khảo sát thành phần hoá học của lá xa kê artocarpus altilis (park ) fosberg thuộc họ dâu tằm moraceae

Các nhà hóa học, bằng nhiều con đường khác nhau, đã tạo ra những sản phẩm có ứng dụng trong các lĩnh vực như: Y học, Dược học, Sinh học, Nông nghiệp,… Tuy nhiên, những sản phẩm được tạo

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



C Ử NHÂN HOÁ HỌC NGÀNH: HOÁ H ỮU CƠ

C ỦA LÁ XA KÊ Artocarpus altilis (Park.) Fosberg

Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, ngành hóa học đóng một vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của xã hội Các nhà hóa học, bằng nhiều con đường khác nhau, đã tạo ra những sản phẩm có ứng dụng trong các lĩnh vực như: Y học, Dược học, Sinh học, Nông nghiệp,… Tuy nhiên, những sản phẩm được

tạo ra bằng cách tổng hợp mặc dù có kết quả tốt nhưng lại gây ra nhiều tác dụng phụ cho con người và môi trường Vì thế, hóa học các hợp chất thiên nhiên ngày càng được quan tâm hơn Các nhà hóa học đã tiến hành tách chiết, cô lập, bán tổng hợp ngày càng nhiều những hợp chất có hoạt tính sinh học để tạo ra những sản phẩm hữu ích từ cây cỏ thiên nhiên nâng cao chất lượng cuộc sống

Có rất nhiều loài, nhiều cây đã được các nhà hoá học nghiên cứu trong nước và ngoài nước, cây Xa kê là một trong những số đó Một số nghiên cứu trước đây cho

thấy rằng Xa kê có chứa một số chất có hoạt tính cao như triterpenes, flavones, dihydroflavonols, chalcones Tuy nhiên cây Xa kê ít được nghiên cứu và ứng dụng vào

thực tế ờ Việt Nam

Cây Xa kê, loại cây miền nhiệt đới được trồng phổ biến ở nước ta với nhiều hoạt tính sinh học thú vị như kháng vi khuẩn, kháng virus, kháng oxi hoá, ngừa ung thư, kháng đái tháo đường Với những thuận lợi về mặt địa lý thì Xa kê sẽ là nguồn nguyên

liệu vô cùng quí giá Do vậy, chúng tôi tiến hành “Khảo sát thành phần hoá học

trên lá Xa kê Artocarpus altilis (Park) thuộc họ dâu tằm Moraceae” ở Việt Nam,

mục tiêu cô lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ có trong lá Xa

kê (được thu hái ở Cần Thơ) Hy vọng rằng kết quả nghiên cứu sẽ góp phần mang lại

những hiểu biết mới về mặt hóa thực vật của cây Xa kê nhằm làm tăng giá trị ứng

dụng của cây vào thực tế cuộc sống

Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến:

PGS.TS Nguy ễn Ngọc Hạnh

Cô đã truyền cho em những kiến thức chuyên môn, luôn động viên và luôn tạo điều

kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận

ThS Phùng Văn Trung

Thầy đã truyền đạt cho em kiến thức chuyên môn, tận tình hướng dẫn kỹ thuật cũng như những kinh nghiệm hết sức quý báu và đầy tâm huyết trong suốt quá trình

thực hiện luận văn

Các Thầy Cô của Bộ môn Hóa - Trường Đại Học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh và

các Thầy Cô của Viện Công nghệ Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

đã tận tình dạy bảo, tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này Và tất cả các bạn cùng lớp đã quan tâm, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

C ử nhân Nguyễn Tấn Phát

Anh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em những việc nhỏ nhặt từ những ngày đầu cho

đến hết quá trình thực hiện luận văn

C ử nhân Võ Thị Bé, cùng các anh chị học viên trường Đại học Cần Thơ, các bạn

sinh viên đến làm đề tài nghiên cứu đã tận tình hướng dẫn, góp ý, cung cấp tài liệu, tạo

điều kiện giúp đỡ em làm tốt công việc của mình

Cuối cùng con rất cảm ơn gia đình đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện từ vật

chất đến tinh thần cho con học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng vi

Danh mục các sơ đồ, đồ thị vii

Danh mục các hình ix

Danh mục các phụ lục xi

Lời mở đầu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về cây Xa kê 1.1.1 Mô tả thực vật 1

1.1.1.1 Khái quát 1

1.1.1.2 Mô tả 1

1.1.2 Phân bố và sinh thái 2

1.2 Y h ọc dân gian của cây Xa kê 1.2.1 Thành phần hoá học 4

1.2.2 Hoạt tính sinh học 5

1.2.3 Công dụng của Xa kê 5

1.2.4 Bài thuốc có Xa kê 6

1.3 Công trình nghiên c ứu trên cây Xa kê 1.3.1 Thành phần hoá học 8

1.3.2 Hoạt tính sinh học 20

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân l ập và tinh chế 2.1.1 Phương pháp sắc kí bản mỏng 25

2.1.2 Phương pháp sắc kí cột 25

3

2.1.3 Phương pháp phổ 26

2.2 Th ử hoạt tính 28

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 Hoá ch ất thiết bị 3.1.1 Hoá chất 30

3.1.2 Thiết bị 30

3.2 Phân lập và tinh chế chất 3.2.1 Điều chế cao thô từ lá Xa kê 33

3.2.2 Phân lập các chất từ lá Xa kê 35

3.2.2.1 Phân l ập 35

3.2.2.2 Tinh ch ế 43

3.3 Th ử hoạt tính kháng đái tháo đường 44

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 4.1 Thành ph ần hoá học 46

4.2 Ho ạt tính sinh học 4.2.1 Xác định độ ẩm cao 52

4.2.2 Dựng đường chuẩn 52

4.2.3 Hoạt tính sinh học 52

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 5.1 K ết luận 57

5.2 Ki ến nghị 58

TÀI LI ỆU THAM KHẢO

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

1H–NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

UV Ultraviolet (Tia tử ngoại, tia cực tím)

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1: Kết quả cột trung áp phân đoạn V 35

Bảng 2: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG 36

Bảng 3: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG4 36

Bảng 4: Điều kiện chạy P-HPLC cao EtOAc 37

Bảng 5: Kết quả cột trung áp cao EtOAc 37

Bảng 6: Kết quả cột trung áp phân đoạn ED 38

Bảng 7: Kết quả cột trung áp phân đoạn ED1 39

Bảng 8: Tóm tắt các chất đã phân lập và tinh chế từ lá Xa kê 43

Bảng 9: Dựng đường chuẩn PNP 44

Bảng 10: Pha mẫu ức chế thử hoạt tính 44

Bảng 11: Dữ liệu phổ 13 C NMR, DEPT 90 và DEPT 135 của AA01 49

Bảng 12: Dữ liệu phổ 13 C NMR, 1H NMR, COSY và HMBC của AA01 50

Bảng 13: Kết quả xác định độ ẩm cao 52

Bảng 14: Dựng đường chuẩn PNP 52

Bảng 15: Kết quả đo mật độ quang AA03 53

Bảng 16: Kết quả đo mật độ quang cao EtOH 54

Bảng 17: Kết quả đo mật độ quang cao hexan 54

Bảng 18: Kết quả đo mật độ quang cao EtOAc 55

Bảng 19: Kết quả đo mật độ quang cao MeOH 55

Bảng 20: Kết quả so sánh IC50 56

7

DANH M ỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Qui trình chiết xuất cao từ lá Xa kê 34

Sơ đồ 2: Tóm tắt các chất đã phân lập 40

ĐỒ THỊ Đồ thị 1: Đường chuẩn PNP 52

Đồ thị 2: Kết quả % ức chế của chất AA03 53

Đồ thị 3: Kết quả % ức chế cao EtOH 54

Đồ thị 4: Kết quả % ức chế cao hexan 55

Đồ thị 5: Kết quả % ức chế cao EtOAc 55

Đồ thị 6: Kết quả % ức chế cao MeOH 56

Đồ thị 7: Kết quả so sánh giữa các cao 56

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1: Lá Xa kê 2

Hình 2: Hoa Xa kê 2

Hình 3: Quả Xa kê 2

Hình 3.1: Artocarpus altitis var seminifera 2

Hình 3.2: Artocarpus altitis var non seminifera 2

Hình 4: Biểu đồ phân bố cây Xa kê 3

Hình 5: Biểu đồ nguồn gốc cây Xa kê 3

Hình 6: Máy cô quay chân không 32

Hình 7: TLC 32

Hình 8: MPLC 32

Hình 9: Sắc kí điều chế P-HPLC 32

Hình 10: Máy đo mật độ quang 32

Hình 11: Máy đo pH 32

Hình 12: Lá Xa kê tươi đem chiết 33

Hình 13: Lá Xa kê héo không chiết 33

Hình 14: TLC phân đoạn V 35

Hình 15: Hình dạng AA01 41

Hình 16: TLC AA01 41

Hình 17: Hình dạng AA02 42

Hình 18: TLC AA02 42

Hình 19: Hình dạng AA03 42

Hình 20: TLC AA03 42

9

Hình 21: Kết quả thử hoạt tính AA01 53

Hình 21 1: Trước khi bỏ enzym 53

Hình 21.2: Sau khi b ỏ enzym 53

Hình 22: Kết quả thử hoạt tính AA03 53

Hình 22 1: Trước khi bỏ enzym 53

Hình 22.2: Sau khi b ỏ enzym 53

Hình 23: Kết quả thử hoạt tính trên các cao 54

Hình 23 1: Trước khi bỏ enzym 54

Hình 23.2: Sau khi b ỏ enzym 54

Hình 23.2.1: Cao EtOH 54

Hình 23.2.2: Cao hexan 55

Hình 23.2.3: Cao EtOAc 55

Hình 23.2.4: Cao MeOH 56

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY XA KÊ

1.1.1 Mô t ả thực vật

1.1.1.1 Khái quát

Tên Việt Nam: cây Xa kê

Tên khác: cây bánh mì

Tên khoa học: Artocarpus altilis (Park.) Fosberg

Tên đồng nghĩa: Artocarpus communis J R et G Foster, A camansi Blanco [1] Tên nước ngoài: Breadfruit (Anh); Arbre à pain (Pháp); Sukun (Indonesia, Malaysia); Rimas (Philipin)

biến hơn Căn cứ vào màu sắc và hình dạng của quả mà chia Xa kê làm 2 loại [32]

- Artocarpus altitis var non seminifera: quả màu xanh, không hạt và nhiều thịt

- Artocarpus altitis var seminifera: quả màu hạt dẻ, chứa nhiều hạt ăn được 1.1.1.2 Mô tả

Cây thân gỗ, cao 10-20m có thể tới 15-20m

Thân cây có đường kính 90cm

Lá to, mọc so le chia 3-9 thuỳ, dài 30-50cm, có khi đến gần 1m, gốc tròn, đầu

nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt và nháp lá kèm sớm rụng

Cụm hoa mọc ở kẽ lá, đực và cái riêng; cụm hoa đực hình chuỳ hoặc tụ họp thành đuôi sóc dài tới 20cm, hoa có 1 nhị; cụm hoa cái hình cầu, có khi hình ống

11

Quả phức hình cầu, có gai, to bằng quả dưa bở, màu lục hay vàng nhạt thịt màu

trắng chứa nhiều bột, hạt màu vàng nhạt [1]

Quả Xa kê là một quả kép to, gần như tròn

hoặc hơi trứng có đường kính 12-20cm, vỏ màu xanh lục nhạt hay vàng nhạt, thịt quả

rất nạc và trắng Quả Xa kê mọc thành từng chụm vài ba quả một ở đầu cành Có

những quả không có hạt, nhưng cũng có những quả có hạt chìm ngập trong thịt quả [2]

1.1.2 Phân b ố và sinh thái

Từ một số đảo thuộc Indonesia đến Papua New Guinea

Vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á và nhiều đảo ở Thái Bình Dương

Nguồn gốc ở các đảo phía nam Thái Bình Dương, Châu Đại Dương (Châu Úc)

Hiện được di thực vào các đảo Giava, Sumatra (Indonesia) Malaysia, các vùng đảo đông nam Châu Á [1] Từ xa xưa cây Xa kê đã được kể là cây tinh bột truyền thống quan trọng trong cuộc nổi dậy trên tàu HMS Bounty vào năm 1789 Hầu hết các giống

Xa kê là xuất hiện từ Polynesia (Pháp) và Melanesia (Úc) qua nhiều thế hệ nhân giống

Hình 3: Qu ả Xa kê

Hình 3.1: Artocarpus altitis var seminifera Hình 3.2: Artocarpus altitis var non seminifera

Hình 5: Bi ểu đồ nguồn gốc cây Xa kê Hình 4: Bi ểu đồ phân bố cây Xa kê

sinh dưỡng và lựa chọn, sau đó được vận chuyển ra nhiều nơi và phụ thuộc vào con người phân tán, dữ liệu được so sánh với lý thuyết về các thuộc địa của con người Châu Đại Dương [27] Ngoài ra, Xa kê còn được vận chuyển đường dài từ miền đông Melanesia vào Micronesia

Ở Việt Nam, Xa kê mới chỉ được trồng rải rác trong vườn cây ăn quả của các gia đình từ Đà Nẵng trở vào Cây không trồng được ở các tỉnh phía bắc Đó là loại cây gỗ,

ưa sáng và ưa khí hậu của vùng nhiệt đới nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình từ 23-30o

C Cây có thể chịu được thời tiết nắng nóng đến 40oC, lượng mưa từ 2000-3000 mm/năm,

độ ẩm không khí trung bình là 70-90% Xa kê sinh trưởng phát triển kém ở những vùng có nhiệt độ trung bình năm dưới 20o

C hoặc có mùa đông lạnh kéo dài Cây mọc

từ hạt sau 4-5 năm bắt đầu có hoa quả, vào những năm sau cây sẽ cho nhiều quả hơn Hoa Xa kê thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng, số hoa cái đậu quả thường đạt 75% Quả non sễ bị rụng khi gặp mưa nhiều Hạt tươi có tỉ lệ nảy mầm rất cao khoảng 95% Cây con ưa bóng và ưa ẩm Từ gốc cây mẹ hàng năm mọc ra nhiều chồi rễ Cây trồng từ

chồi rễ sẽ chóng cho thu hoạch [2]

vitamin A 26-40 đơn vị quốc tế, thiamin 0,10-0,14 mg, riboflavin 0,05-0,08mg, niacin

0,7-1,5mg và vitamin C 17-35 mg [1] Trong bột quả Xa kê có 2-3 hoặc 6% nước, 3,2%

muối vô cơ, 0,2-1,17% chất béo, 1,10-4,09% chất đạm, 64-85% tinh bột, đường,

dextrin, 2-3% độ tro [2]

Hoa: Fujimoto Yasuo và cộng sự [1]đã nghiên cứu hoa Xa kê và thấy hoa chứa 5

chất 2-geranyl-2',3,4,4'-tetrahydroxyldihydrochalcon hay còn gọi là 1 (1),

AC-5-2, AC-3-1, AC-3-AC-5-2, AC-3-3 Các chất này đều có tác dụng ức chế 5-lipooxygenase

Chất AC-5-1 không có tác dụng với prostaglandin synthase

O OH

HO

OH

OH

(1)

Thân: Có các flavonoid isocyclomorusin, isocyclomulberin, cycloaltilisin,

cyclomorusin, cyclomulberin, angeletin, cycloartomunin và dihydroisocycloartemunin

G ỗ: Chứa chất artocarben, (3,2′,4′-trihydroxy-6″,6″-dimethylpyrano

(3″,2″,4,5)-trans-stilben Ruột gỗ chứa chất ức chế tyrosine không độc, dùng để chế mỹ phẩm [2]

V ỏ cây: Có các artonol A, B, C, D và E, 2-prenylflavon artonin E và F và

cycloartobiloxanthon [1]

R ễ: Chứa Artonin V, cyclomulberrin, cyclocomunol, cyclocomunin,

dihydroisocycloartocomunin, pyranodihydrobenzoxanthon, epoxyd, artomunoxanthotrion epoxyd, cycloartomunin, dihydrocycloartomunin, cycloartomunoxanthon, artomunoxanthon, artomunoxanthetrion, β-sitosterol,

cudraflavon A, lupeol acetate [1]

1.2.2 Ho ạt tính sinh học

Qu ả: Có tác dụng bổ tỳ, ích khí Ngoài ra, trong dân gian còn lấy trái Xa kê

nghiền nát rồi đắp vào khối u để làm “chín” chúng [26]

H ạt: Có tác dụng bổ trung ích khí, lợi trung tiện [1]

M ủ: Được sử dụng trên các bệnh ngoài da và được băng bó trên cột sống để giảm

đau thần kinh tọa Mủ pha loãng uống trị tiêu chảy [26]

V ỏ cây: Có tác dụng sát trùng [1]

Hoa: Nướng lên dùng cọ xát vào nướu răng xung quanh răng đau [26]

Lá: Có tác dụng kháng sinh, tiêu viêm, lợi tiểu [1] Ở Trinidad và Bahamas, nước

sắc của lá Xa kê giúp làm giảm huyết áp, và giảm bệnh hen suyễn Lá nghiền được

ngậm trên lưỡi điều trị bệnh tưa miệng Nước ép lá được dùng làm thuốc nhỏ tai Tro

của lá bị bôi lên giảm các nhiễm trùng da Bột lá rang lên được dùng như một phương thuốc trị bệnh phù lá lách [26]

Ở Ấn Độ, trong một nghiên cứu sàng lọc tác dụng dược

lý của cao khô, chiết từ vỏ và lá cây Xa kê bằng cồn 50o các tác giả thấy có tác dụng:

- Tác dụng lợi tiểu: Thí nghiệm được tiến hành ở chuột cống trắng, cho uống với

liều 20mg/kg, cao khô Xa kê có tác dụng lợi tiểu rõ rệt so với lô đối chứng

- Độc tính cấp: Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng dùng đường tiêm phúc mạc, đã xác định được LD50 là 80mg/kg, cao khô Xa kê có độc tính khá mạnh Cần xác định

lại, vì súc vật thích ăn lá Xa kê [1]

1.2.3 Công d ụng của Xa kê [26]

Qu ả: Trái cây chín hoặc chưa chín hẳn dùng để ăn như các loại trái cây khác Ở

Samoa, quả Xa kê còn xanh bóc vỏ, rửa, cắt đôi, bỏ lõi, đặt trong lò hầm đá lót bằng lá Cordylme terminalis Kunth, được axit hóa và bảo quản trong nhiều năm thành món

“po poi” giống pho mát ăn có vị như bánh mì Ở Micronesia, New Hebrides, Ấn Độ cũng có món “po poi”

H ạt: Luộc, hấp, rang, nướng, hoặc than nóng và ăn kèm với muối Ở Tây Phi, đôi

khi chúng được giã nhuyễn Ở Costa Rica, hạt nấu chín được bán trên đường phố Các

hạt giống được ép gói trong lá Heliconia ố với nước cốt dừa và được nướng trong 2

giờ, có mùi giống như pho mát, cứng, được rất nhiều người bản xứ thích

Lá: Tại Ấn Độ, họ lấy lá Xa kê làm thức ăn cho gia súc, dê Ở Guam, làm thức ăn cho gia súc, ngựa và lợn

15

M ủ: Mủ Xa kê đã được người Hawaii sử dụng từ xa xưa như một loại nhựa bẫy

chim Sau khi đun sôi với dầu dừa, mủ Xa kê dùng để hàn tàu thuyền, hay trộn với đất màu để sơn tàu thuyền

Thân: Ở miền Nam nước ta dùng làm gỗ đóng đồ dùng Gỗ Xa kê màu vàng nhạt

hoặc vàng xám với những mảng đen hoặc đốm màu da cam, gỗ nhẹ, cứng, đàn hồi và

chống mối mọt (trừ gỗ khô) và được sử dụng để xây dựng và đồ nội thất Ở Guam và Puerto Rico, gỗ Xa kê được sử dụng làm ván lướt sóng Ở Hawaii gỗ dùng làm trống đánh trong điệu múa Hula Sau khi đem chôn vùi trong bùn, gỗ có giá trị để làm đồ gia

dụng, làm giấy Giấy thô ráp ban đầu đánh bởi san hô và dung nham, nhưng làm mịn

cuối cùng được thực hiện với lá khô cây Xa kê

Ch ất xơ: Chất xơ từ vỏ cây rất khó trích ly, nhưng độ bền cao Người Malaysia

làm trang trí cho nó vào quần áo Ở Việt Nam, nó được làm bộ yên cương cho trâu nước

Hoa: Cụm hoa đực được pha trộn với các chất xơ của quả dâu tằm ở Broussonetia papyrifera Vent để làm khố Gai hoa khô cũng được dùng làm mồi lửa

Ở Jamaica, Puerto Rico và Nam Thái Bình Dương, cụm hoa đực được đun sôi, lột vỏ

và ăn như rau quả với kẹo recooking

1.2.4 Bài thu ốc có Xa kê [1,3]

Chữa bệnh mụn rộp: Lá Xa kê đốt thành than, tán mịn, phối hợp với dầu dừa và nghệ tươi, giã nát, làm thành bánh, đắp [1]

Chữa viêm gan vàng da: Lá Xa kê tươi 100g, diệp hạ châu tươi 50g, củ móp gai

tươi 50g, cỏ mực khô 20-50g Nấu chung, lấy nước uống trong ngày [3]

Trị tiểu đường loại 2: Lấy lá Xa kê tươi 100g (khoảng 2 lá), quả đậu bắp tươi 100g, lá ổi non 50g, cho vào nồi nấu lấy nước uống hằng ngày [3]

Trị chứng tăng huyết áp dao động: Dùng lá Xa kê vàng (vừa rụng) 2 lá, rau ngót tươi 50g, lá chè xanh tươi 20g, nấu chung lấy nước uống trong ngày [3]

Trị đau răng: Lấy rễ cây Xa kê, nấu nước ngậm và súc miệng [3]

4-hydroxy-3,3-O

OH O

HO

OH OH

geranyl-2′,3,4,4′-tetrahydroxyldihydrochalcon hay còn gọi là Dihydrochalcone AC-5-1

(1) trong lá cây Xa kê được thu hái ở Bình Dương

17

O

O HO

OH

(7)

Năm 2011, Phạm Ngọc Ẩn, Phạm Thị Nhật Trinh, Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng

[9] đã cô lập được 3 chất là 2-geranyl-2',3,4,4'-tetrahydroxyldihydrochalcon (1), và Quercertin (8), Rutin (9) từ cao acetone của lá Xa kê được thu hái ở Đồng Nai Kết

quả cho biết 2 chất Quercetin và Rutin ở dạng bột màu vàng có khả năng giảm nguy

cơ ung thư, giúp ngăn ngừa bệnh tim, chống oxi hoá, có hoạt tính kháng viêm, kháng

vi rút, ngăn ngừa và điều trị suy thoái xương Còn chất Dihydrochalcon AC 5-1(1) cô

lập được ở dạng dầu màu cam là 1 dẫn xuất phenolic có khả năng ức chế Cathepsin K

trị bệnh loãng xương

O

OH OH

OH O

OH

O

O OH

O

OH HO

HO

OH

HO

H3C HO

chất thuộc họ triterpenes là Cycloartenone (10) và Cycloartenylacetate (11) từ cao

ether dầu của vỏ cây Xa kê

Năm 1992, Chun-Nan Lin và Wen-Liang Shieh [15] tách được Cyclomulberrin

(12) từ cao acetone của rễ cây xa kê và tìm ra 3 chất mới thuộc họ pyranoflavonoids là

Cyclocommunol (13), Cyclocommunin (14), Dihydroisocycloartomunin (15)

O

O HO

19

Cyclomulberrin (12), Engeletin (17) từ cao MeOH và 3 chất mới là Isocyclomorusin

(18), Isocyclomulberrin (19) và Cycloaltilisin (20) từ cao CHCl3

HO

OH

O

O H

OH

(18)

O

O HO

OH OCH 3

O H O

OH

OH O

HO

O O

O OH

OH

(23)

21

Năm 2006, Jing-Ru Weng, Sheng-Ching Chan, Yi-Huang Lu, Hsien-Cheng Lin, Horng-Huey Ko, Chun-Nan Lin [20] cùng tìm tách được Dihydroartomunoxanthone

(24), Artomunoisoxanthone (25), Cyclocomunomethonol (26), Artomunoflavanone

(27), Artochamins B (28), Cyclocommunol CC (29) có trong vỏ rễ Xa kê

O

OH HO

O

OH

OCH3HO

(24)

O

O OH

O

HO

OH HO

OH OCH3

OH HO

O

OCH3

OCH3HO

O

OH HO

O

OH OH

OH OH

(29) (28)

Năm 2007, Yanbin Lu, Cuirong Sun, Yu Wang, Yuanjiang Pan [43]dùng phương pháp HPLC đánh giá hàm lượng các chất trong cao tổng của cây Xa kê và thấy hàm

lượng 3 chất Dihydrochalcone AC-5-1 (1), Lespeol (30), Isolespeol (31) chứa nhiều

trong cao EtOH

isoartocarpesin (38), 2′,4′,5,7-tetrahydroxy-6(3-methyl-2-butenyl) flavones (39),

3β-acetoxyolean-12-en-11-one (40), cycloartenylacetate (11), β-sitosterol (41),

stigmasterol β-D-glucopyranoside (42) trong cao buthanol chiết từ quả Xa kê

23

OH

HO

OH HO

(34)

HO

OH O

OH HO

O

OH HO

(37) (36)

H3C

HO

CH3

H H

HO

OH HO

O

OH HO

Cùng năm 2007, Lotulung PDN., S.Fajriah, M.Hanafi, E.Filaila [25]

cô lập được

một tinh thể vàng pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl] 1-propanone hay còn gọi là AC-GF (43) có trong

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-cao CH2Cl2 của lá Xa kê

O

O OH

Tiếp đó, Yu Wanga, Kedi Xua, Lin Lin, Yuanjiang Pan, Xiaoxiang Zheng [44]

cùng tìm ra 5 chất mới là

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-{4-hydroxy-6,6,9-trimethyl-6a,7,8,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-5-yl}-1-propanone (44), dihydroxyphenyl)-3-[3,4-dihydro-3,8-dihydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-

1-(2,4-2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (45), methyl-2-(3,4-epoxy-4-methyl-1-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (46),

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (47), 2-[6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2(E),7-

1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-hydroxy-4-methyl-2-pentenyl)-dienyl]-3,4,2’,4’-tetrahydroxydihydrochalcone (48) và 4 ch ất cũ là AC-GF (43), Dihidrochalcone AC-5-1 (1), Cycloaltilisin 6 (22) và (E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-

(8-hydroxy-2-(4-hydroxy-4-methylpent-2-en-1-yl)-2-methyl-2H-chromen-5-yl)

propan-1-one (49)

O O

OH

OH HO

O

O OH

OH

25

O

O

O OH

OH

OH OH

(49) (48)

Năm 2008, Song-Chwan Fang, Chin-Lin Hsu, Yu-Shen Yu, Gow-Chin Yen [37]

cùng tìm ra Isolespeol (31), 5′-geranyl-2′,4,4′-trihydroxychalcone (50),

3′-geranyl-2′,3,4,4′-tetrahydroxydihydrochalcone (21), Lespeol (30) và Xanthoangelol (51) trong

Năm 2009, Kai-Wei Lin, Chiung-Hui Liu, Huang-Yao Tu, Horng-Huey Ko, Luh Wei [21] cùng tìm ra Cyclogera-Communin (52), Artoflavone A (53), Artomunoisoxanthone (25), Artocommunol CC (29), Artochamin D (54), Artochamin

Bai-B (28) và Dihydroartomunoxanthone (24) trong vỏ rễ Xa kê

O

O OH

O OH

HO

(52)

O O

O OH HO

(54)

Gần đây, vào năm 2011, Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui, Berhanu M Abegaz [39]đã nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên cao MeOH

của vỏ cây Xa kê của vùng Cameroon và cô lập được 5 chất peruvianursenyl acetate C

(55) , α-amyrenol còn gọi là viminalol (56), sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside (42),

artonin E (57) và

2-[(3,5-dihydroxy)-(Z)-4-(3-methylbut-1-enyl)phenyl]benzofuran-6-ol (58)

O HO

OH OH

OH

Theo đó, Lin JA, Fang SC, Wu CH, Huang SM, Yen GC [24]

nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm làm giảm bạch cầu đơn nhân S100B trên quả Xa kê và cô lập được

- Chống lao [12]: Là khả năng chống vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis H37Ra trong bài báo Microplate Alamar Blue (MABA) của Collin và Franzblau cho

biết tất cả 9 prenylated flavones: cycloartocarpin, artocarpin, và chaplashin phân lập từ cao CH2Cl2 của thân và rễ cây Xa kê, cũng như morusin, cudraflavone B, artonin E, artobiloxanthone, IC50 tương ứng là 9,9; 6,9; 7,7; 4,5; 5,2; 6,4; 6,9 mM và cudraflavone C, cycloartobiloxanthone cô lập từ rễ cây Xa kê có khả năng kháng lao

với nồng độ ức chế tối thiểu MIC từ 3.12-100 µg/ml

- Kháng tế bào gây độc [37]: 9 hợp chất thuộc họ prenylated flavones được phân

lập được từ rễ cây Xa kê là cycloartocarpin, artocarpin, chaplashin, morusin, cudraflavone B, cycloartobiloxanthone, artonin E, cudraflavone C, artobiloxanthone có

khả năng phát hiện ra tế bào độc hại chống lại tế bào KB, BC và Vero ở IC50 khoảng 2.9-14.7 µg/ml

Lotulung PD, Fajriah S, Hanafi M, Filaila E [25] đã nghiên cứu hoạt tính kháng tế

bào gây độc trên lá cây Xa kê trồng ở Indonesia và thấy chất (43) có khả năng gây độc

cao trên tế bào bạch cầu của chuột P-388

- Kháng tế bào ung thư [37]

: 3 dẫn xuất geranyl của chalcone là chất Isolespeol

(31), 5′-geranyl-2′,4,4′-trihydroxychalcone (50),

3,2′,4,4′-tetrahydroxy-3′-geranyldihydrochalcone (21), Lespeol (30) và Xanthoangelol được phân lập từ lá Xa

kê nghiên cứu bằng in vitro có khả năng kháng ung thư Các chất này có khả năng phát

hiện tế bào ung thư gồm tế bào liposarcoma (SW 872) trong mô mỡ, colorectal carcinoma (HT-29, COLO 205), hepatocellullar carcinoma (PLC5, Huh7) và tế bào hepatoblastoma (HepG2, Hep3B) một loại ung thư gan ác tính Trong đó thì Isolespeol

hoạt động ức chế cao nhất với IC50 = 3.8 µM trong SW 872 tế bào mô mỡ Isolespeol

29

phản ứng với SW 872 làm mất khả năng của màng ty thể (DeltaPsim) Western còn

chỉ ra rằng isolespeol kích thích sự gia tăng protein Tỉ lệ giữa protein và chất thuộc họ kháng tế bào chết Bcl-2 được thay đổi do Isolespeol làm hoạt hoá caspase-9 và caspase-3, những chất bị cắt bởi poly (ADP-ribose) (PARP) Kết quả là Isolespeol đem lại tế bào chết trong mô SW 872

- Huỷ tiểu cầu [43]: những flavones dihydroartomunoxanthone, artomunoisoxanthone, cyclocomunomethonol, artochamins B và artocommunol CC ,được phân lập từ vỏ rễ cây xa kê có tác dụng ức chế mạnh sự kết hợp các tiểu huyết

cầu trong huyết thanh PRP của người 300 µM so với aspirin Ngoài ra

dihydroartomunoxanthone (24), artochamins B (28) và artocommunol CC (29) ức chế quan trọng do kết hợp adrenaline và hiệu quả của việc huỷ tiểu cầu làm ức chế hoạt động của men cyclooxygenese-1 (COX-1) làm giảm sự hình thành thromboxane Sự

kết hợp tiểu cầu là nhân tố sinh bệnh quan trọng trong sự phát triển chứng xơ vữa động

mạch cùng với chứng huyết khối ở người Vì vậy, dihydroartomunoxanthone, artochamins B và artocommunol CC có khả năng là tác nhân chống huyết khối

- Kháng đái tháo đường [10]: Người ta nghiên cứu cao nước của vỏ rễ rất nhạy khi

nồng độ glucose trong máu tăng quá mức ở chuột Wistar và dẫn đến phá huỷ sự trao đổi sinh hoá của tuyến tuỵ và gan ở chuột

- Kháng viêm [40]: Những hợp chất flavonoids cycloartomunin, cyclomorusin, dihydrocycloartomunin, dihydroisocycloartomunin, cudraflavone A, cyclocommunin, artomunoxanthone, cycloheterohyllin, artonin A, artonin B, artocarpanone, artocarpanone A, and heteroflavanones A, B, C có khả năng ức chế chất trung gian được đào thải từ tế bào lớn, bạch cầu trung tính, đại thực bào Chất dihydroisocycloartomunin ức chế sự đào thải β-glucuronidase và histamine từ tế bào màng bụng của chuột hoạt động bởi P-methoxy-N-methylphenethylamine Artocarpanone ức chế sự đào thải lysozyme từ bạch cầu trung tính của chuột nhờ formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Artonin B và Artocarpanone ức chế anion superoxide

tạo thành fMLP trong khi cyclomorusin, dihydrocycloartomunin, cudraflavone A, và cyclocommunin kích thích sự phát sinh anion superoxide Hợp chất artocarpanone còn

ức chế các sản phẩm NO và iNOS (inducible nitric oxide synthase)

Đặc biệt Lin JA, Fang SC, Wu CH, Huang SM, Yen GC [24]

thử hoạt tính trên

chất 5,7,4′-trihydroxy-6-geranylflavanone (59) cô lập được từ quả Xa kê với hoạt tính

kháng viêm và kháng oxi hoá cao nồng độ ≤ 2.5 μM

Một nghiên cứu sử dụng phương pháp tảo carrageenan gây bệnh phù chân chuột

[34]

thử nghiệm trên thuốc sắc cao nước lá Xa kê so với nước muối bình thường cũng

khảo sát tính kháng viêm Kết quả cho thấy nước sắc từ lá Xa kê có hoạt tính kháng viêm mạnh 60 mg/kg thể trọng trong 0.5-4 giờ

- Ức chế hoạt động men tyrosinase [17]: Cao diethyl ether hay cao methanol từ

ruột gỗ cây xa kê ở tỉnh Phitsanulok, Thái Lan chứa nhiều artocarpin có khả năng ức

chế tyrosinase, ức chế quá trình tổng hợp melanin và khả năng kháng oxi hoá Bên

cạnh đó, Shimizu, K Fukuda, M Kondo, R Sakai, K [33] cũng nghiên cứu hoạt tính

ức chế men tyrosinase của 23 loại gỗ ở Papua New Guinea trong đó có cây Xa kê và

kết quả cho biết chất isoartocarpesin có trong cao MeOH của ruột gỗ cây Xa kê hoạt động ức chế mạnh nhất tương đương với acid kojic Cao MeOH ức chế sinh tổng hợp melanin của tất cả các tế bào khối u ác tính B16 mà không gây bất kỳ độc tính nào thử

trên lưng của con lợn nâu Do đó, cao ruột gỗ cây Xa kê là nguyên liệu cho tác nhân làm trắng da và khắc phục chứng rối loạn sắc tố

- Ức chế hoạt động 5-lipoxygenase [22]

: Được cô lập từ cây Xa kê ở Indonesia,

chất AC-5-1 (1) có khả năng ức chế mạnh 5-lipoxygenase của u tế bào bón được thử

nghiệm trên chuột Bệnh phù tai chuột do acid Arachidonic trong một mẫu thử hoạt tính kháng viêm là do leukotriene gây ra Chất AC-5-1 ở nồng độ 10-5

M ức chế 96% C4 leukotriene tổng hợp tế bào phúc mạc chuột nhờ Canxi-ionophore Đó còn là một phát hiện thú vị về leukotriene đối với hoạt tính kháng viêm và các hoạt tính sinh học khác

- Ức chế Cathepsin K [11]: Dihydrochalcon AC-5-1, Cycloaltilisin 6, Cycloaltilisin 7, AC-3-1, AC-3-3, trong đó Cycloaltilisin 6 ức chế mạnh nhất với IC50

= 98nM, còn Cycloaltilisin 7 với IC50 = 840nM

- Ức chế hoạt động của 5-α reductase [23]

: Artocarpin được cô lập từ cao diethyl ether của ruột gỗ cây xa kê có khả năng ức chế 5-α reductase ức chế sự chuyển hoá testosterone thành 5-α-dihydro-Testosterone (IC50 = 37µM) Cùng lúc đó, Shimizu, K Fukuda, M Kondo, R Sakai, K [33] đã thử hoạt tính trên 9 chất cô lập được từ dịch chiết cao MeOH của ruột gỗ cây Xa kê và kết quả cho thấy Chlorophorin (IC =

31

37µM), Artocarpin (IC50 = 85 µM) ức chế mạnh hơn hẳn so với acid α-linoleic, chất

ức chế mạnh trong tự nhiên Trong đó chất prenylated stilbene được cô lập từ cao acetone của lá Xa kê [31] là 2′,3,4,4′-tetrahydroxy-3′-geranylchalcone (21) cũng có hoạt tính ức chế 5-α reductase với IC50 = 104µM Cấu trúc của hợp chất cho thấy rằng sự

hiện diện của một nhóm thế isoprene (prenyl hay geranyl) sẽ tăng khả năng ức chế reductase

5α Giảm thiểu chứng xơ vữa động mạch [41]: Việc bảo vệ tế bào bình thường khác khi sử dụng hoá chất trị liệu được đánh giá trên tế bào U937 của người nuôi cấy bằng OxLDL dùng 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1) oxi hoá Kết quả nghiên cứu cho thấy trong cao ethyl acetate của cây Xa kê có chứa thành phần của chất bảo vệ tế bào bình thường khác là β-sitosterol

và 6 flavonoids

- Kháng oxi hoá: Kai-Wei Lin, Chiung-Hui Liu, Huang-Yao Tu, Horng-Huey

Ko, Bai-Luh Wei [21] đã chứng minh hợp chất cyclogeracommunin, artoflavone A, artomunoisoxanthone, artocommunol CC, artochamin D , artochamin B ,

dihydroartomunoxanthone được cô lập từ vỏ rễ cây Xa kê có khả năng ức chế chất xúc tác phá huỷ DNA, chống lão hoá

- Trị chứng cao huyết áp: Siddesha J M., D’Souza C J M., Viswanath B S., Govil, J N.,Singh, V K [35] nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme chuyển hoá angiotensin làm tăng huyết áp từ các cây thuốc, kết quả cho thấy trong cao ethanol và cao methanol của lá Xa kê có hiệu quả cao hơn so với cao nước và cao acetone

- Kháng vi sinh: Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF

Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui, Berhanu M Abegaz [39]dùng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ thấp nhất tiêu diệt vi sinh MMC để đánh giá Kết quả là giá trị MIC thấp nhất trên cao tổng

64 μg/ml đối với khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25922 và khuẩn Escherichia coli ATCC 8739 Tương ứng MIC đạt 32 μg/ml khi thử cả 2 chất (58), (59) trên khuẩn

Pseudomonas aeruginosa PA01và thử (59) trên khuẩn E.coli ATCC 8739

- Trừ giun sán: Carine Marie-Magdeleine, Maurice Mahieu, Marie-Laure Lastel, Harry Archimede [13] đã đưa ra đánh giá dựa trên thí nghiệm đối với lá của quả Xa kê

có hạt và không hạt thử trên loài giun đỏ Haemonchus contortus, kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol và tannin chứa trong cao nước, cao MeOH của lá già

và lá tươi của cây Xa kê có hạt và không hạt rất nhiều, do đó lá Xa kê có khả năng diệt trừ giun sán

- Diệt côn trùng: Nghiên cứu khả năng diệt côn trùng trên vỏ lá Xa kê của Williams, L.A.D.; Mansingh, Ajai [42] bằng cách sử dụng loài bọ trưởng thành Cylas formicarius Kết quả cho biết trong vỏ lá có chứa một triterpene pentacyclic có liên kết đôi ở vị trí 12 và 13 có khả năng chống côn trùng và độc tính giảm theo mỗi phân đoạn chiết cao LC50 (mg/g thể trọng) trong 48 giờ của các cao tương ứng, cao tổng 3,9 mg/g; cao Hexan 5,5 mg/g; cao MeOH 7,8 mg/g; chất triterpene 11,5mg/g Còn trong cao EtOAc thì lại không có khả năng ức chế, người ta thử với liều trên 10,0 mg/g nhưng chỉ cho hiệu quả ức chế 20% Đặc biệt hiệu quả tăng gấp 6 lần khi pha dẫn xuất triterpene 1% DMSO trong acetone kết quả cho LC50 = 1,9 mg/g

33

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 PHÂN L ẬP VÀ TINH CHẾ

2.1.1 Phương pháp sắc ký bản mỏng [7]

Sắc ký bản mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) dựa chủ

yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ

Bình sắc ký là bình bằng thủy tinh trong suốt, hình dạng đa dạng, có nắp đậy Pha tĩnh là một lớp mỏng silica gel khoảng 0,25mm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng

Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo

tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1μl dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản

để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so

với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

2.1.2 Phương pháp sắc ký cột [7]

Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu (Adsorption chromatography)

Pha tĩnh là hạt silica gel thường và hạt silica gel pha đảo C18 được nạp nén chặt vào cột inox hoặc cột thuỷ tinh

Pha động là chất lỏng, dung môi hoặc hệ các dung môi khác nhau

Trong sắc kí hấp thu, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu lên bề mặt của chất rắn pha tĩnh Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh, hệ

quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách xa nhau ra

Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực (tương

tác lưỡng cực - lưỡng cực), do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm

phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường

là những hạt silica gel Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây

Ph ổ 13 C-NMR

Cho thông tin về các cacbon có trong phân tử Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất

hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0 - 250 ppm) (có thể đến 600ppm cho trường

hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát Mỗi loại cacbon trong

hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau Dựa vào độ dịch chuyển hóa

học của cacbon trong phổ 13

C-NMR, có thể dự đoán được loại cacbon và liên kết của cacbon đó

- DEPT-45 mỗi cacbon có mang hydrogen đều cho hiện 1 mũi trên phổ đồ

- DEPT-90 ch ỉ những cacbon loại metin -CH cho mũi dương

- DEPT-135 cho xu ất hiện mũi dương các cacbon metin -CH và metil -CH3,

xuất hiện mũi âm các cacbon metilen CH2, cacbon tứ cấp không cho mũi trong phổ

Phổ 2 chiều gồm HSQC, HMBC và COSY

Ph ổ HSQC: khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C, cho tín hiệu của cacbon gắn

trực tiếp vào proton, nghĩa là tương tác ngang qua 1 nối hóa trị

35

α-glucosidase

Ph ổ HMBC: cho biết tương tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất

hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị

Phổ COSY: cho biết mối liên quan giữa các proton với nhau: proton gem (2

proton gắn trên cùng một cacbon), proton vic (2 proton gắn trên 2 cacbon kề nhau),

mối liên quan giữa các nguyên tử H trong một phân tử

2.2 TH Ử HOẠT TÍNH

Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α-glucosidase trong điều trị đái

tháo đường loại 2 là phương pháp được chúng tôi ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản,

an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hoá chứ không tham gia vào quá trình chuyển hoá đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của

tế bào beta tuyến tuỵ … như các phương pháp khác

Phương pháp dựa trên nguyên tắc :

- Men α-glucosidase khi g ặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt liên kết để giải phóng đường D-glucose

- Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, dưới tác dụng của men α-glucosidase sẽ bị thuỷ phân cho ra đường

HO

OH O

OH

O HO

HO

OH OH

Theo phản ứng lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP Vì vậy có thể đo độ hấp thu

A của PNP ở bước sóng 405nm để xác định lượng glucose sinh ra So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu ức chế và không ức chế để xác định % ức chế Dựng đường

biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50

[A]o độ hấp thu trung bình khi không sử dụng chất ức chế

[A]iđộ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i

Ch ỉ số IC 50

Chỉ số IC50 là nồng độ của một mẫu ức chế mà tại đó nó ức chế 50% enzym glucosidase Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu)

α-của hoạt chất Mẫu có hoạt tính ức chế ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp Có

thể tính chỉ số IC50 dựa vào đồ thị hoặc từ phương trình đường cong phần trăm ức chế theo nồng độ chất ức chế

37

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 HOÁ CH ẤT THIẾT BỊ

DMSO (A) Merck

Nước tinh khiết HPLC

Acid Formic (A) Prolabo

Thuốc thử hiện hình bản mỏng: dung dịch H2SO4 10% trong EtOH Pha 50ml

H2SO4 đậm đặc trong 500ml EtOH 95%

p-nitrophenol (PA) Merck

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PA) Merck

α-glucosidase 0,9 U/ml (Sigma)

Na2HPO4 (PA) Prolabo

KH2PO4 (PA) Prolabo

Nước khử ion

Thuốc viên trị tiểu đường Arcabose 50mg

3.1.2 Thi ết bị

Máy siêu âm Elma S100 H Elmasonic

Máy cô quay chân không BUCHI Ratavapor R-200

Sắc ký bản mỏng (TLC) Merck-GF60 F254, kích thước 20x20cm, độ dày lớp hấp

phụ 0,2mm (Merck, Germany)

Bình phun xịt thuốc thử

Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker®

Máy soi UV: MINERALIGHT ® LAMP, U.S.A dùng bước sóng 254nm

Cột sắc ký trung áp dùng silicagel 60, Merck, đường kính hạt 0,040-0,063 mm

Cột sắc ký điều chế cột pha đảo dùng silicsgel 60, Merck, cỡ hạt: 15 µm Cân điện tử TANITA KD-200 và PRECISA XB 220ª

Máy đo mật độ quang Elx800 Bio Tek, dùng máy đọc đĩa 96 giếng

Máy đo pH inoLab 720

Tủ sấy UE 400

Micropipette 20-200 µl và 100 – 1000 µl

LC-MS đo trên máy Agilent 1260/6120

Phổ cộng hưởng từ đo trên máy Brucker Advant 500 MHz