khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy tạo rễ in vitro của cây đương quy nhật bản (angelica acutiloba kitagawa)

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro .... Thí n

Trang 1

NGUY ỄN LÊ ANH THƯ

KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN

CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN

(Angelica acutiloba Kitagawa)

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

Trang 2

CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN

(Angelica acutiloba Kitagawa)

Chuyên ngành: Sinh H ọc Thực Nghiệm

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu, hình ảnh thí nghiệm được thu thập và phân tích trong đề tài này là trung thực,

đề tài này không trùng với bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào Các số

li ệu và tài liệu tham khảo hoặc trích dẫn trong luận văn tôi đều chú thích nguồn tham kh ảo rõ ràng, chính xác

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 3 năm 2012

Học viên thực hiện

Nguyễn Lê Anh Thư

Trang 4

L ỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập, nghiên cứu thực hiện đề tài, ngoài sự phấn đấu, nổ lực

bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, khích lệ rất lớn từ nhà trường,

thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh đã

dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành

luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn TS Lê Thị Trung đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều

kiện cho em hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn quý thầy cô ở khoa Sinh, Phòng sau đại học của trường Đại

học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Khoa Học Tự nhiên, quý lãnh đạo

Sở Nội vụ Thành phố Cần Thơ, Sở Giáo dục Đào tạo Thành Phố Cần Thơ và Ban Giám hiệu trường Trung học phổ thông Phan Văn Trị - Thành Phố Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam về công nghệ tế bào thực vật nơi tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Vân, các bạn Như Hiến, Ngọc Nhung, Minh Duy, Phước Hạnh, Quỳnh Giao, Phương Duyên và “bé Cọp” Nguyễn Thanh Hoài

đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn tại Viện Sinh học nhiệt đới Tôi xin cảm ơn các bạn ở Phòng Sinh lý thực vật – Trường Đại học Sư Phạm TPHCM, chị Domres, bé Hằng, bé Thanh đã không ngừng động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Tôi xin cảm ơn tất cả, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập

Thành ph ố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 3 năm 2012

Trang 5

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình ảnh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu về cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zuccarini) Kitagawa 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Đặc điểm phân bố, sinh thái 5

1.1.4 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 5

1.1.5 Tính vị và công dụng dược lý 6

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Đương quy Nhật bản trên thế giới và trong nước 7

1.2.1 Trên thế giới 7

1.2.2 Trong nước 8

1.3 Sự phát sinh rễ ở thực vật và hình thái các loại rễ 8

1.3.1 Rễ trụ 8

1.3.2 Rễ chùm 9

1.3.3 Rễ biến dạng 9

1.3.4 Rễ bất định 10

1.4 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật 13

1.4.1 Lược sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật 13

1.4.2 Nuôi cấy in vitro tạo rễ bất định 14

1.5 Auxin và cytokinin – các chất điều hoà sinh trưởng thực vật thường dùng trong nuôi cấy tạo rễ 15

1.5.1 Auxin 15

Trang 6

1.5.2 Cytokinin 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Nguồn mẫu ban đầu 19

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 19

2.1.3 Một số hóa chất dùng trong thí nghiệm 20

2.1.4 Giá thể và môi trường nuôi cấy 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro 21

2.2.2 Thí nghiệm 2: Sự phát sinh rễ từ mẫu cấy phiến lá và cuống lá ở các vị trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản in vitro dưới sự ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy 26

2.2.3 Thí nghiệm 3: Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản in vitro 29

2.2.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đường lên sự tạo rễ bất định ở phiến lá và cuống lá cây Đương quy Nhật Bản in vitro 33

2.3 Phương pháp tính số liệu 36

2.3.1 Tỷ lệ mẫu chết (%) 36

2.3.2 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) 36

2.3.3 Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) 37

2.3.4 Số rễ/mẫu 37

2.3.5 Chiều dài rễ/mẫu ( mm) 37

2.3.6 Trọng lượng tươi rễ/mẫu (mg) 37

2.3.7 Trọng lượng tươi mẫu (mg) 37

2.3.8 Trọng lượng khô rễ/mẫu (mg) 38

2.3.9 Trọng lượng khô mẫu (mg) 38

2.3.10 Trọng lượng tươi rễ / trọng lượng tươi mẫu 38

Trang 7

2.3.11 Trọng lượng khô rễ/trọng lượng khô mẫu 38

2.3.12 Phần trăm chất khô của rễ (%) 38

2.4 Phương pháp giải phẫu quan sát sự phát sinh hình thái 39

2.5 Phương pháp thống kê 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro 41

3.1.1 Kết quả 41

3.1.2 Thảo luận 53

3.2 Thí nghiệm 2: Sự phát sinh rễ từ mẫu cấy phiến lá và cuống lá ở các vị trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản in vitro dưới sự ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy 57

3.2.1 Kết quả 57

3.3 Thí nghiệm 3: Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản in vitro 72

3.3.1 Kết quả 72

3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đường lên sự tạo rễ bất định ở phiến lá và cuống lá cây Đương quy Nhật Bản in vitro 85

3.4.1 Kết quả 85

3.5 Quan sát hình thái 90

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 92

4.1 Kết luận 93

4.2 Đề nghị 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

PHỤ LỤC

Trang 8

cs : cộng sự

CV : Coefficient of variation (hệ số biến thiên)

EDTA : Acid ethylen diamine tetra acetic

IBA : acid indol-3-butyric

Trang 9

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm1a 22

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm 1b 24

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 2a 26

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 44

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo rễ bất định ở mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 51

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ/mẫu và TLT, TLK của rễ đối với mẫu cấy phiến lá ở các vị trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 58

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin và vị trí mẫu cấy của cây Đương quy Nhật Bản lên TLT, TLK mẫu, tỷ lệ TLT rễ/TLT mẫu, TLK rễ/TLK mẫu và % chất khô rễ ở ngày thứ 42 61

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số lượng rễ/mẫu và chiều dài rễ/mẫu đối với mẫu cấy cuống lá ở các vị trí khác nhau của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 64

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên TLT mẫu, TLK mẫu và tỷ lệ về TLT rễ/TLT mẫu, TLK rễ/TLK mẫu và % chất khô rễ của cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 67

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của cytokinin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu và chiều dài rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 74

Trang 10

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của cytokinin lên TLT và TLK ở rễ và mẫu của

mẫu cấy phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 77

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của cytokinin đến tỷ lệ mẫu tạo rễ và chiều dài

rễ/mẫu, TLT và TLK rễ ở mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản

ngày thứ 42 79

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của cytokinin đến TLT và TLK của rễ và mẫu cấy

cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 81

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định

ở mẫu cấy phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 25 86

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của đường lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định

ở mẫu cấy cuống lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 25 88

Trang 11

DANH M ỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây Đương quy Nhật Bản 3

Hình 1.2 Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa) 4

Hình 1.3 Rễ trụ, rễ chùm và cấu trúc của rễ 9

Hình 1.4 Các loại rễ biến dạng 9

Hình 1.5 Sự phát sinh rễ phụ ở Lilium sp 10

Hình 1.6 Các loại rễ bất định 12

Hình 1.7 Rễ bất định từ mô sẹo rễ Sâm Ngọc linh 15

Hình 1.8 Các loại cytokinin tổng hợp thường dùng 17

Hình 2.1 Chồi và mẫu cấy phiến lá ban đầu 21

Hình 2.2 Mẫu cấy phiến lá trong bình 23

Hình 2.3 Mẫu cấy cuống lá ban đầu 23

Hình 2.4 Mẫu cấy cuống lá trong bình 25

Hình 3.1 Sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 41

Hình 3.2 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên khả năng tạo mô sẹo ở mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 42

Hình 3.3 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên TLT và TLK ở mẫu cấy phiến lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 46

Hình 3.4 Ảnh hưởng của auxin (NAA và IBA) và kinetin lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ngày thứ 42 48

Hình 3.5 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên khả năng tạo mô sẹo ở mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 49

Hình 3.6 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên TLT và TLK ở mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 52

Hình 3.7 Rễ và lông hút trên mẫu cấy phiến lá (a) và cuống lá (b) ở cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 53

Trang 12

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thành phần khoáng, vitamin lên mẫu cấy

phiến lá ở các vị trí khác nhau đến khả năng sống và hình thành mô sẹo

của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 57

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trên trong môi

trường nuôi cấy lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của phiến lá

của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 60

Hình 3.10 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin lên mẫu cấy

cuống lá ở các vị trí khác nhau đến khả năng tạo mô sẹo của cây Đương

quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 63

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi

trường nuôi cấy lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của mẫu cấy

cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản 66

Hình 3.12 Sự hình thành mô sẹo và tạo rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và

cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản in vitro ở ngày thứ 42 72

Hình 3.13 Ảnh hưởng của cytokinin lên mẫu cấy phiến lá đến khả tạo

mô sẹo của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 73

Hình 3.14 (a) Rễ thứ cấp và lông hút trên rễ bất định ở mẫu cấy của

nghiệm thức B0,1 và (b) mô sẹo trên mẫu cấy ở nghiệm thức T1 ngày

thứ 42 75

Hình 3.15 Ảnh hưởng của cytokinin đến khả năng hình thành mô sẹo ở

mẫu cấy cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản ở ngày thứ 42 78

Hình 3.16 Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự hình

thành mô sẹo và rễ bất định ở phiến lá cây Đương quy Nhật Bản ở ngày

thứ 25 85

Hình 3.17 Ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường lên sự hình

thành mô sẹo và rễ bất định ở cuống lá cây Đương quy Nhật Bản ở

ngày thứ 42 87

Trang 13

Hình 3.18 Mô sẹo ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá dưới kính lúp ở

nghiệm thức được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 6 mg l-1

IBA kết hợp với 1 mg l-1

kinetin ở ngày nuôi cấy thứ 21 90 Hình 3.19 Hình thái giải phẫu (a) phiến lá và (b) cuống lá quan sát dưới

kính hiển vi sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 6 mg

l-1 NAA kết hợp với 1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức N6K1) 90 Hình 3.20 Mẫu cấy phiến lá quan sát dưới kính hiển vi sau 28 ngày nuôi

cấy trên môi trường Gamborg B5 có bổ sung 6 mg l-1

NAA kết hợp với

1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức B2) 91 Hình 3.21 Mẫu cấy cuống lá quan sát dưới kính hiển vi sau 28 ngày nuôi

cấy trên môi trường Gamborg B5 có bổ sung 6 mg l-1

NAA kết hợp với

1 mg l-1 kinetin (nghiệm thức B2) 91

Trang 14

M Ở ĐẦU

Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zuccarini)

Kitagawa) là cây thuốc quý, đầu vị và không thể thiếu trong y học cổ truyền đối với việc điều trị bệnh phụ khoa và bồi bổ cơ thể Tuy nhiên, tập tính sinh trưởng của cây Đương quy là ở nơi có không khí mát lạnh và ẩm ướt Điều kiện sinh trưởng của cây Đương quy không phù hợp ở Việt Nam, việc nhân giống và chế biến cây Đương quy gặp nhiều khó khăn, đa số phải nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản dẫn đến giá thành các loại cây thuốc quí tăng cao (Phạm Văn Ý, 2000)

Nhu cầu sử dụng và chiết xuất các hợp chất thứ cấp từ các loại thảo dược (như Nhân sâm, Đương quy) ngày càng tăng theo thời gian, nhưng để thu hoạch rễ cây Đương quy cần phải mất từ 2 – 3 năm, nhân công lao động và chi phí chăm sóc trên đồng ruộng cũng làm tăng giá thành sản phẩm lên rất cao (Fukuda và cs, 2009)

Rễ cây Đương quy có chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp quan trọng giúp giảm đau, điều hoà nội tiết, kháng viêm, tăng cường miễn dịch, bồi bổ khí huyết Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng mở rộng và tăng khả năng thu nhận các hợp chất thứ cấp có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu tinh sạch với hiệu suất cao mà không thể sản xuất từ tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học

Để tạo nguồn sản phẩm sạch, tinh khiết nhằm khai thác được công dụng chữa bệnh và phục vụ cho việc bào chế dược phẩm từ cây Đương quy, giảm giá thành sản

phẩm, trong đó có rễ cây Đương quy Vì lí do trên, đề tài: “KHẢO SÁT MÔI

TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẠO RỄ IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba Kitagawa)” được thực hiện

nhằm khảo sát khả năng phát sinh rễ in vitro từ các nguồn vật liệu là phiến lá và

cuống lá trên môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp

Trang 15

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 16

1.1 Giới thiệu về cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba

(Siebold & Zuccarini) Kitagawa

Theo Nguyễn Bá (2007), cây Đương

quy Nhật Bản được phân loại như sau:

Tên khoa học : Angelica acutiloba

(Siebold & Zuccarini) Kitagawa

Tên tiếng Việt : Đương quy Nhật Bản,

Đông Đương quy

Tên gọi khác : Yamato Touki (Nhật

Bản); Ribendanggui (Trung Quốc)

Hình 1.1 Cây Đương quy Nhật Bản

Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) là loài thực vật sống lâu năm,

thân thảo lớn, cây cao 40 – 80 cm, có thân hình trụ, rãnh dọc màu tím, 5 – 7 ngấn, các ngấn đều có thể mọc thành mầm cành con, hình thành cá thể nhiều cành nhánh Thân chia thành thân sinh dưỡng và thân hoa Thân sinh dưỡng chỉ tồn tại ở thời kì sinh trưởng sinh dưỡng Thân rất ngắn, chưa có sự phân hoá của các ngấn thân,

Trang 17

cũng chưa phân cọng rõ ràng Lá mọc so le, xẻ lông chim 3 lần; cuống dài 10 – 30

cm, có bẹ ngắn, dạng máng ôm lấy thân; lá chét phân thùy hình mác dài 2 – 7 cm, rộng 1 – 3 cm, phía dưới có cuống ngắn hoặc không cuống, các thùy lại phân nhỏ, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có răng to sắc, lá ở phía ngọn tiêu giảm Rễ có mùi hương đặc biệt, rễ 3 năm tuổi được thu hoạch vào mùa thu và mùa đông và được đem phơi hoặc sấy khô để bảo quản Cây cho hoa và hoa nở 1 lần từ tháng 6 – 8 hàng năm, cụm hoa tán kép gồm 25 – 40 tán nhỏ dài ngắn không đều; tổng bao và tiểu bao giống nhau, có lá bắc dạng sợi, hoa nhỏ màu trắng hay lục nhạt, 5 cánh lõm

ở đầu, 5 nhị, bầu hình chóp ngược, có gân lồi, cuống dài Quả bế đôi hơi dẹt, có cạnh và gân lồi, gân ở mép rộng dạng cánh, rìa màu tím nhạt (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

Hình 1.2 Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa)

a: Cây 1 năm tuổi; b: hoa; c: lá; d: rễ thành phẩm

http://blog.daum.net/ckrhim/16591694,

http://plaza.rakuten.co.jp/calfee/diary/200808200000

http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=adskh&logNo=70088604963&parentCategoryNo=15&viewDate=&currentPage=1&listtype=0,

http://www.hiyakiogan.co.jp/shoyaku/index.html

Trang 18

1.1.3 Đặc điểm phân bố, sinh thái

Chi Angelica phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu và New Zealand

Việt Nam đã nhập giống cây Đương quy Trung Quốc Angelica sinensis (Oliv.)

(Diels.) (1960), Đương quy Triều Tiên Angelica uchyamana Yabe (1978) và gần đây là Đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba Kit (1996) Giống cây Đương quy

Trung Quốc hiện không còn, hai giống còn lại vẫn đang được trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội (Đỗ Huy Bích và cs 2003) Cây Đương quy ưa khí hậu ẩm mát, đến mùa đông toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi, phần củ dưới mặt đất chịu đựng được băng tuyết và sẽ mọc lại vào mùa xuân năm sau Cây Đương quy trồng ở Việt Nam thường cũng phải lựa chọn thời vụ, sao cho mùa gieo hạt và sinh trưởng của cây trùng với thời gian có nhiệt độ thấp trong năm (Phạm Văn Ý, 2000)

1.1.4.1 Thành phần tinh dầu

Ở rễ có ligustilide, n – butylphtalide, n – butylidenphtalide, cnidilide, p –

cymen Trong lá cây Đương quy Nhật Bản trồng ở Thanh Trì (Hà Nội), tinh dầu có chứa ligustilid, γ – terpinen, mycren, β – ocimen, limonen, caryophylen oxyde Trong lá cây Đương quy Nhật Bản trồng ở Thái Nguyên chứa tinh dầu với thành phần chính là p cymen, γ – terpinen (Fukuda và cs, 2009) Tinh dầu trong cây Đương quy Nhật Bản có tác dụng ức chế sự co tử cung, làm giảm sự căng tử cung,

từ đó hạn chế cơn đau bụng do kinh nguyệt Ligustilide ở rễ có tác dụng chống hen,

chống co thắt khí quản (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

1.1.4.2 Glucid

Chủ yếu là glucose, sucrose (40%) và có polysaccharide (khoảng 8%) có tác

dụng điều tiết hệ miễn dịch Thành phần polysaccharide của cây Đương quy Nhật

Bản có độ an toàn cao, hầu như không độc, tăng cường khả năng miễn dịch của

hạch, chống lại sự phát triển của tế bào ung thư, nâng cao số lượng tế bào lympho T (Kumazawa và cs, 1982)

Trang 19

1.1.4.3 Các loại acid hữu cơ

Các nghiên cứu cho thấy trong cây Đương quy Nhật Bản có chứa acid ferulic

có hoạt tính chống oxi hoá rất mạnh, có thể loại hết gốc tự do, điều tiết cơ chế sinh

lý cơ thể con người, hạn chế sự tạo dung môi của phần gốc tự do Mặt khác, acid ferulic còn có thể hạn chế kết tụ tiểu cầu máu, hạn chế acid amin gốc –OH, hạn chế nguy cơ tổn hại gan đồng thời phòng tránh xơ cứng động mạch (Lê Kim Loan và cs, 1998; Nguyễn Gia Chấn và cs, 1998)

1.1.4.4 Một số thành phần khác

Trong cây Đương quy Nhật Bản chứa hơn 23 nguyên tố vô cơ, trong đó có 16

loại cần thiết cho cơ thể con người Tuy nhiên, do vùng đất trồng khác nhau, hàm lượng nguyên tố vô cơ cũng có sự khác nhau Ngoài ra còn có coumarin như umbeliferon, scopoletin, xanthotoxin, isopimpinelin, bergapten; 17 loại acid amin trong đó có 7 loại mà cơ thể con người không tự tổng hợp được; polyacetylen như falcarinol, falcarindiol, falcarinolon và các hợp chất sterol (Nguyễn Gia Chấn và cs,

máu; điều kinh, nhuận tràng; và kích thích miễn dịch, gây hoạt hoá tế bào lymphô B

Trang 20

và T, làm tăng sản sinh kháng thể Cây Đương quy Nhật Bản và cây Nhân sâm, được thử nghiệm dưới dạng cao chiết với nước nóng, thể hiện hoạt tính điều hoà miễn dịch Độc tính cấp tính của rễ và hạt Đương quy rất thấp và rễ có độc tính cấp tính thấp hơn so với hạt (Đỗ Huy Bích và cs, 2004)

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Đương quy Nhật bản trên thế giới và trong nước

Kumazawa và cs (1982) đã tiến hành ly trích polysaccharide có trong dịch trích của rễ cây Đương Quy Nhật Bản và nhận thấy rằng nó có khả năng kích thích

hệ thống miễn dịch của cơ thể

Trong dân gian, cây Đương quy thường được trồng bằng hạt Tuy nhiên, hạt

chỉ có thể thu hoạch được vào một thời gian nhất định trong năm và sức nảy mầm

của hạt giảm nhanh chóng sau một thời gian ngắn Wanatabe và cs (1998) đã khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ nuôi cấy chồi ngọn cây Đương quy Nhật Bản

(Angelica acutiloba Kitagawa) trên môi trường MS có bổ sung NAA và Kinetin để

tạo nguồn vật liệu nghiên cứu nhận dạng hình thái DNA Nalawade và Tsay (2004)

đã nghiên cứu nuôi cấy, nhân giống in viro cây Đương quy Trung Quốc (Angelica sinensis) thông qua việc tạo phôi soma

Ninh Thị Phíp và cs (2006) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của việc chọn hạt dựa trên trọng lượng và trọng lực cụ thể lên tỷ lệ nảy mầm và phát triển của hạt cây Đương Quy Nhật Bản Ninh Thị Phíp và cs (2007) đã nghiên cứu sự nảy mầm của

hạt và ảnh hưởng của nồng độ dung dịch dinh dưỡng trong hai hệ thống khí canh và

thủy canh lên sự phát triển của cây Đương Quy Nhật Bản ngoài vườn ươm Hệ

thống khí canh giúp cây phát triển tốt hơn, tuy nhiên, do rễ thứ cấp là nguyên liệu thô dùng làm thuốc tại Việt Nam, nên hệ thống thủy canh được xem như là thích

hợp hơn vì hệ rễ thứ cấp phát triển trong hệ thống thủy canh tốt hơn Ninh Thị Phíp

và cs (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý hạt bằng gibberellin (GA3),

Trang 21

kinetin và nhiệt độ đến sự nảy mầm và sinh trưởng của cây con Angelica acutiloba

Kitagawa

Về nghiên cứu thành phần hoá học của cây Đương quy Nhật Bản, đã có nhiều công trình về xác định hàm lượng tinh dầu và công dụng dược lý (Lê Kim Loan và

cs, 1998; Nguyễn Gia Chấn và cs 1998) Một số nghiên cứu nội bộ tại Viện Dược

liệu, Hà Nội, đã xác định lại đúng tên khoa học và thành phần dược liệu của cây

Đương quy Nhật Bản là Angelica acutiloba Kitagawa tại Việt Nam

Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2011), tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã nuôi cấy lớp

mỏng chồi đỉnh cây Đương quy Nhật Bản trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung vitamin B5 (Gamborg và cs, 1968) bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg l-1 adenin cho số lượng chồi tăng rõ rệt sau 42 ngày nuôi cấy Nguyễn Vũ Ngọc Anh và cs (2011), tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã nuôi cấy phiến lá trên môi trường có thành phần khoáng và vitamin B5 có bổ sung 10 mg l-1

NAA thu được rễ to, ngắn, nhiều lông hút, tỷ lệ tạo rễ cao, số lượng rễ/mẫu cao, TLT và TLK của rễ cao sau 42 ngày nuôi cấy

1.3 Sự phát sinh rễ ở thực vật và hình thái các loại rễ

Rễ là cơ quan sinh dưỡng nằm dưới đất của cây, có nhiệm vụ chủ yếu là hút nước và muối khoáng hoà tan trong nước để chuyển lên các cơ quan trên mặt đất (thân và lá) Rễ giữ chặt cây vào đất, dự trữ chất dinh dưỡng, ở một số ít loài, rễ cũng tham gia vào việc sinh sản sinh dưỡng (Trương Thị Đẹp, 2007)

Theo Nguyễn Bá (2007), rễ trụ là đặc trưng cho các cây hai lá mầm gồm có rễ chính và rễ phụ Rễ chính hay rễ cấp một của thực vật có hạt phát triển từ mô phân sinh tận cùng của đỉnh rễ phôi Rễ bên hay rễ phụ là rễ thứ cấp từ rễ chính phân nhánh thành rễ cấp hai, rễ cấp ba Rễ chính và các rễ bên hợp thành hệ rễ trụ của

thực vật bậc cao (Hình 1.3)

Trang 22

1.3.2 Rễ chùm

Theo Nguyễn Bá (2007), rễ chùm là đặc trưng cho cây một lá mầm như rễ cây

ở lớp Hành Rễ đầu tiên tồn tại một thời gian ngắn và sau đó hệ rễ được tạo thành từ các rễ phát sinh từ mấu thân, phân nhánh và phát triển với mức độ gần giống nhau nên tương đối đồng đều về kích thước (Hình 1.3)

Trang 23

Cây phát triển ở những môi trường khác nhau, rễ có thể thay đổi hình dạng và

cấu tạo để thực hiện những chức năng đặc biệt:

1.3.3.1 Rễ củ

Ở một số cây, rễ phồng to và nạc, chứa chất dự trữ tạo thành rễ củ, đây là dạng

biến đổi của rễ và có sự tham gia của trụ thượng diệp và trụ hạ diệp Rễ củ có thể

phát triển từ rễ chính, như củ cải, carot hoặc có thể phát triển từ rễ bên, như sắn, khoai lang (Hình 1.4)

1.3.3.2 Rễ thở (rễ hô hấp)

Thường gặp ở các cây sống vùng ngập mặn hoặc các cây ở vùng đầm lầy, ở

những nơi rễ khó hấp thụ không khí như cây Bụt mọc (Taxodium distichum), cây

Bần (Someratia), cây Vẹt (Bruguiera) Ở các cây này có những rễ chuyên hóa, ngoi

lên khỏi mặt đất trông như những cái cọc hay mũi chông cắm tua tủa xung quanh

gốc cây Trên rễ có nhiều lỗ ở phần vỏ để lấy oxy cho các phần rễ nằm dưới nước hay đất lầy (Hình 1.4)

Hình 1.5 Sự phát sinh rễ phụ ở Lilium sp

http://kentsimmons.uwinnipeg.ca/2153/lb3pg4.htm

Theo Bùi Trang Việt (2000), rễ bất định phát sinh và phát triển không từ phôi

hợp tử mà từ những bộ phận khác của cây như thân, cuống hoặc lá Rễ bất định là

loại rễ đặc biệt, thường là kết quả của stress hoặc sự tổn thương Theo Mai Trần

Trang 24

Ngọc Tiếng (2001), rễ bất định là những rễ thường gặp ở thực vật có mạch và được

tạo ra ở nhiều vùng trên cơ thể thực vật Hình thái giải phẫu có thể chung cho rễ thứ

cấp và rễ bất định, chỉ khác biệt là rễ bất định không xuất hiện từ rễ chính (Hình 1.5

Rễ cột mọc ra từ cành đâm thẳng xuống đất, to dần lên và phân nhánh, cắm

chặt vào trong đất như ở Đa (Hình 1.6)

1.3.4.3 Rễ khí sinh

Rễ khí sinh mọc ra từ thân, rơi thỏng xuống, lơ lửng trong không khí Những

rễ này thường có màu lục do tế bào chứa nhiều chất diệp lục thường thấy ở nhiều loài phong lan (Hình 1.6)

1.3.4.4 Rễ bám

Thường gặp ở một số cây leo, chúng giúp cây bám chắc vào tường, vào giàn

như rễ trầu không, rễ cây sộp (Ficus pumila) (Hình 1.6)

1.3.4.5 Rễ mút

Rễ của các cây ký sinh hoặc nửa ký sinh, hút thức ăn từ chất hữu cơ có sẵn trong cây chủ Các rễ này đâm sâu vào mô mềm và các bó mạnh cây chủ, hút lấy nước và chất hữu cơ cần thiết như rễ tơ hồng, tầm gửi (Hình 1.6)

1.3.4.6 Rễ tơ (Hairy root)

Rễ tơ là rễ bất định được hình thành ở gần vị trí nhiễm khuẩn sau khi được

chèn đoạn T – DNA của vi khuẩn Gram âm Agrobacterium rhizogenes Conn sống

trong đất (Chilton và cs, 1982) (Hình 1.6)

Trang 25

Hình 1.6 Các loại rễ bất định

http://caycanhvietnam.com/news/detail/tai-sao-mot-cay-da-co-the-thanh-rung 1567.html, http://violet.vn/quangdailoc/document/show/entry_id/3001352,

http://www.macgarden.com.vn/index.php?lang=vn&control=product&view=detail&gid=1

32, http://vista.tutorvista.com,

http://www.rootec.com/index.php?p=2,http://www.fbs.leeds.ac.uk/nem/Anti-feedants.htm

Trang 26

1.4 Nuôi c ấy mô, tế bào thực vật

Năm 1893, Schleiden và Schwann đưa ra học thuyết tế bào” Tế bào là đơn vị

của sự sống; là đơn vị hình thái và chức năng của mọi sinh vật; là đơn vị hình thái

nhỏ nhất có khả năng hoàn thành các chức năng thiết yếu của sự sống như trao đổi

chất và năng lượng, sinh trưởng, phát triển và sinh sản (Bùi Trang Việt, 2002) Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào Theo ông mỗi một tế bào bất

kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật và sẽ phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh nếu gặp điều kiện thích hợp Ông thực hiện ý tưởng về nuôi cấy mô thực vật từ rất sớm khi nuôi

cấy mô lá một số cây đơn tử diệp, tuy nhiên, các thí nghiệm này thất bại do mô cấy được ông sử dụng đã mất khả năng tái sinh và đối tượng sử dụng là cây khó tái sinh (Bùi Trang Việt, 2002; Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009)

Năm 1934, White phát hiện sự tăng trưởng vô hạn của các tế bào rễ cà chua và thành công này trở thành nền tảng cho nuôi cấy mô thực vật sau này Từ năm 1958, Reinert và Steward nuôi cấy thành công từ mô sẹo và huyền phù tế bào cà rốt đã

chứng minh và khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật Năm 1962, Murashige và Skoog đề xuất môi trường nuôi cấy MS, môi trường này sau đó trở thành môi trường nuôi cấy được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô, tế bào thực

vật Năm 1986, Powell và cs đã tạo được lần đầu tiên cây thuốc lá chuyển gen có

khả năng chống lại bệnh virus hại lá (Tobacco mosaic virus)

Theo Nguyễn Quang Thạch và cs (2009) định nghĩa nuôi cấy mô, tế bào thực

vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều

kiện vô trùng Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm nuôi cấy cây non và cây trưởng thành, nuôi cấy cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ

Trang 27

tinh), nuôi cấy phôi (phôi non và phôi trưởng thành), nuôi cấy mô sẹo (callus), nuôi

cấy tế bào (huyền phù tế bào), nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần)

Năm 1957, Skoog và Miller đã chỉ ra rằng tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy có tác dụng quyết định sự phân hóa mô sẹo thuốc lá theo hướng ra

rễ hay chồi Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự ra rễ, ngược lại sẽ kích thích

sự tạo chồi Từ đây, các nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật tập trung nghiên

cứu chế tạo các loại môi trường nuôi cấy và sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Quá trình phát sinh rễ bất định được khởi động nhờ auxin nội sinh tập trung cao ở nơi có vết thương để thúc đẩy quá trình phân bào (Blačková và cs, 1997; Caboni và cs, 1997) Do đó, trong nuôi cấy mô thực vật, auxin ngoại sinh sẽ thẩm

thấu vào mô nuôi cấy và sẽ tập trung tại vị trí vết thương và đạt đỉnh sau vài giờ

hoặc vài ngày khi có vết thương để cảm ứng tạo rễ với nồng độ cao (Gaspar và cs, 1996; Gatineau và cs, 1997)

Năm 1995, Yang và cs đã nuôi cấy rễ, phiến lá, cuống lá, chồi, trụ thượng diệp

và trụ hạ diệp của cây Đương quy Trung Quốc để tạo mô sẹo trên môi trường MS

có bổ sung 20 mg l-1 sucrose, 14 mg l-1 NAA, sau đó mô sẹo được nuôi trên môi trường MS có bổ sung 14 mg l-1 NAA và 2 mg l-1kinetin đã phát sinh rễ bất định Nguyễn Trung Thành và cs (2008) đã mô tả 4 giai đoạn hình thành rễ bất định

từ nuôi cấy mô sẹo ở cây Nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer sau 28 ngày nuôi

cấy gồm: 1) sự hình thành các vị trí mô phân sinh, 2) sự phân hoá tế bào non, 3) sự phân chia các tế bào già để hình thành nên các cơ quan và mô phân sinh rễ, 4) sự phát triển rễ từ mô phân sinh

Nguyễn Thị Ngọc Hương và Võ Thị Bạch Mai (2009) đã nuôi cấy trụ hạ diệ ở cây Nhàu và nhận thấy rằng rễ bất định có nguồn gốc nội sinh từ trong chu luân, còn ở lá, rễ bất định có nguồn gốc từ nhu mô cạnh bó libe (ở vị trí tương đồng với nhu mô chu luân của trụ hạ diệp) Nhóm tế bào nhu mô này trải qua sự phân chia

Trang 28

song song với bề mặt và tạo thành sơ khởi rễ, sơ khởi này tiếp tục phát triển, hoàn thiện cấu trúc trước khi xuất hiện ra bên ngoài

Năm 2011, Nguyễn Thị Liễu và cs đã thành công trong việc nuôi cấy tạo rễ

bất định cảm ứng từ mẫu cấy củ sâm Ngọc Linh, sau 2 tháng, mẫu cấy cảm ứng tạo

mô sẹo và được chuyển sang môi trường B5 có bổ sung 50 mg l-1

sucrose và 5 mg l

-1 IBA, sau 30 ngày mẫu cấy cảm ứng và phát sinh rễ bất định (Hình 1.7)

Hình 1.7 Rễ bất định từ mô sẹo rễ Sâm Ngọc linh (Nguyễn Thị Liễu và cs, 2011)

1.5 Auxin và cytokinin – các chất điều hoà sinh trưởng thực vật

thường dùng trong nuôi cấy tạo rễ

Trang 29

auxin khá nghiêm ngặt xuống các cơ quan theo hướng gốc (không hoàn nghịch)

Tiền thân tổng hợp nên auxin trong cơ thể thực vật là tryptophan

Auxin có tác dụng điều chỉnh rất nhiều quá trình sinh trưởng của tế bào, cơ quan và toàn bộ cơ thể thực vật như kích thích mạnh lên sự dãn của tế bào gây nên

sự tăng trưởng của cơ quan và toàn cây, điều chỉnh tính hướng quang, hướng địa và hướng nước, hiện tượng ưu thế ngọn cũng như điều chỉnh sự hình thành rễ, sự hình thành, sinh trưởng quả và tạo quả không hạt; điều chỉnh sự rụng của lá, hoa và quả

và sự chín của quả Ngoài ra, auxin còn điều chỉnh nhiều quá trình khác như giúp

tổng hợp nhiều enzyme cho quá trình trao đổi chất, hoạt động sinh lý và sự vận động của cây (Bùi Trang Việt, 2000)

IAA là loại hormone thực vật đầu tiên được sử dụng để kích thích tạo rễ (Cooper, 1935) Trong các bước tạo rễ bất định, auxin đóng vai trò chủ đạo Hai loại auxin thường được nghiên cứu trong sự phát sinh rễ bất định là auxin nội sinh IAA

và auxin ngoại sinh (IBA, NAA) Các nồng độ cao của auxin khởi động sự thành

lập các rễ bên và rễ phụ Nói chung, các rễ bên xuất hiện ở bên trên các miền dãn dài và miền lông hút và có nguồn gốc từ các nhóm nhỏ tế bào trong trụ bì Auxin kích thích các tế bào trụ bì ấy phân chia dần tạo nên đỉnh rễ và rễ bên sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu bì Nồng độ auxin và cytokinin đóng vai trò cảm ứng sự hoạt hóa tế bào để hình thành mô phân sinh rễ (Hobbie và cs, 2007)

1.5.2 Cytokinin

Theo Bùi Trang Việt (2000), trong cơ thể thực vật, cytokinin được tổng hợp

chủ yếu ở mô phân sinh ngọn rễ Từ rễ, cytokinin được vận chuyển trong mạch gỗ đến đỉnh sinh trưởng của cành và các bộ phận khác trên mặt đất Trong cơ thể thực

vật, cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào khi kết hợp với auxin, giúp

sự gia tăng kích thước tế bào theo chiều rộng và sinh tổng hợp protein trong tế bào;

tỷ lệ auxin/cytokinin trong tế bào quyết định sự phát sinh chồi hay rễ Cytokinin

hoạt động trong sự lão suy và huy động chất dinh dưỡng hay trong sự trưởng thành

của diệp lạp

Trang 30

BA, kinetin, 2-iP, TDZ và zeatin là các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, trong đó zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA, kinetin và TDZ là cytokinin tổng hợp Cấu trúc của cytokinin được xác định như các dẫn xuất của adenine với các chuỗi bên là furfuryl, isopentenyl và gốc benzyl, các chuỗi bên được gắn vào các nhóm amin N6; TDZ có cấu trúc gồm 2 nhóm cấu trúc chức năng là nhóm phenyl và nhóm thidiazon

Kinetin Benzyladenine (BA hay BAP) Thidiazuron (TDZ)

Hình 1.8 Các loại cytokinin tổng hợp thường dùng Cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, tuy nhiên tuỳ theo tỷ lệ mà giúp

tạo chồi hay tạo rễ bất định Khi kết hợp với auxin, cytokinin kích thích sự phân chia tế bào trên cả 2 giai đoạn phân nhân và phân bào Cytokinin còn có tác dụng trong sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Ở thân và rễ, cytokinin

cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng của tế bào Humphries (1960) đã chứng

thực sự tạo rễ ở cuống lá và trụ hạ diệp ở đậu cove (Phaseolus vulgaris) bị ức chế

bởi ảnh hưởng của kinetin Một loại zeatin riboside hiện diện trong mạch gỗ cản trở

sự thành lập rễ trên trụ hạ diệp ở dưa chuột (Cucumis sativus) (Kuroha và cs, 2002)

Khi rễ bị cắt đi, lượng zeatin riboside nhanh chóng giảm đồng thời với gia tăng lượng auxin và có sự tổng hợp ethylene phần gốc bị cắt của cuống hoặc trụ hạ diệp,

dẫn đến kết quả là rễ bất định được tạo thành

Trang 31

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Trang 32

2.1 Vật liệu

Nguồn mẫu ban đầu là cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba

Kitagawa) nuôi cấy in vitro được nhân giống từ hạt do Trung tâm Nghiên cứu Sức

khỏe, Môi trường và Đồng ruộng, Trường Đại học Chiba, Nhật Bản cung cấp

Sau khi hạt Đương quy Nhật Bản nẩy mầm trong ống nghiệm, cây con được nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962) vitamin Morel (Morel và Wetmore, 1951), bổ sung 30 g l-1

sucrose, CĐHSTTV là 2

mg l-1 BA và 0,2 mg l-1 IBA Sau đó, chồi được tách ra thành từng chồi đơn và nuôi

cấy trong môi trường có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, bổ sung 30 g l-1

sucrose, 8 mg l-1 agar (không có CĐHSTTV) trong 4 tuần Các chồi được nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, ở nhiệt độ 24 + 2 oC và cường độ ánh sáng

- Giàn nuôi cấy gắn bóng đèn (1,4 m x 0,6m)

- Bóng đèn huỳnh quang 1,2 m, công suất 40 w (công ty Điện Quang thành phố

Hồ Chí Minh)

- Nồi hấp Hirayama, model HV – 85 (Hirayama Manufacturing Co., Nhật Bản)

- Tủ cấy vô trùng, model MV9/91 (ADS Laminaire Co., Pháp)

- Máy đo pH hiệu Orion (Orion Research, Inc., Mỹ)

- Cân phân tích, model TE1502S (d = 10 mg) và TE214S (d = 0,1 mg) (Công ty Satorius, AG Göttingen, Đức)

- Tủ sấy Sanyo, model MOV – 212 (Sanyo Electric Co Ltd., Nhật Bản)

Trang 33

- Kính hiển vi Nikkon Eclipe 80i (Nikkon Co., Nhật Bản)

- Ống đong dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml (Isolab, Đức)

- Đèn cồn, bình cồn cắm kẹp cấy, dao cấy, khăn lau, bình tia

- Cồn 96o, 70o

- Javel (Công ty Vân Phương, Thành phố Hồ Chí Minh)

- Thuốc nhuộm 2 màu đỏ carmin và xanh iod

- Acid acetic, nước cất

- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm NAA, IBA, Kinetin, TDZ, BA và

glucose (Công ty Duchefa Biochemie, Hà Lan)

- Sucrose (Công ty Cổ phần Đường Biên Hoà, Đồng Nai),

- Giá thể: Agar (Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh)

- Môi trường nuôi cấy: khoáng MS (Murashige and Skoog, 1962), vitamin Morel (Morel và Wetmore, 1951), khoáng và vitamin Gamborg B5 (Gamborg và cs, 1968) (Công ty Duchefa Biochemie, Hà Lan)

Trang 34

2.2 Ph ương pháp nghiên cứu

đến sự hình thành rễ bất định ở mẫu cấy phiến lá và cuống lá của cây Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro

2.2.1.1 Thí nghiệm 1a: Mẫu cấy phiến lá

Mẫu cấy xuất phát từ chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường

MS có bổ sung 30 g l-1

sucrose Mỗi mẫu là 1 phiến lá (lá thứ 2 hoặc thứ 3 tính từ

chồi ngọn xuống) được cắt thành 3 phần, rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương trên

mỗi phần (Hình 2.1) Mẫu cấy phiến lá có trọng lượng tươi trung bình là 124,75 +

Trang 35

Ghi chú: xN ho ặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện cho nồng độ (2,

4, 6 ho ặc 8 mg l -1 ), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l -1

)

- Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1 sucrose,

8 g l-1 agar Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121 o

C, 1 atm trong thời gian 20 phút

- Bình nuôi cấy dạng nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường

- Thí nghiệm có 16 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 3 bình, được lặp lại 3 lần,

mỗi bình chứa 1 mẫu cấy là 1 phiến lá Tổng số mẫu cấy là 144 mẫu

Trang 36

- Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 oC, độ ẩm 65 + 5 %

- Thời gian thí nghiệm: 42 ngày

Hình 2.2 Mẫu cấy phiến lá trong bình

 Ch ỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ mẫu chết (%)

- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)

- Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)

- Số rễ/mẫu

- Chiều dài rễ/mẫu (mm)

- Trọng lượng tươi mẫu (mg)

- Trọng lượng khô mẫu (mg)

2.2.1.2 Thí nghiệm 1b: Mẫu cấy cuống lá

MS có bổ sung sucrose 30 g l-1 Mỗi mẫu là 1 cuống lá (lá thứ 2 hoặc thứ 3 tính từ

chồi ngọn xuống) được cắt thành 3 phần, rạch tạo 6 vết thương trên mỗi phần (Hình 2.3) Mẫu cấy cuống lá có trọng lượng tươi trung bình là 41,63 + 10 mg

Hình 2.3 Mẫu cấy cuống lá ban đầu

Trang 37

Ghi chú: xN ho ặc I bên trái đại diện cho NAA hoặc IBA, số bên phải N hoặc I đại diện cho nồng độ (2,

4, 6 ho ặc 8 mg l -1 ), K đại diện cho kinetin, số bên phải chữ K đại diện cho nồng độ (0 hoặc 1 mg l -1

)

Trang 38

- Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1 sucrose,

8 g l-1 agar Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121 o

- Bình nuôi cấy dạng chai nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường

mỗi bình chứa 1 mẫu cấy là 1 cuống lá Tổng số mẫu cấy là 144 mẫu

- Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 oC, độ ẩm 65 + 5 %

Hình 2.4 Mẫu cấy cuống lá trong bình

- Số rễ/mẫu

Trang 39

2.2.2 Thí nghiệm 2: Sự phát sinh rễ từ mẫu cấy phiến lá và cuống lá ở các vị

thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy

2.2.2.1 Thí nghiệm 2a: Mẫu cấy phiến lá

MS có bổ sung 30 g l-1 sucrose Mỗi mẫu là 1 phiến lá của lá thứ 2, thứ 3 hoặc thứ 4 tính từ chồi ngọn xuống được cắt thành 3 phần, rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương trên mỗi phần (Hình 2.1)

Trang 40

 Điều kiện thí nghiệm

- Môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, 30 g l-1

sucrose,

8 g l-1 agar Môi trường được điều chỉnh pH đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121o

- Bình nuôi cấy dạng chai nước biển (V = 130 ml) chứa 18 ml môi trường

mỗi bình chứa 1 mẫu cấy là 1 phiến lá Tổng số mẫu cấy là 90 mẫu

- Mẫu được nuôi trong tối, ở nhiệt độ phòng 24 + 2 o

C, độ ẩm 65 + 5 %

- Số rễ/mẫu

- Trọng lượng tươi rễ/mẫu (mg)

- Trọng lượng khô rễ/mẫu (mg)

- TLT rễ/TLT mẫu (%)

- TLK rễ/TLK mẫu (%)

- (%) chất khô rễ

Định dạng
Số trang	154
Dung lượng	3,81 MB