áp dụng kỹ thuật real time pcr để phát hiện varicella zoster virus

Một khi đã mắc bệnh thủy đậu, sau khi lành bệnh virus vẫn còn tồn tại trong cơ thể con người dưới dạng tiềm ẩn trong các hạch thần kinh..  Các dạng thuỷ đậu bất thường - Nốt thuỷ đậu có

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS CAO MINH NGA

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn là kết quả do tôi nghiên cứu và thực hiện, không sao chép của ai Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu luận văn

LỜI CẢM ƠN

Những lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất xin được gửi đến:

Lãnh đạo trường Đại học Sư Phạm TP HCM, phòng Khoa học Công nghệ sau đại học chuyên ngành Vi sinh vật học đã tổ chức Đào tạo, quản lý

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất khóa học và luận văn Các Thầy,

Cô giáo trong và ngoài trường đã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học

PGS.TS Cao Minh Nga đã truyền đạt kiến thức, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận

Các anh, chị và các bạn học viên lớp Cao học VSVH khóa 20; đã luôn quan tâm, chia sẻ và động viên tôi trong suốt khóa học cũng như suốt thời gian thực hiện khóa luận

Các anh, chị em ở Công ty Việt Á đã nhiệt tình và có những trao đổi quý báu trong quá trình thực hiện đề tài; phòng Dịch vụ, Công ty Việt Á đã cung cấp tài liệu tham khảo, cũng như một số mẫu VZV để khảo sát thực nghiệm tại công ty Bác sĩ Siêu, bác sĩ Phong (khoa nhiễm của bệnh viện Nhiệt đới) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu VZV

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn

Thành phố Hồ Chí Minh, 2012 Tác giả

Huỳnh Thị Mỹ Hiệp

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Nhiệm vụ đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

PHẦN II: NỘI DUNG ĐỀ TÀI 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I Đại cương về virus 3

1.1 Lịch sử phát hiện bệnh 3

1.2 Dịch tễ học 3

1.3 Cấu trúc của virus 6

1.4 Chu trình nhân lên của virus 7

1.5 Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị bệnh 8

1.5.1 Đặc điểm sinh bệnh học 8

1.5.1.1 Bệnh thủy đậu 9

1.5.1.2 Bệnh zona 13

1.5.2 Biện pháp phòng ngừa – điều trị bệnh 17

1.5.2.1 Biện pháp phòng ngừa 17

1.5.2.2 Điều trị bệnh 18

II Các phương pháp chẩn đoán bệnh 19

2.1 Chẩn đoán trực tiếp 19

2.2 Chẩn đoán huyết thanh học 20

III Phương pháp PCR 20

3.1 Giới thiệu 20

3.2 Nguyên tắc hoạt động 21

3.3 Phương pháp Real-time PCR 22

3.3.1 Nguyên tắc hoạt động 23

3.3.2 Thiết bị 24

3.3.3 Các kiểu phản ứng Real-time PCR 24

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

I Vật liệu – Hóa chất 31

1.1 Vật liệu 31

1.2 Hóa chất (hãng Biobasic – Canada) 31

1.3 Dụng cụ -Thiết bị 32

II Phương pháp nghiên cứu 32

2.1 Phương pháp thiết kế mồi –mẫu dò 33

2.1.1.Nguyên tắc 33

2.1.2 Các phần mềm máy tính được sử dụng 34

2.1.3 Cách tiến hành 34

2.2 Phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm 35

2.2.1 Lấy mẫu và bảo quản 35

2.2.2 Phương pháp ly trích DNA 35

2.2.2.1 Nguyên tắc 35

2.2.2.2 Cách tiến hành 36

2.3 Thực hiện phản ứng Real-time PCR 36

2.4 Phương pháp khảo sát độ nhạy của quy trình 37

2.5 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của mồi – mẫu dò 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò trên lý thuyết 39

3.1.1 Kết quả thiết kế hệ mồi và mẫu dò 39

3.1.2 Kết quả khảo sát các đặc tính của hệ mồi – mẫu dò 42

3.1.3 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò 43

3.2 Kết quả khảo sát hệ mồi –mẫu dò trên thực nghiệm 43

3.2.1 Khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi –mẫu dò 43

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi – mẫu dò 46

3.2.3 Khảo sát nồng độ mẫu dò 48

3.2.4 Khảo sát nồng độ Mg2+ 49

3.2.5 Khảo sát sát khả năng nhân bản chọn lọc của hệ mồi và mẫu dò 51

3.2.6 Khảo sát độ nhạy của phản ứng 53

3.2.7 Khảo sát tính lặp lại của phản ứng Real-time PCR 57

3.2.8 Ứng dụng quy trình trên một số bệnh phẩm 61

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

I Kết luận 63

II Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 67

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

FRET Flourescent Resonance Energy Transfer

cccDNA covalently closed circula DNA

NCBI National Center for Biotechnology Information

EBV Epsteinbarrvirus

MTB Mycobacterium tuberculosis

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1: Cấu trúc VZV 6

Hình 1.2: Chu trình nhân lên của virus 7

Hình 1.3: VZV có thể gây ra hai bệnh 8

Hình 1.4: Nốt ra điển hình 9

Hình 1.5: Viêm phổi do thủy đậu 10

Hình 1.6: Viêm mô tế bào 11

Hình 1.7: Thủy đậu xuất huyết 11

Hình 1.8: Thủy đậu sơ sinh 13

Hình 1.9: Nguyên tắc hoạt động PCR 22

Hình 1.10: Nguyên tắc hoạt động của Molecular beacon 25

Hình 1.11: Nguyên tắc hoạt động của SYBR Green 25

Hình 1.12: Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang của probe đôi 26

Hình 1.13: Nguyên tắc hoạt động của Taqman probe 28

Hình 2.1: Quy trình khảo sát các đặc tính của mồi và mẫu dò 32

Hình 2.2: Chương trình luân nhiệt của phản ứng Real-time PCR 37

Hình 3.1: Kết quảsắp gióng các trình tự của ORF28 trên BioEdit 39

Hình 3.2: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene ORF28- VZV và mồi xuôi bằng chương trình clustal 40

Hình 3.3: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene ORF28 và mồi ngược bằng chương trình clustal 40

Hình 3.4: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene ORF28 và mẫu dò bằng chương trình clustal 41

Hình 3.5: Kết quả của việc đánh giá mồi, mẫu dò bằng annhyb 41

Hình 3.6: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi- mẫu dò (lần 2) 44 Hình 3.7: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai (lần 1) 47

Hình 3.8: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò (lần 2) 49

Hình 3.9: Kết quả khảo sát sát nồng độ MgCl2 (lần 2) 50 Hình 3.10: Khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò (lần 1) 52 Hình 3.11: Kết quả khảo sát độ nhạy của primer-probe (lần 1) 54 Hình 3.12: Hệ số tuyến tính của đường chuẩn của phản ứng Real-time PCR với các nồng độ DNA VZV từ 102 đến 106

copies/phản ứng 55 Hình 3.13: Đồ thị giá trị Ct các lần lặp lại nội phản ứng 57 Hình 3.14: Đồ thị giá trị Ct các lần lặp lại liên phản ứng 59

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 3.1: Trình tự mồi và mẫu dò trên gene ORF28 của VZV 38

Bảng 3.2: Các thông số của hệ mồi và mẫu dò của gene ORF28 42

Bảng 3.3: Kết quả giải trình tự ORF28 45

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai 47

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò 48

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nồng độ MgCl 2 50

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò thiết kế 51

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò 52

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ mồi – mẫu dò 53

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn 56

Bảng 3.11: G iá trị Ct của các nồng độ của đường chuẩn 58

Bảng 3.12: Kết quả hệ số biến thiên nội phản ứng của Real-time PCR VZV 58 Bảng 3.13: Giá trị chu kỳ ngưỡng của các nồng độ của đường chuẩn 60

Bảng 3.14: Hệ số BTLPU của các nồng độ đường chuẩn 60

Bảng 3.15: Kết quả các hệ số BTNPU và BTLPU của Real-time PCR 61

Bảng 3.16: Kết quả so sánh độ lặp lại trong một số công trình 61

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát mẫu bằng quy trình Real-time PCR 62

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 1: Biểu đồ phân bố tần suất bệnh thủy đậu trẻ em nhập viện Nhi Đồng 1 theo nhóm tuổi (n=203) 5 Biểu đồ 2: Biểu đồ phân bố số ca thủy đậu nhập viện Nhi Đồng 1 năm

2007 và 2008 theo tháng (n=203) 5 Biểu đồ 3: Tình hình bệnh thủy đậu tăng trong những năm gần đây 6

P HẦN I: MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bệnh thủy đậu còn được gọi là bệnh trái rạ do Varicella zoster virus gây ra

Đây là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở mọi lứa tuổi, bệnh có thể phát triển thành dịch với nhiều người bị mắc bệnh Bệnh thường nhẹ và diễn biến trong thời gian ngắn ở trẻ em khỏe mạnh Tuy nhiên ở người lớn hoặc ở những người bị suy giảm miễn dịch, bệnh có thể diễn biến nặng và có thể gây tử vong

Tỷ lệ tử vong khoảng từ 7 đến 10% ở người bị suy giảm miễn dịch, ở trẻ em bình thường tỷ lệ này chỉ chiếm khoảng 0,1 đến 0,4% Khoảng 5% các trường hợp bệnh thủy đậu không có biểu hiện lâm sàng Thủy đậu cấp tính có thể gây biến chứng viêm tiểu não, viêm màng não vô khuẩn, viêm tủy, giảm tiểu cầu và viêm phổi Tuy nhiên, nếu vệ sinh cá nhân kém có thể gây bội nhiễm làm nhiễm khuẩn

ở da nặng hoặc nhiễm trùng huyết do tụ cầu

Ở phụ nữ mang thai có thể có đến 1/14 nguy cơ truyền thủy đậu cho thai nhi và tác hại đặc biệt nguy hiểm như: gây thẹo ở da, sanh thiếu tháng, dị tật ở chân tay, não và mắt thậm chí gây tử vong Nguy cơ xuất hiện nhiều nhất sau khi phụ nữ mang thai trong ba tháng đầu bị nhiễm virus gây thủy đậu, khi đó nguy cơ trẻ chết ngay khi sanh, sẩy thai hay sinh non có thể lên đến 25%

Bên cạnh đó thủy đậu còn liên quan mật thiết với bệnh “giời leo” Giời leo còn gọi là bệnh zona, là một biến chứng của bệnh thủy đậu Một khi đã mắc bệnh thủy đậu, sau khi lành bệnh virus vẫn còn tồn tại trong cơ thể con người dưới dạng tiềm ẩn trong các hạch thần kinh Về sau do một số yếu tố làm suy yếu hệ miễn dịch như tuổi tác, bị stress, đang điều trị ung thư,…thì virus hoạt động trở lại gây ra bệnh giời leo Việc xác định bệnh kịp thời sẽ giảm nguy cơ biến chứng

và tử vong của bệnh

Trong điều kiện ngày càng tiến bộ của Ngành Sinh học phân tử ở Việt Nam, chúng tôi mong muốn góp thêm một phương án vào việc chẩn đoán bệnh liên

quan đến điều trị: sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để phát hiện Varicella zoster

Các kết quả xét nghiệm này được ứng dụng trong thực tiễn nhằm xác định chính xác bệnh để từ đó có phương án điều trị kịp thời

2 Nhiệm vụ đề tài

Thiết kế thành công hệ mồi-mẫu dò phát hiện Varicella zoster virus bằng

phương pháp Real-time PCR

3 Nội dung nghiên cứu

 Thiết kế hệ mồi và mẫu dò đặc hiệu để định lượng Varicella zoster virus

 Khảo sát độ đặc hiệu của primer và Taqman probe

 Khảo sát các điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR  Hoàn thiện quy trình phát hiện VZV trên bệnh nhân bệnh thủy đậu và zona bằng kỹ thuật Real-time PCR

 Thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh phẩm

PHẦN II: NỘI DUNG ĐỀ TÀI

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Đại cương về virus

đã có khả năng lây nhiễm Bệnh rất hay lây như ở công sở, trường học, nhà trẻ, doanh trại quân đội, các đơn vị làm việc tập thể,… Tất cả mọi người đều

có thụ cảm với bệnh thuỷ đậu Sau khi mắc phải thì có miễn dịch bền vững

- Bệnh thủy đậu thường phân bổ theo mùa: ở các vùng đô thị khí hậu điều hoà dịch thuỷ đậu thường xuất hiện vào mùa xuân và mùa thu

- Địa lý: bệnh phổ biến ở khắp mọi nơi trên thế giới và hay gặp ở trẻ em, chủ yếu là trẻ em từ 6 tháng đến 7 tuổi Rất ít khi xảy ra ở trẻ dưới 6 tháng tuổi vì

có miễn dịch truyền từ người mẹ

o 80% trẻ em dưới 10 tuổi đã mắc bệnh thủy đậu

o 95% người trưởng thành đã có miễn dịch

o 25% người lớn không có tiền sử của thủy đậu dễ bị mắc bệnh

- Chủng tộc: những người da đen có khả năng bị ít hơn người da trắng, tuy nhiên zona lại là biểu hiện sớm ở những người nhiễm HIV ở những người trẻ tuổi Châu Phi

- Giới tính: không có sự khác nhau

- Con người là nguồn chứa Varicella zoster virus duy nhất

Trước năm 1995, ở Hoa Kỳ tỷ lệ nhiễm VZV khá phổ biến khoảng

1.500-1.600/100.000 Theo dữ liệu từ Bộ Y tế và Dịch vụ Nhân sinh Hoa Kỳ (United States Department of Health and Human Services) có 1.514 trường hợp thủy đậu được báo cáo trong năm 2006 Các mức tỷ lệ mắc cao nhất của thủy đậu 93,4/100.000 ở lãnh thổ phía Bắc, và 48,9/100.000 tại Nam Úc Tỷ

lệ cao nhất xảy ra ở trẻ em từ 0-4 tuổi (120/100.000) Tổng cộng có 1.052 trường hợp herpes zoster được báo cáo trong cùng một năm với tỷ lệ 5,2/100.000 Tương tự, tỷ lệ cao nhất là ở Nam Úc 40,2/100.000 và Northern Territory (liên bang của Úc) 38,7/100.000

Tuy nhiên, khi nhiễm VZV thì khả năng mắc bệnh zona sau này rất cao

Như ở Hoa Kỳ trên 90% người lớn nhiễm Varicella zoster virus và đều có

nguy cơ bị zona Số người mới mắc bệnh zona hàng năm vào khoảng 1,5 – 3 trường hợp/1.000 người Tỷ lệ mắc mới 2 trường hợp/1.000 người đồng nghĩa với trên 500.000 trường hợp mới hàng năm tại nước Mỹ Tuổi đời tăng là yếu

tố nguy cơ chủ chốt của bệnh zona, số trường hợp mắc mới của zona ở những người trên 75 tuổi vượt quá con số 10 trường hợp/1.000 người/năm Nguy cơ mắc zona trong suốt cuộc sống ước tính là 10 – 20% Đặc biệt, ở người suy giảm miễn dịch ( có 8 - 11% bệnh nhân nhiễm HIV bị zona) Những bệnh nhân có các bệnh lý về u tân sinh (đặc biệt các ung thư tăng sinh tố chức lymphô), những người đang dùng thuốc ức chế miễn dịch (gồm cả corticosteroid), và những người nhận ghép cơ quan là những thành phần có

nguy cơ tăng cao bị mắc zona Yếu tố khởi động do nhiễm khuẩn cấp và mạn

như: viêm phổi, lao, giang mai, sốt do nhiễm siêu vi,… stress về tinh thần, làm việc quá căng thẳng, suy giảm về thần kinh và thể lực, người già yếu, …

Biểu đồ 2: Biểu đồ phân bố số ca thủy đậu

nhập viện Nhi Đồng 1 năm 2007 và 2008 theo

tháng (n=203)

9 6 11 13 21

3

12 14 15

26 28 45

0 10 20 30 40 50

Biểu đồ 1: Biểu đồ phân bố tần suất bệnh thủy đậu

trẻ em nhập viện Nhi Đồng 1 theo nhóm tuổi (n=203)

Nếu người chưa từng bị thủy đậu, có thể bị lây bệnh thủy đậu từ những tiếp xúc gần gũi với những sang thương hở miệng ở những người bị zona Do đó, cần dùng quần áo che phủ sang thương lại giúp giảm nguy cơ lây lan cho người khác

Ở Việt Nam bệnh thủy đậu thường tập trung nhiều nhất là cuối mùa mưa - đầu mùa khô vào khoảng tháng 1 đến tháng 5 hàng năm

Theo thống kê từ 01/01/2007 đến 31/12/2008 ở bệnh viện Nhi Đồng 1 có 203 trường hợp thủy đậu nhập viện Tuổi trung bình là 4,06 tuổi trong đó bệnh nhi nhỏ nhất 1 ngày tuổi, lớn nhất 14 tuổi Số bệnh nhi dưới 5 tuổi chiếm gần 70%

và dưới 10 tuổi chiếm gần 90% các trường hợp (Biểu đồ 1) Tỷ lệ nam: nữ là 1,57: 1 Bệnh thủy đậu xảy ra quanh năm với tần suất cao vào các tháng mùa khô với đỉnh điểm vào tháng 3 và thấp vào các tháng mùa mưa (Biểu đồ 2) [10]

Biểu đồ 3: Tình hình bệnh thủy đậu tăng trong những năm gần đây

(Nguồn: Theo số liệu thống kê của bác sĩ Nguyễn Trần Chính ở bệnh viện Nhiệt Đới năm 2010) [36]

1.3 Cấu trúc của virus [14,18]

Virion có kích thước 150 -200nm, nucleocapsid là một khối đa diện 20 mặt tam giác đều gồm 162 capsome Các capsome sắp xếp theo trục đối xứng 5:3:2, mỗi capsome là một khối lăng trụ kích thước 9 x12nm có lỗ thủng ở giữa đường kính 4nm tạo thành ống trụ rỗng Trong là genom chứa chuỗi đôi DNA gồm 125000 cặp bazơ, có G - C trung bình là 46%, có khối lượng phân

tử khoảng 80 x 106

Dalton Đây là genome nhỏ nhất trong họ Herpesviruses

Vỏ bên ngoài là 2 lớp lipid có chứa 6 hoặc nhiều hơn 6 loại glycoprotein, được kí hiệu như: gE, gB, gH, gI, gC, gL Các glycoprotein làm trung gian cho virus gắn và xâm nhập vào bên trong tế bào vật chủ

Capsid

1.4 Chu trình nhân lên của virus [14, 18]

cảm thụ nhờ receptor của tế bào Vỏ virus kết hợp với màng tế bào để giải phóng nucleocapsid vào trong bào tương của tế bào, nucleocapsid được tháo rời để giải phóng DNA của virus Khi DNA đã được sao chép, các protein cấu trúc được tổng hợp, nucleocapsid sẽ được lắp ráp lại ở trong nhân tế bào vật chủ Virus nhận vỏ ngoài của nó khi nucleocapsid tạo chồi qua màng trong nhân ra khoảng quanh nhân

Hình1.2: Chu trình nhân lên của virus

1.5 Đặc điểm sinh bệnh học và biện pháp phòng ngừa – điều trị bệnh 1.5.1 Đặc điểm sinh bệnh học [2,5,6,10]

Virus thuỷ đậu xâm nhập vào niêm mạc đường hô hấp trên, miệng hầu tiếp

đó nhân lên tại chỗ và gây nhiễm virus huyết tiên phát Sau đó VZV nhân lên trong tế bào hệ thống liên võng nội mô rồi tiếp đến là gây nhiễm virus huyết thứ phát và lan tràn đến da và niêm mạc

VZV xâm nhập vào lớp tế bào đáy, lớp gai nhân lên hình thành các hốc nhỏ

và gây thoái hoá hình cầu ở tế bào biểu mô, tích tụ dịch phù, thoái hoá mụn

nước và tạo thành những chất vùi trong nhân Cũng như tất cả các loại Herpes

gây nên bệnh zona (Herpes zoster)

Hình1.3: VZV có thể gây ra hai bệnh: bệnh thủy đậu (trái rạ)

và bệnh zona (herpes zoster)

1.5.1.1 Bệnh thủy đậu [2,5, 6,7,10, 11, 24, 38]

 Thể điển hình thông thường

thường không có triệu chứng gì

Thường ngắn khoảng 1 ngày, triệu chứng không rõ, dễ bỏ qua Có thể không sốt hoặc sốt nhẹ khoảng 38°C, đau mình, mệt mỏi, trẻ không chịu chơi, quấy khóc Cá biệt có thể sốt tới 39-40°C, bệnh nhi trằn trọc, mê sảng và khi sốt cao trẻ có thể bị co giật Bệnh nhân thường kèm theo viêm họng, viêm xuất tiết đường hô hấp trên

ngày đầu của bệnh, điển hình của thời kỳ này là “nốt rạ”

Ban mọc không thứ tự, hết đợt này đến đợt khác Vì vậy trên mỗi vùng da, thấy có đủ các nốt ban ở các độ tuổi khác nhau

Trong niêm mạc đôi khi cũng có nốt phỏng như ở trong má, vòm họng, khi

vỡ thành những nốt loét nông, tròn hoặc bầu dục, làm chảy dãi hoặc nuốt đau

Ở giai đoạn mọc ban, bệnh nhân thường ngứa nhiều, gãi làm vỡ các nốt phỏng, gây bội nhiễm, có thể nổi hạch ngoại biên nhất thời

Nốt thuỷ đậu diễn biến lâu nhất 4-6 ngày là khô lại, đóng vảy, mầu nâu sẫm, bong đi sau một tuần, không thành sẹo vĩnh viễn trừ khi gãi loét và bội nhiễm

 Các dạng thuỷ đậu bất thường

- Nốt thuỷ đậu có thể có máu ở những bệnh nhân bệnh máu, hoặc ở những trẻ

em suy yếu thì nốt thuỷ đậu có thể bị hoại tử, gây loét sâu, có chất dịch màu xám

- Nốt thuỷ đậu có thể bội nhiễm, gây mủ dễ nhầm với đậu mùa Vi khuẩn gây bội nhiễm thường là tụ cầu, liên cầu,

 Biến chứng: bệnh thuỷ đậu nói chung lành tính, nhưng cũng có thể gặp biến chứng

- Nếu thuỷ đậu mọc nhiều trên niêm mạc có thể gây biến chứng viêm niêm

mạc miệng, âm hộ, viêm tai giữa và tai ngoài, viêm thanh quản, “croup” giả

- Viêm thận, trong các trường hợp bệnh nặng, ban mọc vào ngày thứ 3, thứ 4 của bệnh, có thể làm đi tiểu ra máu, khỏi sau vài tuần

- Viêm khớp tràn dịch: thường gặp ở thể nặng, các khớp có viêm và tràn dịch, ít khi thành mủ và khỏi sau vài ngày nhưng biến chứng này ít gặp

- Viêm phổi: là biến chứng nghiêm trọng nhất của thủy đậu, chủ yếu được nhìn thấy ở những người suy giảm miễn dịch nhưng có thể xảy ra ở những người bình thường, đặc biệt là người lớn.Viêm phổi thuỷ đậu xuất hiện 1 - 6 ngày sau khi có ban với triệu chứng thở nhanh, khó thở, ho và sốt Ở người lớn, nó có thể không có triệu chứng X quang phổi 16% có hình ảnh viêm phổi rõ

Hình1.5: Viêm phổi do thủy đậu

- Bệnh kết hợp: bệnh thuỷ đậu có thể kết hợp cùng xuất hiện với một bệnh khác như bạch hầu, sởi, ho gà, nhưng các bệnh này nặng hơn, thường làm lấn

át thuỷ đậu Làm nặng lên một số bệnh như lao phổi, viêm phế quản có thể xuất hiện do bội nhiễm

- Biến chứng thần kinh: đáng chú ý nhất là viêm não Nguyên nhân vẫn chưa

rõ, có thể là do virus thuỷ đậu, hoặc là do dị ứng, hoặc do một virus khác có sẵn trong não Song về mặt giải phẫu bệnh cho thấy, đây là viêm não virus hậu phát Thường gặp nhiều ở trẻ trai Khởi phát từ ngày thứ 3 đến ngày thứ

8 của bệnh, chậm nhất là ngày thứ 21 Biến chứng bắt đầu đột ngột, tự nhiên sốt cao lên, nhức đầu, nôn, li bì, nhiều khi co giật và liệt Khám thấy hội chứng màng não (+), có dấu hiệu Babinski Lâm sàng là bệnh cảnh của viêm não và màng não Dịch não tuỷ trong, áp lực hơi tăng Tế bào tăng vừa có khi tới 100 tế bào/mm3, phần nhiều là tế bào lympho, protein hơi tăng, glucoza hơi tăng hoặc bình thường Tỷ lệ tử vong vào khoảng 5%, có 15% khỏi hoàn toàn không di chứng Nếu có di chứng là: rối loạn tiền đình, liệt, mù, đần độn, v.v

Hình 1.6:Viêm mô tế bào Hình 1.7:Thủy đậu xuất huyết

Varicella trong thai kỳ [32]

Phụ nữ đã từng nhiễm bệnh thủy đậu trước khi mang thai hoặc đã được chủng ngừa bệnh thủy đậu thì được miễn dịch với bệnh này, trong cơ thể đã

có kháng thể chống lại bệnh Do đó, khi mang thai, những thai phụ đã có kháng thể chống lại bệnh thủy đậu không cần phải lo lắng về biến chứng của bệnh đối với bản thân họ cũng như thai nhi

Tuy nhiên, khoảng 10% phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ vẫn còn dễ bị thủy đậu Thai phụ nhiễm bệnh thủy đậu có nguy cơ viêm phổi do VZV khoảng

10 – 20%, trong số người viêm phổi do virus này nguy cơ tử vong lên đến 40%

Tỉ lệ tử vong ở phụ nữ mang thai mắc bệnh thủy đậu cao nhất trong số những người lớn nhiễm bệnh này

Đối với những thai phụ bệnh thủy đậu nguyên phát khi mang thai, sự ảnh hưởng của bệnh trên thai nhi tùy vào từng giai đọan tuổi thai:

Trong 3 tháng đầu, đặc biệt tuần lễ thứ 8 đến 12 của thai kỳ, nguy cơ thai nhi bị Hội chứng thủy đậu bẩm sinh là 0,4% Biểu hiện thường gặp nhất của hội chứng thủy đậu bẩm sinh là sẹo ở da Những bất thường khác có thể xảy

ra là tật đầu nhỏ, bệnh lý võng mạc, đục thủy tinh thể, nhẹ cân, chi ngắn, chậm phát triển tâm thần

Trong 3 tháng giữa, đặc biệt tuần 13 – 20 của thai kỳ, nguy cơ thai nhi bị hội chứng thủy đậu bẩm sinh là 2% Sau tuần lễ thứ 20 thai kỳ, hầu như không ảnh hưởng trên thai

Nếu người mẹ nhiễm bệnh trong vòng 5 ngày trước sinh và 2 ngày sau sinh,

bé sơ sinh dễ bị bệnh thủy đậu lan tỏa thường nổi nốt rạ nhiều hơn và có biến chứng rất cao do mẹ chưa có đủ thời gian tạo kháng thể truyền cho thai nhi trước sinh Tỉ lệ tử vong bé sơ sinh lúc này lên đến 25 – 30% số trường hợp bị nhiễm

1.5.1.2 Bệnh zona [5,10,18,24,38]

 Lâm sàng

sáng và khó ở, nhưng hiếm khi có sốt Bệnh khởi đầu với các cảm giác da bất thường khu trú, bao quát từ ngứa hoặc đau nhói đến đau dữ dội, có trước các tổn thương da từ một đến năm ngày, cơn đau với các cường độ khác nhau xảy

ra hầu như ở tất cả bệnh nhân bị zona cấp

Đau, hiếm gặp hơn là dị cảm ở vùng 1 hoặc nhiều dây thần kinh chi phối, kéo dài 1-10 ngày (trung bình 48h) Đau có thể gây ra những chẩn đoán nhầm

là đau đầu, viêm mống mắt, viêm màng phổi, viêm thần kinh cánh tay, đau do bệnh tim, viêm ruột thừa hoặc những nguyên nhân trong bụng (viêm túi mật, sỏi mật, đau quặn thận, thoát vị đĩa đệm, đau thần kinh toạ, )

Thời kỳ tiền triệu từ khi đau đến khi có biểu hiện ở da được cho là thời kỳ virus lan truyền dọc dây thần kinh Tuy nhiên, khoảng 10% bệnh nhân đau và biểu hiện ở da là đồng thời Chỉ gặp ở những thể nặng: sốt, rét run, triệu chứng quan trọng là đau kiểu bỏng, buốt từng cơn nơi sắp xuất hiện tổn thương, đôi khi triệu chứng này khiến bệnh nhân đi khám không đúng chuyên khoa và thầy thuốc đa khoa cũng dễ chẩn đoán nhầm là đau thần kinh ngoại biên, đau cột sống,…

Hình 1.9:Thủy đậu Sơ Hình 1 8: Thủy đậu sơ sinh

- Khởi phát: Sau giai đoạn tiền triệu khoảng nửa ngày đến một ngày thì bắt

đầu xuất hiện thương tổn Là những mảng da đỏ, hơi nề nhẹ, có đường kính khoảng vài cm, gờ cao hơn mặt da bình thường, các mảng da này sắp xếp dọc theo dây thần kinh chi phối và dần dần nối với nhau thành dải, thành vệt

- Toàn phát: Sau vài ngày thì trên những mảng da đỏ này xuất hiện nhiều mụn nước, bọng nước tập trung thành đám giống như chùm nho, lúc đầu mụn nước căng, dịch trong, về sau đục, hóa mủ, dần dần vở đóng vảy tiết, dưới vảy tiết

là vết loét nhỏ và hạch bạch huyết vùng lân cận có thể sưng to Trong 3 – 5 ngày sau và diễn tiến qua các giai đoạn hóa mũ, loét và đóng vảy Hồng ban thường xuất hiện như một băng hay một dãi, ở một bên cơ thể và thường có ở mặt ngực, bụng, lưng, tứ chi Vị trí xuất hiện một bên của hồng ban - bóng nước kèm cảm giác đau rát nhiều là một triệu chứng đặc trưng của zona Nếu sang thương zona xuất hiện ở vùng trán, virus có thể gây tổn thương mắt nghiêm trọng cho bệnh nhân dẫn đến mù lòa

 Các thể zona đặc biệt:

Zona mắt:

Có khoảng 10-15% zona mắt Tổn thương nhánh mắt của thần kinh V gấp

5 lần tổn thương nhánh hàm trên và hàm dưới Đau đầu, buồn nôn và nôn là triệu chứng đầu tiên Thương tổn là mụn nước trên nền da đỏ ở mắt, hàm trên, tai của nửa bên cơ thể Hạch khu vực sưng đau phản ứng khi mụn nước nhiễm trùng thứ phát Nhánh mắt của thần kinh V sẽ truyền thông tin đến thần kinh III và thần kinh VI nên đôi khi gặp bệnh lý liệt dây thần kinh III và VI, có dấu

hiệu màng não phối hợp với zona mắt Ban đỏ lan toả ở mắt lên đỉnh đầu nhưng không bao giờ vượt qua đường giữa Zona mắt được xác định do tổn thương nhánh mắt của dây V, thương tổn ở đầu và thân mũi do nhánh thần kinh chi phối vùng mũi-mi bị kích thích Mụn nước ở đầu và thân mũi gọi là

chứng về mắt như: viêm kết mạc, viêm giác mạc và các bệnh về mắt khác

Tổn thương nhánh cảm giác của dây V gây nên các thương tổn vùng quanh mắt nhưng không thương tổn nhãn cầu Tình trạng đau nhức cấp tính mắt chiếm 93% trường hợp và 31% trường hợp đau nhức mắt kéo dài trên 6 tháng Bệnh nhân trên 60 tuổi đau nhức mắt trên 6 tháng chiếm 30%, bệnh nhân trên 80 tuổi tỉ lệ này là 71% Khoảng 20-72% zona mắt gây biến chứng mắt Viêm màng mạch nho trước thường gặp với tỉ lệ 92% và viêm kết mạc là 52% Biến chứng đe dọa đến thị lực gồm hoại tử võng mạc cấp tính, viêm dây thần kinh thị giác, hội chứng đỉnh ổ mắt, viêm hậu củng mạc, glaucome thứ phát, viêm giác mạc 28% thương tổn mắt tiến triển thành bệnh mắt (viêm màng mạch nho mãn tính, viêm và loét giác mạc) trong 6 tháng Zona mắt (nhánh mắt của dây thần kinh III) dễ gây viêm màng tiếp hợp, viêm giác mạc,

viêm mống mắt, viêm đồng tử, teo gai thị giác và có thể dẫn đến mù

Z ona hạch gối: gây thương tổn vành tai kèm theo rối loạn cảm giác 2/3 trước lưỡi, ù tai, điếc, có trường hợp gây liệt ½ mặt Zona hạch gối

(geniculate ganglion zoster) hay Hội chứng Ramsay Hunt (Ramsay Hunt syndrome) Định nghĩa chính xác hội chứng Ramsay Hunt là liệt dây thần kinh mặt ngoại biên kèm theo có ban đỏ mụn nước ở tai (zona tai) hoặc ở miệng Triệu chứng này do virus gây thương tổn hạch gối Các triệu chứng khác như ù tai, nghe kém, buồn nôn, nôn, chóng mặt và giật nhản cầu Những triệu chứng của dây thần kinh số VIII (thần kinh tiền đình ốc tai) này là do chúng nằm gần hạch gối Mắt không nhắm kín được (hở mi), dấu hiệu Charler Bell (+) Thương tổn phần cảm giác của thần kinh VII gây mất cảm giác vị giác một bên 2/3 trước lưỡi, mụn nước mọc ở màng nhĩ, ống tai, vành tai Thương tổn phần vận động của thần kinh VII gây liệt một bên mặt Thương tổn thần kinh thính giác (VIII) chiếm 37,2% trường hợp, kết quả là nghe kém

và mất khả năng nghe Có khoảng 3% liệt vận động và 75% hồi phục rất chậm.Tổn thương dây thần kinh IX hoặc X cũng được đề cập trong hội chứng này khi mà thương tổn ở tai lan rộng và kích thích nhánh chi phối vùng tai của nhiều dây thần kinh

Viêm não: các triệu chứng thần kinh xuất hiện 2 tuần trước khi có thương tổn da Viêm màng não có thể do đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào hơn là

do sự tấn công của virus vào não Bệnh nhân bị zona hạch gối và bị các thể lan toả có nguy cơ cao viêm màng não, tỉ lệ chết 10-20% Bệnh khó chẩn đoán do hiếm khi phân lập được virus trong dịch não tuỷ Protein và tế bào trong dịch não tuỷ tăng trong viêm màng não nhưng có 40% trường hợp zona điển hình có protein và tế bào tăng trong dịch não tuỷ

Zona vùng xương cùng (S2, S3, S4): viêm dây thần kinh chi phối vùng bàng

quang trong zona vùng xương cùng, bệnh nhân khó tiểu, tiểu gắc, bí tiểu, có trường hợp tiểu máu và tiểu mủ Đau bụng giống như các triệu chứng ngoại khoa, đau quặn bụng dưới, căng tức, bí trung đại tiện, hậu môn co thắt và cứng như đá không thể khám được, đau nhức vùng da một bên sinh dục kèm theo thương tổn da điển hình Virus cư trú trong thần kinh vùng cùng

S2,S3,S4 tái hoạt gây ra

Zona tai: đau xảy ra từng cơn kéo dài nhiều ngày làm bệnh nhân không ăn, không ngủ được, đặc biệt là với những zona tai kết hợp với zona vùng họng gây đau họng không nuốt được Rối loạn cảm giác vùng mặt Liệt mặt ngoại biên xuất hiện ngay sau khi xuất hiện mụn nước hoặc sau vài ngày Rối loạn cảm giác vùng họng, lưỡi như ăn thấy rát bỏng, đau Nổi hạch trước hoặc sau tai Hiếm khi xuất hiện hội chứng màng não như đau đầu dữ dội, nôn vọt không liên quan đến bữa ăn, rối loạn tiêu hóa: táo bón hoặc tiêu chảy

Đau thần kinh sau zona

Đau dây thần kinh sau zona (Post Herpetic Neuralgia – PHN) thường gặp nhất và được chú ý nhiều nhất Đây là một hội chứng đau mạn tính, thường nặng nề khó trị và đôi khi rất nghiêm trọng, xảy ra sau một đợt zona cấp tính Các yếu tố nguy cơ của đau sau zona:

- Tuổi là yếu tố nguy cơ rất quan trọng Theo thống kê, có khoảng 20% bệnh nhân zona bị biến chứng đau nhức thần kinh sau zona, trong đó có :  1/4 bệnh nhân trên 55 tuổi

 2/4 bệnh nhân trên 60 tuổi

 3/4 bệnh nhân trên 70 tuổi

- Biểu hiện đau của thời kỳ tiền triệu, đau trong thời kỳ tổn thương cấp tính

Do virus hướng da - thần kinh ngoại biên (ái thần kinh ngoại biên) chúng xâm nhập thần kinh và gây xơ hóa các đầu mút dây thần kinh ngoại biên nơi thương tổn bởi một chất do virus tạo ra tạm gọi là yếu tố “ B” PHN có thể là:

• Tình trạng nhạy cảm ở vùng da đã xuất hiện sang thương zona khi sờ chạm đến và có cảm giác rát bỏng khi cọ xát với quần áo

• Đau âm ỉ hay đau nhói như dao đâm ở vùng da đã bị zona

• Đau cơ, đau khớp thứ phát quanh vùng da nhiễm bệnh

Việc điều trị đau thần kinh hậu zona rất phức tạp

1.5.2 B iện pháp phòng ngừa – điều trị bệnh

1.5.2.1 Biện pháp phòng ngừa[23,30]

- Tạo miễn dịch: dùng Varivax ,Varilrix có hiệu lực 80% phòng nhiễm VZV tiên phát nhất là chỉ định cho các bệnh nhân có nguy cơ cao mắc thuỷ đậu như trẻ sơ sinh, trẻ em bị bệnh bạch cầu cấp, bệnh nhân thiếu hụt miễn dịch (điều trị nhiễm HIV, ung thư) Vaccine VZV gây cả miễn dịch trung gian tế bào và tạo kháng thể chống lại virus Trong đó, thuốc chủng Varivax – dùng virus đã

được làm yếu đi – được áp dụng từ năm 1995 ở các nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Hoa Kỳ và một số nước ở châu Âu

Nếu thai phụ chưa được miễn nhiễm với VZV (IgG -) bị phơi nhiễm với nguồn bệnh có thể dùng varicella-zoster immunoglobulin (VZIG) 125 U/10kg Thuốc có thể giúp ngừa nhiễm bệnh nếu được sử dụng trong vòng 96 giờ sau khi tiếp xúc với nguồn lây

Vaccine VZV có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh zona do làm tăng sức đề kháng của cơ thể để chống lại VZV hoặc giữ chúng trong trạng thái bất hoạt Những cải tiến của loại vaccine này đang được nghiên cứu và có thể giúp ngừa được bệnh zona trong tương lai

- Trong thời kỳ bệnh đang phát mạnh nên cách ly tránh lây lan

- Ăn uống hợp lí, tăng cường sức đề kháng của cơ thể

- Phụ nữ biết là có thai hoặc đang cố gắng để có thai không nên được chủng ngừa thủy đậu

1.5.2.2 Điều trị bệnh

-Thuốc giảm đau: efferalgan codein (paracetamol + codein) 500mg, có tác dụng giảm đau; hoặc giảm đau chống viêm non-steroides như aspirrin 1.000mg;

- Corticoides (prednisolon)

- Thuốc kháng virus (Acyclovir, Valacyclovir, Famyclovir) Acyclovir viên nén 200mg, 400mg, 800mg Thời gian điều trị từ 5-7 ngày Thuốc được dùng ngay khi bệnh mới biểu hiện rõ và mụn nước xuất hiện Thuốc có tác dụng làm giảm cường độ và thời gian đau sau zona, điều trị càng sớm thì hiệu quả càng cao;

- Thuốc bôi tại chỗ: trong thời gian mụn nước xuất hiện, vệ sinh nơi tổn thương sạch sẽ rồi thoa, mặc quần áo thoáng mát tránh trầy vết phỏng rạ Khi mụn nước vỡ, có thể chấm bằng thuốc xanh methylene

- Thuốc kháng histamine: thuốc này không có tác dụng chống virus nhưng có tác dụng làm giảm ngứa tại chỗ và an thần nhẹ

- Thuốc bôi chống bội nhiễm: bôi thuốc màu, hồ nước, mỡ kháng sinh (mỡ Bactroban, Fucidin), mỡ chống virus acyclovir

- Kháng sinh chống bội nhiễm vi khuẩn: uống Erythromycin, Cephalexin

- Nằm nghỉ trong thời kì có sốt, tránh gãi vì có thể gây sẹo vĩnh viễn

- Trong các thể nặng tuyệt đối tránh sử dụng Corticoid, chú ý cân bằng

nước, điện giải Tuyệt đối không nên dùng aspirin để hạ sốt cho bệnh nhân thuỷ đậu Điều này có thể gây ra hội chứng Reyes, tổn thương gan và não

- Điều trị thuỷ đậu lan tràn dùng Acyclovir đường tĩnh mạch hoặc Vidarabin cho các ca thuỷ đậu nặng, viêm phổi thuỷ đậu, viêm não thuỷ đậu và thuỷ đậu

ở người thiếu hụt miễn dịch

- Đối với bệnh zona:có ba dược chất được chấp thuận sử dụng trong điều trị zona là acyclovir, valacyclovir, famciclovir

II Các phương pháp chẩn đoán bệnh

dễ sử dụng, hiệu quả ở những bệnh nhân miễn dịch nhưng không hiệu quả đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch và đòi hỏi kỹ thuật cao

- Phân lập virus: phương pháp này giúp phân biệt được VZV và HSV Nhưng

VZV yếu ớt và tương đối khó hồi phục từ các mẫu bệnh phẩm của những tổn thương ở da Vì phương pháp này rất tốn thời gian (cho kết quả sau 2 tuần hoặc hơn) và độ nhạy thấp nên không có ý nghĩa lớn trong công tác chẩn đoán

- Xác định phân tử DNA của virus bằng kỹ thuật PCR: là kỹ thuật phản ứng khuếch đại chuỗi gen bằng enzym polymerase có ưu điểm nhanh, nhạy trong việc tìm DNA của VZV trong dịch và các mô Đồng thời, giúp phân biệt được VZV và HSV

2.2 Chẩn đoán huyết thanh học [34]

Các phản ứng huyết thanh: xét nghiệm miễn dịch enzym (EIA), ngưng kết latex (LA), kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) và kháng thể huỳnh quang

để khảo nghiệm kháng nguyên màng (FAMA- fluorescen antibody to membrane antigen) là đáng tin cậy ở bệnh nhân có hệ miễn dịch hoạt động bình thường nhưng không hiệu quả ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch

Trong các phương pháp trên, phương pháp phân tử có ưu điểm là nhạy, cho kết quả nhanh, đặc hiệu Các chẩn đoán đầu tiên nhằm phát hiện VZV chủ yếu dựa trên phương pháp PCR (Gilden et al., 1992) Phương pháp PCR ngày càng được cải tiến đến ngày nay là Real-time PCR Phương pháp này hiệu quả, giúp chẩn đoán nhanh trên bệnh nhân Từ đó có những liệu pháp chữa trị sớm cho bệnh nhân, đặc biệt là ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch, ở người lớn tuổi hoặc ở phụ nữ mang thai,

III Phương pháp PCR

3.1 Giới thiệu [1,4, 8, 9, 13]

Năm 1985, Kary B.Mullis cùng các cộng sự đã phát minh ra phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Đây là phương pháp tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA

đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA

có chức năng di truyền Người ta còn gọi nó là kĩ thuật tạo dòng DNA in

Kết quả của phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: DNA

khuôn, Taq polimerase, mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi, ion Mg2+, nguyên liệu là các dNTP, nước, dung dịch đệm,

3.2 Nguyên tắc hoạt động

Nguyên tắc của PCR là khuếch đại đoạn DNA đích trong ống nghiệm phản ứng để sau đó phát hiện chúng Do vậy, PCR hiện nay đang trở thành một công cụ chẩn đoán nhạy nhất, cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp,

để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được bằng các xét nghiệm khác) trong các bệnh phẩm khác nhau

Đây là một kỹ thuật tạo dòng in vitro nhằm khuếch đại đặc trưng một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự oligonucleotide đã biết trước Hai trình tự

oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi (forward primer) bắt cặp với mạch

âm DNA và mồi ngược (reverse primer) bắt cặp với mạch dương DNA Một

phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ giống nhau được lặp đi lặp lại nhiều lần Một chu kỳ PCR bình thường gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

 Bước 1: Nhiệt độ phản ứng là 940 - 950C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các

mạch đơn Giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính

(denaturation)

 Bước 2: Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 550

C - 650C là nhiệt độ thích hợp

để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích,

giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp (annealing)

 Bước 3: Giai đoạn kéo dài hay tổng hợp (elongation): nhiệt độ được đưa

lên 720C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của Taq polymerase để kéo các

dNTPs lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao Nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230đến 240bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao Thông thường, một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ

sự tồn tại của các chất kìm hãm phản ứng PCR, cả sau quá trình tách chiết cũng ảnh hưởng lớn đến hàm lượng sản phẩm PCR sau cùng

Người ta đã có nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn Sự phát triển về

kỹ thuật cũng góp phần đáng kể vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng nên được gọi là Real-time

So với PCR truyền thống, Real-time PCR có nhiều ưu điểm hơn như:

 Độ đặc hiệu của Real-time PCR cao hơn rất nhiều so với PCR truyền thống do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại

 Real-time PCR cho phép định lượng sản phẩm khuếch đại nhờ sử

dụng các chất phát quang đặc hiệu, lượng sản phẩm khuếch đại có thể định lượng ở từng chu kỳ phản ứng

 Dữ liệu Real-time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực

hiện

 Việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng PCR

3.3.1 Nguyên tắc hoạt động

Phản ứng Real-time PCR thực chất chính là phản ứng PCR, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye) Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR mục tiêu sẽ được theo dõi hàm lượng theo một thời gian thật (realtime) của phản ứng Sản phẩm DNA khuếch đại được đánh dấu bằng chất hiện màu hay mẫu dò (probe) phát huỳnh quang Những máy luân nhiệt đặc hiệu có trang bị hệ thống quang học nhằm phát và thu nhận tín hiệu

huỳnh quang (máy real-time PCR) Tín hiệu huỳnh quang được đo lường, phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ

3.3.2 Thiết bị

Các loại thiết bị nhân bản nucleic acid có sử dụng huỳnh quang thông dụng trên thị trường hiện nay như: hệ thống ABI Prism 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems), LightCycler (Roche Diagnostics), iCycler (Bio-Rad), Mx400 (Stratagene), Chimaera Quantitative PCR System (hybaid), DNA Engine Opticon Continuous Flourescent Detection System (MJ Research)

3.3.3 Các kiểu phản ứng Real-time PCR

Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-time PCR với độ nhạy tương đương nhau Cả bốn phương pháp đều sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang (florescent dye) có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi hàm lượng sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (real-time) của phản ứng Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào phân

tử DNA mạch đôi Ba phương pháp còn lại sử dụng probe có đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu

 Molecular beacon

Đây là loại probe có cấu trúc dạng vòng và cuống (stem and loop structure), trong đó cấu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiêu Một chất hóa học phát huỳnh quang được gắn vào một đầu của probe và một chất hóa học khác (quencher) được gắn ở đầu bên kia Quencher là một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lượng mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang dưới dạng nhiệt

và vì thế không cho ánh sáng huỳnh quang nào được phát ra Phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của probe ở gần với nhau trong không gian, lúc

đó quencher sẽ phát huy tác dụng và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang Khi probe bắt cặp bổ sung với một mạch của trình tự DNA mục tiêu ở nhiệt độ lai của phản ứng thì probe mất cấu trúc dạng vòng và

cuống trở thành dạng thẳng Điều này làm gia tăng khoảng cách không gian giữa chất phát huỳnh quang và quencher Chất phát huỳnh quang lúc đó sẽ phát ánh sáng mà các thiết bị có thể thu nhận và phân tích Nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự DNA thì không có sự phát ánh sáng huỳnh quang

Hình1.10 : Nguyên tắc hoạt động của Molecular beacon

 Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi

Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi Khi ở trạng thái tự

do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào DNA mạch đôi thì chất nhuộm phát huỳnh quang và cường độ huỳnh quang phát ra

tỉ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR Các chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I, Ethidium bromide

Hình1.11 : Nguyên tắc hoạt động của SYBR Green

Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào các DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính trong bước biến tính Mọi DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và phát huỳnh quang nên nếu có các sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng, người ta xây dựng một đường cong “nóng chảy” (mealting curve) bằng cách nâng dần nhiệt độ phản ứng và đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ khác nhau

 Probe đôi (Hybridization probe)

Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng lúc hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu Một probe mang ở đầu 3’ chất cho

“flourescein” (flourescein donor) phát ánh sáng màu xanh và một probe thứ hai mang ở đầu 5’ chất nhận “flourescein” ( flourescein acceptor) Probe thứ hai được chặn ở đầu 3’ sao cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu này Ánh sáng huỳnh quang chuyển từ chất cho đến chất nhận thông qua hiệu ứng FRET (Flourescent Resonance Energyn Trasfer – sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) và chất nhận sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang có màu đỏ (red flourescent)

Hình 1.12: Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang của probe đôi

Trong dung dịch phản ứng khi chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra Đến bước bắt cặp giữa probe với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai probe sao cho phần đầu của probe này tiếp xúc với phần đuôi của probe kia Khi có hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được và sẽ có các thiết bị ghi nhận Cường độ huỳnh quang do chất nhận phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng PCR trong phản ứng

 Probe thủy giải ( Hydrolysis probe)

Probe sử dụng trong phương pháp này cò gọi là Taqman (Taqman probe) Probe Taqman được gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thu bởi quencher Trong bước bắt cặp và kéo dài mạch của một chu kỳ PCR, probe này sẽ bắt cặp với mạch bổ sung trên trình tự DNA mục tiêu Khi Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến tiếp xúc với probe, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease

và loại bỏ một số nucleotide ở đầu của probe thay bằng các nucleotide mới Khi đó, chất huỳnh quang sẽ tách rời probe và quencher mất tác dụng Cường

độ huỳnh quang phát ra tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng

Taqman probe chỉ bắt cặp với mạch khuôn nếu trình tự nucleotide của hai phân tử DNA là bổ sung hoàn toàn với nhau Nếu không có sự bổ sung hoàn toàn thì Taqman probe sẽ không bắt cặp và sẽ không có tín hiệu huỳnh quang nào được phát ra Như vậy, các sản phẩm ký sinh nếu có trong phản ứng PCR cũng không thể hiện Điều này khiến cho phản ứng PCR sử dụng Taqman probe có tính đặc hiệu cao Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn cặp primer từ 8-100C nhằm tạo thuận lợi cho việc bắt cặp và thủy giải probe bởi Taqman polymerase