đựng pH thấp [14], [15]0T 410T

2.2.13 Khả năng chịu đựng acid mật [14]0T 410T

2.2.14 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn0T 420T

2.2.15 Ảnh hưởng pH ban đầu đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn0T 420T

2.2.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn0T 430T

2.2.17 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh, lắc đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn0T 430T

2.2.18 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon MT nuôi cấy đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn0T 430T

2.2.19 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn0T 440T

2.2.20 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên sự ST và hoạt tính kháng khuẩn0T 440T

2.2.21 Động thái quá trình sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn các chủng LAB được tuyển chọn0T 440T

2.2.22 Bảo quản giống vi khuẩn lactic bằng phương pháp đông khô [14] [15]0T 450T

2.2.23 Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch [17]0T 450T

2.2.24 Phương pháp.định danh bằng sinh học phân tử0T 460T

3.4.1 Khả năng kháng các chất kháng sinh0T 580T

3.4.2 Khả năng chịu đựng pH thấp0T 600T

3.4.3 Khả năng chịu acid mật0T 610T

3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn của

3.5.6 Nồng độ glucose0T 760T

3.5.7 Nồng độ cao nấm men0T 780T

3.6 Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng LAB trong điều kiện tối

với sức khỏe con người, thông qua các đặc tính probiotic vốn có của chúng Điển hình là điều trị các chứng bệnh rối loạn đường tiêu hóa, khắc phục một số hạn chế do việc điều trị kháng sinh dài ngày, giúp đồng hóa lactose trong sữa uống đối với các bệnh nhân không có

khả năng dung nạp lactose trong sữa Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến

hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme

có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được dễ dàng hơn, hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ

miễn dịch, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể chủ,

Những chủng vi sinh vật probiotic thường được nghiên cứu và sử dụng chủ yếu là vi khuẩn lactic nhờ có các đặc tính ưu việt phù hợp cho việc sử dụng tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi Những đặc tính đó là: khả năng sống sót và phát triển tốt trong điều kiện bất lợi ở đường tiêu hóa của người như acid mật, pH thấp, kháng sinh, Đồng thời, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn như acid lactic, bacteriocin, HR 2 ROR 2 R, diacetyl,… tạo môi trường bất lợi, từ đó ức chế VSV gây bệnh và thiết

lập sự cân bằng hệ VSV đường ruột Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng sản sinh nhiều enzyme thúc đẩy quá trình tiêu hóa hấp thu các chất của cơ thể vật chủ

Trong số các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu làm probiotic thì chủng Lactobacillus

acidophilus sớm được biết đến và nghiên cứu nhiều nhất Đây là chủng vi khuẩn được phân lập đầu tiên bởi Moro (1900) từ ruột người và động vật, đặc biệt là từ phân của trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa mẹ Mặt khác, vi khuẩn này có mặt trong hầu hết các chế phẩm probiotic trên

thị trường hiện nay

Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu cho mình là: “Nghiên

c ứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế phẩm probiotic”

V ới mục tiêu:

Nhằm tìm hiểu vai trò probiotic của L acidophilus thông qua các đặc điểm sinh học

của chủng này

Nhi ệm vụ của đề tài:

1 Phân lập, tuyển chọn 2 chủng L acidophilus từ các chế phẩm probiotic dành cho

người

2 Tìm hiểu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng L acidophilus

3 Khảo sát phổ kháng khuẩn của 2 chủng L acidophilus với các VSV gây bệnh

đường ruột ở người

4 Nghiên cứu khả năng tồn tại trong điều kiện bất lợi ở đường ruột

5 Xác định các điều kiện ST và sinh chất đối kháng của 2 chủng L acidophilus được

tuyển chọn

6 Nghiên cứu khả năng sống sót sau quá trình đông khô

7 Phân loại đến loài 2 chủng VK nghiên cứu bằng sinh học phân tử

C HƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 L ược sử nghiên cứu

Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người bệnh và người khỏe mạnh Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi là probiotic

Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ

Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ những vi sinh vật đã được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người và động vật [63]

Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có

chứa “Lactobacillus acidophilus” [15]

Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công việc kích thích sự tăng trưởng của heo

bằng thức ăn có bổ sung L acidophilus [15], [65]

Khái niệm này sau đó được làm rõ hơn bởi Fuller (1989) Probiotic là “một chất bổ

trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó”

Một định nghĩa khác về probiotic là “các vi sinh vật sống có ích cho sức khỏe của vật

trong đường tiêu hóa của người, chúng tạo thành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của

một số VSV gây bệnh, cung cấp cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc phòng và chữa bệnh [60]

Nghiên cứu về việc sử dụng VSV probiotic trong chế độ ăn uống đã được tiếp tục suốt cả thế kỷ qua Công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các VSV này, cũng như về bảo đảm sự sống sót của các VK này khi

ở trong vùng dạ dày - ruột và các loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen, 2001)

1.1.2 Các vi sinh vật probiotic thường gặp

Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của

hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB

M ột số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp:

loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó chủ yếu là

những loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus như L acidophilus, L casei, L

plantarum, L bulgaricus, L kefir, L delbruckii, L sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,…

Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá trình

sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sung thêm trong chế phẩm như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt là fructoligosaccharide, là một tá dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chế phẩm propiotic

Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (như L acidophilus hay L

sprorogenes,…) ho ặc kết hợp nhiều chủng LAB (L acidophilus, L sprorogenes, L kefir,

Streptococcus faecalis,…) Sử dụng chế phẩm probiotic - lactic là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu hóa, giúp duy trì hệ VSV có lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ những tác dụng trong cơ thể người

[12], [49]

 Bacillus subtilis

B subtilis là VK ứng dụng làm probiotic từ rất sớm Chúng được sử dụng qua đường

uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi dùng kháng sinh (KS) B

subtilis có tác dụng hồi phục hệ VSV tự nhiên trong đường tiêu hóa của người sau khi dùng

KS kéo dài Các chế phẩm B subtilis được bán ở hầu hết các nước Châu Âu, mặc dù người

ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng Bào tử của B subtilis có thể vượt qua

rào chắn đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường

ruột Một số tác dụng lâm sàng của B subtilis đã được biết như làm tác nhân kích thích

miễn dịch trong một số bệnh [63]

 Bacillus clausii [17]

- Thuộc giống Bacillus, GP

+

P, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các MT dinh dưỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp VK tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt Bào tử của

B clausii có thể qua dạ dày với tỉ lệ sống sót cao, có thể sống được trong MT dịch vị với pH

= 2 ít nhất l2 giờ Chúng đề kháng rất tốt với nhiều loại KS Vì thế, có thể dùng chung trong

thời gian điều trị KS

- Khi vào ruột non, bào tử B clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trưởng và tiếp tục

sinh sôi nảy nở trong ruột Nhờ đó lấp đầy lại được khoảng trống rối loạn hệ VK trong

đường ruột Đồng thời sự ST của B claussi sẽ tái lập được điều kiện kị khí, tạo điều kiện

thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đường ruột (như Bifidobacterium,

Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác nhau

- B clausii thường được dùng tạo chế phẩm probiotic cho người như chế phẩm

không mùi, không v ị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho tr ẻ em.

N ấm men được sử dụng làm probotic như Saccharomyces cerevisiae, S boulardii

Trong các chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài Chúng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản Ngoài ra, chúng còn tiết enzyme tiêu hóa như amylase, protease,…[15]

S boulardii: được dùng như probiotic từ năm 1950 Là thành phần chính của

m ột số chế phẩm probiotic như ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp) Tác

động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp Ngừa tiêu chảy do KS và trị

li ệu phối hợp trong nhiễm trùng H pylori S boulardii tác động thông qua cơ chế:

+ Ti ết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh

phosphatase làm b ất hoạt các nội độc tố do E coli tiết ra

+ Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và aminopeptidase, t ăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thi ết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải

N-+ Ngoài ra, chúng còn tác d ụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào T

 N ấm mốc trong chế phẩm probiotic có vai trò tạo sinh khối chứa nhiều acid amin,

sản xuất enzyme amylase, protease nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn ở động vật nuôi [15]

1.1.3 Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác động thông qua một số cơ chế khác nhau Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa vật

chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa Điển hình là các điều kiện như pH thấp, acid mật, kháng sinh,…

 Ch ịu pH thấp

Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều kiện áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5 Do đó, các chủng được chọn lọc để sử dụng như trong chế phẩm probiotic cần

phải chịu được môi trường pH thấp ít nhất 90 phút Sống sót ở pH 3,0 trong 2 giờ và nồng

độ acid 1000 mg/l được xem như là khả năng chống đỡ đối với acid tối ưu đối với các chủng

probiotic [43]

Tiếp đến, chúng phải gắn vào biểu mô và phát triển được trong ruột trước khi chúng

có thể bắt đầu phát huy vai trò đối với sức khỏe vật chủ

Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzyme trong đường miệng như lysozyme Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để sàng lọc khi

20 – 30 g acid mật tiết vào ruột mỗi ngày [68]

Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột Tại đây, chúng

chịu sự tác động của acid mật Khi acid mật đi vào khu vực tá tràng thì số lượng VSV sẽ

giảm Khả năng chịu đựng acid mật là một trong những đặc tính cần thiết của VSV có hoạt

tính probiotic [54]

 Ch ịu kháng sinh

Kháng sinh được ứng dụng phổ biến trong điều trị một số bệnh cho người cũng như vật nuôi Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do KS mang lại thì phương pháp trị liệu KS có một số hạn chế nhất định như là tác động loại bỏ không phân biệt được mầm bệnh thật sự và

hệ VSV có lợi trong ruột Vì vậy, phương pháp trị liệu này đã dẫn đến thay đổi sự cân bằng

hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này

Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được chỉ định uống trong thời gian điều

chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu đựng được kháng sinh [14]

Các chủng VSV probiotic khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau lên đường tiêu hóa Chúng chỉ có thể tác động được khi chúng có thể ST và phát triển tốt trong đường tiêu hóa Do vậy, bên cạnh khả năng sống sót thì chúng phải có khả năng bám vào thành biểu

mô ruột, nhờ đó chúng mới không bị rửa trôi ra ngoài cùng với phân [34]

Sự kết bám với tế bào biểu mô ruột là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư lâu dài của VK probiotic trong đường ruột, chống lại sự loại bỏ do nhu động ruột và tạo được

một ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột (Pedersen và Tannock 1989; Freter 1992; Alander và cộng sự 1997) [31], [35]

Bên cạnh khả năng sống sót và phát triển được trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa, vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt tính kháng khuẩn như các acid hữu cơ, ethanol, bacteriocin, HR 2 ROR 2 R,… Những chất này được sản sinh cùng với quá trình ST và phát triển của chúng trong đường tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ sinh thái đường ruột

Ngoài ra, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol, lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng nhiều enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn diễn ra dễ dàng Bên cạnh đó, chúng còn giúp hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư, các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ

miễn dịch cơ thể chủ, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,…[12],[49]

sử dụng tạo chế phẩm probiotic cần phải đảm bảo tiêu chuẩn sau đây:

- Giống dùng cho probiotic phải mang tính đại diện và được công nhận chung về tính an toàn cho người và vật nuôi (GRAS microorganism) [28], [51]

- Có nguồn gốc từ người được chứng minh an toàn cho người

- Có khả năng sống sót trong điều kiện acid ở dạ dày, nồng độ acid mật và kháng sinh trong ruột

trong ruột người

- Góp phần điều chỉnh tích cực chức năng của ruột

- Khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol và lactose,

tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được

diễn ra dễ dàng, hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết và khử các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại [12],[52]

- Tạo ra chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng mầm bệnh ở người như sản sinh acid L

- lactic và những chất ức chế VK gây hại

- Có khả năng tiết ra các chất có hoạt tính sinh học có thể kích thích đáp ứng miễn dịch, làm gia tăng chức năng phòng thủ của mạng lưới tế bào chủ

- Có khả năng tồn tại trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản bằng đông khô

1.1.4 Cơ chế tác động chung của probiotic

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên đường tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh,

sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật

chủ,…

 C ạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh

Hệ vi sinh vật ở đường tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác nhau, một trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng KS dài ngày dẫn đến việc tiêu diệt các VSV có lợi trong ruột Để khắc phục điều này, người ta thường bổ sung các VSV có lợi thông qua sử dụng probiotic Các VSV probiotic sẽ phát triển, chiếm ưu thế trong đường

ruột bằng cách cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng và khối lượng các

chất được sản sinh Từ đó, ức chế và tiêu diệt được VSV gây hại, thiết lập lại sự cân bằng hệ

VSV đường ruột

dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật nuôi với liều lượng thích hợp

(1,2 tỷ CFU/ kg thức ăn/ ngày), sự cân bằng của hệ VSV đường ruột được duy trì [7], [13], [23], [56]

 Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn

Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lượng cạnh tranh

vị trí bám với VK gây bệnh, chúng còn tác động nhờ vào khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như KS, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, acid béo,

bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn [53] Những chất này có tác dụng ức

chế và tiêu diệt các VK gây bệnh ở đường ruột

 Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột

Một số chủng VSV probiotic khi được bổ sung vào đường tiêu hóa có vai trò tăng

cường hoạt động chuyển hóa của một số chủng VK đường ruột khác Chẳng hạn như khi sử

dụng L rhamnosus dưới dạng sữa lên men, chúng kích thích hoạt động enzyme và khả năng

biến dưỡng của VK đường ruột [56]

 Điều hòa phản ứng miễn dịch

Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng điều hòa phản ứng miễn dịch thông qua ảnh

hưởng lên lympho bào B Như khi cho chuột sử dụng L plantarum ATCC 14917 và L

fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hóa P

3

P

H - thymidine trong tế bào lách ở

cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [56]

Ngoài ra, VSV probiotic còn tác động lên hệ tiêu hóa của người cũng như vật nuôi

bằng những cơ chế khác, như đồng hóa lactose trong sữa, Sự không dung hòa lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người thiếu khả năng sản xuất enzyme lactase hay β-galactosidase Lactase cần thiết để đồng hóa lactose trong sữa, phân giải chúng thành các phân tử đường glucose và galactose đơn giản Các cá thể thiếu lactase sẽ không tiêu hóa được sữa và thường gây ra những khó khăn trong quá trình tiêu hóa, đặc biệt ở trẻ sơ sinh Triệu chứng thường thấy là khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp bẻ, đầy hơi, nôn và buồn nôn,… khi dùng sữa Một vấn đề khác có liên quan đến việc không dung hòa lactose là tình

trạng thiếu canxi do không dùng sữa Ngoài ra, VK khu trú trong ruột kết không lên men tiêu hóa được lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây ra các triệu chứng như đau bụng, sưng phù

và tiêu chảy [22]

Các dòng probiotic đã được chứng minh là có thể giải quyết vấn đề không dung hòa được lactose nhờ khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ β-galactosidase ở ruột non Do

vậy, người ta cho các bệnh nhân không dung hòa được lactose sử dụng probiotic Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ được đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [53]

1.1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm probiotic

Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau Một trong

những chế phẩm probiotic được biết đến phổ biến với tên thường gọi là “men vi sinh” Chúng tồn tại ở các dạng như cốm, bột, lỏng, viên nén,… chứa VSV có thể ở dạng sống,

chết đông khô, xác VK Các sản phẩm probiotic có thể phối hợp nhiều chủng VK (như L

acidophilus, L sprorogenes, L kefir, Streptococcus faecalis,…) hoặc chỉ sử dụng một

chủng VK ( như L acidophilus hay L sprorogenes,…) [12], [49]

Một số chế phẩm thông dụng ở dạng men tiêu hóa trên thị trường hiện nay như Antibio (Hàn Quốc), Probio (Việt Nam), Acidophilus (Mỹ), Biolactyl (Việt Nam), Lactéol (Pháp), Bio - acimin (Việt Nam), Biolactyl (liên doanh Pháp), L – bio - 3D (Việt Nam),

đường tiêu hóa, một số hạn chế do điều trị bằng KS dài ngày mang lại, điều trị tiêu chảy

cấp, tăng cường khả năng miễn dịch,…

Tuy nhiên, thực tế cho thấy chất lượng các chế phẩm probiotic trên thị trường hiện nay đang là một vấn đề đáng lo ngại

Theo Yeung P.S.M và cộng sự, có một số sản phẩm thương mại probiotic ghi trên nhãn không đúng với nội dung (xem bảng 1.1), có đến 28/44 sản phẩm nghiên cứu có tên không đúng với nội dung ghi trong nhãn, trong đó có 9/16 sản phẩm trên nhãn là L

acidophilus nhưng khi kiểm nghiệm bằng phương pháp lên men carbonhydrat lại cho kết quả là một loài khác [9], [58]

Bảng 1.1 Kết quả khảo sát một số chế phẩm probiotic [58]

faecium; S cerevisiae; L rhamnosus

Lên men carbonhydrat

Theo kết quả kiểm tra mới đây (2011) của Thanh tra Sở Y tế Tp Hồ Chí Minh:

men thực chất chỉ là bột mì có chứa độc tố [66]

Theo kết quả kiểm nghiệm thuốc của tác giả Phạm Hùng Vân (2007) thì có đến 4/10

chế phẩm probiotic cho người đã sử dụng không đúng chủng được ghi trên nhãn thuốc Đặc biệt, các sản phẩm này đã bổ sung nhầm VK gây hại vào các chế phẩm probiotic Điển hình

là chế phẩm Biosubtyl DL (dạng gói bột do Viện Vắc xin Đà Lạt sản xuất) và chế phẩm Subtyl (dạng viên nén, sản xuất tại Việt Nam) Hai chế phẩm đã ghi thành phần trên nhãn là

vi khuẩn B subtilis, nhưng thực tế lại là Bacillus cereus, một loài VK gây bệnh đường tiêu

hóa do có nhiều dòng mang độc tố gây nôn ói và tiêu chảy sau khi uống sớm nhất là nửa tiếng [17], [67]

Theo kết quả nghiên cứu khác của tác giả Nguyễn Thị Minh Tâm (2008): có 4/14 chế

phẩm probiotic khảo sát đã công bố trên nhãn là L acidophilus nhưng kết quả định danh

bằng API50CHL cho thấy VK phân lập được không liên quan đến loài này [9]

Kết quả kiểm nghiệm thuốc mới đây của Cục Quản lý Dược cho biết 2 loại men tiêu hóa: thuốc bột Biolac (lô sản xuất 030710, ngày sản xuất 15/7/2010, có hạn dùng 14/7/2012,

số đăng ký QLSP-0046-08) và thuốc viên nang Biolac 500mg (lô sản xuất 321210, ngày sản xuất 10/12/2010, hạn dùng 9/12/2012, số đăng ký QLSP-0046-08) không đạt tiêu chuẩn chất lượng về định tính, độ nhiễm khuẩn và độ đồng đều khối lượng Do vậy, Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế có quyết định đình chỉ lưu hành và yêu cầu thu hồi trên toàn quốc [65]

Tác dụng và hiệu quả lâm sàng của các chế phẩm probiotic phụ thuộc gần như hoàn toàn vào đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng VSV được sử dụng Chỉ những loài nào đã được nghiên cứu lâm sàng đầy đủ mới bảo đảm an toàn và lợi ích sử dụng được chứng minh

một cách khoa học Vì vậy, việc công bố sai danh pháp của VSV trong chế phẩm probiotic

là một điều không thể chấp nhận được Để bảo đảm quyền lợi cho người tiêu dùng, cần phải

có một tiêu chuẩn kiểm tra các sản phẩm chức năng mà trong đó chỉ tiêu định danh phải được quan tâm đúng mức, xây dựng đủ cơ sở khoa học cho công tác kiểm nghiệm

1.2.Vi khuẩn LACTIC

1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và phân loại

Nhìn chung vi khuẩn lactic là vi khuẩn GP

+

P, không tạo bào tử, kị khí tùy ý và hầu hết không di động Chúng thuộc loại đa khuyết dưỡng, được tìm thấy trong nhiều loại thực

phẩm lên men như sữa chua, kim chi, dưa muối chua, nem chua,… LAB tồn tại khá hạn chế trong một số MT do nhu cầu dinh dưỡng cao của nó [10]

Về mặt hình thái, các nhóm LAB tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hình que hoặc hình cầu [10]

Về mặt sinh lí, chúng tương đối đồng nhất: thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrat và tiết ra acid lactic Khác với các VK đường ruột sinh acid lactic, LAB là nhóm kị khí không bắt buộc, chúng không có cytochrome và enzyme catalase Tuy nhiên, chúng vẫn có thể ST được khi có mặt oxy do có enzyme peroxidase [18]

Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, Streptococcaceae, thuộc:

Nhóm LAB được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm thuộc về các chi như

Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus Trong đó Lactobacillus chiếm vị

trí quan trọng nhất [4], [6], [15], [57], [59]

 Lactobacillus [24], [27], [65]

Giống Lactobacillus có dạng hình que, thường tồn tại từng tế bào riêng rẽ hay dạng

chuỗi, kích thước tế bào dao động từ 0,5-1,2 x 1-10 µm tế bào không di động, GP

+

P, không sinh bào tử Chúng là dạng kị khí không bắt buộc, có thể tăng trưởng ở nhiệt độ từ 5P

Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus rất phức tạp cần phải có nguồn cacbonhydrat,

acid amin, peptit, các este của acid béo, dẫn xuất của các acid nucleic,

vitamin và khoáng chất Giống Lactobacillus không tổng hợp được porphyrinold nên không

có các hoạt tính hoạt động phụ thuộc nhân heme, do đó hoạt tính catalase âm tính Tuy nhiên, có một vài chủng có thể sử dụng porphyrinold từ MT nên có hoạt tính catalase dương

tính (L mali), có cytochrom và có thể khử được nitrat (Meisel, 1991)

Lactobacillus có thể sử dụng glucose để lên men đồng hình (sản phẩm cuối cùng có hơn 85% là acid lactic) hay lên men dị hình (sản phẩm cuối cùng gồm acid lactic, COR 2 R, etanol) Sự hiện diện của oxy hay các tác nhân oxy hoá khác như acetat có thể tạo thành lactat Một số chất như citrat, malat, tartrat, quinolat, nitrat, nitrit,… cũng được chúng sử

dụng như nguồn năng lượng trong quá trình trao đổi chất hoặc đóng vai trò như chất nhận electron

Lactobacillus bao gồm 25 loài được chia thành 3 nhóm chính dựa vào sản phẩm cuối cùng tạo thành là:

- Nhóm I: lên men đống hình bắt buộc

- Nhóm II: lên men dị hình tuỳ ý

- Nhóm III: lên men dị hình bắt buộc

Bảng 1.1 Phân loại Lactobacillus [59]

+ + + +

M ột vài đại diện

Ghi chú: -: không có khả năng +: có khả năng

Một điều đáng chú ý là việc xác định chính xác các loài của giống Lactobacillus

không chỉ dựa vào đặc điểm sinh lí Pot và cộng sự (1994) đã cung cấp một số phương pháp

xác định Lactobacillus như phân tích thành phần DNA hay RNA (bằng lai phân tử hay giải

trình tự), rRNA là đích của các mẫu dò DNA được sử dụng để xác định các loài Người ta cũng sử dụng phương pháp điện di SDS –PAGE toàn bộ protein của tế bào dưới những điều

kiện chuẩn để xác định chính xác các loài

Một số loài thuộc chi Lactobacillus thường sử dụng để tạo chế phẩm probiotic cho người như: L acidophilus, L bulgaricus, L casei, L kefir, L delbruckii, L sporogenes,…

 Lactobacillus acidophilus

Là vi khuẩn probiotic có mặt trong hầu hết các men tiêu hóa Lần đầu tiên được phân

lập bởi Moro (1990) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật Có dạng hình que kích thước

từ 0,5-1 x 2-10 µm, là vi khuẩn GP

+

P, đi theo cặp hoặc dạng chuỗi ngắn Đây là LAB ưa nhiệt,

có thể đề kháng được 40 loại kháng sinh [46]

L acidophilus như là một probiotic lên men đồng hình và dị hình sống trong đường

ruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài lên men đồng hình, tạo thành nhóm gọi là phức hợp L acidophilus [46] Các thành viên của nhóm này tạo điều kiện

thuận lợi cho sự phát triển bình thường của hệ VSV trong đường ruột Cơ chế tác động bao

gồm:

- Duy trì hệ vi sinh vật bình thường trong đường ruột

- Tác động lên hệ VSV gây bệnh

- Điều hoà khả năng miễn dịch

- Hoạt tính chống đột biến và chống ung thư

- Làm mất sự liên kết của các acid mật

- Tạo enzyme lactase

- Làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh [59]

 Lactobacillus bulgaricus

Đây là loài VK quen thuộc, cư trú thường xuyên trong ruột người và động vật, cùng

với các loài VK khác tạo thành một khu hệ VSV không thể thiếu L bulgaricus đã được ứng

dụng cho lên men sữa chua từ rất lâu [28]

- Chúng có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, salicin Trong quá trình lên men chúng tạo thành acid L-lactic

với nồng độ khoảng 180 g/l trong tổng số 210 g/lacid lactic [28]

 Lactobacillus kefir

L kefir có chứa nhiều tryptophan là một trong những acid amin quan trọng có tác

dụng an thần Ngoài ra, chúng cũng có thể cung cấp nhiều Ca và Mg, là những khoáng

chất rất quan trọng cho hệ thần kinh Chúng cung cấp photpho, carbonhydrat, chất béo và các protein giúp tế bào cơ thể phát triển và duy trì năng lượng Trong thành phần tế bào

VK còn chứa nhiều vitamin B1, B12, K rất tốt cho da [28]

 Lactobacillus delbruckii

- L delbruckii có thể lên men được các loại đường glucose, maltose, fructose, galactose và dextrin Chúng không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, trehalose, inulin, mannitol

- L delbrukii sản xuất 90% là acid L- lactic từ nguồn đường glucose Trong thành

phần tế bào có chứa các chất khoáng, acid amin quan trọng giúp cơ thể nhanh chóng hồi

phục sức khỏe [28]

 Lactobacillus sporogenes

- Vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và biến dưỡng của con người Ổn định ở nhiệt độ phòng, tăng sinh rất nhanh trong ruột

- Quá trình lên men tạo acid L (+) lactic, cung cấp phức hợp vitamin B và các

enzyme tiêu hóa như protase, lipase, amylase, lactase,… Chúng cũng sản xuất bacteriocin, giúp kiểm soát sự tăng trưởng vượt mức của những nhóm VSV gây thối trong ruột, duy trì

sự cân bằng pH acid [28]

 Streptococcus

Tế bào hình cầu hay oval, đường kính nhỏ hơn 2µm, xếp thành dạng đôi hay chuỗi

ngắn hoặc dài, ưa ấm, nhiệt độ thích hợp khoảng 37P

0

P

C Có khả năng phân giải nhiều loại đường như glucose, mantose, lactose Chúng góp phần tạo nên hương vị và chất lượng cho

Streptococcus faecalis khi k ết hợp với các chủng LAB khác như L acidophilus và

C Chúng có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí hoặc kị khí, 6,5% NaCl,

gelatin Lên men lactic đồng hình tạo ra lượng acid khoảng 90 - 95% Trong điều kiện pH trung tính, VK này còn tạo ra một số chất có khả năng kháng khuẩn như ethanol, acid acetic, diacetyl, HR 2 ROR 2 R Đặc biệt, một số chủng còn có khả năng sinh bacteriocin dạng cytolysin, streptococin và nisin [15],[59] Bên cạnh đó, tốc độ sinh trưởng của chúng rất lớn Do đó,

áp đảo nhanh VK gây tiêu chảy và các bệnh đường ruột khác [28]

 Pediococcus

Các dòng Pediococcus được tìm thấy trong thực phẩm, thực vật Chúng sản xuất acid lactic và được dùng chủ yếu trong lên men dưa cải, nước ủ rượu, bia và hèm rượu Là dòng LAB đặc biệt, giúp cân bằng hệ VK đường ruột [21]

1.2.2.Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy acid lactic trong

môi trường Có thể tóm tắt theo phương trình sau:

- Nhóm VK lên men dị hình: sản phẩm tạo ra ngoài acid lactic còn có ethanol,

COR 2 R,…

 Lên men lactic đồng hình

(Embden-Meyerhof–Parnas) và cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (90 - 98%) Chỉ một phần nhỏ pyruvate được decacboxyl hóa và chuyển thành acid acetic, ethanol, aceton và COR 2 R Mức độ

tạo thành các sản phẩm phụ thuộc vào sự có mặt của oxy

 Phương trình tóm tắt

CR 6 RHR 12 ROR 6 R + 2ADP + 2Pi 2CHR 3 RCHOHCOOH + 2ATP

Một số LAB lên men đồng hình thường gặp là Lactococcus lactis, L acidophilus, L

casei, L cremoris, L hevelticus, L delbrueckii, Streptococcus lactis, S thermophilus, P cerevisiae [57]

 Lên men lactic d ị hình

Vi khuẩn lactic lên men dị hình do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và triozophosphat – merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose

xảy ra theo con đường PP (pentose - phosphat) Quá trình chuyển hóa trizophosphat thành acid lactic giống như lên men đồng hình

Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài acid lactic (40%), còn có các sản

phẩm khác như acid succinic, ethanol (20%), acid acetic (10%), các chất khí còn lại (20%) [57]

 Phương trình tóm tắt

CR 6 RHR 12 ROR 6 R CHR 3 RCHOHCOOH + CHR 3 RCHR 2 ROH + COR 2 R + xKcal

Glucose Acid lactic Ethanol

Một số LAB lên men dị hình thường gặp là Leuconostoc mensenteroides, Leuconostoc

cremoris, L brevis, L fementum,… [4], [6], [57]

1.2.3 Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic

Vi sinh vật được sử dụng trong hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là LAB, do chúng mang những đặc điểm ưu việt vốn có thích hợp cho việc tạo chế phẩm probiotic Tuy nhiên, không phải bất kì LAB nào cũng được ứng dụng làm probiotic Những

chủng LAB được chọn phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau:

- Là VK hiện diện bình thường ở ruột của người, ST và phát triển nhanh

Glucose Acid lactic

- Là VK chịu được pH thấp nên có thể sống được khi qua dạ dày

- Lên men lactic làm giảm pH môi trường sống, ức chế sự phát triển của VSV gây

bệnh khác

- Có khả năng làm mất sự liên kết của các acid mật nên chịu acid mật tốt

- Đề kháng được kháng sinh

- Tạo enzyme lactase giúp đồng hóa được đường lactose trong sữa

- Làm tăng quá trình tiêu hoá thức ăn, tăng hấp thu chất dinh dưỡng

- Sản sinh một số chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh

- Điều hoà khả năng miễn dịch

- Làm giảm lượng cholestrol trong huyết thanh [59]

- Hoạt tính chống đột biến và chống ung thư

1.2.4 Vai trò probiotic - lactic đối với người

 Phòng ng ừa, chữa trị bệnh tiêu chảy và sự nhiễm trùng VK ở dạ dày, ruột

95% trẻ em được sử dụng sẽ giảm thời gian tiêu chảy trong 1 ngày Ảnh hưởng L

rhamnosus rõ ràng sau ngày đầu tiên chữa trị Bệnh nhân có sử dụng L rhamnosus sẽ ít nôn

máu sau ngày thứ hai chữa trị [2], [13], [31], [56]

Trong một nghiên cứu khác cho thấy, ở những trẻ em bị tiêu chảy do Rotavirus, Rotavirus nhân lên trong tế bào hình trụ, làm cho phần đỉnh của nhung mao bị bào mòn dẫn

đến một phần màng nhầy của ruột bị phá hủy Sử dụng L acidophilus và L reuteri sẽ làm

giảm ½ số trẻ em bị nhiễm và giúp tăng cường hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể (IgA là kháng thể sản sinh nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiện chức năng

chống VK trên bề mặt niêm mạc) [2], [13], [15], [56]

 Vai trò probiotic - lactic đối với sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa

Vi sinh vật probiotic – lactic có vai trò quan trọng đối với việc đồng hóa lactose và protein trong sữa, nhờ khả năng khả năng sản sinh enzyme lactase và protease

Trong cơ thể, đường lactose dưới tác dụng của enzyme β-galactosidase sẽ bị phân

giải thành glucose và galactose Các loại đường này sẽ dễ dàng được hấp thụ qua ruột non vào máu Khi thiếu hệ thống enzyme này đường lactose không được tiêu hóa sẽ chuyển

xuống ruột già Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi những VK đường ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng Điều này gây bất lợi cho việc tiêu hóa sữa Nhưng nếu thay

sữa bằng sữa lên men, lượng lactose giảm đi, đồng thời enzyme β-galactosidase được tăng cường bởi LAB, sẽ làm giảm đi những triệu chứng của bệnh này Vì vậy, sự hấp thu lactose

ở những người sử dụng yaourt tốt hơn những người sử dụng sữa [15], [23], [56]

Ngoài ra, probiotic - lactic còn được biết đến với vai trò điều trị một số bệnh khác như làm giảm lượng cholesterol trong máu,… Chẳng hạn, khi sử dụng yaourt với liều lượng thích hợp, hàm lượng cholesterol trong cơ thể sẽ giảm Ảnh hưởng này xuất hiện chậm và kéo dài khoảng 6 ngày sau khi ngừng sử dụng yaourt Cơ chế này có liên quan đến sự tổng

hợp protein điều hòa Tác nhân này có thể là hydroxymethyl glutarat [15], [56]

Đối với một số bệnh nhân bị các bệnh về gan mãn tính Có thể sử dụng L

acidophilus để cải thiện tình trạng bệnh của họ [15], [23]

Candida ở trong phân cao (10P

tiền ung thư thành chất gây ung thư [4], [56]

Khi cho bệnh nhân ung thư cổ tử cung và bệnh nhân ung thư bàng quang sử dụng L

casei Shirota với một liều thích hợp, chúng sẽ giúp tăng cường thoái hóa khối u trong sự điều trị phóng xạ, giúp kéo dài sự sống, ngăn chặn giảm bạch cầu trong trong thời gian chữa

trị, ngăn chặn sự tái trở lại của khối u [15], [48], [56]

Bên cạnh đó, probiotic còn có khả năng ngăn chặn bệnh tiểu đường và bệnh cao huyết áp Kết quả nghiên cứu trên chuột cho thấy, khi cho chuột sử dụng L casei sẽ làm

giảm tỷ lệ tiểu đường của chuột nhưng L casei (LEx) không ảnh hưởng trên

chuột bình thường [56]

L acidophilus còn có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào khối u, làm giảm nguy cơ ung thư do ngăn cản sự chuyển hoá cá tác nhân tiền ung thư thành ung thư Trong

một nghiên cứu ở gà cũng thấy rằng L acidophilus cũng ức chế các VK gây bệnh như S

aureus, Salmonell typhimurium cũng như E coli [5]

1.2.5 Vai trò probiotic lactic đối với vật nuôi

 C ải thiện tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn

Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho người sản xuất Phần lớn các chế phẩm probiotic đều bao gồm một hoặc nhiều chủng

Ch ỉ tiêu Đối chứng Lactobacillus S faecium Acid lactic

thức ăn 1250mg/kg thức ăn 220mg/kg thức ăn

Heo con: Tăng trọng

Heo trưởng thành:

Virut, mầm bệnh

VK, kháng nguyên, phóng xạ

Ruột

Tiêu chảy

Rối loạn tính thấm

Bình thường hóa nhờ

vi khuẩn lactic

Hình 1.1 Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường

tiêu hóa (Selminen, 1998)

Tăng trọng trung bình

Điều này cho thấy, khi sử dụng L acidophilus với liều lượng 750 mg/kg thức ăn đối

với heo 4 tuần tuổi, đã làm cho heo tăng trọng bình quân mỗi ngày là 0,159 kg và tăng khả năng chuyển hóa thức ăn Acid lactic cũng giúp heo gia tăng khối lượng cơ thể nhưng nó không có tác dụng trên heo trưởng thành [15]

Tóm l ại, hệ VSV đường ruột của động vật trong đó các LAB có một vai trò quan

trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ Nó sản sinh nhiều acid lactic, acid acetic, acid pyruvic, acid propionic, chuyển pH ruột sang acid, do đó có tác dụng ức chế VSV gây bệnh đường ruột Ngoài ra, nó còn có vai trò quan trọng là tổng hợp vitamin nhóm

B, vitamin nhóm K, sản sinh các enzyme (amylase, pectinase, cellulose) làm tăng khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng [15]

mẹ (từ 1 - 21 ngày tuổi) Nhưng heo con sử dụng VBP có sức khỏe tốt và lớn nhanh hơn

[15], [23], [56], [48]

Bên cạnh đó, độc tố đường ruột được sinh ra bởi các VK gây bệnh có thể được trung hòa bởi probiotic Những nghiên cứu có liên quan đến L bulgaricus cho thấy, VSV này sản

sinh một chất trao đổi trung hòa có tác dụng đối với độc tố ruột được giải phóng ra từ

Coliform ho ặc E coli, mặc dù chất trung hòa chưa được nhận diện (Metchell và Kenworthy,

1976) Hoặc là khi cho heo con sử dụng 500ml sữa nuôi cấy có L bulgaricus/ 1 khẩu phần

ăn, nó làm giảm tỷ lệ E coli ở trực tràng Từ đó làm giảm tỷ lệ chết trên heo con [7], [15],

[56]

1.2.6 Cơ chế tác động của probiotic – lactic

Vi sinh vật probiotic được sử dụng phổ biến hiện nay chủ yếu là các lợi khuẩn lactic Các LAB sau khi được bổ sung vào cơ thể chủ chúng tác động lên vật chủ thông qua nhiều

cơ chế khác nhau Trong đó, hai cơ chế chính là cạnh tranh vị trí bám với VSV và khả năng

sản sinh nhiều chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế, tiêu diệt VSV gây bệnh nhằm duy trì

sự cân bằng hệ VSV đường ruột

Một trong những tác động chính là khả năng cạnh tranh và ức chế các VSV gây bệnh

của các vi sinh vật probiotic – lactic Một số nghiên cứu cho thấy, khi cho heo Large White

sử dụng L fermentum 14 kết hợp với S salivarius 312, sẽ làm giảm số lượng lớn E coli

trong dạ dày và tá tràng Khi chỉ dùng L fermentum 14, cũng có tác dụng làm giảm số lượng

E coli trong dạ dày [56]

Hoặc trong nhiều nghiên cứu khác cho thấy, khi cho những bệnh nhân rối loạn tiêu hóa sử dụng probiotic chứa thành phần vi khuẩn L acidophilus, B bifidum và B breve sẽ làm gia tăng số lượng của Lactobacillus và giảm số lượng của E.coli trong ruột Còn khi cho

bệnh nhân bệnh bạch cầu sử dụng Bifidobacterium sp và L acidophilus, hệ VK đường ruột

và nấm men sẽ được phục hồi Vì khi sử dụng thuốc chữa trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một

số VSV có lợi trong đường ruột [15], [56]

Một cơ chế tác động khác của vi khuẩn probiotic - lactic là tác động vào hệ tiêu hóa

vật chủ thông qua sản sinh nhiều chất có hoạt tính kháng khuẩn cao như sản sinh nhiều acid

hữu cơ nồng độ cao, sản sinh bacteriocin, HR 2 ROR 2 R, ethanol,… Cụ thể:

 Trong nhiều nghiên cứu cho thấy, LAB có hoạt tính kháng khuẩn trên diện rộng Trong số các hoạt tính này, khả năng sản xuất acid lacticvà acid acetic được xem là quan

trọng nhất [53] Trong khi các LAB lên men đồng hình chủ yếu sản sinh acid lactic thì nhóm LAB lên men dị hình tạo ra cả những acid hữu cơ khác như acid acetic, acid formic, acid propionic,… Những acid này làm giảm pH của MT và khi pH thấp đạt đến

một mức nào đó sẽ đủ để loại trừ những VSV gây hại trong đường ruột Chẳng hạn như các VSV gây bệnh như E.coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella

typhimurium, S cholerasuis (gây sốt thương hàn),… Ngoài ra, một số LAB còn tạo ra ethanol có vai trò ức chế một số loài vi khuẩn cạnh tranh, dù đó là sản phẩm chiếm tỷ lệ

thấp trong quá trình lên men [1], [3], [4], [7]

 Bên cạnh khả năng sản sinh các acid hữu cơ, LAB còn được biết đên bởi khả năng

sản sinh bacteriocin Theo Maria E C Bruno và cộng sự “Bacteriocin của LAB là các

phân t ử protein mang điện tích dương, kích thước nhỏ (từ 30 – 60 acid amin), trung tính,

có điểm đẳng điện cao và khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với

ch ủng VK sinh bacteriocin đó” [15]

Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn

+

P, MgP

2+

P

bị ức chế và cuối cùng dẫn đến giết

chết tế bào VSV nhạy cảm với bacteriocin đó

Cơ chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt như sau: bacteriocin được hút bám trên màng tế bào VSV nhạy cảm với nó, tác động lên màng tế bào này và làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất, gây những tổn thương không thể khắc phục được Sau

đó, bacteriocin dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm thay đổi pH nội bào, dẫn đến phá vỡ

hoặc làm suy giảm động lực proton, đồng thời gây ra sự thoát các acid amin tiền tích tụ trong tế bào và các thành phần nội chất khác của tế bào ra ngoài MT thông qua các lỗ

thủng trên màng tế bào Cuối cùng tế bào chết do mất năng lượng [15]

 Ngoài ra, còn một số chất kháng khuẩn khác như HR 2 ROR 2 R: Một số chủng LAB có thể

tạo HR 2 ROR 2 R(hydrogen peroxyde), như L lactis, Leuconostoc cremoris có thể sản sinh

HR 2 ROR 2 R khi chuyển từ MT kị khí sang hiếu khí Vì LAB không có catalase nên trong điều

kiện có oxygen, chúng sẽ sinh ra HR 2 ROR 2 R Năm 1951, Whater và đồng nghiệp đã chứng minh khả năng ức chế S aureus của L lactis nhờ khả năng sinh H2O2 [1], [3], [4]

 Kháng khuẩn do sinh diacetyl: diacetyl là chất có khả năng ức chế sự phát triển

của nhiều VSV gây bệnh Hoạt tính ức chế này tăng lên trong MT acid, ức chế mạnh hơn đối với vi khuẩn GP

-P

và nấm mốc, đặc biệt với M turberculosis ( vi khuẩn lao) Tuy

nhiên, nồng độ tối thiểu có tác dụng của chúng thường cao hơn mức thường thấy trong

thực phẩm Vì vậy, tác dụng riêng diacetyl không thể giải thích cho khả năng kháng khuẩn của LAB [1], [3] [4], [15]

Ngoài ra, một số LAB còn tác động thông qua việc điều hòa phản ứng miễn dịch và tăng cường hoạt động chuyển hóa của VK đường ruột [15], [56]

1.2.7 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, trong lĩnh vực chế biến bảo quản thực phẩm, đặc

biệt được ứng dụng trong lĩnh vực y dược học,… Có thể kể đến một vài ứng dụng như sau:

thường sử dụng là L bulgaricus, L delbrueckii [15]

+ Ứng dụng LAB để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa, có thể kể đến một vài sản

dụng nhất là L bulgaricus, S lactic, S thermophilus [4], [15], [49]

+ Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi, thông qua việc người ta bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng để cung cấp hàm lượng canxi cho cơ thể

chua, muối chua quả, sản xuất tương,…

+ Ứng dụng LAB trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống như việc

sử dụng LAB để ủ chua thức ăn gia súc Trong quá trình lên men ngoài sản phẩm acid lactic còn có một số chất có giá trị như chất thơm, vitamin, KS làm tăng giá trị về mặt dinh dưỡng Các chủng thường được sử dụng là L plantarum, Leuconostoc mesenteroides [15]

+ Một số chủng LAB có khả năng tạo bacteriocin ức chế sự sinh trưởng một số VSV khác Do đó, có thể ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

Đặc biệt, một trong những ứng dụng của LAB đã và đang thu hút nhiều nhà nghiên

ứng dụng chữa bệnh đường ruột người cũng như vật nuôi

Ngày nay, dựa vào sự hiểu biết các đặc tính quan trọng của LAB như khả năng chịu acid, chịu mật, đề kháng kháng sinh, sử dụng được lactose, hoạt tính proteinase, cơ chế phòng thủ bacteriophage (thực khuẩn thể) và sản xuất bacteriocin, Con người đã biết sử

dụng hiệu quả LAB trong việc tạo ra nhiều chế phẩm probiotic hổ trợ đường tiêu hóa, điều

trị tiêu chảy giúp duy trì cân bằng hệ VSV đường ruột cho người cũng như vật nuôi

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Antibio Tropical Granule (Hàn Quốc): L acidophilus

2 Antibio Granule (Hàn Quốc): L acidophilus

3 Acidophilus (Mỹ): L acidophilus

4 Bio-acimin (Việt Nam): L acidophilus, B subtilis, Streptococcus feacalis

5 Bilactin (Việt Nam): L acidophilus

6 Biolactyl (liên doanh Pháp): L acidophilus, L casei, L bulgaricus, Streptococus

lactis

7 Biosubtyl DL (Việt Nam) chứa thành phần: L acidophilus, B subtilis

8 Bio vita plus (Việt Nam): L acidophilus, S faecalis, Bifidobacterium lactic

9 Lactomin Plus (Hàn Quốc): L acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus

faecalis

rhammnosus

11 Labido Plus (Việt Nam): L acidophilus, Bifidobacterium longum, S thermophilus,

L delbrueckii ssp, L paracasei ssp Paracasei

12 L- bio (Việt Nam): L acidophilus

13 L-Bio-3D (Vi ệt Nam): L acidophilus, Bifidobacterium longum, L rhammnosus

14 Lactéol (Pháp): Lactobacillus LB

15 Ρms-Probio (Việt Nam): L acidophilus

16 Ybio (Vi ệt Nam): L acidophilus

 Các ch ủng vi khuẩn kiểm định: B subtilis, E coli trong bộ sưu tập giống của phòng

thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Tp HCM

- S aureus, S aureus kháng methicillin, E coli kháng ampicillin, Klebsiella sp do

Trung tâm Sâm và Dược liệu TP HCM cung cấp

 Đĩa giấy kháng sinh chuẩn: Ampicillin (30 µg); tetramycin (30 µg); ciprothokacin

(30 µg); neomycin (30 µg); streptomycin (30 µg); ceftazidine (5 µg); kanamycin (30 µg); clindamycin (30 µg); erythromycin (30 µg); tobramycin (30 µg) do Công Ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam Khoa Tp Hồ Chí Minh cung cấp

 M ật heo: mua tại chợ Chợ Lớn – Tp Hồ Chí Minh

2.1.2 Hóa chất

- Cao nấm men, cao thịt, sữa gầy, tween 80 (Đức)

- Glucose, saccharose, lactose, galactose, maltose, manitol, pepton, NaCl, CaCOR 3 R, KOH, NaOH, HCl, phenol, acid lactic, phenolphthalein, gentian violet, KI (Trung

(Đức),…

 D ụng cụ: Ống nghiệm, đĩa peptri, bình tam giác, que gạt, que cấy, pipet, đầu típ các

loại, màng lọc Minisart,…

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

- [MT1] Môi trường cacbonateR Ragar: Dùng để khảo sát khả năng sinh acid tổng

Thành ph ần môi trường cacbonate agar (g/l):

+ Cao nấm men 5g + Glucose 20g + Calcium carbonate 10g

+ Agar 20g + Nước cất 1000ml

- [MT2] Môi trường MRS: Dùng để phân lập nuôi cấy và nghiên cứu các đặc tính của

vi khuẩn L acidophilus

Thành ph ần môi trường MRS (g/l):

+ Pepton 10g + Cao thịt 10g + Cao nấm men 5g + Glucose 10g + KR 2 RHPOR 4 R 2g + CHR 3 RCOONa 5g + (NHR 4 R)R 3 RCR 6 RHR 5 ROR 7 R 2g + MgSOR 4 R.7HR 2 RO 0,2g + Tween 80 1ml + Agar 20g + Nước cất 1000ml

- [MT3] Môi trường MPA: Dùng để nuôi cấy các vi khuẩn kiểm định

Thành ph ần môi trường MPA (g/l)

+ Pepton 5g + Cao thịt 5g + NaCl 5g + Agar 20g + Nước cất 1000ml

- [MT4] Môi trường MRS lỏng: dùng để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc tính của L

acidophilus Thành phần tương tự như MT2 nhưng không có agar

- [MT5] Môi trường Nutrient agar (NA): Dùng để nuôi cấy các vi khuẩn kiểm định

kháng lại các KS

- Thành ph ần môi trường NA (g/l):

+ Bacto - Beef Extract 3g + Bacto - Peptone 5g + Bacto - Agar 15g + Nước cất 1000ml

- [MT6] Môi trường thử khả năng di động của vi khuẩn lactic Thành

2.2.1 Xác định khả năng sinh acid tổng bằng MT cacbonat agar

 Mục đích: phân lập các chủng VK có khả năng sinh acid

 Nguyên tắc: do CaCO3 sẽ tan khi gặp acid, tạo vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc khi cấy VK trên MT carbonat agar

- Dùng que cấy lấy một ít dung dịch mẫu pha loãng

- Trải dịch pha loãng trên MT cacbonat agar [MT1]

- Ủ ở nhiệt độ 37P

0

P

C trong 3 ngày

- Chọn những khuẩn lạc có vòng tan CaCOR 3 R xung quanh

2.2.2 Phân lập từ môi trường MRS

M ục đích: phân lập LAB từ các chủng VK sinh acid ở trên

Quan sát hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MRS và quan sát hình thái tế bào VK trên kính hiển vi để đánh giá mức độ thuần khiết của chủng tuyển chọn

2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [14]

 Nguyên t ắc: VSV khi phát triển trên bề mặt các MT đặc trưng sẽ hình thành các dạng

khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó Sử dụng môi trường MRS là đặc trưng cho LAB

 Cách ti ến hành:

- Pha loãng dịch nuôi cấy VK đã hoạt hóa trên môi trường sau 24 giờ, ở nồng độ 10P

-3

P,

- Quan sát và nhận xét các đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước, tính chất bề mặt

của khuẩn lạc bằng kính hiển vi soi nổi

2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram [14]

Đối với LAB muốn quan sát hình thái tế bào, người ta làm phương pháp nhuộm Gram

 Nguyên t ắc: dựa vào khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc

nhuộm tím kết tinh và iốt, hình thành hai loại phức chất khác nhau

Lo ại 1: vẫn giữ nguyên màu sắc của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng

cồn VSV dạng này thuộc GP

+

P (bắt màu tím)

Lo ại 2: không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt

màu của thuốc nhuộm bổ sung VSV dạng này thuộc GP

-P (bắt màu hồng)

+ Đặt miếng giấy thấm lên vết bôi

+ Nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên giấy thấm giữ trong một phút

+ Nhỏ bổ sung lugol lên vết bôi, giữ trong một phút

+ Rửa bằng cồn 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước

+ Nhuộm bổ sung fuchsin kiềm 10 – 30 giây, rửa lại bằng nước Để khô và xem

lại tiêu bản với vật kính dầu x100

+ Ghi nhận khả năng bắt màu Gram của VK

2.2.5 Phương pháp khảo sát khả năng di động [15]

 Nguyên t ắc: dựa vào khả năng di chuyển của vi khuẩn trên MT bán lỏng có chất chỉ

VK trong MT, từ đó xác định khả năng di động của chúng

2.2.6 Phương pháp xác định kiểu hô hấp [15]

khác nhau

 Cách ti ến hành:

- Chuẩn bị các ống nghiệm thạch đứng chứa 10ml môi trường MRS agar Cấy các

chủng VK vào ống nghiệm bằng que cấy đầu nhọn theo phương pháp cấy trích sâu

- Nuôi ở nhiệt độ 37P

0

P

C trong 3 ngày Nhận xét sự ST của VK trong MT, từ đó xác

định quan hệ của chúng với oxy

2.2.7 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính catalase [43]

 Nguyên t ắc: nhằm phát hiện sự hiện diện của enzyme catalase trong VSV Dựa vào

khả năng sinh catalase và phân giải HR 2 ROR 2 Rcủa các chủng VSV

- Lấy một giọt canh khuẩn lên lame

- Bổ sung vài giọt hydrogen peroxid (HR 2 ROR 2) R lên giọt canh khuẩn

- Quan sát và ghi nhận kết quả:

+ Không có hiện tượng sủi bọt -> catalase âm tính

+ Có hiện tượng sủi bọt (do OR 2 R phóng thích) -> catalase dương tính

Đối chứng dương là B subtilis

2.2.8 Phương pháp xác định hoạt tính protease [15]

kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc

2.2.9 Phương pháp khảo sát khả năng sinh acid lactic [3], [11]

 Nguyên t ắc: acid lactic khi phản ứng với nhân phenol có trong thuốc thử Uphenmen

làm đổi màu thuốc thử, từ màu xanh tím sẽ chuyển sang màu vàng rơm Nhờ đó, xác định được VK có sinh acid lactic hay không

 Cách ti ến hành: