vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển phôi hợp tử của cây dừa cocos nucifera l

7 1.4 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng trái và phát triển phôi ..... 20 2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT TRONG

LU ẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT TRONG

Chuyên ngành : Sinh h ọc thực nghiệm

L ời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- PGS TS Bùi Trang Việt, Trưởng bộ môn Sinh lý thực vật, người đã gợi ý đề tài, hướng dẫn nghiên cứu và cho những lời khuyên bổ ích trong thời gian thực hiện luận văn

- TS Lê Thị Trung, người đã tận tình chỉ dẫn, bỏ nhiều công sức giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn Cô đã cho nhiều kinh nghiệm trong học tập và trong nghiên cứu khoa học

Xin chân thành c ảm ơn:

- TS Nguyễn Thị Bích Hồng, Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM, đã dành nhiều thời giờ quí báu đóng góp ý kiến, truyền đạt kinh nghiệm và cung cấp những tài liệu mới về cây dừa

- TS Trần Thanh Hương, ThS Phan Ngô Hoang, ThS Trịnh Cẩm Tú, ThS

Đỗ Thường Kiệt, ThS Trần Thị Thanh Hiền đã giảng dạy, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn

- Bạn Hồ Thị Mỹ Linh, phụ trách phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt luận văn

- Ông/Bà Chín Thãnh - vườn dừa ấp An Thạnh B, xã Mỹ Thạnh An, Tp Bến Tre - đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi làm việc tại vườn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm về trồng dừa, luôn động viên tinh thần để tôi hoàn thành luận văn

- Các Thầy/Cô giảng dạy Sau đại học đã truyền đạt nhiều kinh nghiệm, cung cấp nhiều kiến thức bổ ích giúp tôi nghiên cứu luận văn thật tốt

- Các Thầy/Cô trong Ban Giám Hiệu trường THPT Trần Quang Khải quận 11

và các đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên và hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt thời gian theo học Cao học

- Các anh chị Cao học khóa 19, các bạn Cao học khóa 20 và các em Cao học khóa 21 chuyên ngành Sinh lý thực vật ở trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

- Các bạn học đại học và các anh/chị học Cao học tại trường Khoa Học Tự Nhiên đang thực hành thí nghiệm tại phòng Sinh lí thực vật trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm

- Các bạn Mỹ Hiệp, Ngọc Mai, Tuyết Nhung và chị Quyên, học chung lớp Đại học Sư Phạm niên khóa 1998-2002, đã luôn quan tâm, giúp đỡ trong suốt thời gian tôi học Cao học

Con xin cám ơn gia đình đã vô cùng yêu thương, luôn bên cạnh động viên, quan tâm, giúp đỡ con về tinh thần và vật chất trong suốt thời gian con làm

lu ận văn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2012

Nguy ễn Thị Thanh

M ỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC ……… i

CÁC CHỮ VIẾT TẮT ……… iv

DANH MỤC CÁC BẢNG ………v

DANH MỤC CÁC HÌNH ………vii

DANH MỤC CÁC ẢNH……….viii

M Ở ĐẦU i

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây dừa Cocos nucifera L 3

1.1.1 Nguồn gốc cây dừa 3

1.1.2 Vị trí phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm sinh học 4

1.2 Sự thành lập và tăng trưởng trái 5

1.2.1 Nguồn gốc của trái và hột 5

1.2.2 Đường cong tăng trưởng trái 6

1.2.3 Sự tạo hột và phát triển phôi 6

1.3 Nuôi cấy in vitro phôi hợp tử 7

1.4 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng trái và phát triển phôi 8

1.4.1 Auxin 8

1.4.2 Cytokinin 9

1.4.3 Giberelin 10

1.4.4 Acid abcisic 11

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 13

2.1 Vật liệu 13

2.2 Phương pháp 14

2.2.1 Quan sát các biến đổi hình thái trong tự nhiên 14

2.2.2 Quan sát hình thái giải phẫu 15

2.2.3 Định lượng đường glucose bằng phương pháp quang phổ hấp thụ 17

2.2.4 Định lượng dầu bằng phương pháp cổ truyền 18

2.2.5 Đo cường độ hô hấp 18

2.2.6 Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 20

2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh lên sự phát triển trái dừa “dâu” ngoài thiên nhiên 23

2.2.8 Thử nghiệm nuôi cấy phôi hợp tử in vitro 23

2.2.9 Xử lý thống kê kết quả thu được 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 27

3.1 Quan sát các biến đổi hình thái trong tự nhiên 27

3.2 Quan sát hình thái giải phẫu 32

3.3 Hàm lượng đường glucose trong nước dừa 37

3.4 Hàm lượng dầu trong cơm dừa 38

3.5 Cường độ hô hấp của khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi và của phôi trái dừa “dâu” qua các giai đoạn phát triển 399

3.6 Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh 40

3.6.1 Trong trái dừa giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi 40

3.6.2 Trong nước dừa giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi 41

3.7 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh lên quá

trình phát triển trái dừa “dâu” ngoài thiên nhiên 43

3.8 Thử nghiệm nuôi cấy in vitro phôi hợp tử 47

3.8.1 Ảnh hưởng của tuổi phôi trong quá trình nuôi cấy phôi in vitro 47

3.8.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của phôi hợp tử 50

3.8.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển phôi và nảy mầm 53

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN 61

4.1 Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển phôi Error! Bookmark not defined 4.2 Sự thay đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và nhu cầu năng lượng trong sự phát triển phôi hợp tử 61

4.3 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát triển phôi 62

4.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh lên quá trình phát triển trái và sự rụng trái ngoài thiên nhiên 63

4.5 Về việc thử nghiệm nuôi cấy in vitro phôi hợp tử dừa “dâu” 633

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 655

5.1 Kết luận 65

5.2 Đề nghị 655

Tài li ệu tham khảo 666

Ph ụ lục 71

CÁC CH Ữ VIẾT TẮT

IAA : Indol acetic acid

ABA : Abcisic acid

Môi trường nuôi cấy Y3 bổ sung thêm các chất điều hòa tăng

trưởng thực vật với thành phần và liều lượng khác nhau

Sự thay đổi các chỉ tiêu nghiên cứu ở trái dừa qua các giai đoạn

Cường độ hô hấp của phôi giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi

Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong trái

dừa “dâu” giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi

Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong nước

dừa qua ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi

Chiều cao trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi

phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Chu vi trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi

phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Tỉ lệ rụng (%) của trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai

đoạn sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Tỉ lệ sống của phôi ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi sau 4

tuần nuôi cấy

Trọng lượng phôi (giai đoạn trái 12 tháng tuổi) sau một tháng

nuôi cấy trên ba môi trường khác nhau

Khả năng nảy mầm của phôi ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi sau

3.14

3.15

3.16

hai tháng nuôi cấy trên ba môi trường nuôi cấy khác nhau

Tỉ lệ phôi ở giai đoạn trái 12 tháng tuổi sống và phát triển sau

bốn tháng nuôi cấy trên ba môi trường nuôi cấy khác nhau

Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên trọng

lượng phôi sau khi nuôi cấy một tháng tuổi

Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả năng

nảy mầm của phôi sau ba và bốn tháng nuôi cấy

52

52

53

56

Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong trái

dừa giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi

Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong nước

dừa qua ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi

Chiều cao trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi

phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Chu vi trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi

phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Tỉ lệ rụng trái dừa “dâu” được theo dõi qua các giai đoạn sau khi

phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên trọng

lượng phôi sau khi nuôi cấy một tháng

Chiều cao chồi của cây non sau ba và bốn tháng nuôi cấy ở các

môi trường với hàm lượng và thành phần các chất điều hòa tăng

trưởng thực vật khác nhau

Chiều dài rễ của cây non sau ba và bốn tháng nuôi cấy ở các môi

trường với hàm lượng và thành phần các chất điều hòa tăng

Cây dừa “dâu” bốn tuổi trồng tại vườn ở Bến Tre

Vị trí cắt ngang và dọc trái dừa “dâu” với khúc cắt cô lập ngay vị

trí phôi

Phôi dừa “dâu” giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi

Trái dừa “dâu” giai đoạn 0, 1 và 3 tháng tuổi (đã bóc bỏ cánh)

với khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi

Trái dừa “dâu” giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi (đã bóc bỏ vỏ) cho

thấy vị trí phôi nằm ở “con mắt mềm” trong 3 mắt dừa

Vị trí phôi giai đoạn trái 6 tháng tuổi, phôi nằm trong phần cơm

Trái dừa “dâu” ở các giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi

Trái dừa “dâu” ở các giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi

Cắt dọc trái dừa “dâu” ở các giai đoạn 0, 1 và 3 tháng tuổi cho

thấy trái giai đoạn này là một khối đặc

Cắt dọc trái dừa “dâu” ở các giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi cho

thấy bề dày cơm dừa qua các giai đoạn

Màu sắc nước dừa giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi

Lát cắt ngang trái dừa “dâu” giai đoạn trái 0 tháng tuổi cho thấy

bầu noãn có ba ngăn (nc), mỗi ngăn chứa một noãn (n)

Lát cắt ngang trái dừa “dâu” giai đoạn trái 1 tháng tuổi cho thấy

Lát cắt dọc trái dừa “dâu” giai đoạn trái 1 tháng tuổi cho thấy

bầu noãn (b) và noãn (n)

Lát cắt dọc trái dừa “dâu” giai đoạn trái 1 tháng tuổi cho thấy

vùng chứa bầu noãn (b) và noãn (n)

Lát cắt dọc trái dừa “dâu” giai đoạn trái 1 tháng tuổi cho thấy

một trong ba noãn còn lại đã di chuyển vào trung tâm bầu noãn

và phát triển thành hột

Phóng to lát cắt dọc trái dừa “dâu” giai đoạn trái 1 tháng tuổi

ngay vị trí của hột (h) cho thấy phôi (p) và cuống noãn (c)

Lát cắt dọc trái dừa “dâu” cuối giai đoạn trái 3 tháng tuổi cho

thấy nội nhũ lỏng (L) ở trong hột (h), cuống noãn (c)

Lát cắt dọc phôi dừa “dâu” giai đoạn trái 6 tháng tuổi nhờ

Lát cắt dọc ngay vị trí phôi của trái dừa “dâu” giai đoạn trái 12

tháng tuổi cho thấy cực chối (c) và cực rễ (r)

Phôi dừa “dâu” giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi lúc mới đem cấy

ở môi trường Y3

Phôi dừa “dâu” giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi sau khi cấy 2 tuần

tuổi ở môi trường Y3

Phôi dừa “dâu” giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi sau khi cấy 4 tuần

tuổi ở môi trường Y3

Phôi giai đoạn trái 12 tháng tuổi lúc đem cấy

Phôi sau một tháng nuôi cấy ở môi trường MS với 30 g/l đường

Phôi sau một tháng nuôi cấy ở môi trường Y3 với 30 g/l đường

Phôi sau một tháng nuôi cấy ở môi trường Y3 với 60 g/l đường

Phôi một tháng tuổi ở môi trường đối chứng

Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA

Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1mg/l BA

Phôi một tháng tuổi ở môi trường 1mg/l BA

Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l

BA

Phôi một tháng tuổi ở môi trường chứa 1mg/l IAA và 1mg/l BA

Phôi nuôi cấy ba tháng ở môi trường đối chứng

Phôi nuôi cấy bốn tháng ở môi trường đối chứng

Phôi nuôi cấy ba tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA

Phôi nuôi cấy bốn tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA

Phôi nuôi cấy ba tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l BA

Phôi nuôi cấy bốn tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l BA

Phôi nuôi cấy ba tháng ở môi trường 1mg/l BA

Phôi nuôi cấy bốn tháng ở môi trường 1mg/l BA

Phôi nuôi cấy ba tháng ở môi trường chứa 0,1mg/l IAA và 1mg/l

MỞ ĐẦU

Dừa (Cocos nucifera L.) là một trong các cây lấy dầu quan trọng nhất thế

giới với tổng diện tích khoảng 12 triệu ha được trồng tại 90 quốc gia dọc theo đường xích đạo, phân bố rộng từ 20 độ vĩ tuyến Bắc đến 20 độ vĩ tuyến Nam Cây

dừa cung cấp nguồn thực phẩm (chủ yếu là chất béo), nguyên liệu cho công nghiệp

chế biến hàng tiêu dùng và xuất khẩu Cây dừa được xem là cây của cuộc sống, là cây của 1001 công dụng, rất nhiều sản phẩm có giá trị được tạo ra từ vỏ dừa, gáo

dừa, cơm dừa, thậm chí từ lá dừa, thân dừa… Thực tế cho thấy, không có bất cứ

loại cây trồng nào cho con người nhiều loại sản phẩm như cây dừa (Võ Văn Long

và cs 2008)

Trong giới thực vật, dừa là một trong những loài có kích thước hột lớn Hột

dừa không trải qua thời kỳ tiềm sinh mà chín liên tục rồi nảy mầm, điều này gây khó khăn cho việc thu mẫu, bảo quản để nhân giống (Assy Bah 1986, Engelmann 1997)

Năm 1989, Việt Nam có 333.000 ha dừa, đạt sản lượng 1.200 triệu trái, đến năm 2004 chỉ còn 132.800 ha dừa Năng suất thấp đi là do các giống dừa bị lẫn tạp, thoái hóa, trồng không đúng kỹ thuật (Võ Văn Long và cs 2008)

Hiện nay, phôi hợp tử dừa được nuôi cấy trong ống nghiệm cho nẩy mầm và phát triển thành cây con, sau đó chuyển cây ra vườn Việc sử dụng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro để thu mẫu, trao đổi và bảo quản các giống dừa đã được nhiều nhà khoa

học ở nhiều quốc gia thực hiện như Pháp, Ấn Độ, Phillipines và Srilanka (Assy-

Bah 1986; Assy- Bah và cs 1989) cùng các tổ chức khoa học ở Châu Phi, Châu Á

và Châu Mĩ Latinh Mặc dù đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu nuôi cấy in

vitro phôi hợp tử dừa ở nhiều điều kiện môi trường khác nhau nhưng kết quả thu được chưa cao Vấn đề chính đặt ra hiện nay là phải tìm ra được điều kiện nuôi cấy thích hợp để cây non phát triển tốt (Engelmann 1997)

Các công trình nghiên cứu về nuôi cấy phôi dừa nhằm mục đích sử dụng công nghệ nuôi cấy phôi để nhân các giống dừa quý hiếm nhưng có tỉ lệ nảy mầm

rất thấp trong tự nhiên như dừa Dứa (Aromatic) hoặc dừa Sáp (Makapuno) Bên

cạnh đó, việc trao đổi giống dừa bằng nuôi cấy phôi trong ống nghiệm mà không trao đổi bằng quả hoặc cây sẽ đảm bảo an toàn, tránh được các loại sâu bệnh đi theo con đường nhập giống và có thể chuyên chở một lượng giống rất lớn nhưng ít tốn kém

Vì lí do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Vai trò của các chất điều hòa tăng

trưởng thực vật trong sự phát triển phôi hợp tử của cây dừa Cocos nucifera L.”

nhằm tìm hiểu các chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong quá trình phát triển phôi

hợp tử dừa để từ đó tạo ra một môi trường nuôi cấy hợp lí giúp phôi hợp tử phát triển thành cây non

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật trường Đại học

Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 10/2010 đến tháng 03/2012

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây dừa Cocos nucifera L

1.1.1 Ngu ồn gốc cây dừa

Hiện nay, các nhà khoa học vẫn chưa xác định được quốc gia nào trồng dừa đầu tiên Nhưng các giống dừa hoang được tìm thấy tại nhiều nước khác nhau trên các quần đảo ở Java, Inđonesia, Úc và Philipines (Batugal và Oliver 2003; Ohler 1984)

Dừa được phân bố ở nhiều châu lục trên thế giới như châu Á, châu Phi, châu

Mỹ cũng như một số quốc gia nhỏ và các đảo Dừa được phân bố rộng rãi là do quả khô rụng xuống, trôi theo dòng nước, sau một thời gian chúng bị sóng đánh vào bờ,

gặp điều kiện thuận lợi, dừa nảy mầm và phát triển thành cây Ở đảo Thái Bình Dương, người ta thấy có sự hiện diện của dừa cách đây hàng triệu năm, trước khi định cư ở đảo Polynesia Dừa cũng có một lịch sử lâu đời từ 2000 năm ở vùng duyên hải Srilanka và Nam Ấn Độ, còn ở Tây Phi và Nam Mỹ thì chỉ vào khoảng

500 năm trở lại (Nguyễn Thị Bích Hồng 2007; Harries 1978; Nuce1 de Lamothe 1977)

Một số nước trồng dừa trên thế giới: Cây dừa được trồng ở 93 quốc gia vùng nhiệt đới với tổng diện tích 12,05 triệu ha vào năm 2005, trong đó diện tích dừa của các nước châu Á – Thái Bình Dương là 10,62 triệu ha, chiếm 85,05% Sản lượng cơm dừa khô cả thế giới là 12,22 triệu tấn trong đó các nước châu Á – Thái Bình Dương chiếm 84,27% (Rethinam 2005)

1.1.3 Đặc điểm sinh học

Dừa là cây thích hợp với miền nhiệt đới Dừa “dâu” thuộc nhóm dừa lai Trái

cỡ hơi nhỏ, dạng trái tròn, ba khía không rõ rệt Trái hơi nhỏ nhưng xơ mỏng nên trái to, do đó mà lượng cơm dừa/trái khá Hàm lượng dầu cao nhất trong các giống

dừa hiện nay Dừa “dâu” trồng tốt cho mỗi năm 14-16 buồng, mỗi buồng từ 10-15 trái Khoảng 4500-5000 trái cho một tấn cơm dừa khô Tùy theo màu sắc vỏ trái dừa

ta có hai loại là Dâu đỏ và Dâu vàng (Arturo và cs 2000, Dương Tấn Lợi 2004)

R ễ

Rễ dừa thuộc loại rễ chùm, không có rễ trụ, hệ thống rễ chằng chịt Rễ gồm

có bầu rễ là phần thấp nhất của thân Bầu rễ có hình chóp ngược, rễ dừa phát sinh từ

bầu rễ Rễ có nhiệm vụ chủ yếu là giúp cây bám đất, hấp thụ nước và chất dinh dưỡng Hệ thống rễ phần lớn tập trung xung quanh thân trong vòng bán kính 1,5 – 2 mét và ăn sâu trong đất khoảng 0,75 – 1,0 mét, do đó mực nước thủy cấp cạn (quá 1 mét) thì hệ thống rễ không phát triển đầy đủ dẫn đến tình trạng sinh trưởng kém,

ngọn teo tóp Rễ có thể phân thành hai loại: rễ to (cấp 1) và rễ nhỏ (cấp 2, cấp 3)

Rễ cấp 1 xuất phát từ bầu rễ, lúc non có màu trắng ngà, khi già trổ sang màu nâu

Rễ cấp 2 xuất phát từ rễ cấp 1, rễ cấp 2 mang rễ cấp 3, tận cùng bằng chóp rễ (là cơ quan hấp thụ) (Nguyễn Văn Dõng 1962, Võ Văn Long và cs 2008)

Thân – Lá

Thân cây thẳng đứng, không có cành, phía gốc phình ra Thân có sẹo lá chia thân ra làm nhiều đốt Thân cao từ 16 – 25 m, chu vi từ 40 – 80 cm Tuy nhiên, sự phát triển chiều cao thân thay đổi tùy theo giống và điều kiện môi trường Lá mọc xoay vòng từ dưới lên trên Mỗi năm, cây dừa ra 15 - 20 tàu lá và cũng rụng đi 15 -

20 tàu Sẹo lá trên thân cũng biểu hiện khả năng sinh trưởng của cây Sẹo lá lớn và khít nhau chứng tỏ cây sinh trưởng mạnh Do đó, khi chọn cây mẹ để lấy trái giống nên chọn cây thân thẳng, các vết sẹo khít nhau và vết sẹo rộng Ở ngọn thân mang tán lá và cuối cùng là đỉnh sinh trưởng Nếu đỉnh sinh trưởng chết thì cây chết Đặc điểm của thân là không có tượng tầng do đó không thể tăng sinh thứ cấp Khi cây bị

vết thương trên thân thì không thể sản sinh mô mới để lấp lại vết thương mà sẽ mang vết thương ấy suốt đời (Võ Văn Long và cs 2008, Trần Mỹ Lý và cs 1990)

Hoa

Hoa mọc từng chùm từ nách lá Hoa thuộc loại đơn tính, hoa đực ở phía trên, hoa cái ở phía dưới, mọc trên cùng một bông mo Bông mo bao giờ cũng phân nhánh Hoa đực có sáu bản bao hoa mọc thành hai vòng và sáu nhị đực Hoa cái cũng có bao hoa như hoa đực và có ba tâm bì Hoa dừa trổ qua hai bước: Bước một:

ra lưỡi mèo, lưỡi mèo lớn lên, vỡ ra đổ ra một chất phấn, phấn đó nuôi dưỡng nụ và hoa Bước hai: khi buồng dừa trổ ra khỏi lưỡi mèo thì hoa đực rụng dần, hoa cái lớn lên thành nụ, những nụ đó rụng đi một phần, những nụ còn lại lớn lên thành quả Cây dừa từ khi trổ hoa đến khi già thì đúng mười hai tháng (Chan và cs 2006,

Nguyễn Văn Dõng 1962, Trần Văn Hâu 2009)

Qu ả - Hạt

Quả dừa thuộc loại quả hạch Cấu tạo từ ngoài vào trong có vỏ và hạt Phôi nhũ có phôi nhũ lỏng là nước dừa và phôi nhũ đặc là cơm dừa Phôi của quả dừa trưởng thành có hình trụ, nằm trong cơm dừa, dưới lỗ mầm Lúc nảy mầm, vùng ở đầu gần lá mầm mọc dài ra, kéo chồi và rễ mầm chui ra ngoài lỗ mầm, phần còn bên trong trái sẽ phát triển thành một khối gọi là giác mút hay phổi dừa Giác mút

có vai trò hấp thu chất dinh dưỡng để nuôi cây con Đó là một thể xốp, phát triển

thể tích rất nhanh theo sự phát triển của chồi (Trần Mỹ Lý và cs 1990, Nguyễn Thị

Minh Nguyệt và Đồng Thị Thanh Thu 2004)

1.2 S ự thành lập và tăng trưởng trái

1.2.1 Ngu ồn gốc của trái và hột

Trong sự tạo trái, bầu noãn cho trái, vách của bầu noãn cho các mô vỏ trái Noãn là nguồn gốc của hột, được tạo bởi một nhu mô đồng nhất (2n) gọi là phôi tâm Trong phôi tâm, túi phôi chứa tám tế bào đơn bội; nhóm ba tế bào gần lỗ noãn

là noãn cầu (giao tử cái) và hai trợ cầu (bất thụ) Noãn cầu (trứng) thụ tinh cho hợp

tử, nguồn gốc của phôi; nhân 3n từ sự dung hợp cho phôi nhũ Noãn gắn lên giá noãn nhờ cuống noãn; vùng gắn noãn trên cuống noãn gọi là rốn noãn, nơi mà hột

chín tách rời khỏi trái Phôi nhũ phát triển nhờ phôi tâm và phôi phát triển bằng cách tiêu hóa phôi nhũ Trong sự biến đổi này, các vỏ noãn biến đổi thành các vỏ

hột Toàn bộ các tổ chức được bao bọc trong các vỏ hột tạo nên nhân trái (Bùi Trang Việt 2000)

1.2.2 Đường cong tăng trưởng trái

Sự tăng trưởng trái bao gồm các hiện tượng: ức chế các cơ chế cản tăng trưởng; “lôi kéo” thức ăn về cơ quan tăng trưởng; tạo ra năng lượng cần thiết và kích thích cơ chế tổng hợp (Nitsch 1953)

Sau khi đậu trái, đời sống của trái có thể là vài tuần (chanh), vài tháng (xoài, lê) hoặc vài năm (chà là) Tuổi của trái thường được tính từ khi hoa nở (thụ phấn) (Trần Thế Tục 1998)

Dù là loại trái nào, sự tăng trưởng trái cũng theo đường cong hình chữ S (táo,

lê, cam, cà chua) hay chữ S kép (nho, xoài, dừa, chùm ruột) (trái có nhân trái) (Lê

Thị Trung 2003; Bùi Trang Việt 2000; Mazliak 1998)

1.2.3 S ự tạo hột và phát triển phôi

Sau khi thụ tinh, noãn chứa tế bào tam bội trung tâm và hợp tử nhị bội bắt đầu phát triển thành hạt Tế bào tam bội phân chia và phát triển thành một khối đa bào giàu chất dinh dưỡng được gọi là nội nhũ (phôi nhũ) Nội nhũ nuôi dưỡng phôi cho đến khi nó phát triển thành cây non tự dưỡng (Nguyễn Như Khanh 2009, Bùi Trang Việt 2000)

Sự phân chia đầu tiên của hợp tử điển hình là xuyên qua trục dọc, xác lập tính phân cực của phôi Khi tế bào phía dưới phân chia, tạo ra cấu trúc dạng cuống

gọi là cuống noãn, trong khi đó, các tế bào phía trên phát triển thành phôi gần giống hình cầu gọi là mầm phôi trước khi nó biến thành hình cầu Cuống noãn tham gia tích cực trong việc hấp thụ chất dinh dưỡng từ nội nhũ và kéo dài phôi đến nguồn

triển lớn hơn hẳn so với các lá khác Mô phân sinh ngọn nằm ở một phía của lá

mầm và được bao bọc trong phần kéo dài hình lá từ gốc của lá mầm (Nguyễn Bá 2006)

1.3 Nuôi cấy in vitro phôi hợp tử

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro để phân

biệt với các quá trình nuôi cấy cây trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm Bao

gồm: nuôi cấy cây non và cây trưởng thành, nuôi cấy cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh, nuôi cấy phôi (phôi non và phôi trưởng thành), nuôi

cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào), nuôi cấy Protoplast (nuôi cấy

phần bên trong của tế bào thực vật sau khi tách vỏ) (Ngô Xuân Bình 2010)

Phôi được tạo ra do thụ tinh giữa tế bào trứng và giao tử đực được gọi là phôi hợp tử hay phôi hữu tính Nuôi cấy phôi hữu tính là một hướng nghiên cứu in

vitro được sử dụng trong nhân giống và chọn giống thực vật (Vũ Văn Vụ và cs

2009) Hanning (1904) là người đầu tiên đã thí nghiệm nuôi cấy phôi trưởng thành

của cây Cochleria và Raphanus Sau đó là nhiều công trình của các nhà nghiên cứu

khác nuôi phôi tách rời từ hạt chín

Có hai vấn đề quan trọng nhất về mặt kỹ thuật liên quan chặt chẽ đến nuôi

cấy phôi hữu tính là kỹ thuật tách phôi và thành phần của môi trường nuôi cấy Ở

những thực vật có hoa dạng chùm, phôi được hình thành ở các độ tuổi khác nhau và

những phôi non hơn thường được sắp xếp ở đỉnh của chùm hoa

Các phôi hữu tính thường được hình thành trong môi trường vô trùng của mô noãn và mô bầu hoa Do đó, trong nhiều trường hợp có thể tách phôi ngay và đưa vào nuôi cấy ở điều kiện vô trùng (Vũ Văn Vụ và cs 2009) Ở hạt cam, quýt, do

phôi nằm trong lớp vỏ quả dày, đây là môi trường hoàn toàn vô trùng nên không

cần phải khử trùng (Ngô Xuân Bình 2010)

Nhiều tổ hợp khoáng khác nhau đã được sử dụng cho nuôi cấy phôi, trong đó môi trường của Murashige và Skoog (1962) có biểu hiện kích thích sinh trưởng phôi mạnh nhất đối với nhiều loài thực vật, tuy nhiên tỷ lệ sống sót của phôi thấp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên 2006)

Kỹ thuật nuôi cấy phôi hợp tử được ứng dụng trong việc bảo quản và trao đổi các giống dừa giữa các quốc gia Bên cạnh đó, nuôi cấy in vitro phôi dừa sẽ tránh

được sự lây lan của dịch bệnh và giảm bớt giá thành vận chuyển Tách phôi dừa và nuôi cấy in vitro có thể bảo quản tốt trong một năm và chúng vẫn phát triển tốt khi

đem trồng ngoài tự nhiên (Batugal và Engelmann 1998)

1.4 Vai trò c ủa các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng trái và phát tri ển phôi

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật tác động ở những giai đoạn khác nhau trong quá trình tăng trưởng trái một cách chuyên biệt Hột là trung tâm tổng

hợp quan trọng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong các giai đoạn phát triển trái và hột, tuy nhiên không loại trừ các nguồn khác (ngọn chồi, lá hay rễ) (Bùi Trang Việt 2000)

1.4.1 Auxin

Auxin cần thiết cho hoạt động kéo dài tế bào, kích thích sự phân chia tế bào

dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên “mô sẹo”, auxin có hiệu quả trong sự rụng trái Áp dụng auxin vào bất kỳ giai đoạn nào của sự phát triển trái đều có tác dụng Nội nhũ và phôi trong hạt sản sinh ra auxin, sau đó auxin di chuyển ra phía ngoài vỏ và kích thích sự phát triển (Dương Công Kiên 2002)

Auxin đóng vai trò “dấu hiệu tương quan” và di chuyển tới các mô đích vùng

rụng, kích thích sự tạo “chất cản tương quan” tại đây “Chất cản tương quan” là acid abcisic, chất có vai trò kích thích sự rụng (Tamas và cs 1979; Tamas và cs 1981)

Auxin ở nồng độ cao cản sự rụng, bất kì xử lí “gần” hay “xa” (Abeles 1967; Jacobs 1962)

Sự hình thành auxin ở hạt cũng kích thích sự sinh trưởng của quả Khi auxin

tập trung trong lá hoặc quả nhiều hơn trong thân thì lá và quả sẽ không bị rụng Do

đó có thể phun dung dịch auxin loãng cho cây ăn quả để giữ quả chín khỏi rụng Auxin tổng hợp được sử dụng để ngăn chặn sự rụng quả táo trước khi chúng chín (Hoàng Đức Cự 2006)

Hàm lượng auxin trong hột có hai đỉnh quan trọng: một ở giai đoạn tăng trưởng trái nhanh lần một, tương ứng với sự phát triển nhân noãn hay nội nhũ; và

một ở giai đoạn tăng trưởng trái chậm (trung quả bì và nội quả bì không gia tăng thể tích), tương ứng với sự phát triển nội nhũ tối đa và sự phát triển phôi Trong giai đoạn trái tăng trưởng nhanh lần hai (trên đường biểu diễn S kép), tương ứng với sự gia tăng thể tích quả bì, hàm lượng các chất kích thích giảm tới mức thấp nhất Vài loài còn một đỉnh nhỏ thứ ba khi phôi hoàn thành tăng trưởng (Lê Thị Trung 2003; Bùi Trang Việt 2000; Biale 1978; Crane 1969)

Ở bông vải, trên đường cong tăng truởng hình chữ S, trong giai đoạn một, có

sự tương quan nghịch giữa hàm lượng auxin và tăng trưởng trái nhưng trong giai đoạn hai, hàm lượng auxin tương ứng với sự tăng trưởng nhanh của trái Như thế, dường như không có mối liên hệ rõ ràng giữa hàm lượng các chất tăng trưởng tổng

cộng cũng như auxin trong hột với sự tăng trưởng trái Nhiều tác giả ủng hộ giả thuyết ban đầu: auxin trong hột di chuyển ra các mô xung quanh và kích thích tăng trưởng các mô này đã chuyển sang chấp nhận quan điểm: auxin, hay nói rộng ra, các chất điều hòa tăng trưởng trong hột có vai trò huy động các sản phẩm quang

hợp và do đó giúp trái tăng trưởng cạnh tranh với những cơ quan dinh dưỡng, riêng auxin ở các nồng độ thấp cần cho sự tăng trưởng và phát triển trái (Bianco-

Trinchant và cs 1998; Crane 1969; Rodgers 1981)

chứa cytokinin, là chất điều hòa tăng trưởng thực vật cần cho quá trình phân chia tế bào (Hoàng Đức Cự 2006)

Hoạt tính cytokinin cao trong phôi ở giai đoạn phát triển sớm của trái, sau đó

giảm khi trái tăng trưởng (Bùi Trang Việt 2000; Blumenfeld và Gazit 1970) Ở trái

Avocado, nội nhũ cùng với vỏ hột và phôi là nơi dự trữ chính cytokinin trong giai đoạn tăng trưởng sớm sau sự đậu trái Nội nhũ biến mất khi trái tăng trưởg nhanh, lúc ấy hoạt tính cytokinin của vỏ hột còn cao, của phôi thì giảm bớt Hàm lượng cytokinin trong vỏ hột thay đổi theo tuổi sinh lí của trái, không theo mùa Sự kiện

vỏ hột nhăn và sẫm màu trong giai đoạn tăng trưởng sớm của trái liên quan trong sự

rụng trái non, cho thấy vai trò quan trọng của cytokinin trog các mô vỏ hột Người

ta xem hột là trung tâm sinh tổng hợp và dự trữ các cytokinin cho sự phát triển trái

và sự nẩy mầm của hột sau này Hoạt tính cytokinin còn cao trong phôi khi trái chín

và vỏ hột đã nhăn (Blumenfeld và Gazit 1970) Tuy nhiên, ở những trái như

Lupinus, cytokinin có cả ở trong hột lẫn vỏ trái ở hàm lượng khá cao Do đó, có thể trong giai đoạn phát triển sớm của trái, hột lệ thuộc vỏ trái về nhu cầu cytokinin, vì lúc này lượng cytokinin trong chất nhựa vào trái không đáng kể (Lê Thị Trung 2003; Davey và Staden 1977)

1.4.3 Giberelin

Nếu auxin và cytokinin giàu và đạt tới đỉnh trong giai đoạn phát triển sớm

của trái (giai đoạn phân chia tế bào), giberelin có nhiều trong giai đoạn kéo dài tế bào và đạt tới đỉnh trước khi trái trưởng thành (Abdel- Rahman 1977) Ở một số trái, giberelin đạt tới đỉnh vào thời điểm đậu trái, sau đó giảm dần tới sự chín trái Thường, giberelin làm chậm sự trưởng thành và chín trái Ở trái mơ, hoạt tính giberelin rất cao, điều này khiến giberelin ngoại sinh không kích thích tăng trưởng trái, ngược lại, auxin có tác dụng mạnh Ở một số trái, đôi lúc hoạt tính giberelin cao trong quả bì so với hột khiến người ta nghĩ rằng quả bì cũng có khả năng tự cung cấp đủ giberelin (Crane 1969) Sự hiện diện của giberelin trong trái táo trinh

sản là bằng chứng ủng hộ quan điểm này (Hayashi và cs 1968), nghịch với quan

điểm của Dennis (1967): các giberelin được tổng hợp trong hột và chịu trách nhiệm trong sự đậu trái

Giberelin có thể phá vỡ trạng thái nghỉ của hạt và chồi Nghiên cứu ở hạt đại

mạch có nội nhũ lớn chứa tinh bột và bị phân giải thành đường cho thấy: sau khi phôi tổng hợp giberelin thì giberelin kích thích tổng hợp α amilaza và enzim này

phân giải tinh bột thành đường để sử dụng như một nguồn năng lượng cho phôi đang sinh trưởng (Ngô Xuân Bình 2010, Hoàng Đức Cự 2006, Nguyễn Như Khanh 2009)

1.4.4 Acid abcisic

Acid abcisic là chất ức chế sinh trưởng rất mạnh nhưng nó không gây hiệu

quả độc khi ở nồng độ cao Vai trò của acid abcisic trong việc điều chỉnh sự rụng đã được phát hiện lần đầu tiên cùng với sự phát hiện ra acid abcisic Acid abcisic đã kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thành tầng rời ở cuống (Ngô Xuân Bình 2010)

Acid abcisic cản tăng trưởng trái và kích thích sự rụng trái non (Nguyễn Như Khanh 1996) Sự tăng trưởng của trái dâu tây ngừng lại trong thời điểm ra hoa là do

lá noãn sinh ra chất này Acid abcisic cản tăng trưởng diệp tiêu Avena do auxin, cản

các phản ứng do giberelin kiểm soát nhưng tương tác với cytokinin trong hiệu ứng kích thích sự đậu trái Rosa (Lê Thị Trung 2003; Crane 1969)

Từ lâu, người ta biết rằng, trái và hột đang phát triển là những nguồn giàu các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Nói chung, lúc khởi đầu sự phát triển trái, hàm lượng các chất kích thích tăng trưởng cao và sau đó là hàm lượng các chất cản

tăng trưởng, chủ yếu là acid abcisic (Nguyễn Như Khanh 1996) Hàm lượng acid abcisic cao vào cuối giai đoạn phát triển trái và hột liên quan mật thiết với sự chín trái (Bùi Trang Việt 2000; Le Page- Degivry và cs 1990) Sự giảm hàm lượng nước

cũng liên quan tới sự tổng hợp acid abcisic ở những cơ quan khác như lá (Bianco-

Trinchant và cs 1998; Mazliak 1998) Acid abcisic có thể đổi nhanh thành các dạng chuyển hóa như acid phaseic hay acid dihydrophaseic (Nguyễn Như Khanh 1996;

Lê Thị Trung 2003) Khi hột đậu trưởng thành (ngày 36), hàm lượng acid abcisic

biến mất hoàn toàn do sự chuyển hóa này; điều này giúp hột đậu nẩy mầm nhanh so

với hột khó nẩy mầm như hột táo (Hsu 1979)

Vào khoảng cuối 1/3 đầu của sự phát triển hột, sự tăng hàm lượng acid abcisic kích thích giai đoạn trưởng thành của phôi Phôi tiếp tục phát triển in vitro và hàm

lượng acid abcisic giảm khi sự khử nước bắt đầu Tuy nhiên, sự khử nước cản sự

nẩy mầm và làm ngừng chương trình sinh phôi Khi có sự thấm nước, với hàm lượng acid abcisic thấp, chương trình nẩy mầm biểu hiện Acid abcisic cản sự nẩy

mầm nhưng kích thích sự tăng trưởng của phôi non và sự tích tụ của các chất dự trữ (Bùi Trang Việt 2000)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 V ật liệu

 Cây dừa “dâu” (Cocos nucifera L.) 4 năm tuổi trồng tại vườn nhà số 112 G

ấp An Thạnh B – xã Mỹ Thạnh An – TP Bến Tre, được dùng trong các xử lý ngoài đồng (ảnh 2.1)

 Trái dừa “dâu” (Cocos nucifera L.) qua các giai đoạn 0, 1, 3, 6, 9 và 12 tháng

tuổi (tương ứng t0, t1, t3, t6, t9 và t12) dùng trong các quan sát hình thái và giải phẫu, xác định hàm lượng hormon nội sinh

 Phôi dừa dâu (Cocos nucifera L.) giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi được sử dụng để nuôi cấy in vitro

V ật liệu sinh trắc nghiệm

 Khúc cắt diệp tiêu cây mạ lúa (Oryza sativa L.) 72 giờ tuổi (kể từ khi nảy

Ảnh 2.1: Cây dừa “dâu” bốn tuổi

trồng tại vườn ở Bến Tre

2.2 Phương pháp

2.2.1 Quan sát các bi ến đổi hình thái trong tự nhiên

Trái được theo dõi trong tự nhiên ở 6 giai đoạn phát triển

- Giai đoạn t0: trái không tháng tuổi, được tính từ khi hoa vừa thoát ra khỏi

mo, chưa thụ phấn, hoa có màu vàng chanh

- Giai đoạn t1: trái một tháng tuổi, giai đoạn tất cả hoa cái đã được thụ phấn hoàn toàn Phần đầu hoa cái bám rất nhiều hạt phấn, nuốm hoa màu trắng mở ra để tiếp nhận hạt phấn Hoa cái có màu vàng nâu

- Giai đoạn t3: trái ba tháng tuổi, trái lúc này là một khối cứng, chắc Nuốm hoa từ màu trắng ở giai đoạn t0 giờ chuyển thành màu đen

- Giai đoạn t6: trái sáu tháng tuổi, trái dừa phát triển to, màu vàng xanh, vỏ có

độ mềm, búng tay nghe âm thanh “tốc, tốc”

- Giai đoạn t9: trái chín tháng tuổi, trái cứng, chắc, có màu vàng ươm

- Giai đoạn t12: trái mười hai tháng tuổi, trái cứng, khô, có màu vàng nâu

S ự tăng trưởng trái được theo dõi ở sáu giai đoạn phát triển qua các chỉ tiêu

- Chiều cao trái: dùng thước chữ L, đặt trái ngay vị trí góc vuông của thước,

đo chiều cao trái, nơi cao nhất

- Chu vi trái: dùng thước dây đo vòng chung quanh trái, nơi lớn nhất

- Trọng lượng tươi trái: cân trọng lượng cả trái dừa lúc trái còn tươi

- Bề dày cơm dừa: dùng thước thẳng đo bề dày cơm, nơi dày nhất lúc trái còn tươi

- Trọng lượng tươi cơm/trái: nạo phần cơm dừa lúc còn tươi ở mỗi trái và cân bằng cân phân tích

- Thể tích nước/trái: dùng ống đong để đo thể tích nước ở mỗi trái

Kết quả thu được là trung bình cộng ba lần lặp lại cho mỗi giai đoạn nghiên cứu Tiến hành đo hai lần, một lần vào tháng 10/2010 và một lần vào tháng 03/2011

2.2.2 Quan sát hình thái gi ải phẫu

Cấu trúc phôi ở các giai đoạn phát triển trái được quan sát dưới kính hiển vi quang học

- Ba giai đoạn đầu (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi): mẫu giải phẫu là khúc cắt trái dừa được cô lập ngay vị ví phôi (ảnh 2.2)

Ảnh 2.2: Vị trí cắt ngang và dọc ở trái dừa dâu Cocos nucifera L với

khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi (p)

- Ba giai đoạn sau (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi): mẫu giải phẫu là phôi dừa giai đoạn 6, 9 và 12 tháng tuổi

Ảnh 2.3: Phôi dừa “dâu” giai đoạn trái 6 (t6), 9 (t9) và 12 (t12) tháng tuổi

 Mẫu được cắt bằng tay trước khi nhuộm với phẩm nhuộm hai màu

Phương pháp giải phẫu lần lượt qua các bước:

- Cắt ngang và dọc phôi ở sáu giai đoạn nghiên cứu

- Tẩy mẫu bằng Javel trong 30 phút, sau đó rửa sạch mẫu nhiều lần bằng nước cất, chậm giấy thấm cho hết nước

- Ngâm mẫu trong acid acetic 45% trong 5 phút, rửa sạch bằng nước cất

- Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmin-xanh iot trong 15 phút, rửa sạch bằng nước cất

- Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học

 Sử dụng máy cắt microtome giải phẫu phôi

Phôi ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi được cắt dọc bằng microtome qua các bước:

- Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm

Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 560 – 600C:

- Paraffin 1: 1 giờ

- Paraffin 2: 1 giờ

- Paraffin 3: 1 giờ

Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin

2.2.3 Định lượng đường glucose bằng phương pháp quang phổ hấp thụ

 Lập đường chuẩn glucose

Pha glucose theo các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 mg/l Cho dung

dịch glucose phản ứng màu với phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc theo tỉ lệ glucose: phenol 5%: acid sulfuric đậm đặc (1:1:5 theo thể tích) Đo mật độ quang (OD) bằng máy quang phổ ở bước sóng 490nm với chuẩn là nước cất: phenol 5%: acid sulfuric đậm đặc (1:1:5 theo thể tích) Thu các giá trị đo được và vẽ đường chuẩn của glucose theo tám nồng độ khác nhau

 Li trích mẫu và đo

Li trích và đo hàm lượng đường trong nước dừa ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi

Đong 1ml nước dừa với 10ml cồn 960, đun sôi cách thủy cho cô cạn dung

dịch rồi pha loãng với 1000ml nước cất Dịch trích đường thu được cho thực hiện

phản ứng màu với phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc theo tỉ lệ 1:1:5 thể tích Đo

mật độ quang ở bước sóng 490nm Tính hàm lượng đường dựa theo đường chuẩn

glucose (Coombs và cs 1987)

Mỗi giai đoạn lấy nước dừa của ba trái trộn lại Thực hiện đo hàm lượng glucose ba lần cho mỗi giai đoạn Kết quả là trung bình cộng của ba lần lặp lại với sai số chuẩn

2.2.4 Định lượng dầu bằng phương pháp cổ truyền

Định lượng dầu trong cơm dừa ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi Cho tất cả cơm dừa vào cối đá giã nhỏ (đối với trái giai đoạn trái 6 và 9 tháng tuổi vì cơm dừa ở giai đoạn này rất mềm) và dùng bàn nạo để nạo dừa (đối

với trái giai đoạn trái 12 tháng tuổi vì cơm dừa lúc này cứng) Sau đó trộn cơm dừa

đã nạo vào nước ấm rồi vắt lấy nước Thực hiện nhiều lần để đảm bảo lấy gần hết lượng dầu chứa trong cơm dừa Nước cốt thu được đem cô cạn trên lửa nhỏ sẽ thu được dầu

Mỗi giai đoạn lấy cơm dừa của ba trái trộn lại, mỗi lần xử lí 100g trọng lượng tươi Kết quả là trung bình cộng của ba lần lặp lại với sai số chuẩn

2.2.5 Đo cường độ hô hấp

Khúc cắt ngay vị trí phôi ở trái dừa giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi (khúc

cắt chứa phôi có cạnh 7mm, trọng lượng tươi 1 gam) (ảnh 2.4), phôi dừa ở giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi (lấy cả phôi đem cân cho đủ 1 gam) (ảnh 2.5) Đo cường

độ hô hấp của mẫu (µl oxygen hấp thu /gam TLT /giờ ) được xác định bằng máy Warburg ở 25o

C, trong tối Kết quả là giá trị trung bình của ba lần lặp lại

Cân chính xác trọng lượng tươi mẫu vật Rửa sạch mẫu nhẹ nhàng và đựng trong nước cất Cho vào thân bình Warburg 2ml nước cất Dùng kẹp cho mẫu vật vào thân bình Cho vào trụ giữa 0,5ml dung dịch KOH 20% Dùng kẹp cho mảnh

giấy lọc đã xếp vào trụ giữa Thực hiện một bình nhiệt khí áp kế với 2,5ml nước cất (không có mẫu vật) Thoa vaselin vào mặt trong cổ bình (kể cả ống nhánh) Gắn bình Warburg vào áp kế, xoay nhẹ nút và bình để chỗ ráp thật kín Buộc thun qua các móc để giữ bình không rớt

Gắn áp kế vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước Mở khóa chia ba để áp kế thông với khí quyển

Cho máy lắc 10 phút (thời gian này cho nhiệt độ khí trong bình ổn định với nhiệt độ nước là 250

C)

Sau 10 phút, tắt máy lắc Điều chỉnh mực chất lỏng trong áp kế đến vạch 10 Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp kế kín Mở máy lắc, ghi

thời điểm t1: thí nghiệm đo bắt đầu

Khi muốn đọc số đo (sau mỗi 15 phút): ngừng máy lắc, điều chỉnh chất lỏng trong nhánh kín của áp kế về vạch 10 Đọc mực chất lỏng bên nhánh mở của áp kế Tính trị số ΔP bằng số mm chất lỏng chênh lệch giữa hai nhánh áp kế Tính trị số

Δv ở bình (thể tích khí oxy bị mô hấp thu) qua hệ thức Δv = K ΔP, từ đó tính ra cường độ hô hấp của mô thí nghiệm (µl oxygen hấp thu/gam TLT /giờ)

Ảnh 2.4: Trái dừa “dâu” giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi (đã bóc bỏ cánh) với khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi

Ảnh 2.5: Trái dừa “dâu” giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi (đã bóc bỏ vỏ) cho thấy

vị trí phôi nằm ở “con mắt mềm” trong 3 mắt dừa

2.2.6 Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Li trích và phân đoạn

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992), Meidner (1984) và Yokota và cs (1980)

Vì ba giai đoạn đầu (trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) trái dừa còn non, chưa có nước

dừa nên sử dụng khúc cắt cô lập ngay vị trí phôi với trọng lượng tươi là 3 gam để

đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Ba giai đoạn sau (trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) đã có nước dừa và vì nước dừa là thành phần quan trọng để nuôi phôi phát triển nên sử dụng nước dừa ở ba giai đoạn sau để tiến hành sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Vì thành phần chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nước khá thấp nên sử dụng 50 ml nước dừa đem quạt cạn

rồi mới tiến hành li trích

Nghiền 3 gam thịt trái chứa phôi (đối với trái non dừa giai đoạn trái 0, 1 và 3 tháng tuổi) hay 50 ml nước dừa (đối với trái dừa giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) trong 50ml methanol 80%, để trong tối, thỉnh thoảng lắc Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và

thu lấy dịch lọc I Thêm vào bã 20ml methanol 80%, lắc 20 phút, lọc thu dịch lọc II

Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III Hòa chumg 3 dịch lọc I, II, III, đem

cô cạn dưới quạt còn khoảng 1ml

Thêm nước cất vào cho đủ 10ml, dịch nước được chỉnh pH 2,5 với dung

dịch HCl 1% Cho hỗn hợp vào bình lóng, thêm 15ml eter, lắc bình lóng khoảng 20 phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp Tách lấy dịch nước (lớp dưới) vào một becher và dịch eter (lớp trên) vào một becher khác Từ dịch nước thu được, lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa Sau quá trình này, thu được dịch eter 1 (chuẩn bị cho sự sắc ký và sinh trắc nghiệm nhóm chất acid: IAA, ABA và GA3) và

dịch nước

Dịch nước này được chỉnh pH 7 và tiếp tục lóng eter theo cách tương tự như trên, sau đó thu dịch eter 2 (dịch để sắc ký và sinh trắc nghiệm zeatin) và nước (bỏ)

Dịch eter 1 và 2 thu từ những lần lóng được cho vào bình lóng (riêng cho

từng phần) thêm 3ml dung dịch NaHCO3 8%, lắc khoảng 5 phút, để yên hỗn hợp trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới Tiếp tục lặp lai như

vậy một lần nữa với 3ml NaHCO3 8% Mỗi dịch eter thu được từ quá trình này được cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5ml

Sắc ký lớp mỏng

Dịch acid và trung tính (trong eter) của thịt trái chứa phôi và nước dừa được

chấm trên bản mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), ở nhiệt độ 30oC Dung môi di chuyển là chloroform : metanol : acid acetic (tỉ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích) Vị trí hormon tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan

sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm (Yokota và cs 1980)

Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được trích từ trái (giai đoạn trái 0, 1

và 3 tháng tuổi) và nước dừa (giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi) được xác định tương ứng với các băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn Chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được cô lập riêng, cạo lấy các hạt silicagel

trên bản sắc ký, ngâm với nước cất 24 giờ để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định

hoạt tính

Sinh tr ắc nghiệm auxin và acid abscisic

Hoạt tính auxin và acid abcisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Bùi Trang Việt 1992) Hột lúa được cho nẩy mầm trong tối Sau 80 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2mm để dùng trong sinh trắc nghiệm Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 1o

C Hoạt tính của auxin và acid abcisic lần lượt

tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch trích và các dung dịch IAA 1 mg/l và ABA 1 mg/l

Sinh tr ắc nghiệm cytokinin

Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo Hột dưa leo được ngâm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2 mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử

diệp Hoạt tính cytokinin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh với dung dịch zeatin 1 mg/l sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200 lux), ở nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5%

Sinh tr ắc nghiệm giberelin

Hoạt tính giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách sau 24 giờ cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 1oC, ẩm độ 65 ± 5% Các hột với rễ mầm nhú ra 1mm được chọn để dùng trong sinh trắc nghiệm Mỗi nghiệm thức gồm 10 cây mầm Hoạt tính giberelin tỉ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với đối chứng sau 72 giờ xử lý và được tính bằng cách so sánh

với dung dịch GA3 10 mg/l

Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng

thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng

thực vật là giá trị trung bình của ba lần lặp lại

2.2.7 Kh ảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại

sinh lên s ự phát triển trái dừa “dâu” ngoài thiên nhiên

Trái dừa giai đoạn trái 0 tháng tuổi được xử lý chất điều hòa tăng trưởng

thực vật bằng cách phun trực tiếp lên trái

Các dung dịch riêng lẻ NAA 2mg/l, BA 10mg/l và GA3 20mg/l có bổ sung

5% Tween 20 được phun lên cả buồng dừa giai đoạn trái 0 tháng tuổi Mỗi buồng

dừa phun 200ml dung dịch chất điều hòa tăng trưởng thực vật mỗi loại, phun đều

lên cả buồng dừa vào 5 giờ sáng và phun lặp lại vào 5 giờ sáng ngày hôm sau Thí

nghiệm được lặp lại hai lần, mỗi lần cách nhau một tháng

- Đợt 1 vào tháng 5/2011

- Đợt 2 vào tháng 6/2011

Sau khi phun chất điều hòa tăng trưởng thực vật, trái sẽ được đánh dấu và

theo dõi chiều cao, chu vi và tỉ lệ trái rụng theo thời gian Mỗi nghiệm thức được

thực hiện trên ba cây, mỗi cây sẽ đánh dấu năm trái ngẫu nhiên để theo dõi các chỉ

tiêu và tính tỉ lệ trung bình

2.2.8 Thử nghiệm nuôi cấy phôi hợp tử in vitro

Trái dừa “dâu” ở các giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi (ở các giai đoạn này

phôi đã có thể quan sát bằng mắt thường) được hái từ vườn ở Bến Tre mang lên

phòng thí nghiệm Khi tiến hành nuôi cấy mới bóc vỏ để đảm bảo phôi nằm trong

trái sẽ không bị nhiễm khuẩn Khi nuôi cấy thì mang cả trái đã được bóc sạch vỏ

vào phòng cấy, dùng dao mổ tách lấy phôi nằm ở vị trí “con mắt mềm” của trái dừa

và đưa trực tiếp vào ống nghiệm để nuôi cấy mà không cần qua giai đoạn khử trùng

vì phôi đã được bảo vệ vô trùng trong phần cơm dừa (ảnh 2.6 – 2.7)

Phôi được nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 2500 ± 200 lux (12/24 giờ), nhiệt

độ 27 ± 20C, độ ẩm 71 ± 5%

Ảnh 2.6: Vị trí phôi giai đoạn trái 6 tháng tuổi, phôi nằm trong phần cơm dừa

Ảnh 2.7: Vị trí phôi giai đoạn trái 12 tháng tuổi, phôi nằm trong phần cơm dừa

Tìm hiểu ảnh hưởng của tuổi phôi trong quá trình nuôi cấy phôi

in vitro

Phôi dừa đem nuôi cấy ở ba giai đoạn trái 6, 9 và 12 tháng tuổi

Môi trường nuôi cấy: Y3 với 60 g/l saccharose, 8 g/l agar, pH ở 0,58 ± 0,2 và

bổ sung thêm IAA 0,1 mg/l và BA 1 mg/l (phụ lục 2.3)

Mỗi giai đoạn nuôi cấy 10 phôi, theo dõi tỉ lệ sống sót của phôi sau bốn tuần nuôi cấy Tuổi phôi có sự phát triển tốt nhất được chọn để thực hiện các thí nghiệm

Số phôi còn lại sẽ được theo dõi khả năng nẩy mầm và tỉ lệ % sống sót của phôi sau bốn tháng nuôi cấy

Thí nghiệm được thực hiện hai lần tại phòng nuôi cấy bộ môn Sinh lí thực

vật trường Đại học Sư Phạm

Tìm hiểu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình phát triển phôi và nảy mầm

Phôi hợp tử giai đoạn trái 12 tháng tuổi được sử dụng làm thí nghiệm Môi trường nuôi cấy: Y3 với 60 g/l saccharose, 8 g/l agar, pH ở 0,58 ± 0,2 và bổ sung thêm chất điều hòa tăng trưởng thực vật với các liều lượng và thành phần khác nhau (bảng 2.1)

B ảng 2.1: Môi trường nuôi cấy Y3 có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng

thực vật với thành phần và liều lượng khác nhau

2.2.9 X ử lý thống kê kết quả thu được

Số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên

bản 11.5 cho Window Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất 0,05 với các giá trị được thể hiện bởi các chữ cái khác nhau kèm theo