khảo sát khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm chất kháng sinh của chủng trichoderma cf aureoviride sau đột biến

Các chủng Trichoderma được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ qua khảo sát đã xác định được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp các CKS đối kháng với các tác nhân gây bệnh cho người v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Phan Văn Giác

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ ĐẶC

ĐIỂM CHẤT KHÁNG SINH CỦA CHỦNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Phan Văn Giác

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ ĐẶC ĐIỂM CHẤT KHÁNG SINH CỦA CHỦNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi; những

s ố liệu trong luận văn này là trung thực, chưa ai công bố và kết quả thể hiện qua

các thí nghi ệm

Tác gi ả luận văn

Phan Văn Giác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành lận văn này, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

TS Trần Thanh Thủy – Người đã trực tiếp định hướng, giúp đỡ và tạo điều kiện

thu ận lợi để tôi thực hiện đề tài này

Xin ghi nh ớ công ơn tất cả Thầy, Cô khoa Sinh học-Đại học Sư phạm Thành ph ố Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học

t ập

Xin chân thành c ảm ơn các bạn học viên cao học khóa 19 và 20, đặc biệt là bạn

Tr ần Thị Minh Định, Nguyễn Xuân Đức, Trần Thị Ái Liên, Nguyễn Thị Thu Nga đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Sở Giáo dục và Đào tạo Tây Ninh, các đồng nghiệp ở Trường THPT Lộc Hưng, THPT Nguyễn Trãi đã luôn giúp đỡ, động viên và t ạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học

Cu ối cùng xin gửi lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã luôn yêu thương và ủng hộ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và thực

hi ện luận văn này

MỤC LỤC

L ỜI CAM ĐOAN 3

L ỜI CẢM ƠN 4

MỤC LỤC 5

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH M ỤC CÁC HÌNH 8

DANH M ỤC CÁC BẢNG 11

PH ẦN I MỞ ĐẦU 13

1.Lý do ch ọn đề tài 13

2 M ục đích nghiên cứu 14

3 Nhi ệm vụ nghiên cứu 14

4 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu 14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15

1.1 T ỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH 15

1.1.1 L ịch sử nghiên cứu chất kháng sinh [9],[20] 15

1.1.2 Đặc điểm cơ bản của các chất kháng sinh [7],[21] 16

1.1.3 CKS t ừ nấm sợi 18

1.1.4 Cơ chế tác động của CKS [4], [9], [20] 19

1.1.5 Ứng dụng của chất kháng sinh 20

1.2 VI N ẤM TRICHODERMA VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH 22

1.2.1 Phân lo ại vi nấm Trichoderma [6],[7],[13] 22

1.2.2 Phân b ố của chi Trichoderma 22

1.2.3 Đặc điểm hình thái 23

1.2.4 Các ch ất có hoạt tính sinh học từ Trichoderma 24

1.2.5 Tình hình nghiên c ứu ứng dụng CKS của Trichoderma trong nông nghiệp trên thế gi ới và Việt Nam 27

1.3 GÂY ĐỘT BIẾN Ở VI NẤM BẰNG TIA UV 28

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG 31

2.2 HÓA CH ẤT VÀ THIẾT BỊ 31

2.3 CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG 32

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Kh ảo sát đặc điểm của chủng Trichoderma cf.aureoviride và kết quả gây đột biến ch ủng T cf.aureoviride bằng tia tử ngoại (tia UV) 41

3.1.1 Đặc điểm của chủng Trichoderma cf.aureoviride 41

3.1.2 K ết quả gây đột biến chủng T cf.aureoviride bằng tia tử ngoại 42

3.2 Kh ảo sát các điều kiện MT ảnh hưởng đến hoạt tính kháng sinh của các chủng 48 3.3 Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp CKS của chủng T cf.aureoviride và chủng ĐB108 62

3.4 Kh ảo sát đặc điểm dịch KS thô 65

3.4.1 Độ bền nhiệt 65

3.4.2 Độ bền pH 66

3.4.3 Độ bền thời gian 68

3.4.4 Tách chi ết CKS bằng dung môi hữu cơ 69

3.5 Tác d ụng của dịch chiết KS thô với các VSV kiểm định 73

3.5.1 Tác d ụng của dịch chiết KS thô với các nấm gây bệnh cây trồng 73

3.5.2 Tác d ụng của dịch chiết KS thô với các tác nhân gây bệnh cho người 73

PH ẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

I K ẾT LUẬN: 76

II ĐỀ NGHỊ: 77

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 78

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của T viride 14

Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thimine 20

Hình 3.1 Hình thái đại thể chủng T cf.aureoviride 34

Hình 3.2 Hình thái vi th ể của chủng T cf.aureoviride 35

Hình 3.3 Hoạt tính ĐK với B subtilis của chủng gốc T cf.aureoviride 35

Hình 3.4 Hình thái đại thể chủng ĐB108 38

Hình 3.5 Hình thái vi thể chủng ĐB108 39

Hình 3.6 Hình thái đại thể chủng ĐB2.23 40

Hình 3.7 Hình thái vi thể chủng ĐB2.23 40

Hình 3.8 Hình thái đại thể chủng ĐB283 41

Hình 3.9 Hình thái v i thể chủng ĐB283 41

Hình 3.10 Ảnh hưởng của MT đến hoạt tính KS của chủng T cf.aureoviride 43

Hình 3.11 Ảnh hưởng của MT đến hoạt tính KS của chủng ĐB108 43

Hình 3.12 Bi ểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng của chủng T cf.aureoviride và ch ủng ĐB108 44

Hình 3.13 Bi ểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính ĐK của chủng T cf.aureoviride và ch ủng ĐB108 45

Hình 3.14 Bi ểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của chủng T cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 46

Hình 3.15 Đồ thị ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CKS của ch ủng T cf.aureoviride và chủng ĐB108 49

Hình 3.16 Bi ểu đồ ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng sinh trưởng của ch ủng T cf.aureoviride và chủng ĐB108 49

Hình 3.18 Bi ểu đồ ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của chủng T cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 51

Hình 3.19 Đồ thị ảnh hưởng của nguồn ni tơ đến khả năng hình thành CKS của

Hình 3.24 Đồ thị động thái lên men của chủng T cf.aureoviride 59

Hình 3.25 Đồ thị động thái lên men của chủng đột biến ĐB108 59

Hình 3.26 Đồ thị ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS trong dịch lên men của

chủng T cf.aureoviride và chủng ĐB108 63

Hình 3.27 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến độ bền của dịch KS thô của chủng T

cf.aureoviride và chủng ĐB108 64

Hình 3.28 Độ bền thời gian của dịch KS thô chủng T cf.aureoviride 64

Hình 3.29 Độ bền thời gian của dịch KS thô chủng ĐB108 64

Hình 3.30 Đồ thị thể hiện hoạt tính KS của dung môi và dịch lên men sau lắc 6 giờ

Hình 3.35 Khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng KS của chủng ĐB108 và

chủng T cf.aureoviride 70

Hình 3.36 Kh ả năng kháng Klesbsia sp của chủng T cf.aureoviride và chủng

ĐB108 71

B ảng 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh

t ổng hợp CKS của chủng T cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108

B ảng 3.10 So sánh khả năng sinh tổng hợp CKS của hai chủng nghiên cứu trước và

sau khi t ối ưu 60

Bảng 3.11 Độ bền nhiệt của KS trong dịch lên men của chủng T cf.aureoviride và

chủng ĐB108 61

Bảng 3.12 Độ bền pH của KS trong dịch lên men của chủng T cf.aureoviride và

chủng ĐB108 62

Bảng 3.13 Độ bền thời gian của KS trong dịch lên men của chủng T cf.aureoviride

và chủng ĐB108 63

B ảng 3.14 Hoạt tính của dung môi và dịch lên men sau khi lắc 6 giờ 65

Bảng 3.15 Hoạt tính đối kháng của dung môi và dịch lên men sau khi lắc

PHẦN I MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đã từ lâu, nghiên cứu về các chất kháng sinh (CKS) luôn là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Trong đó, CKS từ vi sinh vật (VSV), đặc biệt là NS được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất bởi vai trò quan trọng và khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống

Một ứng dụng quan trọng hàng đầu của CKS là sử dụng trong y học chữa bệnh cho con người Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong thời gian qua đã làm mất

khả năng chữa bệnh của các loại kháng sinh trước đây, do đó việc tìm ra CKS mới là việc làm cấp bách hiện nay

Ngoài ra, các CKS còn được sử dụng trong việc phòng trừ các loại nấm gây hại trên các loại cây trồng Các CKS dùng trong bảo vệ thực vật có tác dụng chọn lọc cao, độc tố

thấp, nhiều chất bị phân giải trong điều kiện tự nhiên do đó không gây ô nhiễm môi trường,

có khả năng ức chế các VSV kháng thuốc

Nhờ đó, CKS được tổng hợp từ nấm sợi đã góp phần tích cực trong việc giúp con người chống lại các bệnh tật cũng như tiêu diệt các tác nhân gây bệnh trên vật nuôi, cây trồng

Thời gian gần đây, các loài nấm sợi của chi Trichoderma đã được biết đến với khả

năng sinh các CKS tác động lên các VSV khác, hoạt động như một tác nhân kiểm soát sinh

học Khả năng tấn công của Trichoderma spp đối với các nấm gây bệnh đã được biết đến từ rất lâu Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng của Trichoderma viride đối với nấm bệnh trên rau diếp là Botrytis cinerea Ngày nay, người ta còn biết sử dụng Trichoderma để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh nấm ở rễ (như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora , ) và cả các bệnh ở các phần trên mặt đất (như Botrytis cinerea)

Các chủng Trichoderma được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ qua khảo sát đã

xác định được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp các CKS đối kháng với các tác nhân gây bệnh cho người và cây trồng Tuy nhiên, hiệu suất tạo các chất có hoạt tính sinh học của các chủng này chưa đáp ứng được yêu cầu ứng dụng thực tiễn Từ đó, đòi hỏi nâng cao chất lượng chủng giống nghiên cứu để có thể ứng dụng trong thực tiễn Một trong những biện pháp được sử dụng nhiều đối với VSV là xử lý gây đột biến các chủng hiện có để tạo ra các

chủng có năng suất sinh tổng hợp các sản phẩm cao hơn Đây là việc làm rất cần thiết và có

ý nghĩa thực tiễn cao

Vì những lí do như trên, chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp

và đặc điểm chất kháng sinh của các chủng Trichoderma cf.aureoviride sau đột biến”

2 M ục đích nghiên cứu

Nghiên cứu chọn lọc chủng Trichoderma cf.aureoviride đột biến có khả năng sinh

tổng hợp CKS cao làm cơ sở cho việc ứng dụng

3 N hiệm vụ nghiên cứu

− Khảo sát đặc điểm của chủng gốc Trichoderma cf.aureoviride

− Gây đột biến chủng Trichoderma cf.aureoviride bằng tia UV

− Chọn lọc các chủng nấm sợi đột biến có khả năng tổng hợp chất kháng sinh cao hơn

chủng ban đầu

− Xác định điều kiện môi trường tối ưu cho quá trình tổng hợp chất kháng sinh của

chủng gốc và chủng đột biến

− Thu nhận CKS thô, nghiên cứu đặc điểm dịch chiết KS thô

4 T hời gian và địa điểm nghiên cứu

− Thời gian: từ tháng 10/2010 đến tháng 07/2011

− Địa điểm: thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh-Sinh hóa, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh

PH ẦN II NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh [9],[20]

Người đầu tiên đặt nền móng cho việc nghiên cứu CKS là Alexander Fleming Vào

năm 1928, tại phòng thí nghiệm bệnh viện Xanh Mary ở Luân Đôn, A.Fleming đã phát hiện

thấy một hiện tượng lạ: trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn Staphylocoocus aureus bị nhiễm một

loại nấm mốc xanh và xung quanh vùng nấm mọc, vi khuẩn không thể phát triển được Điều

đó chứng tỏ loại nấm này tiết ra một chất ức chế sự phát triển và tiêu diệt S aureus A Fleming đã phân lập, định danh loại vi nấm này là Penicillium notatum và đặt tên cho chất

kháng khuẩn ấy là penicilin

Hơn một thập kỉ sau (1940), H.W Florey, E Chain và Heatley đã tiếp tục nghiên cứu

để sản xuất penicilin Chúng được sản xuất với số lượng lớn và trở thành “loại thuốc thần kì” Sự khám phá ra giá trị to lớn của penicilin đã thực sự mở ra kỉ nguyên mới trong y học – kỉ nguyên chất kháng sinh

Sau penicilin, hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện Năm 1939, R.J Dubos phát

hiện ra gramixidin và tiroxidin (1938), Waksman phát hiện ra streptomyxin (1944), Ehrlich phát hiện ra cloramphenicol (1947), Duggar phát hiện ra clotetraxyclin (1948)…

Tốc độ tìm kiếm các chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh Nếu từ năm 1945 người ta chỉ mới phát hiện được 30 chất thì đến 1953 gần 150 chất và đến 1970 có hơn 270 CKS được đưa vào sản xuất Tính đến nay số lượng CKS được phát hiện tới trên 1700 chất [11] Theo thống kê năm 2002, thị trường CKS trên thế giới đạt 26 tỉ đôla/năm và vẫn tiếp

tục tăng 0,6% từ năm 2002 – 2008 Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ sản xuất CKS trong nền kinh tế quốc dân Tuy nhiên, sự xuất hiện ngày càng nhiều các

vi khuẩn đa kháng thuốc cùng sự thiếu hụt các kháng sinh mới khiến chúng ta phải đối mặt

với “thời kì hậu KS” Giờ đây, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp này là: cải biến các

CKS cũ đồng thời với nghiên cứu phát hiện các CKS mới với cơ chế tác động mới hoàn toàn [11]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu CKS bắt đầu từ năm 1949 khi giáo sư, bác sĩ Đặng Văn

Ngữ thu được dịch lọc kháng sinh peniclin từ các chủng thuộc chi Penicillium dùng để rửa

vết thương cho thương binh trong chiến tranh Sau kháng chiến 9 năm, công trình này tiếp

tục được nghiên cứu tại trường Đại học Y dược Hà Nội Cho đến nay, việc nghiên cứu CKS

đã dành được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học đầu ngành Viện công nghệ Sinh học thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Các công trình công bố như

“nghiên cứu điều chế 6-APA, 7-ADCA và Cephalexin từ Penicillin” (đề tài cấp nhà nước năm 1999-2000); “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất các KS mới hiệu quả cao bằng nguyên liệu trong nước” (đề tài cấp nhà nước, 2001-2005); Đề tài “Dự án tiền khả thi nhà máy kháng sinh” của tổng công ty Dược Việt Nam; Tác giả Vũ Thị Đoan Chính (Trường ĐHKH Tự nhiên Hà Nội), người đầu tiên của Việt Nam nghiên cứu “ Sử dụng kĩ thuật gây đột biến trên tế bào trần để nâng cao hoạt tính KS của xạ khuẩn” Công trình nghiên cứu về

nấm sợi sinh CKS từ rừng ngập mặn 2 tỉnh Nam Đinh và Thái Bình (2002) của tác giả Mai

Thị Hằng (Trường ĐHSP Hà Nội) đã góp phần làm phong phú thêm vai trò của CKS từ nấm

sợi trong hệ sinh thái đặc biệt này [21]

1.1.2 Đặc điểm cơ bản của các chất kháng sinh [7],[21]

Có giả thuyết cho rằng CKS là cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong tự nhiên hoặc cạnh tranh môi trường dinh dưỡng Cũng có giả thuyết lại cho rằng CKS chỉ là sản phẩm thải của qua trình trao đổi chất của tế bào Thường CKS không có chức năng rõ rệt đối với các tế bào

sản sinh ra chúng và việc mất khả năng hình thành CKS không ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng của tế bào

Về mặt hóa học, CKS là nhóm rất đa dạng, chúng có trọng lượng phân tử biến động

từ 150-5000 dalton Thành phần một số kháng sinh chỉ chứa cacbon, hidro hoặc thường

chứa C, H, O, N và một số khác có S, P, halogen Trong phân tử kháng sinh thường chứa các nhóm chức như hydroxyl (– OH), cacboxyl (– COOH), cacbonyl (– CO), các nhóm định

chức chứa nitơ đồng thời có cấu trúc đặc trưng của chất hữu cơ (mạch béo, vòng béo, vòng thơm, polipeptit, dị vòng cacbonhydrat,…) Cho đến nay, CKS đều ở thể rắn, có cấu tạo hóa

học rất khác nhau, chúng gồm các nhóm sau:

- Nhóm β-lactam: chứa hệ thống vòng β-lactam, dị vòng phức tạp; Nhóm này

gồm các CKS như penicillin, monolactam, cephalosporin và nhiều nấm khác cũng sản sinh ra CKS chứa hệ thống vòng này

- Nhóm aminoglucoside: chứa nhiều các đường amin nối với các đường amin khác bởi liên kết glucoside như streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin

- Nhóm tetracylin: có cấu tạo hóa học vòng naphthalene, gồm clotetracylin, oxytetracylin, tetracylin,… có phổ kháng khuẩn rộng

- Nhóm mocrolit: chứa vòng laton lớn nối với aminosaccarose và nhóm polyen, tiêu biểu là erythromycin

- Nhóm polypeptit: có cấu tạo gồm các axít amin

Tùy theo mục đích và phương pháp nghiên cứu, các nhà nghiên cứu đã phân loại CKS theo nguyên tắc sau:

- Phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra CKS

- Phân loại theo phổ kháng sinh

- Phân loại theo cơ chế tác dụng

- Phân loại theo cơ chế sinh tổng hợp ra CKS đó

- Phân loại theo cấu tạo hóa học

Quá trình tổng hợp CKS chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố trong đó có thành phần môi trường (nguồn cacbon, ni tơ, nguyên tố vi lượng, phương pháp nuôi cấy, tuổi giống, độ thoáng khí,…) và điều kiện nuôi cấy Vì vậy, khi nuôi cấy người ta nghiên cứu tìm điều

kiện tối ưu cho các yếu tố trên để hiệu suất tổng hợp CKS cao nhất:

- Quá trình sinh trưởng và tổng hợp CKS chịu ảnh hưởng sâu sắc của nguồn thức ăn Tùy thuộc vào chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn (glucose, manitol, …) đường kép (saccarose, lactose,…) hoặc đường đa như tinh bột hay các chất có thành phần không xác định như rỉ đường

- Nguồn nitơ và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp CKS Sự dư thừa các amin hay các ni tơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS Quá trình sinh tổng hợp CKS ở nấm sợi thường cần cả hai nguồn nitơ

hữu cơ và nitơ vô cơ trong môi trường

- Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng từ 28 – 300

C

- Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc đáng kể vào pH môi trường, pH thích hợp cho việc

tổng hợp CKS là trung tính, môi trường hợp ngả về acid, pH acid hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS

Vai trò của phốtphát vô cơ cũng là một trong những yếu tố điều chỉnh sự tổng hợp CKS Nồng độ phốtphát thích hợp cho sinh tổng hợp CKS không quá 10mg/ml môi trường

Nồng độ chất này ban đầu cao sẽ làm tăng lượng acid nucleic trong tế bào, làm kéo dài pha sinh trưởng của VSV

Có nhiều nhóm VSV sinh tổng hợp được CKS, trong đó các CKS từ nấm sợi có nhiều đặc điểm thuận lợi hơn trong ứng dụng chăm sóc, bảo vệ sức khỏe của con người, đồng thời cũng được ứng dụng trong chăn nuôi và bảo vệ thực vật

1.1.3 CKS từ nấm sợi

Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên được nghiên

cứu trong lịch sử cũng như ứng dụng trong y học Các chất kháng sinh từ NS chiếm tỉ lệ khá

lớn và được ứng dụng nhiều trong thực tiễn Phần lớn NS có khả năng sinh CKS đều thuộc nhóm nấm bất toàn (Fungi imperfecti) CKS từ nấm sợi có khả năng ức chế các loại VK gây

bệnh như cephalosporin chống được cả VK G (+) lẫn VK G (-), đặc biệt, chúng có khả năng

chống nấm gây bệnh trên người, động vật và nấm gây bệnh cây trồng Ngày nay, các CKS

từ nấm sợi được sử dụng rộng rãi hơn trong công tác phòng chống tác nhân gây bệnh trên cây trồng

Một số CKS phổ biến có nguồn gốc từ NS:

- Penicilin: Lo ại kháng sinh nay do các loài nấm thuộc chi Penicillium sinh ra: P notatum, P baculatum, P chrysogenum ,… Người ta sử dụng các biến chủng của loài P chrysogenum để sản xuất chất kháng sinh này ở quy mô công nghiệp Penixillin là loại chất kháng sinh phổ rộng, được ứng dụng rộng rãi trong điều trị và được sản xuất với lượng lớn

nhất trong số các chất kháng sinh đã biết hiện nay Chung tác dụng lên hầu hết các VKG(+)

và thường được dùng để điều trị hầu hết các trường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ

cầu khuẩn, ví dụ viêm màng não, viêm tai mũi họng,…

- Cephalosporin: điển hình là Cephalosporin C được Newton và Abraham phát hiện

năm 1956 Người ta thường dùng các chủng của loài Cephalosporium acremonium để sản

xuất CKS này ở quy mô công nghiệp Cephalosporin C có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các cầu khuẩn có hoạt tính β-lactamase, với nhiều VK G (-) và hầu như không độc

- Griseofulvin: được Oxford và đồng nghiệp phát hiện năm 1939 từ nấm Penicillin grieeofulvum Lo ại kháng sinh này do nhiều loài NS sinh ra: P.janczewskii, P.nigricans, P.urticae, P.raistrickii, Asp.versicolor,… Hoạt tính kháng sinh điển hình của Grireofulvin là kháng nấm, nhất là các loài nấm có chứa kitin trong thành tế bào như các chi Trichophyton, Epidermophyton và Microsporum, nhưng hầu như không tác dụng lên nguyên sinh động vật,

bản chất hóa học, nồng độ chế phẩm, cấu trúc hiển vi của tế bào VSV và điều kiện biểu hiện

của chúng Khác với các chất độc, CKS có tác dụng đặc hiệu, tính đặc hiệu đó gắn liền với

cơ chế tác động Cùng một CKS nhưng ở những điều kiện khác nhau thì cơ chế tác động không hoàn toàn giống nhau Nhìn chung, cơ chế tác dụng của CKS được thể hiện theo các phương thức sau:

a Ức chế tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn:

Các nhóm KS thuộc kiểu tác động theo phương thức này gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác động lên quá trình tổng hợp thành tế bào nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

b Làm h ỏng màng nguyên sinh chất:

Các nhóm KS gồm colistin, polymyxin, gentamycin, amphoterricin Cơ chế làm mất

chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài

c Ức chế tổng hợp protein

Nhóm này gồm nhiều CKS như streptomycin, erythromycin, tetracylin, cloraphemicol,

… gây cản trở quá trình tổng hợp protein

d Ức chế tổng hợp acid nucleic

Các CKS có thể gắn vào acid nucleic (DNA, RNA) tạo thành phức phân tử bất hoạt, ngăn cản sự sao chép của các acid này

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin) Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA-gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleic Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

CKS nhóm này thì rất độc không những đối với VSV mà còn độc cho người và các VSV khác

mới được phát hiện nhưng mối lo ngại của con người về bệnh tật dường như không hề suy

giảm [11] Nguyên nhân do hiện tượng mầm bệnh vẫn còn sống sót sau khi đã điều trị kháng sinh hay còn gọi là hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng Hiện nay, hiện tượng kháng thuốc đã trở nên hết sức nghiêm trọng và đe dọa trực tiếp đến tính mạng toàn nhân

loại Một số loài VSV có khả năng kháng thuốc tự nhiên với một số loại kháng sinh nhất định, do thuốc này không tác động lên chúng Nhìn chung, các chủng VSV vốn nhạy cảm

với CKS lại trở nên kháng thuốc thường xảy ra khi chúng xuất hiện một trong các đặc điểm

mới như: có khả năng làm bất hoạt hay phá hủy CKS, có thể tự điều chỉnh khả năng hấp thu

của màng tế bào chất làm giảm hoặc ngăn ngừa CKS xâm nhập vào trong tế bào chất, hay chúng có thể tự điều chỉnh thay đổi đường hướng trao đổi chất để vô hiệu hóa CKS đó,…[10],[21]

- Sử dụng CKS trong chăn nuôi:

Trong chăn nuôi CKS được sử dụng để phòng và chữa các bệnh cho gia súc, gia cầm

và để kích thích sinh trưởng của động vật, nhất là các động vật còn non Các chất được sử

dụng rộng rãi hơn cả là penicillin, biomicillin, tetracyclin, grizin, tetramycin, xintomycin Ngoài ra người ta còn sử dụng một số chất khác như streptomycin, nixtatin [21]

Hiện nay, trên thị trường có nhiều chế phẩm chứa các CKS dùng cho chăn nuôi như: Biovit-20,40,80 (có 20, 40, 80 g kháng sinh trong 1kg sản phẩm và 3, 5, 8 microgam B12/1

g sản phẩm), chế phẩm oxy-tetracyclin có tetravit-P (tan), tetravit-K (thô) có 5, 20, 40, 50 g kháng sinh/ 1kg chế phẩm Đây là những sản phẩm được sử dụng nhiều do hiệu quả mang

lại cao cho người chăn nuôi trong việc bảo vệ động vật nuôi trước các bệnh tật

- Sử dụng CKS trong bảo vệ thực vật [10],[11],[21]

Trong trồng trọt, con người sử dụng CKS để phòng và chống các bệnh thực vật Lúc đầu, người ta sử dụng các CKS đã được dùng cho y học, chẳng hạn như penicillin, streptomycin,… Nhưng sau khi các CKS đã dược sử dụng khá phổ biến trong y học thì việc dùng quá rộng rãi các CKS này có thể làm xuất hiện các loại vi sinh vật kháng thuốc, và có

thể ảnh hưởng trực tiếp đến tác dụng chữa bệnh cho người Cho nên về sau người ta đã quyết định sản xuất những CKS dành riêng cho trồng trọt [11] So với thuốc hóa học, dùng CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao,

độ độc thấp, không gây ô nhiễm môi trường, có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học CKS và dịch lên men của các chủng VSV sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống

với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất

Ngoài tác dụng chữa bệnh, CKS còn được dùng sử dụng như là một chất kích thích sinh trưởng của thực vật Người ta đã chứng minh được rằng CKS có tác dụng làm cho cây mau lớn và xử lí hạt giống sẽ làm tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt Chẳng hạn penicilin và chlo-tetracylin kích thích sự sinh trưởng của củ cải và đậu Một số CKS có tác dụng gián tiếp kích thích sinh trưởng của thực vật bằng cách làm tăng số lượng các VSV có lợi trong vùng

rễ thực vật, một số khác lại làm tăng số lượng nốt sần của cây họ đậu Ở Việt Nam, hướng

đi mới trong bảo quản sau thu hoạch là sử dụng chế phẩm chứa CKS giúp hoa quả vừa giữ được độ tươi lâu vừa tránh nấm gây thối quả Cho đến nay, việc sử dụng CKS trong nông nghiệp vẫn được xem như biện pháp an toàn, hiệu quả, tăng năng suất cũng như phẩm chất cây trồng

Như vậy, các CKS có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của con người Việc phát

hiện và ứng dụng CKS trong đời sống đã mang lại cho con người một công cụ hữu hiệu để phòng chống các nguyên nhân gây ra bệnh tật cho mình cũng như bảo vệ vật nuôi và cây

trồng Tuy nhiên, viêc sử dụng CKS không đúng qui định trong thời gian qua đã làm cho con người biết đến hiện tượng kháng CKS của tác nhân gây bệnh Do đó, con người phải đi

tìm những loại CKS mới hữu hiệu hơn, tiêu diệt được nhiều loại tác nhân hơn, đặc biệt là các tác nhân đã lờn thuốc Trong quá trình đó, CKS từ các loài vi nấm thuộc chi

Trichoderma cũng là một hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế

giới trong thời gian qua

1.2 VI NẤM TRICHODERMA VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT

KHÁNG SINH

1.2.1 Phân loại vi nấm Trichoderma [6],[7],[13]

Số lượng các loài thuộc chi Trichoderma được phát hiện ngày càng nhiều trong thời

gian gần đây Tuy nhiên, Trichoderma được xem là nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho

công tác phân loại vì các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn chưa được tìm hiểu và phân tích đầy đủ

Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuel da Silva, Trichoderma thuộc họ

Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; chi Trichoderma được chia thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum

Theo Nguyễn Lân Dũng và một số nhà khoa học khác, chi Trichoderma thuộc lớp

Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae

Dựa vào việc phân tích trình tự của một số gen đặc trưng như ITS, tef, rpb hay ech24, Druzhinina và cs (2006) đã phân loại Trichoderma như sau:

1.2.2 Phân bố của chi Trichoderma

Trichoderma phân bố rộng rãi, có thể phân lập từ đất, phát triển được trên nhiều loại

cơ chất (sáp, gỗ, thép không gỉ và các nấm khác) [28],[29] Trichoderma spp là nhóm vi

nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc Hầu hết là những

vi sinh vật hoại sinh, nhưng chúng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác

Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật Chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực Bắc đến những vùng núi cao

cũng như miền nhiệt đới Nhưng hình như có một sự tương quan nào đó giữa sự phân bố các loài và các điều kiện môi trường [28]

T polysporum và T viride có m ặt ở vùng khí hậu lạnh trong khi T harzianum có ở

các vùng khí hậu nóng Điều này tương quan với nhu cầu nhiệt độ tối đa cho từng loài

Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt,

những khu rừng khác nhau Giá trị aw nhỏ nhất là 0,91 ở 250

C T hamatum và T pseudokoningii có thể chịu độ ẩm cao hơn so với những loài khác Tuy nhiên, các loài

Trichoderma spp thường không chịu được độ ẩm thấp và điều này được cho là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt trong những nơi ẩm thấp Các loài Trichoderma spp khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau [10],[23]

Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid Theo Gochenaur (1970) có thể có

sự tương quan giữa sự hiện diện của T.viride với đất acid trong vùng khí hậu lạnh rất lạnh ở Peru Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất

kiềm nếu như ở đó có sự tập trung đủ một lượng CO2 và bicarbonate cần thiết [23]

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển trong đất có độ pH từ 2,5 – 9,5; phát

triển tốt ở pH: 4,5 – 6,5 Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 300

Trichoderma cũng có các đặc điểm cấu tạo như những tế bào nấm sợi khác

Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục

đậm Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, khuẩn lạc có thể đạt đường kính từ

2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C

Theo Prasun và Kanthadai (1997), hình thái khuẩn lạc và bào tử Trichoderma khác

nhau khi ở những điều kiện khác nhau Ở 350

C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường

với sự hình thành bào tử nhỏ và mép khuẩn lạc bất thường, ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.[26]

Hầu hết các loài Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính (chỉ một vài

giống sinh sản hữu tính), chúng sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty

Khuẩn ty của Trichoderma không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều Ở cuối

nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, thường không màu, liên kết với nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy Bào tử của Trichoderma có

hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn

Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 1,0 μm, được bao bọc bởi một lớp màng mỏng gọi là thành tế bào Thành tế bào không chứa cellulose như ở thực vật mà chứa chitin và một số thành phần khác như polysaccharide, lipid, protein, hexozamin, chất màu Màng tế bào chất dày khoảng 7 μm chứa lipid (40%) và protein (38%) Nhân phân hóa, thường có hình tròn

và đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 – 3 μm Ty thể có hình elip và luôn di động

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của T viride

(A: khuẩn lạc, B: bào tử và khuẩn ty) 1.2.4 Các chất có hoạt tính sinh học từ Trichoderma

- Các chất kháng sinh từ Trichoderma [13]

Trichoderma spp sản xuất nhiều loại kháng sinh và danh sách ngày càng được kéo dài thêm Các CKS từ Trichoderma bao gồm: gliotoxin, glioviridin (một dikitopiperazin),

sesquiterpenoids, trichothecenes (trichodermin), cyclic peptides, isocyanid- bao gồm các

chất chuyển hóa (trichoviridin) (Brewer và cs, 1982) Trong đó, những CKS phổ biến ở

nhóm Trichoderma là:

- Gliotoxin: chất này được R.weindling và O Emerson mô tả năm 1936

do nấm T lignorum tạo thành Gliotoxin được hình thành từ loài T virens (hay còn tên khác là Gliocladium virens) [29] Trichoderma sinh KS gliotoxin với điều

kiện oxi phải cao Gliotoxin được tích lũy nhiều trong dịch môi trường và thường

ở giai đoạn phát triển sớm của nấm Trichoderma Gliotoxin có phổ tác động rộng

lên nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm

- Viridin: được phát hiện vào năm 1945, chất này được hình thành trong

hoạt động sống của Trichoderma Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và có

hoạt tính chống nấm cao (Weindling và Emerson 1936; Weindling 1941)[28]

- Trichodermin: được phát hiện vào năm 1975 ở Nhật Bản khi các tác

giả Atsushi, Shunsuke nuôi cấy loài T koningii và T aureoviride Theo Dennis và Webster (1971), hai loài T polysporum và T viride cũng hình thành trichodermin [28]

Trichoderma cũng sinh ra nhiều loại hợp chất ức chế dễ bay hơi có thể trợ giúp cho

sự hình thành khuẩn lạc của chúng trong đất (Dennis và Webster, 1971) [28] Các chất này kìm hãm sự phát triển của nhiều loài vi khuẩn và nấm kí sinh gây bệnh ung thư

Pseudomonas tumefaciens, P tabacum, P fluorescens, Xanthomonas phaseoli, Botrytis cinerea, Helminthosporium sativum, Fusarium culmorum, F sporotrichiella…

Trichoderma sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất (polyketid, terpeniod và polypeptid) Vấn đề độc tố của Trichoderma chưa được biết đến

non Hệ enzyme ở Trichoderma [13],[14],[15],[16]

Theo tác giả Đinh Minh Hiệp và cộng sự, Trichoderma là nhóm nấm hình thành

nhiều loại enzyme khác nhau Ngày nay, các enzyme do Trichoderma đã được tìm hiểu và ứng dụng nhiều lĩnh vực trong đời sống của con người Trichoderma sinh tổng hợp nhiều hệ

enzyme ngoại bào như chitinase, β- glucanase, cellulase và protease phân hủy nguồn xác bã

thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong quá trình hoại sinh và kí sinh, cạnh tranh nguồn

dinh dưỡng với các loài nấm đối kháng Bên cạnh đó, Trichoderma còn có khả năng kích

thích hệ rễ thực vật phát triển cũng như gián tiếp kích hoạt sự biểu hiện một số gene trong

cơ chế phòng vệ của thực vật chống lại nấm gây bệnh

Một trong những ứng dụng được quan tâm nhiều nhất của Trichoderma là khả năng

kiểm soát sinh học, chúng có khả năng kháng phổ rộng nấm gây bệnh ở thực vật như

Sclerotium rolfsii, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani…gây ra (Maoa và cs,2000; Kulling

và cs,2000) [42] Hoạt tính kháng nấm có được bởi hoạt động phân giải nhanh sợi nấm và các bào tử đang nảy mầm Do đó, hoạt tính phân giải tỉ lệ thuận với khả năng kiểm soát sinh

học các tác nhân gây bệnh trong điều kiện in vivo [47] Lorito và cộng sự (1994) cho rằng các enzyme thủy giải chitin và glucan từ T atroviride P1 tương tác đồng thời với nhau trong

việc ức chế sự nảy mầm và kéo dài sợi nấm của Botrytis cinerea Những enzyme này là

công cụ hiệu quả cho việc phân giải hoàn toàn các vách tế bào nấm và bào tử của các nấm gây bệnh (Flatch và cs,1992) [32] Đối với nấm gây bệnh R solani, các enzyme phân giải

các loại đường (carbohydrolase) của T harzianum giải phóng các oligosaccharide từ vách tế

bào nấm này có lẽ cảm ứng sinh tổng hợp một lượng lớn các enzyme phân giải vách tế bào

nấm từ T harzianum [26] Chitinase và β-glucanase ở Trichoderma được xem như các

enzyme quan trọng, quyết định đến khả năng phân giải vách tế bào nấm trong suốt quá trình

kí sinh lên nấm gây bệnh thực vật của Trichoderma (de la Cruz và cs,1992,1995;Lorito và

cs,1994) [40] Sridevi và cs (2006) đã biến nạp biểu hiện đồng thời hai gene mã hóa chitinase (chi11) và β-1,3-glucanase giúp cây lúa (Oryza sativa L.) tăng khả năng chống

chịu bệnh đốm vằn

T harzianum ALL42 có kh ả năng tăng sinh và phân hủy R solani và Macrophomina phaseolina, qu ấn quanh tơ nấm ở thể xâm nhiễm Tơ nấm T.harzinum ALL42 không quấn quanh tơ nấm Fusarium sp cho thấy tính kháng nấm có thể khác nhau giữa các tác nhân gây

bệnh thực vật Hệ protein ngoại bào được tiết ra từ T.harzinum ALL42 nuôi cấy trên môi trường có vách tế bào của M phasealina, Fusarium sp., và R solani được phân tích bằng điện di 2 chiều và phổ MALDI-TOF Tổng cộng có 60 protein được tiết ra từ T harzianum

ALL42 Xác nhận 7 protein được tạo ra do cảm ứng với vách tế bào nấm, hơn 53 protein còn lại chưa xác định Có thể đây là những protein mới hay chưa được giải trình tự Endochitinase, β-glucosidase, α-mannosidase, acid phosphatase, α-1,3-glucanase và protease xác nhận bằng điện di trên gel là những enzyme hiện diện trong dịch nuôi cấy (Monteiro và cs, 2010), [45]

Pan và cs (1991) đã hoàn thiện qui trình native-PAGE trong việc khảo sát sự hiện

diện của endochitinase, β-1,3-glucanase, một số protease và những enzyme có khả năng phân giải mạnh thành phần vách tế bào của một số loài nấm bệnh.Từ đó native-PAGE trở thành một công cụ mạnh cho việc phân tách và kiểm tra sự hiện diện của các dạng isoform khác nhau của cùng một enzyme Zaldivar và cs (2001) đã sử dụng phương pháp native-PAGE cho việc kiểm tra sự hiện diện và đánh giá hoạt tính của các isozyme endochitinase,

β-1,3-glucanase từ chủng T aureoviride hoang dại và chủng đột biến 7-12 trên các cơ chất

chủng Trichoderma Các chủng Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi

trường cũng ảnh hưởng đến cả sản lượng và chất lượng kháng sinh tạo ra Hơn nữa, các chất kháng sinh cũng tác động đặc hiệu vào các tác nhân gây bệnh khác nhau (Claydon và cs,

1987; Dennis và Webster, 1971a,b; Ghisaberti và Sivasithamparam, 1991; Howell và Stipnovic, 1995).[27],[28]

1.2.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng CKS của Trichoderma trong nông nghiệp trên

thế giới và Việt Nam

Rất nhiều loài Trichoderma có khả năng kiểm soát tất cả các loài nấm gây bệnh khác

Tuy nhiên, một số loài thường có hiệu quả hơn những loài khác trên một số bệnh nhất định Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ

yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium Quá trình đó được gọi là: kí sinh nấm (mycoparasitism) Trichoderma tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của các loài nấm khác Sau đó, nó có thể tấn công vào bên trong loài nấm gây hại đó và tiêu thụ chúng

Chủng Trichoderma harzianum T-22 được sử dụng nhiều do nó sinh ra các enzym

endochitinase cao hơn các chủng hoang dại Sự kết hợp này cho phép nó bảo vệ vùng rễ của cây trồng chống lại các loại nấm gây thối rễ trên đồng ruộng

Hiện nay, loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như không được

đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản

xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng

vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây

Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây Hiện nay, một loài nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ

mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây

cảnh có khả năng chịu được hạn hán

Đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm Trichoderma dòng T22 ở

rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây không có sự hiện diện của loài

nấm này ở rễ

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông

Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả

rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm

Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một

số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani

Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân

chậm tan Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân

hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như

loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai), phân của công ty Điền Trang (Tp Hồ Chí Minh) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả

Tuy nhiên, các chủng phân lập được từ tự nhiên chưa có khả năng tổng hợp các enzymes và CKS cao Để có thể đưa các chủng vi nấm sản sinh các enzyme cũng như các CKS vào sản xuất ở qui mô công nghiệp thì yêu cầu đặt ra là phải nâng cao năng suất sinh

tổng hợp của các chủng giống Đối với VSV, từ lâu các nhà nghiên cứu đã áp dụng phương pháp gây đột biến nhân tạo để nâng cao chất lượng của các chủng giống, trong đó gây đột

biến bằng tia UV đóng vai trò quan trọng

1.3 GÂY ĐỘT BIẾN Ở VI NẤM BẰNG TIA UV

Vi nấm nói chung, Trichoderma nói riêng đều có thể xuất hiện các đột biến Tần số

xuất hiện đột biến tự nhiên là rất thấp, nằm trong khoảng 10-5 – 10-8 Con người đã sử dụng các tác nhân đột biến gây nên các đột biến nhân tạo hay cảm ứng để nâng cao tỉ lệ các đột

biến phát sinh Các đột biến này gồm nhiều loại khác nhau và chúng được thu nhận dễ dàng

nhờ các phương pháp phát hiện chuyên biệt Các tác nhân gây đột biến (mutagen) bao gồm các tác nhân vật lí (như phóng xạ, tia X, tia tử ngoại), nhiều hóa chất như các đồng đẳng của các base nitric, HNO2 (nitrous acid), các chất alxyl hóa mạch

Đối với các vi nấm, các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia tử ngoại và một số hóa

chất Tia tử ngoại có bước sóng dài (10-5

- 10-6 cm) nên khó tạo ion, có lẽ chỉ tác động đến

những chất hấp thu nó trực tiếp Trong tế bào, các chất hữu cơ có mạch vòng chủ yếu như purine và pirimidine hấp thu trực tiếp tia tử ngoại Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại

và các cấu phần của DNA đã được chứng minh DNA hấp thu tia tử ngoại mạnh nhất ở bước sóng 2537Ǻ, đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến

Cơ chế tác động của tia UV như sau:

Dưới tác động của tia tử ngoại, cytosine gắn thêm phân tử nước vào liên kết C = C của

mạch vòng (hình 3.6) và thymine bị đứt liên kết C = C mạch vòng nối 2 phân tử thành thymine dimer

Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thimine

Stone và các cộng sự đã nhận thấy tần số đột biến tăng lên ở Staphylococcus aureus

khi môi trường nuôi chúng được chiếu tia UV trong thời gian ngắn trước khi cấy vào Đây

là tác động gián tiếp của tia tử ngoại

Có thể khi hiện diện oxygen, tia tử ngoại tạo ra nhiều hơn các gốc peroxide :

H* + O2 → HO*

2

HO*2 + H* → H2O2 2HO*2 + H* → H2O2 + O2

Các peroxide là những phân tử có phản ứng mạnh, chúng dễ tạo các đột biến

Tia tử ngoại mặc dù có khả năng gây đột biến cao ở VSV nhưng sau khi chiếu tia tử ngoại lên tế bào, nếu để ngoài ánh sáng, thì các sai hỏng phần lớn được phục hồi Ánh sáng

có tác động hoạt hóa enzyme sửa sai, cắt đứt các thymine dimer Hiện tượng này gọi là

Các thimine kề nhau Chiếu tia tử ngoại UV

quang ph ục hồi (photoreactivation) Trong quá trình xử lý VSV bằng tia UV, cần phải chú ý

hiện tượng này

Bằng cách sử dụng tia X và tia UV trên loài Penicillium chrysogenum ở Mỹ, qua nhiều

lần chọn lọc ngày nay thu được chủng đột biến E.15.1 có sản lượng penicilin cao hơn rất nhiều lần so với chủng ban đầu (chủng E.15.1 có sản lượng là 6000mg/l, chủng ban đầu có

sản lượng 60mg/l) Wang và cộng sự đã dùng tia UV để gây đột biến loài Trichoderma reesei ở các mốc thời gian khác nhau, kết quả tạo được chủng đột biến M23 có gen pyrG đột

biến mã hóa enzymes phân giải uridine [56] Theo tác giả Phương Phú Công (2004), chủng

Apergillus Gm56 sau khi được xử lý bằng tia UV đã thu được 30 chủng đột biến sống sót có

một số đặc điểm hình thái và sinh lí khác nhau Trong đó 29/30 chủng đột biến vẫn giữ được đặc điểm ban đầu của chủng là khả năng sinh xylansae, nhưng đều yếu so với chủng gốc,

chỉ duy nhất một chủng thu được sau khi xử lý UV trong 10 phút (ký hiệu Apergillus

ĐB106) có khả năng sinh xylanase cao hơn chủng gốc 15% - 25% Chủng đột biến này được sử dụng để nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzymes thô sử dụng đơn độc hoặc kết hợp

với các sản phẩm khác vào thức ăn cho gà và lợn đã làm tăng trọng gà lên 16-27%, lợn là 20kg/con

8-Tóm l ại: Trichoderma là một nhóm nấm có nhiều đặc điểm ưu việt để ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực, trong đó có các CKS do các loài thuộc chi Trichoderma sinh ra Việc nghiên

cứu và nâng cao năng suất sinh tổng hợp CKS của chủng ban đầu là một yêu cầu quan trọng khi muốn đưa các chủng giống này vào thực tiễn sản xuất Trong các nhân tố gây đột biến, tia UV là tác nhân phù hợp để xử lý và gây đột biến chủng gốc Trichoderma nhằm thu được

các chủng đột biến có năng suất sinh tổng hợp CKS cao hơn

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG

2.1.1 Chủng Trichoderma cf.aureoviride phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ trong

bộ sưu tập giống của PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp.Hồ Chí Minh

2.1.2 Vi sinh v ật kiểm định

- Vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli nhận từ bộ sưu tập giống của PTN

Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp.HCM

- Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus nhận từ viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh

- Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin, E coli kháng ampicillin, Streptococcus pyogenes nhận từ Trung tâm Sâm và Dược liệu

Tp HCM

- Vi nấm gây bệnh Phytophthora palmivora, Colletotrichum sp nhận

từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM

- Vi nấm gây bệnh cây trồng Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani nhận

được từ tác giả Nguyễn Thị Thu Nga, Bộ môn Bệnh cây trồng Khoa Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Cần Thơ

− Tủ ấm (Memmert, CHLB Đức)

− Tủ lạnh (National, Nhật)

− Tủ sấy (Memmert, CHLB Đức)

− Máy lắc (Gerhardt, CHLB Đức)

− Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

− Máy li tâm (Hettich, CHLB Đức)

− Kính hiển vi (Omlympus, Nhật)

− Máy chụp ảnh kỹ thuật số (Omlympus, Nhật)

− Máy đo pH (Windaus, Mỹ)

− Tủ giữ giống (Sanyo, Nhật)

− Cân phân tích điện tử (Sartorius, CHLB Đức)

MT 3: Môi trường Math Extract agar (MEA-Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm sợi RNM )

MT 5: Môi trường Meat Extract Petone agar (MPA-Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn kiểm định)

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Kh ảo sát đặc điểm hình thái nấm sợi và định danh nấm sợi [5]

a/ Quan sát đại thể nấm sợi (Phương pháp tạo KL khổng lồ)

Nuôi cấy NS trên ống thạch nghiêng trong thời gian 5 ngày

Cho vào ống thạch nghiêng chứa 5 ml nước cất vô trùng, lắc đều để tạo dung dịch huyền phù

Dùng que cấy chấm vào dịch huyền phù, sau đó nhanh chóng chấm điểm lên mặt

thạch ở giữa đĩa pêtri chứa MT 2

Quan sát sự hình thành và phát triển của KL dựa trên các đặc điểm sau:

- Hình thái, kích thước (đường kính) khuẩn lạc

- Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…),

màu sắc mặt trên và mặt dưới, dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…)

- Giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc), mùi khuẩn lạc (có, không mùi), sắc tố hoà

tan (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có

- Các cấu trúc khác: bó sợi, bó giá (Synnematous or sporodochial conidiomata)

các cấu trúc mang bào tử trần (Fruit body - conidiomata) như đĩa giá (acervuli) hoặc túi giá (Pycnidia), đệm nấm (Stroma), hạch nấm (sclerotia) vv

b/ Quan sát vi th ể nấm sợi (Phương pháp làm phòng ẩm) [4], [5]

Chuẩn bị môi trường thạch YEA, đổ 1 lớp thật mỏng khoảng 1mm trên bề mặt đĩa pêtri Khi thạch đã đông hoàn toàn thì dùng dao vô trùng cắt thành từng mẩu hình vuông,

Sau thời gian nuôi giữ 2 ngày, khẽ gỡ lamen ra, úp lên 1 phiến kính sạch có bề mặt thuốc nhuộm gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lamen lên trên Quan sát tiêu bản ở vật kính x40, x100 và mô tả các đặc điểm sau:

- Sợi nấm có phân nhánh hay không, sợi nấm có hay không có vách ngăn

- Giá bào tử, các thể bọng, thể bình

- Màu sắc, hình dạng, kích thước bào tử, bào tử có gai hay không có gai

Chụp hình kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần

2.4.2 Phương pháp gây đột biến

a/ Nguyên t ắc chung

Khi được chiếu dưới đèn UV thì bào tử đang nảy mầm của nấm sợi sẽ bị đột biến

b/ Cách ti ến hành

Chủng gốc Trichoderma được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày

Cho vào ống giống 10ml nước cất vô trùng, lăn nhẹ trên tay để cho các bào tử thấm nước và tạo thành dịch huyền phù

Dùng pipet vô trùng hút 2ml dịch huyền phù cho vào bình tam giác chứa 50ml MT 1

dịch thể Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng từ 8 -10 giờ

Ly tâm dịch nuôi cấy, thu cặn sau ly tâm Cho vào mỗi ống ly tâm 10ml dung dịch Tween-20 0,2%, NaCl 0,09% để tạo thành dịch huyền phù Dùng que cấy thẳng nhúng vào

dịch huyền phù, sau đó cấy thành một hình tam giác lên đĩa petri chứa môi trường thạch MT

1

Sau thời gian 4 giờ, quan sát kiểm tra trên kính hiển vi, khi bào tử bắt đầu nảy mầm thì các đĩa petri được đặt dưới đèn UV ở khoảng cách 20cm trong thời gian là 2 phút, 4 phút, 6 phút, 8 phút, 10 phút

Các đĩa sau khi đặt dưới đèn UV trong thời gian như trên sẽ được ủ 2 – 4 ngày ở nhiệt độ phòng Cấy chuyền các khuẩn lạc mọc được để kiểm tra, so sánh hoạt tính với

- Phương pháp đục lổ

Chủng NS nghiên cứu được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày

Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nấm nghiên cứu cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trường lỏng MT 4 đã vô trùng

Nuôi cấy bình tam giác trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 20ml dịch nuôi cấy ở 3000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ sinh khối, phần

dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng Điều chỉnh pH của dịch thu được về trung tính (6-7)

Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lổ thạch trên môi trường có chứa các VSV

kiểm định Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch chiết chất kháng sinh thô vào các lổ khoan

Đặt các mẫu trong tủ lạnh từ 4-6 giờ, sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng

Xác định hoạt tính kháng sinh bằng cách đo vòng vô khuẩn sau thời gian 22-24 giờ

- Phương pháp khoanh giấy lọc

Chủng NS nghiên cứu được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày

Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nấm nghiên cứu cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trường lỏng MT 4 đã vô trùng

Nuôi cấy bình tam giác trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng

Thu dịch lên men bằng cách lọc tách sinh khối Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch chiết chất kháng sinh thô cho vào khoanh giấy lọc vô trùng có đường kính 1cm, để khô tự nhiên hoặc sấy khô ở điều kiện không quá 500

C Đặt các khoanh giấy lọc có tẩm dịch lên men lên các đĩa petri đã cấy trải VSV kiểm định

Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4-6 giờ, sau đó ủ mẫu ở nhiệt độ phòng Xác định hoạt tính kháng sinh bằng cách đo vòng vô khuẩn sau thời gian 22-24 giờ

c/ Ki ểm tra kết quả

Hoạt tính kháng sinh = (D – d) mm

Trong đó: D - đường kính vòng phân giải, d - đường kính lổ thạch

(D – d) ≥ 25mm : hoạt tính rất mạnh (D – d) ≥ 20mm : hoạt tính mạnh (D – d) ≥ 10-19,5mm : hoạt tính trung bình (D – d) ≤ 10mm : hoạt tính yếu

2.4.4 Xác định khả năng sinh trưởng của các chủng NS

a/ Nguyên t ắc chung

Khả năng sinh trưởng của NS được thể hiện bằng việc tăng sinh khối của chúng trong môi trường nuôi cấy

b/ Cách ti ến hành

Chủng NS nghiên cứu được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày

Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nấm nghiên cứu cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trường lỏng MT 4 đã vô trùng

Nuôi cấy bình tam giác trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng

Giấy lọc được sấy đến khối lượng không đổi, cân khối lượng giấy lọc (M1)

Lọc dịch nuôi cấy, sinh khối NS được giữ lại trên giấy lọc, sấy đến khi khối lượng không đổi, cân lần 2 (M2)

c/ Ki ểm tra kết quả

Xác định khả năng sinh trưởng của NS dựa vào sự tăng trưởng của sinh khối khi nuôi

cấy:

∆M = M2 – M1

2.4.5 Kh ảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng sinh trưởng

và hoạt tính kháng sinh của các chủng Trichoderma

a/ Nguyên t ắc chung

Mức độ phát triển và hoạt tính chất kháng sinh của nấm sợi thể hiện ảnh hưởng của điều kiện khác nhau của môi trường

b/ Cách th ực hiện

• Kh ảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon

Để khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của các chủng nấm nghiên cứu chúng tôi sử dụng môi trường MT 1 nhưng glucose lần lượt được thay thế bằng các nguồn hydrat cacbon khác nhau: lactose, sucrose, fructose, maltose, tinh bột, CMC, rỉ đường với

trọng lượng như nhau

Mẫu đối chứng được nuôi ở môi trường MT 1

Cấy chấm điểm các chủng nghiên cứu lên bề mặt môi trường tương ứng, sau đó để trong tủ ấm 4 ngày

Kiểm tra sinh trưởng bằng cách cân sinh khối

Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

• Kh ảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ

Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng của các

chủng nghiên cứu chúng tôi sử dụng môi trường MT 1 nhưng nguồn NaNO3 được thay lần lượt bằng cao thịt, cazein, bột đậu, NH4Cl, NH4NO3, NaNO2, NH4H2PO4 với hàm lượng tương đương

Mẫu đối chứng được nuôi ở môi trường MT 1

Cấy chấm điểm các chủng nghiên cứu lên bề mặt môi trường tương ứng, sau đó để trong tủ ấm 4 ngày

Kiểm tra sinh trưởng bằng cách cân sinh khối

Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

• Kh ảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Cấy các chủng Trichoderma thu được sau khi gây đột biến vào bình tam giác chứa 50

ml môi trường MT 1 dịch thể, nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các nhiệt độ khác nhau: 26, 28,

30, 32, 34, 36, 380C trong thời gian 5 ngày

Kiểm tra sinh trưởng bằng cách cân sinh khối

Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

• Kh ảo sát ảnh hưởng của pH

Cấy các chủng Trichoderma thu được sau khi gây đột biến vào bình tam giác chứa 50

ml môi trường MT 1 dịch thể, nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các mức pH khác nhau: 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 7,5; 8,0 được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N trong thời gian 5 ngày

Kiểm tra sinh trưởng bằng cách cân sinh khối

Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

• Kh ảo sát ảnh hưởng của độ mặn

Cấy các chủng Trichoderma thu được sau khi gây đột biến vào bình tam giác chứa 50

ml môi trường MT 1 dịch thể bổ sung NaCl với các nồng độ là 0%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1,0%, 1,25%, 1,5%, 1,75%, 2,0%, 2,25%, 2,5%, 2,75%, 3,0%, 3,25%, 3,5%, 3,75%, 4,0%, nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong thời gian 5 ngày

Kiểm tra sinh trưởng bằng cách cân sinh khối

Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

• Kh ảo sát ảnh hưởng của thời gian

Cấy các chủng Trichoderma thu được sau khi gây đột biến vào bình tam giác chứa 50

ml môi trường MT 1 dịch thể bổ sung NaCl nồng độ tối ưu ở nhiệt độ 300C, nuôi cấy lắc

200 vòng/phút Thu sinh khối và dịch chiết kháng sinh sau các khoảng thời gian 24 giờ, 36

giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, 108 giờ, 120 giờ, 132 giờ, 144 giờ

Kiểm tra sinh trưởng bằng cách cân sinh khối

Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

c/ Ki ểm tra kết quả

Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh trưởng bằng cách so sánh sinh khối thu được

Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ

2.4.6 Phương pháp tách chiết chất kháng sinh

a/ Nguyên t ắc chung

Sử dụng các chất hữu cơ hòa tan CKS để tách CKS do nấm sợi sinh ra khỏi môi trường thạch có nấm sinh trưởng

b/ Cách th ực hiện

Nuôi cấy chủng NS nghiên cứu trong các điều kiện tối ưu thu dịch lên men và lọc để

loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men, điều chỉnh pH tới 7.0 – 7.5 cho dịch lọc

Bổ sung thêm các loại dung môi Ehtyl acetate, Cloroform, Diethyl ether, Hexan, Butanol theo tỉ lệ 1 : 1 Lắc các bình tam giác 200 vòng/phút trong 6 giờ để CKS hòa tan vào dung môi

Dịch chiết kháng sinh thô được đặt trong tủ sấy ở 500C, 600C, 700C, 800C, 900C,

1000C, 1100C, 1200C kéo dài trong thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút Sau đó xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

Đối chứng dịch kháng sinh thô của các chủng tuyển chọn để ở nhiệt độ phòng (300C)

• Độ bền pH

Dịch chiết kháng sinh thô được điều chỉnh có pH từ 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 và

để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ Sau đó điều chỉnh pH=7, xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

Đối chứng dịch kháng sinh thô của các chủng tuyển chọn có điều chỉnh pH=7

• Độ bền thời gian

Dịch chiết kháng sinh thô được giữ ở nhiệt độ 40C Sau thời gian 1 tuần, 2 tuần, 3

tuần, 4 tuần kiểm tra hoạt tính hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lổ

Đối chứng dịch kháng sinh thô của các chủng tuyển chọn đặt ở nhiệt độ phòng

2.4.8 Tác d ụng của dịch KS thô với các chủng nấm gây bệnh cây trồng

Đối chứng là các đĩa chỉ cấy chấm điểm các chủng nấm gây bệnh đối xứng qua lổ