khảo sát khả năng tạo phôi soma của cây sâm việt nam (panax vietnamensis ha et grushv ) trong nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại auxin 2,4-D, NAA hay IBA và cytokinin TDZ, Kin hay BA lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA

CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết

quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Lời cảm ơn

Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học trường Đại Học Sư phạm Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Quỳnh, người cô kính mến đã hết lòng dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến TS Lê Thị Trung, người cô đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, các thầy cô, đặc biệt là các thầy cô

tổ Sinh – Công nghệ trường THPT Võ Thị Sáu, quận Bình Thạnh đã động viên, giúp đỡ rất nhiều để em hoàn thành được luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho

em những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này

Xin chân thành cảm ơn chị Vân, anh Hiến, chị Hạnh, Nhung, Duy, Duyên ở phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện những nghiên cứu trong luận văn này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị, các bạn ở phòng Sinh lý thực

vật, Khoa Sinh học trường Đại Học Sư phạm Tp.HCM và các bạn trong lớp Cao

học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm khóa 20, đặc biệt là “ột” Thư đã động viên, giúp đỡ tôi trong những lúc gặp khó khăn

Và cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ông bà, bố mẹ, em trai và

“người dưng khác họ” thân thương đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn

Ngày 30 tháng 03 năm 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM 4

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây sâm Việt Nam 4

1.1.1.1.Phân loại 4

1.1.1.2.Đặc điểm hình thái 4

1.1.1.3.Phân bố và đặc điểm sinh thái 8

1.1.1.4.Thành phần hóa học 9

1.1.2 Nguồn gốc, lịch sử phát triển trồng và khai thác cây sâm Việt Nam 11

1.1.3 Tác dụng dược lý của sâm việt Nam 13

1.1.3.1 Bộ phận dùng làm thuốc 13

1.1.3.2.Tính năng và tác dụng dược lý 14

1.1.4 Bảo tồn và nhân giống 14

1.1.5 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước và trên thế giới 16

1.1.5.1.Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước

16

1.1.5.2.Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trên thế giới 19

1.2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG 20

1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 20

1.2.2 Sự phát sinh mô sẹo 21

1.2.3 Sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro 22

1.2.3.1 Sự phát sinh rễ 22

1.2.3.2 Sự phát sinh chồi 23

1.2.4 Sự phát sinh phôi soma 25

1.2.4.1 Khái niệm phôi soma 25

1.2.4.2 Sự phát sinh phôi soma 27

1.2.4.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự phát sinh phôi soma 30

CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

2.1 VẬT LIỆU 40

2.1.1 Nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu 40

2.1.2 Các thiết bị và dụng cụ 41

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.2.1 Thí nghiệm 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi trường MS có bổ sung NAA, IBA và TDZ 42

2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 44

2.2.3 Thí nghiệm 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 48

2.2.4 Thí nghiệm 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin 50

2.2.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây

sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 52

2.3 PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ LIỆU 53

2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 55

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 THÍ NGHIỆM 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi trường MS có bổ sung NAA, IBA và TDZ 57

3.2 THÍ NGHIỆM 2: Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 67

3.3 THÍ NGHIỆM 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 83

3.4 THÍ NGHIỆM 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin 88

3.5 THÍ NGHIỆM 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 94

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99

4.1 KẾT LUẬN 100

4.2 ĐỀ NGHỊ 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO 102

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : Acid 2,4-diclorophenoxyacetic

2iP : N6-[2-isopentenyl] adenosine

ABA : Acid abscisic

BA : N6-Benzyladenine

CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

CLC : Môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy mô sẹo sinh phôi từ cây

khoai lang của Cheé và cs đề xuất năm 1992 Môi trường cho

sự tăng trưởng mô sẹo sinh phôi (CP)

cs : cộng sự

IAA : Acid indol-3-acetic

IBA : Acid indolbutyric

GA : Gibberellin

Kin : Kinetin (6 – furfurylaminopurin)

MS : Môi trường khoáng cơ bản do Murashige & Skoog đề xuất năm

1962

MS1/2 : Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm một nửa MS2/3 : Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm còn 2/3 NAA : Acid α-naphthalenacetic

DANH MỤC CÁC BẢNG

B ảng 1 1. Phân biệt phôi soma với phôi hợp tử 25

B ảng 2.1 Bố trí thí nghiệm 1a 42

B ảng 2.2 Bố trí thí nghiệm 1b 43

B ảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 2a 45

B ảng 2.4 Bố trí thí nghiệm 2b 45

B ảng 2.5 Bố trí thí nghiệm 3a 48

B ảng 2.6 Bố trí thí nghiệm 3b 49

B ảng 2.7 Bố trí thí nghiệm 4 50

B ảng 2.8 Bố trí thí nghiệm 5 52

B ảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56 58

B ảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56 62

B ảng 3.3 Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84

68

B ảng 3.4 Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84

75

B ảng 3.5 Ảnh hưởng của CĐHSTTV và ánh sáng lên sự phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 35

85

B ảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin lên khả

năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày

thứ 42 90

B ảng 3.7 Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường

sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy

in vitro ở ngày thứ 49 95

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của cây sâm Việt Nam 5

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của một số loài sâm trong chi Panax 7

Hình 1.3. Vị trí địa lý của núi Ngọc Linh 8

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Majonoside-R2 10

Hình 1.5. Rễ củ khô của cây sâm Việt Nam 13

Hình 1.6. Viên ngậm sâm Việt Nam (Vinaginseng pastilles) 13

Hình 1.7. Sắc kí đồ của sinh khối cây sâm Việt Nam in vitro nuôi cấy tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 19

Hình 1.8. Sự phát triển rễ phụ từ trụ bì của rễ chính 24

Hình 1.9. Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây sâm Việt Nam in vitro 24

Hình 1.10. Sự phát triển của phôi hợp tử ở Capsella 26

Hình 1.11. Sự phát sinh phôi soma ở xoài (Mangifera indica L.) 26

Hình 1.12. Sự phát sinh phôi soma trực tiếp từ lá cây Phalaenopsis ‘Little Steve’. 27

Hình 1.13. Các giai đoạn của sự phát sinh phôi soma ở dịch treo tế bào cà rốt 29

Hình 1.14. Cấu trúc của auxin tự nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (2,4-D, NAA và IBA) 31

Hình 1.15. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi soma 31

Hình 1.16. Cấu trúc của một số dạng cytokinin 34

Hình 1.17. Cấu trúc của GA3 35

Hình 1.18. Cấu trúc của ABA 35

Hình 1.19. Cấu trúc của ethylene 36

Hình 2.1 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực

vật, Viện Sinh học Nhiệt đới 40

Hình 2.2 Cây sâm Việt Nam nuôi cấy trong tủ điều khiển khí hậu Percival 40

Hình 2.3 Thân khí sinh và phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 43

Hình 2.4 Mẫu cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam

in vitro 47

Hình 2.5 Cách bố trí mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh trên đĩa petri 47

Hình 2.6 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro 51

Hình 3.1 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của lớp mỏng phiến lá cây

sâm Việt Nam in vitro 57

Hình 3.2 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 5 của lớp mỏng phiến lá cây sâm

Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56 59

Hình 3.3 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của đoạn thân khí sinh cây

sâm Việt Nam in vitro 61

Hình 3.4 Các thể giống phôi hình cầu và hình tim của phôi soma hình thành tại vị

trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở nghiệm thức có

2 mg l-1 NAA và 0,2 mg l-1 TDZ 61

Hình 3.5 Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt

Nam in vitro sau 56 ngày nuôi cấy 63

Hình 3.6 So sánh tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh

của cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56 65

Hình 3.7 Chồi và rễ bất định hình thành trên đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt

Nam in vitro sau 4,5 tháng nuôi cấy 66

Hình 3.8 Hình thái mô sẹo từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro

trên môi trường không có 2 mg l-1

NAA sau 9 tuần cấy chuyển 66

Hình 3.9 Hình thái mô sẹo và rễ hình thành từ lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt

Nam in vitro ở các vị trí khác nhau trên môi trường MS1/2 bổ sung 2

mg l-1 2,4-D và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84 70

Hình 3.10 Rễ hình thành từ vị trí thứ 6 của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in

vitro trên môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 BA ở ngày thứ 84 70

Hình 3.11 Mẫu cấy tại vị trí thứ 1 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro sau 84

ngày nuôi cấy 72

Hình 3.12 Cụm phôi soma tại vị trí gốc lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam

in vitro sau 84 ngày nuôi cấy trên môi trường ban đầu có 2 mg l-1 IBA

và 0,2 mg l-1 Kin 73

Hình 3.13 Số rễ hình thành trên thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro 76

Hình 3.14 Sự hình thành mô sẹo, chồi và rễ bất định trên mẫu cấy tại vị trí thứ 1

của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 84 77

Hình 3.15 Đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường

MS1/2 bổ sung 2 mg l-1

NAA và 0,2 mg l-1 BA mang một phôi hình tim ở ngày nuôi cấy thứ 84 81

Hình 3.16 Phôi soma nẩy mầm thành cây hoàn chỉnh có chồi và rễ từ vị trí thứ 4

của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường bổ sung 2

mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84 81

Hình 3.17 Chồi bất định hình thành từ vị trí thứ 4 của thân khí sinh cây sâm Việt

Nam in vitro ở ngày thứ 84 82

Hình 3.18 Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro vào

ngày thứ 35 84

Hình 3.19 Mẫu cấy từ vị trí thứ 5 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày

thứ 35 84

Hình 3.20 Mẫu cấy từ vị trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở

ngày thứ 35 86

Hình 3.21 Số rễ hình thành từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở

các nghiệm thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy 86

Hình 3.22 Gia tăng số chồi/mẫu theo thời gian nuôi cấy của cụm chồi cây sâm Việt

Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau 89

Hình 3.23 Số rễ hình thành từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm

thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy 91

Hình 3.24 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 42 ngày nuôi cấy với

ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin 92

Hình 3.25 Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 49 ngày nuôi cấy với

ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose 96

Hiện nay, sâm Việt Nam được bán trên thị trường với giá ngày càng cao, cao hơn sâm Triều Tiên nhiều lần, dẫn đến tình trạng bị khai thác quá mức Cây sâm

Việt Nam hiện nằm trong số 250 loài thực vật quý hiếm và đang có nguy cơ bị tuyệt

chủng trong Sách đỏ Việt Nam Vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loài thực vật quý

hiếm này đòi hỏi sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý và là nhiệm vụ vừa quan trọng vừa cấp bách về phương diện khoa học lẫn kinh tế, xã hội Trong thời gian qua, một số công trình nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng cây sâm Việt Nam trong điều kiện tự nhiên đã được công bố, song kết quả thu được còn nhiều hạn chế Cây sâm trồng từ hạt sinh trưởng rất chậm và phải mất 5 – 7 năm mới tạo củ có hoạt chất Hạt sâm gieo khoảng 6 tháng mới có thể nẩy mầm, tỷ

lệ nẩy mầm thấp, lại bị dịch bệnh, chuột bọ phá hoại, cây sâm cho hoa đậu hạt cũng

ít, một cây chỉ có 1 – 2 hạt mà sau 3 năm cây mới ra hoa Do đó, nhu cầu về các kỹ thuật mới về nhân giống, nuôi trồng và nhân nhanh sinh khối từ cây sâm Việt Nam đang trở nên rất bức thiết (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Nghiên cứu nhân giống vô tính bằng con đường nuôi cấy mô tế bào thực vật

đã mở ra một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu từ cây sâm Việt Nam: chủ động được nguồn nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng Một số phòng thí nghiệm trong nước đã chứng minh việc nuôi cấy mô cây sâm tạo được các hợp chất

thứ cấp như cây trồng tự nhiên, hạn chế ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy khách quan bên ngoài (Nguyễn Ngọc Dung, 1995) Sự phát sinh phôi soma là một con đường quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Đây là một phương pháp

ưu việt được sử dụng để sản xuất nhiều loại cây trồng (Ammirato và cs., 1983) Ứng

dụng con đường phát sinh phôi soma ở thực vật không chỉ phục vụ công tác vi nhân

giống mà còn được phát huy trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về di truyền học, sinh học phân tử và chuyển gen ở thực vật (Nguyễn Hữu Hổ, 2009)

Vì vậy, đề tài “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA CÂY

SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG NUÔI CẤY IN

VITRO” được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới nhằm mục đích tìm hiểu và xây dựng nên quy trình tạo phôi soma của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro, từ đó có thể nhân giống vô tính loài sâm quý hiếm

này và góp phần bảo tồn loài sâm đặc hữu của Việt Nam

Đề tài chỉ tập trung khảo sát hai nguồn vật liệu từ cây sâm Việt Nam in vitro là

phiến lá và thân khí sinh, ảnh hưởng của một số CĐHSTTV và ánh sáng đến sự cảm ứng và phát sinh phôi soma Đồng thời, đề tài cũng nghiên cứu tìm hiểu loại môi

trường nuôi cấy nhằm tăng khả năng phát triển thành cây in vitro sau khi hình thành

phôi soma, nhằm tăng số lượng và khả năng sống sót trước khi chuyển ra trồng trong bầu đất

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 G IỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây sâm Việt Nam

1.1.1.1 Phân lo ại

Theo Hoàng Thị Sản (2003), Đỗ Huy Bích và cs (2004), cây sâm Việt Nam được phân loại như sau:

Giới : Plantae (Thực vật) Ngành : Magnoliophyta (Ngọc Lan)

Lớp : Magnoliopsida (Ngọc Lan)

Bộ : Araliales (Nhân sâm)

Họ : Araliaceae (Nhân sâm)

Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv

Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng

Tên khác: Sâm Việt, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Sâm trúc, Sâm đốt trúc, Trúc tiết nhân sâm, Củ ngải rọm con, Thuốc dấu (dân tộc Xê Đăng)

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây sâm Việt Nam là loài cây thân thảo đa niên (thậm chí trên 100 năm), cao

40 – 100 cm, sinh trưởng chậm (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích và cs., 2004) Cây sâm Việt Nam có hai loại thân là thân khí sinh (mọc trên mặt đất) và thân

rễ (nằm dưới mặt đất) (Hình 1.1a) Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, đường kính 4 – 8 mm, thường tàn lụi hàng năm, thỉnh thoảng cũng tồn

tại vài thân trong vài năm Lá của cây sâm Việt Nam thuộc loại lá kép chân vịt, mọc vòng (Hình 1.1b) Cuống lá kép dài 6 – 12 mm, mang 3 – 5 lá chét ở ngọn thân khí sinh, lá chét chính giữa lớn hơn cả với chiều dài lá 10 – 15 cm, chiều rộng 3 – 5 cm Phiến lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng cưa nhỏ Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp gân phụ hình mạng Phiến lá màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông tơ ở hai mặt, mặt dưới ít hơn Cây sâm Việt Nam từ 1 – 3 năm tuổi chỉ có một lá kép duy nhất, từ năm tuổi thứ 4 trở đi mới có 2 đến 3 lá

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của cây sâm Việt Nam

(a) Cây sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha et Grushv.; (b) Lá cây sâm Việt Nam

ở Tu Mơ Rông (Kon Tum); (c) Hoa; (d) Quả

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam; the-gioi.html; http://samngoclinh.com; http://tuoitre.vn/Sam-Ngoc-Linh.html)

http://www.tienphong.vn/VungsamNgocLinhlonnhat-Cụm hoa được hình thành ở cây sâm Việt Nam trên 4 – 5 năm tuổi, mọc thành tán đơn ở ngọn thân khí sinh, cuống hoa dài 10 – 20 cm, có thể kèm 1 – 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính (Hình 1.1c) Mỗi tán có 60 – 100 hoa,

cuống hoa ngắn từ 1 – 1,5 cm, đài có 5 răng dài, hoa có 5 cánh, màu lục vàng với 5

nhị, chỉ nhị hình sợi, màu trắng; bầu trên 1 ô với 1 vòi nhụy Hoa nở từ tháng 4 đến tháng 7, ra quả từ tháng 9 – 10 hàng năm Quả hạch, hình trứng, màu đỏ thắm, có

một chấm đen ở đỉnh (Hình 1.1d) Quả mang 1 – 2 hạt hình thận, màu trắng ngà, có vân, mỗi cây trung bình có khoảng 10 – 30 quả Quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông và sẽ nẩy mầm vào đầu mùa xuân năm sau (Phạm Hoàng Hộ, 2000;

Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Thân rễ (căn hành) nạc, mọc bò ngang như củ gừng, trên hoặc dưới mặt đất khoảng 1 – 3 cm, đường kính 1 – 2 cm, dài 30 – 40 cm, mang nhiều rễ phụ, có nhiều đốt cong ngoằn ngoèo, không phân nhánh, dài 3 – 15 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm Vỏ của thân rễ có màu nâu nhạt hay màu vàng xám, ruột màu trắng ngà,

phần cuối thân rễ đôi khi có một củ hình cầu Thân rễ cứng, giòn, có mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị đắng, hơi ngọt Mỗi năm, từ đỉnh chồi của thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân khí sinh mới Thân rễ mang những vết sẹo do thân khí sinh rụng hàng năm để lại Mỗi vết sẹo tương đương 1 năm tuổi của cây sâm Căn cứ vào các vết sẹo trên thân rễ, người ta tính được tuổi của cây sâm (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Rễ củ có dạng hình con quay dài 2,4 – 4 cm, đường kính 1,5 – 2 cm, thường hợp thành bó 2 – 4 rễ củ hình thoi Rễ củ có màu nâu nhạt, có những vân ngang và nốt các rễ con (Hình 1.1a) Thể chất của củ nạc, chắc, khó bẻ gãy, củ có vị đắng, nhưng hơi ngọt (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Cây sâm Việt Nam có đặc điểm hình thái tương tự với những cây sâm khác

trong chi Panax (Hình 1.2)

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái của một số loài sâm trong chi Panax

a Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.),

b Sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A Meyer),

c Sâm Mỹ (Panax quinquefolius),

d Sâm Nhật (Panax japonicus C.A Meyer)

(Nguồn: tai-vung-dat-moi;http://www.gfmer.ch/Atlas_medicinal_plants/Panax_ginseng.htm; http://fdlserver.wordpress.com/2008/07/03/chi-sam;http://aobayama.miyakyo.ac.jp)

http://mobi.vietbao.vn/vi/Khoa-hoc/Di-thuc-thanh-cong-sam-Ngoc-Linh-1.1.1.3 Phân b ố và đặc điểm sinh thái

Trong số hơn 10 loài đã biết của chi Panax, ở Việt Nam có ba loài mọc tự

nhiên và một loài là cây nhập trồng Cây sâm Việt Nam là loài được phát hiện sau cùng Đến nay, cây sâm Việt Nam mới chỉ phát hiện được duy nhất ở vùng núi

Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có toạ độ địa lý từ 107o50’ – 108o7’ kinh độ Đông và từ 15o0’ –

15o10’ vĩ độ Bắc (Hình 1.3) Đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2.598 m Những điểm trước đây vốn có cây sâm Việt Nam mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1.500 – 2.200

m, chủ yếu tập trung ở độ cao 1.800 – 2.000 m thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam) Ngoài ra, cây sâm Việt Nam còn phân bố tại núi Ngọc Lum Heo (Quảng Nam), Đắc Glây (Kon tum), núi Langbian (Lâm Đồng) (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Hình 1.3 Vị trí địa lý của núi Ngọc Linh

(Nguồn: http://www.vacne.org.vn; http://samngoclinh.com/nuinlinh.jpg)

Cây sâm Việt Nam đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng già; độ che phủ có thể tới 80% hoặc hơn Cây sâm chỉ chịu được cường độ chiếu sáng bằng 1/3 ánh sáng toàn phần Môi trường rừng có cây sâm Việt Nam mọc tự nhiên luôn ẩm ướt và thường xuyên có mây mù Nhiệt độ ban ngày từ 20 – 25°C, ban đêm 15 – 18°C, lượng mưa xấp xỉ

3000 mm/năm Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước Trong cùng một quần thể sâm Việt Nam có nhiều cây ở các lứa tuổi khác nhau, điều đó chứng tỏ cây sâm Việt Nam có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt (Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

1.1.1.4 Thành ph ần hóa học

Cây sâm Việt Nam có hàm lượng saponin dammaran cao nhất (12 – 15%) và

số lượng các loại saponin nhiều nhất so với các loài khác của chiPanax Trong đó, saponin dammaran kiểu ocotillol với hàm lượng cao vượt trội (hơn 50% hoạt chất saponin) so với các loài sâm khác, đặc biệt là hợp chất tiêu biểu Majonoside-R2

(sâm Hàn Quốc không có) (Hình 1.4) Thân rễ và rễ củ của cây sâm Việt Nam chứa

32 hợp chất saponin nhóm triterpen, trong đó có 30 chất là saponin dammaran, là

hoạt chất có tác dụng giảm stress (Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Nguyễn Thượng Dong, 2007)

Theo Đỗ Huy Bích và cs (2004), Nguyễn Thượng Dong (2007), các hợp chất

thứ cấp hiện diện trong cây sâm Việt Nam ở hai phần chính:

a) Ph ần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ)

H ợp chất saponin: Thân rễ và rễ củ cây sâm Việt Nam có 52 hợp chất

saponin gồm 26 saponin đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật)

và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenoside-R1-R25 và G.Rh1

20-O-Me-+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol ở thân rễ và rễ củ chiếm tỉ

lệ cao hơn so với bộ phận nằm trên mặt đất, gồm 22 hợp chất với đại diện chính là ginsenoside-Rb1, -Rb3, -Rd

+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện chính là ginsenoside-Re, -Rg1, notoginsenoside-R1

+ Các saponin có cấu trúc ocotillol gồm 11 hợp chất, trong đó có hai loại saponin chính là Majonoside-R1 (0,14%) và Majonoside-R2 (5,29%) Đặc biệt Majonoside-R2 chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn phần từ phần dưới mặt đất

của sâm Việt Nam và trở thành hợp chất chủ yếu đặc trưng cho sâm Việt Nam + Các saponin dẫn chất của acid oleanolic chỉ chiếm tỉ lệ rất thấp là ginsenoside-R0 và hemsloside-Ma3

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của Majonoside-R2

(Nguồn: http://www.ykhoanet.com/NCKH/duoc04.htm)

H ợp chất polyacetylen: bảy hợp chất polyacetylen được phân lập ở phân

đoạn ít phân cực Năm hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là hai polyacetylen chính yếu; hai hợp

chất mới là 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E), 10(E)-trien-4,6-diyn-3,10-diol

H ợp chất steroid: β-sitosterol và daucosterin

(β-sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid)

Acid béo: 14 loại trong đó có các acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic

Acid amin gồm 18 loại (trong đó có đủ 8 loại acid amin không thay thế) như acid aspartic, acid glutamic, alanin, arginin, cystin, glycin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, prolin, serin, threonin, tryptophan, tyrosin, valin Một số acid amin có tỉ lệ rất cao như arginin 46,66%, lysin 17,90% và

tryptophan 10,20% đã được xác định có khả năng chống lão hóa tế bào

Nguyên t ố đa lượng, vi lượng: 20 loại trong đó có K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe,

Co, Zn, Se có tác dụng sinh học

H ợp chất glucid gồm đường tự do 6,19% và đường toàn phần 26,77%

Các thành ph ần khác như tinh dầu 0,05 – 0,1%, vitamin C 0,059%

b) Ph ần trên mặt đất (lá)

Hợp chất saponin có 19 saponin dammaran đã được phân lập gồm 11 saponin

đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8

+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol

+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol

+ Các saponin có cấu trúc ocotillol chỉ có một loại saponin chính là Vinaginsenoside-R1 (0,155%)

1.1.2 Ngu ồn gốc, lịch sử phát triển trồng và khai thác cây sâm Việt Nam

Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, cây sâm Việt Nam đã được các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc

Xê Đăng sử dụng để chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền Năm

1973, khu Y tế Trung Trung Bộ cử một tổ 4 cán bộ dodược sĩ Đào Kim Long làm trưởng đoàn, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược sĩ Trần Thanh Dân đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum Tháng 3 năm 1973, đoàn đã phát hiện hai cây sâm đầu tiên ở độ cao 1800 m so với mực nước biển và sau đó là một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc Linh Sau 15 ngày nghiên cứu về hình thái, sinh thái, quần

thể, phân bố, di cư và phát tán, dược sĩ Đào Kim Long đã xác định núi Ngọc Linh là

quê hương của cây sâm mới, chưa từng xuất hiện tại bất cứ nơi nào khác trên thế

giới Ngày 8/6/1973, dược sĩ Đào Kim Long – chủ nhiệm đề tài nghiên cứu sâm

Việt Nam – đã đặt tên khoa học cho loài sâm mới là Panax articulatus KL Dao

(trong kháng chiến để giữ bí mật nên thường gọi là Sâm K5) Năm 1978, tại một vùng dài hàng chục kilô mét trên vùng núi Ngọc Linh, người ta đã tìm thấy khoảng 6.000 – 7.000 cây sâm mọc dày đặc với mật độ từ 1 cây/m2 đến 7 – 8 cây/m2 Nǎm

1979, qua đợt điều tra ở 5 xã của huyện Trà My tỉnh Quảng Nam, người ta tìm thấy

1337 cây trong 211 ô tiêu chuẩn Trọng lượng trung bình thân rễ sâm là 5,26 g, số thân có trọng lượng trên 25 g là 7,39% và số thân rễ có trên 10 vết sẹo là 36,9% Đợt điều tra này đã thu được một thân rễ có tới 52 vết sẹo do thân khí sinh rụng hàng năm để lại (ước tính cây trên 50 năm tuổi) với đường kính 1,2 cm Trong

những đợt điều tra về sau còn phát hiện ra cây sâm khoảng 82 năm tuổi có rễ củ và thân rễ dài hơn nửa mét Năm 1985, cây sâm Việt Nam với tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Araliaceae (Nhân sâm) được công bố tại Viện Thực

vật Kamarov (Liên Xô cũ) do Hà Thị Dung và I.V.Grushviski đặt tên (Nguyễn

Ngọc Dung, 1995; Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Từ năm 1978, cây sâm Việt Nam bắt đầu được khai thác ồ ạt Cách tuyên truyền thái quá về tác dụng bảo vệ sức khoẻ đã khiến cây sâm Việt Nam đang trong

thời kỳ bị đe doạ tuyệt chủng Hai tỉnh Quảng Nam (trước đây là Quảng Nam – Đà

Nẵng) và Kon Tum đã kiên trì đầu tư để duy trì bảo tồn giống và hiện nay đã có khoảng 200.000 cây sâm Việt Nam ở các lứa tuổi khác nhau được trồng từ hạt dưới tán rừng, ở độ cao 1.800 m Cùng với việc nhân giống bằng hạt, phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật cũng đã được sử dụng nhằm xây dựng quy trình vi nhân

giống cây sâm Việt Nam Việc bảo vệ cây sâm Việt Nam và nghiên cứu nuôi trồng ngay tại quê hương của loài cây thuốc đặc biệt quý hiếm này hiện vẫn là nhiệm vụ hàng đầu trong công tác bảo tồn và phát triển cây sâm Việt Nam (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

1.1.3 Tác d ụng dược lý của sâm việt Nam

1.1.3.2 Tính năng và tác dụng dược lý

Những kết quả nghiên cứu dược lý thực nghiệm sâm Việt Nam đã chứng minh tác dụng chống stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch,

chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan Nghiên cứu dược

lý lâm sàng của cây sâm Việt Nam cũng cho kết quả tốt: bệnh nhân ăn ngon, ngủ

tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cải thiện, gia tăng sức đề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp Cây sâm Việt Nam còn có những tính năng như tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng sinh các tế bào mới Đặc biệt, cây sâm Việt Nam

có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống ôxi hóa và phối hợp tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Cây sâm Việt Nam được dùng làm thuốc bổ, thường dùng phối hợp với các vị thuốc bổ khí hoặc bổ huyết khác như sâm quy dưỡng lực, viên và chè sâm – đinh lăng, sâm cốt giao (gồm sâm Việt Nam và cao xương động vật) Gần đây, có một số

chế phẩm mới như viên ngậm sâm Việt Nam (Vinaginseng pastilles) (Hình 1.6), viên sâm Việt Nam (Vinapanax), rượu ngọt Vinapanax (hoặc tinh sâm K5) (Đỗ Huy Bích và cs., 2004; Nguyễn Thượng Dong, 2007)

1.1.4 B ảo tồn và nhân giống

Việc khai thác, mua bán và sử dụng tràn lan đã khiến trên 108 vùng có cây sâm mọc tự nhiên giữa Quảng Nam và Kon Tum dần cạn kiệt, kéo theo hàng ngàn hecta rừng nguyên sinh bị tàn phá nặng nề Trước nguy cơ tuyệt chủng của cây sâm Việt Nam, Chính phủ Việt Nam đã quyết định thành lập vùng cấm quốc gia ở khu vực có cây sâm mọc tập trung tại hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, đồng thời đưa cây sâm Việt Nam vào danh sách cấm khai thác, mua bán bất hợp pháp Để bảo

vệ và phát triển cây thuốc này cùng một số cây dược liệu khác, Trại Dược liệu Trà Linh được thành lập tại Quảng Nam Từ nǎm 1985, trại đã áp dụng các biện pháp bón phân và chǎm sóc để tǎng nǎng suất thân rễ, tǎng tỷ lệ nẩy mầm và tỷ lệ cây

sống Tính đến tháng 4/1987, trại đã thu được 53,3 kg thân rễ, trồng được 81.000 cây sâm; tháng 9/1992 trại đã có 100.000 cây Từ tháng 1/1995, công việc nghiên

cứu gieo trồng cây sâm Việt Nam được tiến hành một cách có hệ thống hơn tại Trại

Dược liệu Trà Linh, với việc nhân giống bằng cây lai hữu tính và vô tính, gia tăng

diện tích trồng, vận động bà con dân tộc thiểu số trong vùng nhận giống về nuôi

trồng Đặc biệt, với việc áp dụng thành công phương pháp nhân giống vô tính bằng cách ươm đoạn đầu của thân rễ trong túi polyethylen hoặc ươm trên đất mùn cho tỷ

lệ sống và đâm chồi tới 65% Cây sâm có nguồn gốc từ phương pháp nhân giống vô tính mọc khỏe, nhanh, ra hoa sớm, năng suất thân rễ và củ cao hơn so với cây mọc

từ hạt (Đỗ Huy Bích và cs., 2004)

Năm 2004, Chính phủ đã đồng ý cho tỉnh Kon Tum triển khai dự án Bảo tồn

và phát triển cây sâm Việt Nam của Nhà nước, nhưng tình trạng đào trộm cây sâm khi đang nuôi trồng thường hay xảy ra nên rất khó kiểm soát, quản lý Do không đáp ứng đủ nhu cầu cung cấp nguyên liệu, tháng 11/2005, Xí nghiệp Dược phẩm tỉnh Kon Tum đã phải ngừng sản xuất ba chế phẩm từ cây sâm Việt Nam là tinh sâm nước, tinh sâm viên, viên ngậm Độ an toàn của cây sâm Việt Nam còn thấp và

mức độ đe dọa vẫn ở bậc E trong Sách đỏ Việt Nam Chính phủ Việt Nam và Bộ Y

tế đang từng bước nghiên cứu giải pháp đầu tư phát triển bền vững cho công nghiệp dược phẩm và xuất khẩu Việc đưa cây sâm Việt Nam trở thành cây trồng chính cho vùng cao, khai thác lợi thế khí hậu, thổ nhưỡng để trồng sâm theo hướng sản xuất hàng hóa và tạo vùng nguyên liệu, hướng tới khẳng định một thương hiệu sâm Việt Nam như sâm Triều Tiên, sâm Trung Quốc, sâm Nhật Bản hay sâm Mỹ Cùng với hướng mở rộng diện tích trồng cây sâm Việt Nam là sự nghiêm cấm khai thác khi cây sâm còn non (chưa đủ 6 tuổi), đồng thời các nhà khoa học cũng tiến hành nghiên cứu thăm dò tại những vùng núi khác có khí hậu, cao độ tương đương thuộc Trung Trung Bộ để xác định và mở rộng vùng sinh trưởng của sâm (Đỗ Huy Bích

và cs., 2004)

1.1.5 Tình hình nghiên c ứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước và trên th ế giới

1.1.5.1 Tình hình nghiên c ứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước

Từ năm 1973, nhiều công trình nghiên cứu về cây sâm Việt Nam đã được thực

hiện trên các lĩnh vực khác nhau như tạo nguồn nguyên liệu, vi nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào, nghiên cứu chế phẩm, nghiên cứu phân tích di truyền, nghiên

cứu hóa học và tác dụng sinh học

Về nuôi cấy mô tế bào thực vật, cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu cơ bản được thực hiện như tạo sinh khối ban đầu từ mẫu cấy phiến lá, cuống lá, thân rễ và rễ củ; xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu; nghiên cứu nâng cao hoạt chất trong sinh khối sâm Việt Nam Nguyễn Ngọc Dung (1995) đã nghiên cứu tìm ra môi trường tạo mô sẹo và tái sinh chồi bất định Nhờ phương pháp kích hoạt neutron và huỳnh quang tia X tại Viện Hạt nhân Đà Lạt, thành phần đất tự nhiên của cây sâm Việt Nam đã được phân tích, từ đó đề xuất môi trường nuôi cấy

mô có thành phần khoáng đa lượng, vi lượng thích hợp Trong đó, đạm nitrat rất thấp, K và P cao vì cây sâm Việt Nam là cây tạo củ tổng hợp saponin, cần trao đổi đường nên phải có K giúp cây tạo củ Các vi lượng Mn cao gấp 2 lần, B và Zn gấp 1,5 lần so với môi trường nuôi cấy thông dụng Khi đạm thấp thì bổ sung thêm casein thủy phân và dịch nấm men Vì nuôi cấy mô cây thuốc nên auxin như 2,4-D

đã được thay bằng nước dừa, đường, sữa, đậu nành, v.v và các CĐHSTTV có nguồn gốc tự nhiên hoặc không gây độc Hướng nghiên cứu tạo ra cây sâm hoàn

chỉnh từ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật được triển khai bước đầu và phát triển mạnh, tuy nhiên tỉ lệ sống của cây sâm Việt Nam in vitro khi chuyển ra bầu đất trong điều kiện ex vitro còn rất thấp và tăng trưởng yếu

Nguyễn Trung Thành và cs (2007) tạo được mô sẹo từ rễ sâm Việt Nam trên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 1 mg l-1 2,4-D và 0,1 mg l-1Kin, đồng thời cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ môi trường,

nồng độ đường và các khoáng đa lượng lên sự tăng sinh khối và tạo ginsenoside của

mô sẹo cây sâm Việt Nam trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc Kết quả cho thấy nồng

độ đường 50 g l-1 tối ưu cho sự tăng sinh khối và tạo ginsenoside, nồng độ các khoáng KNO3, MgSO4 và CaCl2 cao trong khi NH4NO3 thấp thích hợp cho sự tích lũy ginsenoside Năm 2009, Nguyễn Thành Sum và cs đã nuôi cấy các mẫu củ của cây sâm Việt Nam trên môi trường MS bổ sung 30 g l-1 sucrose, 8 g l-1 agar, 3 mg l-12,4-D Mô sẹo và rễ bất định hình thành tốt nhất sau 2 tháng nuôi cấy Sau đó,

những đoạn cắt dài 1 cm của mẫu rễ bất định này khi được chuyển sang môi trường White bổ sung 30 g l-1 sucrose, 8 g l-1 agar, 3 mg l-1 NAA đã cho kết quả tăng sinh

khối rất khả quan Kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới: tạo sinh khối rễ sâm

Việt Nam trong thời gian ngắn, số lượng nhiều thay vì phải nuôi trồng từ cây con

mất đến 5 – 6 năm mới được thu hoạch, nhưng vốn đầu tư lớn, năng suất không cao

Với mẫu ban đầu là củ sâm tự nhiên, Nguyễn Hữu Hổ và cs (2009) nghiên

cứu thành công tạo được rễ in vitro từ hai nguồn vật liệu khác nhau của cây sâm

Việt Nam là cây in vitro trên môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 NAA, 1g l-1 than

hoạt tính và mô sẹo trên môi trường MS có 2 mg l-1 IBA Trong nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hổ và cs (2009), khi rễ in vitro được tiếp tục nuôi cấy, mô sẹo có khả

năng sinh phôi soma được hình thành và phôi ở các giai đoạn khác nhau như phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi, phôi có hai lá mầm sau 2 – 2,5 tháng nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg l-1

Nhut và cs (2006) đã nghiên cứu thành công môi trường nhân nhanh rễ bất định, bước đầu định tính, định lượng saponin trong sinh khối sâm Việt Nam nuôi

cấy in vitro, xác định được dư lượng CĐHSTTV trong các loại sinh khối này Môi

trường khởi tạo mô sẹo tốt nhất là môi trường MS được bổ sung 1 mg l-1

2,4-D Năm 2010, Dương Tấn Nhựt và cs đã nghiên cứu thành công môi trường nhân nhanh mô sẹo và chồi từ các mẫu củ cắt mỏng của cây sâm Việt Nam tự nhiên 10

năm tuổi Môi trường cảm ứng và tăng sinh khối mô sẹo tốt nhất là môi trường MS

bổ sung 1 mg l-1

2,4-D kết hợp với 0,2 mg l-1 TDZ trong điều kiện chiếu sáng 16

giờ/ngày Chồi của cây sâm Việt Nam in vitro tái sinh từ mô sẹo tốt nhất trên môi

trường SH (Schenk và Hildebrandt, 1972) bổ sung 1 mg l-1 NAA, 1 mg l-1 BA và 2 g

l-1 than hoạt tính Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường MS1/2 được bổ sung 0,5 mg l-1 NAA, 1 mg l-1 BA, 50 g l-1 sucrose và 2 g l-1 than hoạt tính, đặt trong điều kiện ánh sáng đèn LED 70% đỏ và 30% xanh là tốt nhất Các tác giả cũng đã nghiên cứu con đường phát sinh phôi vô tính từ mô, tế bào của lá, thân rễ

và rễ củ Hiện tại, có trên 2.000 cây sâm Việt Nam in vitro từ 2 tháng – 2 năm tuổi được trồng trong điều kiện ex vitro Kết quả cho thấy cây sâm Việt Nam in vitro có

tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với cây sâm Việt Nam gieo bằng hạt ngoài tự nhiên, với tỉ lệ sống là 87% sau 6 tháng trồng trong vườn ươm tại khu vực núi Ngọc Linh (Dương Tấn Nhựt và cs., 2010) Nhut và cs (2012) đã chứng minh ảnh hưởng

của spermidine, proline và nguồn cacbohydrat đến sự phát sinh phôi soma từ rễ cây sâm Việt Nam nuôi cấy lớp mỏng Môi trường MS bổ sung 1 mg l-1 2,4-D, 0,5 mg l-

1

NAA và 0,2 mg l-1 Kin, 50 g l-1 sucrose, 8,5 g l-1 agar thích hợp cho sự phát sinh phôi soma, đồng thời bổ sung 0,1 mM spermidine hoặc 300 mg l-1proline làm tăng

tần suất phát sinh phôi (93,3% và 86,7%)

Năm 2010, Nguyễn Thị Quỳnh và cs đã bắt đầu nghiên cứu sự phát sinh hình thái của cây sâm Việt Nam qua nuôi cấy in vitro tại phòng Công nghệ Tế bào Thực

vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Các bộ phận của cây sâm Việt Nam in vitro đều có

hợp chất saponin dammaran tương tự như cây sâm Việt Nam ngoài tự nhiên, nhưng hàm lượng thấp hơn (Hình 1.7) (Tài liệu nội bộ chưa công bố)

Hình 1.7 Sắc kí đồ của sinh khối cây sâm Việt Nam in vitro nuôi cấy tại

Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Sắc kí đồ do Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM thực hiện vào tháng 3/2012

1.1.5.2 Tình hình nghiên c ứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trên thế giới

Nghiên cứu nuôi cấy cây Nhân sâm Panax ginseng được bắt đầu vào những

năm đầu thập niên 60 của thế kỉ XX và nhiều nghiên cứu được công bố trong vòng

10 năm tiếp theo Các nghiên cứu chủ yếu về mô sẹo, dòng tế bào, nuôi cấy in vitro

và thu được các hợp chất thứ cấp từ mô, tế bào nuôi cấy của các loài sâm thuộc chi

Panax Tuy chưa có công trình nào của thế giới nghiên cứu về vi nhân giống cây sâm Việt Nam, một số nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học và dược lý của cây sâm Việt Nam có sự hợp tác của các chuyên gia nước ngoài (Duc và cs., 1993,

1994 a và b)

1.2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp nuôi cấy in vitro mô hoặc tế bào

đã tách rời ra khỏi cơ thể thực vật trong môi trường thích hợp để chúng trở lại trạng thái chưa phân hóa có khả năng phân chia tế bào và biệt hoá thành mô, cơ quan, phát triển thành cây con mới Tất cả mọi tế bào của một cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, nghĩa là chứa bộ gen y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể đều có khả năng tổng hợp những loại protein – enzym giống nhau và nếu tế bào được nuôi dưỡng trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên

vẹn đặc trưng cho loài và ra hoa, kết quả bình thường Nhân giống vô tính in vitro

bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật có nhiều ưu điểm như có thể nhân giống cây trồng trên quy mô công nghiệp, rút ngắn thời gian chọn giống do hệ số nhân giống cao,

tạo ra các sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền, giữ nguyên được tính trạng của cây

mẹ, tái sinh, phục tráng được các giống cây quý bị nhiễm bệnh virus, bị thoái hóa,

tạo được các giống sạch bệnh, có phẩm chất tốt như mong muốn, nhanh chóng tạo

ra thế hệ các cây đồng hợp tử rất cần cho phân tích di truyền và ứng dụng thực tiễn (Nguyễn Như Khanh, 2009; Nguyễn Quang Thạch, 2009)

1.2.1 L ịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Haberlandt (1902) đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật nhưng chưa thu được kết quả, các mẫu nuôi cấy không có sự tái sinh Winkler (1902) đã nhận

thấy tế bào noãn trương lên khi hạt phấn nảy mầm và đề nghị có thể nuôi cấy các

mô, tế bào soma tách rời trong một giọt dịch cùng với ống phấn để lợi dụng các chất

tiết ra của ống phấn kích thích tế bào nuôi cấy phân chia Ngoài ra, ông còn đề nghị

bổ sung vào môi trường dinh dưỡng dịch chiết của các mô dinh dưỡng khác, ví dụ như dịch chiết của túi phôi Winkler cho rằng bằng cách này có thể nuôi cấy thành công tế bào soma tách rời thành phôi được gọi là phôi nhân tạo (artificial embryo) Năm 1939, White và Gautheret đã sử dụng môi trường nuôi cấy Knop có bổ sung thêm vitamin nhóm B và CĐHSTTV mới phát hiện là auxin (IAA – Indol-3-acetic acid), thu được những kết quả rất đáng khích lệ trong việc nuôi cấy hệ rễ cây

cà chua và sự phân chia, tái sinh của mô cây liễu

Cùng với sự phát hiện ra nhóm CĐHSTTV tiếp theo là cytokinin, Skoog và Miller (1957) đã chỉ ra rằng tỉ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy có tác

dụng quyết định sự phân hóa mô sẹo thuốc lá nuôi cấy theo hướng tạo rễ hoặc chồi

Tỉ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo rễ, ngược lại tỉ lệ auxin/cytokinin thấp kích thích tạo chồi

Sự phát sinh phôi soma được nghiên cứu đầu tiên trong nuôi cấy dịch treo tế bào (Stewart và cs., 1958) và từ nuôi cấy mô sẹo (Reinert, 1959) ở cà rốt (Daucus carrota) Nhiều loài thực vật đã được cảm ứng để tạo phôi soma như bắp cải

(Brassica oleracea), đu đủ (Carica papaya), cà phê chè (Coffea arabica), cam (Citrus sinensis), thuốc lá (Nicotiana tabacum), thông (Pinus ponderosa) và mía (Saccharum officinarum) (Ammirato, 1983)

Murashige và Skoog (1962) đã đề xuất môi trường nuôi cấy MS và sau đó môi trường này trở thành môi trường cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật

1.2.2 S ự phát sinh mô sẹo

Kĩ thuật nuôi cấy mô phát triển đầu tiên vào thập niên 20 và nuôi cấy mô sẹo

là kĩ thuật đầu tiên được sử dụng Rất ít thực vật không tạo được mô sẹo sau khi xử

lý (Yu, 2000) Mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương hoặc xử lý CĐHSTTV, do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là sự tạo rễ Cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh

(như 2,4-D) được áp dụng riêng hay phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000) Theo Bùi Trang Việt (2000), sự tạo mô sẹo in vitro nhờ auxin thuộc về một

trong ba quá trình:

- Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô: nhu mô gỗ và libe, nhu mô vỏ hay lõi

- Sự phân chia của tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe-mộc) Các tế bào tượng

tầng của phần lớn cây hai lá mầm dễ phân chia dưới tác động của auxin, thậm chí không cần auxin ngoại sinh như ở các loài cỏ hay dây leo

- Sự xáo trộn của mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) – mô phân sinh cấp một Quá trình này thường được áp dụng ở cây một lá mầm vì không có tượng tầng điển hình

và các tế bào nhu mô khó phản biệt hóa

1.2.3 Sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro

Sự hình thành các cơ quan của cơ thể là một trong những vấn đề căn bản và

phức tạp nhất của sinh học Vài bằng chứng thực nghiệm gần đây cho thấy sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc vào hai quá trình cơ bản, đó là sự điều hòa hướng kéo dài tế bào và sự kiểm soát vị trí, hướng mặt phẳng phân chia của tế bào Chính

kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể

thực vật Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện tới nguồn gốc và sự phát triển của thực vật Hai phương pháp thực nghiệm thường được dùng nhất là cắt

bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh, theo dõi các biến đổi phát triển sau đó và nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của cơ

thể thực vật Trong thí nghiệm nuôi cấy in vitro, các nghiên cứu sinh lý thường khó

tiến hành do kích thước các loại mô nuôi cấy quá nhỏ nên việc áp dụng các CĐHSTTV là cách hữu hiệu để tìm hiểu sự phát sinh hình thái của thực vật (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự gia tăng kích thước tế bào có thể xảy ra theo mọi hướng như ở các tế bào

mô sẹo, mô lá hay mô dự trữ (củ khoai tây), nhưng tế bào thường kéo dài theo trục

dọc của cơ thể Sự kéo dài tế bào liên quan chặt chẽ với khả năng kéo dài và sự sắp

xếp của các vi sợi cellulose (Bùi Trang Việt, 2000)

1.2.3.1 S ự phát sinh rễ

Sự kéo dài rễ được thực hiện nhờ mô phân sinh ngọn rễ Trong vùng kéo dài (cách ngọn rễ vài cm), các tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh ngọn vừa kéo dài vừa phân hóa Sự gia tăng đường kính được thực hiện nhờ các tầng phát sinh libe – gỗ

và sube – nhu bì (ở cây hai lá mầm chỉ có hoạt động tạo mô) hoặc nhờ sự phát triển

của các tổ chức sơ cấp có nguồn gốc từ mô phân sinh ngọn (ở cây một lá mầm) (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự tạo rễ phụ từ một nhóm tế bào ở tương đối sâu bên trong rễ chính, gồm ba giai đoạn chính sau: sự phản phân hóa của một nhóm tế bào nằm tương đối sâu bên trong các tế bào chu bì hay tế bào bao quanh tầng phát sinh nếu rễ già hơn, sự tái thiết lập hoạt tính phân chia của các tế bào trên theo cách của tế bào mô phân sinh

ngọn để tạo sơ khởi rễ, sơ khởi rễ tiêu hủy nhu mô vỏ và kéo dài ra ngoài (Hình 1.8)

Sự tạo rễ bất định (từ các cơ quan không phải là rễ) gồm hai giai đoạn là tạo sơ

khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe – gỗ và kéo dài sơ khởi rễ Theo Bùi Trang Việt (2000), sự tạo sơ khởi rễ được khởi phát bởi auxin ở nồng độ cao, còn sự kéo dài sơ khởi rễ được kích thích bởi auxin ở nồng độ thấp

1.2.3.2 S ự phát sinh chồi

Trong quá trình sinh phôi, mô phân sinh ngọn chồi phát triển ở vùng giữa hai

sơ khởi lá mầm (cây hai lá mầm) hay ở gốc thuẫn (cây một lá mầm) Đặc điểm quan

trọng của mô phân sinh ngọn chồi là sự phân lớp và vùng Vùng đỉnh gồm các tế bào tương đối lớn chứa không bào to, hoạt tính phân chia thấp được gọi là vùng mô phân sinh chờ, chỉ hoạt động khi mô phân sinh ngọn chuyển sang trạng thái sinh

sản Vùng bên có các tế bào nhỏ, hoạt tính phân chia mạnh gọi là vùng phát sinh cơ quan hay vùng khởi sinh, nơi phát sinh lá và mô dẫn của thân Vùng lõi chứa vài dải

tế bào xếp chồng lên nhau là vùng phát sinh mô lõi (Hình 1.9) Chồi hiện diện ở

ngọn thân (chồi ngọn) hay nách lá (chồi nách) Chồi ngọn được tạo bởi mô phân sinh ngọn và các phác thể lá xếp chồng lên nhau Chồi nách có nguồn gốc ngoại sinh Thân phát triển từ chồi ngọn, nhánh từ chồi nách Trong sự nhân giống sinh dưỡng, các nhánh có thể phát triển từ chồi bất định hình thành trên thân hay lá, từ các tế bào biểu bì hay dưới biểu bì (Bùi Trang Việt, 2000)

Hình 1.8 Sự phát triển rễ phụ từ trụ bì của rễ chính (Tài liệu giảng dạy Cao

học của Bùi Trang Việt, 2010)

Hình 1.9 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây sâm Việt Nam in vitro

tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

1.2.4 S ự phát sinh phôi soma

1.2.4.1 Khái ni ệm phôi soma

Phôi soma là cấu trúc được hình thành và phát triển từ các tế bào sinh dưỡng,

có thể phân hóa thành cấu trúc lưỡng cực (một cực hình thành rễ, cực kia tạo ra

chồi) giống như phôi hợp tử và không có liên kết hệ thống mạch với tế bào gốc ban đầu, trong những điều kiện thích hợp có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh Trong quá trình phát sinh phôi soma, tế bào sinh dưỡng đóng vai trò sinh phôi như hợp tử và sự phát triển của phôi soma cũng trải qua các giai đoạn tương tự như sự sinh phôi hợp tử Phôi soma chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi

hữu tính, có mầm rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh chồi rễ Sự phát sinh phôi soma dễ hay khó tùy từng loài, mô, tế bào thực vật và các điều kiện nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000; Dương Tấn Nhựt, 2009) Đặc điểm của phôi soma là có đặc tính di truyền giống cây mẹ, tạo được “hạt

giống nguyên thủy” là phôi soma thay vì sử dụng hạt tự nhiên, sạch bệnh, loại bỏ điều kiện ngoại cảnh, diện tích canh tác, công chăm sóc và có thể đạt sản lượng cao trong thời gian ngắn (Nguyễn Ngọc Dung, 1995)

Bảng 1 1 Phân biệt phôi soma với phôi hợp tử

Phôi hợp tử (phôi hữu tính) Phôi soma (phôi vô tính)

- Hình thành từ hợp tử (do sự thụ tinh

giữa giao tử đực và giao tử cái) Hợp tử

lưỡng bội phân cắt nguyên nhiễm nhiều

lần và phát triển thành phôi

- Luôn đi kèm với nội nhũ, cơ quan dự trữ

năng lượng và chất dinh dưỡng cho quá

trình nẩy mầm

- Dây treo dài (Hình 1.10)

- Hình thành từ tế bào sinh dưỡng, trải qua quá trình phát triển như một cấu trúc phôi

bào sinh dưỡng nên cây trưởng thành từ phôi soma giống hệt cây mẹ (Nguyễn Ngọc Dung, 1995)

Đặc điểm của tế bào phôi soma là tế bào chất đậm đặc, chứa nhiều hạt tinh bột

lớn, hạch nhân lớn, bắt màu đỏ với phẩm nhuộm acetocarmin, hàm lượng protein và RNA cao, có biểu hiện hoạt tính dehydrogenase cao với thuốc thử tetrazolium (McWilliam và cs., 1974)

Hình 1.10 Sự phát triển của phôi hợp tử ở Capsella.

(Nguồn:http://vietsciences1.free.fr/vietscience/biology/sinhhocdaicuong.htm)

Hình 1.11 Sự phát sinh phôi soma ở xoài (Mangifera indica L.)

A- Phôi hình cầu, B- Phôi hình tim, C- Phôi hình thủy lôi, D- Phôi nẩy mầm, E- Tái sinh thành cây con (Nguồn: http://www.as-bcst.sinica.edu.tw)