định danh các phân chủng vi nấm cryptococcus neoformans trên bệnh nhân hiv aids viêm màng não và khảo sát độ nhạy cảm đối với các thuốc kháng nấm hiện hành

HỒ CHÍ MINH Nguyễn Như Quỳnh ĐỊNH DANH CÁC PHÂN CHỦNG VI NẤM CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TRÊN BỆNH NHÂN HIV/AIDS VIÊM MÀNG NÃO VÀ KHẢO SÁT ĐỘ NHẠY CẢM ĐỐI VỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Như Quỳnh

ĐỊNH DANH CÁC PHÂN CHỦNG VI NẤM

CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TRÊN

BỆNH NHÂN HIV/AIDS VIÊM MÀNG NÃO

VÀ KHẢO SÁT ĐỘ NHẠY CẢM ĐỐI VỚI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Như Quỳnh ĐỊNH DANH CÁC PHÂN CHỦNG VI NẤM

CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TRÊN

BỆNH NHÂN HIV/AIDS VIÊM MÀNG NÃO VÀ KHẢO SÁT ĐỘ NHẠY CẢM ĐỐI VỚI CÁC THUỐC KHÁNG NẤM HIỆN HÀNH

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS.BS TRẦN PHỦ MẠNH SIÊU

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:

 TS BS Trần Phủ Mạnh Siêu, người đã tận tình chỉ dẫn, động viên, tạo

điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

 PGS BS Cao Minh Nga, người định hướng cho tôi trong việc chọn đề tài

 Phòng xét nghiệm vi nấm – Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới, TP HCM đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm đề tài

 Quý Thầy, Cô khoa Sinh học – Trường ĐHSP Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ tôi trong suốt khóa học cao học

 Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên tôi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực

Tác giả luận văn

Nguyễn Như Quỳnh

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải

(Acquired immunodeficiency syndrome) ARV Anti – retrovirus

BV Bệnh Nhiệt Đới Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới

BMI Chỉ số khối cơ thể (Body mass index)

Thạch BHI Brain heart infusion agar

CGB Canavanine glycine bromothyloml blue

CFU Colony forming unit

CDBT Creatinine dextrose bromothymol blue

thymine

HIV Human immunodeficiency virus

NTCH Nhiễm trùng cơ hội

PCR Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase chain

reaction) SDA Sabouraud dextrose agar

SGMD Suy giảm miễn dịch

MIC Minimum Inhibit Concentration (nồng độ ức

chế tối thiểu) GMX Glycuronoxylomannan

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1.Tình hình nhiễm HIV/AIDS tại Việt Nam 3

1.2 Sinh bệnh học HIV/AIDS 3

1.3 Vi nấm cơ hội Cryptococcus neoformans 4

1.3.1 Định nghĩa vi nấm cơ hội 4

1.3.2 Vi nấm cơ hội Cryptococcus neoformans 5

1.3.3 Dịch tễ học 7

1.3.4 Chẩn đoán 10

1.3.5 Điều trị 12

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Hóa chất 16

2.1.3 Môi trường 16

2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy 16

2.1.3.2 Môi trường định danh 17

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 19

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 19

2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 20

2.2.3.1 Thu thập dữ liệu 20

2.2.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu 20

Chương III - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Tỷ lệ cấy dương tính 29

3.1.1 Tỷ lệ cấy dương tính với Cryptococcus neoformans trên bệnh phẩm DNT 29

3.1.2 Tỷ lệ cấy dương tính với Cryptococcus neoformans trên bệnh phẩm máu 31

3.2 Đặc điểm cỡ mẫu 32

3.2.1 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính trên bệnh phẩm DNT 32

3.2.2 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính trên bệnh phẩm máu 33

3.3 Về tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoforman theo nhóm tuổi 33

3.3.1 Về tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi

trên bệnh phẩm DNT 33

3.3.2 Về tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi trên bệnh phẩm máu 34

3.4 Tỷ lệ thứ của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên từng loại bệnh phẩm 35

3.4.1 Tỷ lệ thứ của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên bệnh phẩm DNT 36

3.4.2 Tỷ lệ thứ của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên bệnh phẩm máu 37

3.5 Tỷ lệ kiểu huyết thanh của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên từng loại bệnh phẩm 39

3.5.1 Tỷ lệ kiểu huyết thanh của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên bệnh phẩm DNT 40

3.5.2 Tỷ lệ kiểu huyết thanh của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên bệnh phẩm máu 41

3.6 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương trên từng loại bệnh phẩm 41

3.6.1 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm DNT 41

3.6.2 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm máu 43

3.7 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm (MIC) 45

3.7.1 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm trên bệnh phẩm DNT 46

3.7.2 Về độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm trên bệnh phẩm máu 46

3.7.3 Bàn luận 46

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 KẾT LUẬN 51

4.2 KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

HÌNH ẢNH NGHIÊN CỨU

DANH SÁCH BỆNH NHÂN ĐƯA VÀO NGHIÊN CỨU

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Tỷ lệ cấy nấm dương tính trên bệnh phẩm DNT 30

Bảng 3.2 Tỷ lệ cấy nấm dương tính trên bệnh phẩm máu 30

Bảng 3.3 So sánh tỷ lệ cấy nấm dương tính giữa máu và DNT 31

Bảng 3.4 Phân bố giới tính ở bệnh phẩm DNT 32

Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính trên bệnh phẩm DNT 32

Bảng 3.6 Phân bố bệnh nhân theo giới tính ở bệnh phẩm máu 33

Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo giới tính trên bệnh phẩm máu 33

Bảng 3.8: Tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi trên bệnh phẩm DNT 34

Bảng 3.9 Tỷ lệ phân bố vi nấm Cryptococcus neoformans theo nhóm tuổi trên bệnh phẩm máu 34

Bảng 3.10 Tỷ lệ thứ của vi nấm Cryptococcus neoformans trên bệnh phẩm DNT 36

Bảng 3.11 Tỷ lệ thứ của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên bệnh phẩm máu 37

Bảng 3.12 Tỷ lệ kiểu huyết thanh của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên bệnh phẩm DNT 40

Bảng 3.13 Tỷ lệ huyết thanh của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố trên bệnh phẩm máu 41

Bảng 3.14 Tỷ lệ dương tính với Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm DNT 42

Bảng 3.15 Tỷ lệ các thứ của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm DNT 42

Bảng 3.16 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var gattii phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm DNT 43

Bảng 3.17 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var neoformans phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm DNT 43

Bảng 3.18 Tỷ lệ dương tính với vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm máu 43

Bảng 3.19 Tỷ lệ các thứ của vi nấm Cryptococcus neoformans phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm là máu 44

Bảng 3.20 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var gattii phân bố

theo địa phương trên bệnh phẩm máu 44

Bảng 3.21 Tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans var neoformans

phân bố theo địa phương trên bệnh phẩm máu 45

Bảng 3.22 Kết quả làm kháng nấm đồ trên bệnh phẩm là DNT 46 Bảng 3.23 Kết quả kháng nấm đồ trên bệnh phẩm máu 46

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình dạng vi thể của Cryptococcus neoformans khi soi bằng

mực tàu (x40) 6

Hình 1.2 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans trong mô khi nhuộm Gram (x100) 6

Hình 1.3 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày 6

Hình 1.4 Khuẩn lạc nấm Cryptococcus neoformans trên môi trường Sabouraud nhiệt độ phòng 6

Hình 2.1 Chai cấy máu 19

Hình 2.2 Sơ đồ định danh vi nấm Cryptococcus neoformans 25

Hình 2.3 Bảo quản các chủng vi nấm 28

Hình 2.4 Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng nước cất 28

Hình 3.1 Kết quả phản ứng ngưng kết hạt Latex để phát hiện kháng nguyên của vi nấm Cryptococcus neoformans 28

Hình 3.2 Phản ứng dương tính với urê của vi nấm Cryptococcus neoformans 28

Hình 3.3 Hình dạng vi thể của Cryptococcus neoformans khi soi LPCB 28

Hình 3.4 Hình dạng vi thể của vi nấm Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày khi soi mực Tàu 28

Hình 3.5 Môi trường CGB 34

Hình 3.6 Hai thứ var neoformans và var gattii trên môi trường CGB 34

Hình 3.7 Cryptococcus neoformans var neoformans trên mt CGB 35

Hình 3.8 Cryptococcus neoformans var gattii trên mt CGB 35

Hình 3.9 var neoformans (serotype A) trên môi trường CDBT từ bệnh phẩm DNT 39

Hình 3.10 var neoformans (serotype D) trên môi trường CDBT từ bệnh phẩm DNT 39

Hình 3.11 Kết quả làm kháng nấm đồ 44

MỞ ĐẦU

 Lý do chọn đề tài

Tình hình nhiễm HIV/AIDS hiện nay đang lan tràn không còn thu hẹp trong một quốc gia hay một khu vực nữa mà thật sự nó đang là hiện tượng ở mọi nơi trên thế giới Điều đó biểu hiện ở sự gia tăng bệnh nhân HIV/AIDS với tốc độ ngày càng mạnh mẽ Theo Tổ chức Y tế Thế giới 2004: Toàn thể nhân loại đang đương đầu đại dịch AIDS, có 20 triệu người tử vong, 39,4 triệu đang mang HIV Chỉ tính riêng trong năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu người mới nhiễm HIV Tại Việt Nam, Bộ Y tế cho biết tính đến ngày 31/3/2011, cả nước có

185623 người nhiễm HIV/AIDS đang còn sống được báo cáo, trong đó có 44701 bệnh nhân AIDS hiện còn sống và 49912 trường hợp tử vong do AIDS Theo nhiều tác giả nước ngoài, các tổn thương có thể gặp tới 40% ở bệnh nhân nhiễm HIV là nấm, vi khuẩn, virus hay ung thư Nhiễm trùng cơ hội (NTCH) là một trong những nguyên nhân gây tử vong của AIDS, trong đó nhiễm Cryptococcus

neoformans là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trên cơ địa suy giảm miễn dịch

HIV/AIDS Cryptococcus neoformans gây ra bệnh viêm màng não nấm là bệnh cảnh thường gặp nhất và gây tử vong hàng đầu ở bệnh nhân HIV/AIDS

Ngày nay việc lạm dụng thuốc kháng nấm và thuốc ức chế miễn dịch đã tạo điều kiện cho các chủng vi nấm cơ hội phát triển đặc biệt là ở các nước có khí hậu nóng ẩm quanh năm như Việt Nam

Từ đầu thế kỉ XX đến nay, có rất nhiều khảo sát về Cryptococcus neoformans

được thực hiện và báo cáo trên thế giới, tuy nhiên ở Việt Nam bệnh nấm do

Cryptococcus neoformans được phát hiện từ năm 1928 (chiếm 10%) sau đó xuất hiện lẻ tẻ cho đến cuối thập niên 1990 chứ chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống đặc biệt chưa đề cập đến sự phân bố các thứ, các kiểu huyết thanh Liệu

rằng cách phân lập, định danh Cryptococcus neoformans var neoformans và

Cryptococcus neoformans var gattii giống hay khác nhau, và độ nhạy cảm tương ứng của chúng đối với thuốc kháng nấm hiện hành như thế nào là vấn đề cần tìm hiểu để có thể đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả nhất cho các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS hiện nay

 Đối tượng

Các bệnh nhân HIV/AIDS chỉ định xét nghiệm dịch não tủy (DNT), máu

 Nhiệm vụ đề tài

Phân lập và định danh các phân chủng vi nấm Cryptococcus neoformans từ

dịch não tủy, máu của bệnh nhân HIV/AIDS tại khoa nhiễm E, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới TP HCM

So sánh sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm vi nấm Cryptococcus neoformans theo

thứ, theo kiểu huyết thanh và khảo sát độ nhạy cảm tương ứng của chúng với các thuốc kháng nấm hiện hành

 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và định danh các phân chủng vi nấm Cryptococcus neoformans trên

bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não điều trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011

Xác định tỷ lệ phân bố theo thứ, theo kiểu huyết thanh trên mẫu bệnh phẩm DNT, máu ở bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não do Cryptococcus neoformans

điều trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011

Xác định độ nhạy cảm với thuốc kháng nấm hiện hành của các chủng vi nấm

Cryptococcus neoformans trên bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não điều trị tại

BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến 7/2011

 Thời gian, địa điểm và phạm vi nghiên cứu

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1.Tình hình nhi ễm HIV/AIDS tại Việt Nam

Đại dịch HIV/AIDS tuy mới xuất hiện từ những năm 80 nhưng đã nhanh chóng lan ra toàn cầu HIV tấn công mọi đối tượng thanh niên, phụ nữ, trẻ em, người có tuổi, làm các nghành nghề khác nhau, người nghiện ma túy, mại dâm, đồng tính luyến ái Tại Việt Nam, theo báo cáo mới nhất của Uỷ ban phòng chống AIDS Thành phố Hồ Chí Minh thì đến 31/12/2002, trong cả nước tổng số người nhiễm HIV được ghi nhận là 59200 trường hợp, trong đó 8793 trường hợp chuyển sang AIDS và đã có 4889 ca tử vong vì HIV/AIDS Số lượng người nhiễm HIV được báo cáo trong năm qua tăng hơn 40% so với năm trước Đến cuối năm 2002, có 12 tỉnh thành có trên 1000 người nhiễm HIV được phát hiện

là TP Hồ Chí Minh, Quảng Ninh, Hải Phòng, An Giang, Hà Nội, Lạng Sơn, Đồng Nai, Hải Dương, Nghệ An, Đồng Tháp, Bà Rịa - Vũng Tàu và Cần Thơ Đứng đầu là Quảng Ninh (50247/100000 dân), kế đến là Hải Phòng (24565/100000) và TP Hồ Chí Minh (22806/100000) [2] Năm 2007, tại Việt

Nam có 132628 trường hợp nhiễm HIV và 26828 trường hợp AIDS, số ca tử vong là 15007 người Năm 2010 có 2741 trường hợp nhiễm HIV mới, tổng số bệnh nhân nhiễm HIV đến hết quý I là 209424 ca; tổng số bệnh nhân AIDS

82416 ca, số tử vong là 45227 ca từ cục phòng chống HIV/AIDS của Bộ y tế

Hình thái lây nhiễm HIV chủ yếu qua đường tiêm chích ma túy, nhưng đang có xu hướng gia tăng ở đối tượng có nguy cơ thấp (tỷ lệ nhiễm HIV ở thanh niên khám nghĩa vụ quân sự tăng từ 0,04% năm 1996 lên 0,15% năm 1998 và tăng đến 1,31% năm 2001; tỷ lệ nữ mang thai nhiễm HIV tăng từ 0,08% năm

1999 lên 0,2% năm 2000 và trong năm 2002 đã tăng 0,39%)

Nhiễm HIV tiếp xúc có xu hướng gia tăng ở tuổi trẻ (nhóm tuổi từ 20 - 29 chiếm 29% năm 1997, đã tăng lên 60,4% trong năm 2002)

Tại TP Hồ Chí Minh, từ trường hợp đầu tiên nhiễm HIV được phát hiện vào tháng 12 năm 1990, số trường hợp có HIV dương tính qua xét nghiệm không ngừng gia tăng Tính đến cuối năm 2010, đã có 13067 trường hợp nhiễm HIV trên toàn thành phố Tuy nhiên, tổng số người nhiễm HIV thật sự ước tính phải gấp 4 - 5 lần Trong đó, bệnh nhân AIDS là 4481 và chết vì AIDS là 1732 người

1.2 Sinh bệnh học HIV/AIDS

• HIV nhiễm vào cơ thể qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: xâm nhập vào cơ thể qua 3 đường: sinh dục, máu, mẹ bị nhiễm

truyền sang con

Giai đoạn 2: tấn công vào “tế bào đích” (là những tế bào của hệ thống miễn

dịch có trên bề mặt phân tử CD4+: cửa ngõ để virus xâm nhập vào), HIV có thể xâm nhập vào nhiều loại tế bào như lymphoT CD4+, monocyst, lympho B, đại thực bào

Giai đoạn 3: sinh sản trong tế bào đích và gây ra các hiện tượng Sự sinh sản

của virus làm cho tế bào bị hủy hoại do nhiều cơ chế Khi tế bào bị nhiễm virus, virus sử dụng nguồn năng lượng của tế bào, các enzym, chất liệu di truyền để tăng trưởng và nhân lên, hậu quả cuối cùng là tế bào bị hủy hoại và bị chết

Tại BV Bệnh Nhiệt Đới, TP Hồ Chí Minh từ năm 2000 - 2009 số lượt bệnh

nhân nhiễm HIV/AIDS nhập viện điều trị vì các bệnh nhiễm trùng cơ hội không ngừng gia tăng, với số lượng người bệnh tăng trung bình mỗi năm khoảng 20%

Cụ thể: số lượng bệnh nhân điều trị nội trú tại bệnh viện năm 2006 là 2725

trường hợp, gấp 4 lần số lượt bệnh nhân điều trị năm 2000 Trong khi đó, khu

vực ngoaị trú bệnh viện hàng ngày tiếp nhận điều trị cho khoảng hơn 100 lượt bệnh nhân Riêng trong năm 2006, đã tiếp nhận khám 3800 lượt cho số 5000 bệnh nhân Vấn đề khó khăn hiện nay trong điều trị người bệnh nhiễm HIV/AIDS là đa số các bệnh nhân suy kiệt và mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội rất nặng, chưa có hướng điều trị hiệu quả như các trường hợp hạch trong ổ bụng

và trung thất, nhiễm trùng thần kinh trung ương Đặc biệt, với bệnh viêm màng

não do nấm Cryptococcus neoformans gây tử vong với tỷ lệ rất cao

1.3 Vi nấm cơ hội Cryptococcus neoformans

1.3.1 Định nghĩa vi nấm cơ hội

Nấm cơ hội được định nghĩa là những loài nấm mà dưới điều kiện bình thường không gây bệnh Chúng chỉ gây bệnh ở những người có hệ miễn dịch yếu như trẻ sơ sinh, người già, phụ nữ có thai, bệnh nhân sau phẫu thuật , hay suy giảm miễn dịch mắc phải như bệnh nhân HIV/AIDS

Nhiễm trùng cơ hội (Opportunistic Infections - OIs) là những nhiễm trùng do

các vi sinh vật gây ra ở những người suy giảm miễn dịch (miễn dịch yếu - Immunodeficiency hoặc bị ức chế miễn dịch - Immunosuppression) Chúng cần

có một cơ hội như:

- Suy dinh dưỡng

- Nhiễm trùng dai dẳng

- Các yếu tố gây ức chế miễn dịch trong ghép phủ tạng

- Hóa trị trong ung thư

1.3.2 Vi nấm cơ hội Cryptococcus neoformans

Cryptococcus neoformans là tác nhân gây bệnh quan trọng trong y học ngày nay, đặc biệt trên cơ địa suy giảm miễn dịch Đây là một vi nấm hạt men, gồm 4

kiểu huyết thanh (serotypes): A và D thuộc thứ neoformans (var neoformans), kiểu huyết thanh A với đề nghị tách riêng thành Cryptococcus neoformans

var.grubii vẫn đang được tranh cãi; kiểu huyết thanh B và C thuộc thứ gattii (var

gattii) Sự phân bố địa lý, nguồn chứa, đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh

của Cryptococcus neoformans thay đổi tùy theo thứ Cryptococcus neoformans

var neoformans phân bố khắp nơi trên thế giới, trong phân khô của các loài chim,

gà, hoặc trong đất chứa nhiều phân chim, đặc biệt là chim bồ câu Các tháp lâu đài, nhà thờ, tầng dưới nóc các tòa nhà cũ, bệ cửa sổ, kho chứa rơm, cỏ khô , là nơi các loài chim, dơi đến trú ngụ và trở thành nguồn chứa vi nấm quan trọng [58] Tuy nhiên, ít khi phân lập được vi nấm này từ phân chim tươi và ẩm vì

Cryptococcus neoformans không phát triển trên môi trường kiềm Ngược lại,

Cryptococcus neoformans var gattii hiếm khi xuất hiện trong phân chim nhưng hiện diện rất nhiều trong chất mục nát tích tụ ở các hốc trên thân cây bạch đàn [49], vì vậy Cryptococcus neoformans var gattii là tác nhân chủ yếu của nhiễm

Cryptococcus neoformans ở vùng nhiệt đới, nơi phát triển nhiều giống cây này như Châu Phi, Australia, Châu Á và Nam Mĩ Đối với cơ thể cảm thụ,

Cryptococcus neoformans var gattii có một số khác biệt về đặc điểm bệnh học

như khả năng đáp ứng với quá trình trị liệu Cryptococcus neoformans var

neoformans chiếm ưu thế trên cơ địa HIV/AIDS, trong khi Cryptococcus

neoformans var gattii gây bệnh chủ yếu trên người khỏe mạnh nên số trường hợp

khỏi bệnh cao hơn, nghĩa là điều trị hiệu quả hơn

 Bệnh học

Vi nấm có đường kính khoảng 20 µm, trong mô vi nấm có đường kính 5 - 10

µm và kể cả bao dày bên ngoài Phần bao khó nhuộm nên ta thấy một lớp vỏ rộng, trong suốt (không ăn phẩm màu), bao quanh tế bào hạt men Vi nấm hạt men này tăng trưởng bằng cách nảy búp với một cuống hẹp ở giữa hạt men và

búp Cryptococcus neoformans cho phản ứng urê dương tính, làm môi trường đổi màu hồng ít giờ sau

Gây bệnh ở một số cơ quan trong cơ thể như: màng não, máu, phổi, da, nguy hiểm nhất là bệnh viêm màng não [15], [19]

Hình 1.3 Hình dạng vi thể Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày

Hình 1.4 Khuẩn lạc nấm Cryptococcus neoformans trên môi trường Sabouraud

nhiệt độ phòng

 Đặc điểm lâm sàng

Nhiễm Cryptococcus neoformans bao gồm các thể lâm sàng phổ biến như:

thể phổi nguyên phát, VMN, tổn thương da viêm xương, tủy xương Ngoài các

cơ quan nói trên, vi nấm có thể tấn công các tổ chức khác gây viêm thận, bể thận,

viêm tiền liệt tuyến, viêm gan, viêm nội tâm mạc, viêm đường tiêu hóa

Sau khi xâm nhập cơ thể ký chủ qua đường hô hấp Cryptococcus neoformans gây

phản ứng viêm thoáng qua ở phổi và tương tự giới hạn trên cơ địa miễn dịch bình thường

Trên thể tạng HIV/AIDS, vi nấm từ phổi sẽ phát tán vào máu đến thần kinh trung ương gây VMNM - vị trí thường gặp trong nhiễm nấm toàn thân [15]

 Độc tố của vi nấm

Nấm này có các yếu tố độc tính chủ yếu sau đây:

- Tổng hợp sắc tố melanin : bảo vệ các tế bào nấm chống lại stress oxy hóa,

thực bào, thuốc chống nấm, và cũng có thể sửa đổi chủ phản ứng miễn dịch

- Phát triển vỏ polysaccharide của vi nấm Cryptococus neoformans: giúp

các tế bào nấm chống được các đại thực bào phế nang thực bào

Phần lớn các loài nấm phát triển tối ưu giữa 25o

Năm 1894, Sanfelice phân lập từ dung dịch nước quả đào được một loại

nấm men có vỏ bao dày, đặt tên cho chúng là Saccharomyces neoformans [93]

Đến năm 1901, Vuillemin đưa chủng nấm trên vào họ Cryptococcus vì không tìm được dạng bào tử nang của Saccharomyces, và ông ta đặt tên lại cho nó là

Cryptococcus hominis Vào năm 1955, Emmons có bài viết đầu tiên về tính gây

bệnh của loài nấm Cryptococcus hominis hay hiện nay gọi là Cryptococus

neoformans

Bệnh nấm Cryptococcosis được chẩn đoán ở khắp phương Đông Tuy

nhiên, trong hầu hết trường hợp tác nhân gây bệnh là nấm Cryptoccocus

neoformans Điều đáng chú ý là có tới 75 - 90% các trường hợp mắc bệnh

Cyptococcosis ở phương Đông do chủng vi nấm này gây ra và chưa tìm tất cả nơi

cư trú của vi nấm này Không phải chúng chỉ cư trú ở đất và phân chim (đặc biệt

là phân chim bồ câu) mà theo bác sĩ David H.Ellis làm việc tại bệnh viện nhi Adelaide - Australia giải đáp năm 1990 thì sự lây nhiễm theo ông liên quan tới

một loài cây mọc khắp Australia là bạch đàn (Eucalyptus) Và ông cho rằng sự

phân bố toàn cầu của loài cây này tương ứng với sự phân bố dịch tễ của bệnh

nấm Cryptococcus spp do chủng vi nấm Cryptococcus neoformans gây ra [48]

Điều này hiện cần phổ biến cho tất cả các nước phương Đông

Mặc dù có nhiều loài nấm Cryptococcus spp, nhưng chỉ có một chủng gây bệnh trên người là Cryptococcus neoformans Tên của chủng nấm này cũng thể hiện bản chất của bệnh vì “crypto” theo tiếng Hi Lạp có nghĩa là “ẩn náu”

Về mặt vi sinh, thuật ngữ này có nghĩa là có một bao nang bao quanh

Cryptococcus neoformans là thể nấm men có bao nang duy nhất gây bệnh cho

người

Cryptococcus neoformans phát triển trong đất, ở khắp nơi đặc biệt là phân chim bồ câu Trong đất và phân chủng nấm này thoát ra khỏi các bao nang, nhờ gió bay đi khắp nơi và những phần tử gây nhiễm không bao nang có đường kính

1 - 5 µm xâm nhập vào phổi con người

Mặc dù bệnh nấm Cryptococcus spp được mô tả lần đầu từ cuối những

năm 1880, nhưng trước thời kỳ có HIV/AIDS nó vẫn được coi là bệnh rất hiếm

gặp Tuy nhiên, hiện nay bệnh đang có xu hướng tăng trên toàn thế giới Theo

tính toán của một tác giả thì mỗi năm ở NewYork có khoảng 5000 - 15000

trường hợp mắc bệnh nấm Cryptococcus spp [29] Ở Thái Lan, đây là nguyên

nhân thứ hai gây tử vong ở bệnh nhân AIDS Cho tới nay hầu hết những người

mắc bệnh này đều có thiếu hụt miễn dịch qua trung gian tế bào Vì thế, những người Hodgkin, bệnh nhân AIDS có lympho và lao thường bị nhiễm bệnh [36]

Các tế bào CD4+T rất quan trọng cho sự đề kháng của cơ thể đối với bệnh nhiễm vi nấm Hệ miễn dịch dịch thể tác dụng chủ yếu với vỏ polysaccharide,

glucuronoxylomannan, muerin của Cryptococcus neoformans

 Tỷ lệ nhiễm trong cộng đồng

Tại Thái Lan, theo tài liệu từ ĐH Harward, CDC Mỹ và chương trình

GAP, tỷ lệ nhiễm nấm Cryptococcus neoformans là 19% - 38% [15]

Tại Việt Nam, tình hình bệnh nấm Cryptococcus neoformans như sau:

theo thống kê của các bác sĩ Khoa Giải Phẫu Bệnh của Bệnh Viện Chợ Rẫy từ

tháng 4/1999 đến tháng 10/2001, tỷ lệ nhiễm nấm Cryptococcus spp là 5%

(2/40) [7]; theo thống kê của tác giả Trần Phủ Mạnh Siêu tại BV Bệnh Nhiệt Đới

TP HCM, tỷ lệ nhiễm Cryptococcus neoformans chiếm đa số trên bệnh nhân

HIV/AIDS: năm 2003: 60 ca (57,8%); năm 2004: 83 ca (50%); năm 2005 (8 tháng đầu năm): 69 ca (60%)

 Phân bố nguồn nhiễm

Cryptococcus neoformans gồm 4 kiểu huyết thanh (serotype) xếp thành 2

thứ (variety): kiểu huyết thanh A, D và AD thuộc var neoformans; kiểu huyết thanh B và C thuộc var gattii Gần đây một số tác giả đề nghị tách kiểu thanh A

thành var grubii Nhưng vẫn còn nhiều tranh cãi Các kiểu huyết thanh phân bố khác nhau trong môi trường do sự khác biệt về đặc tính sinh học

Trong tự nhiên, Cryptococcus neoformans var neoformans được phân lập

từ chim, đặc biệt là chim bồ câu và đất lẫn phân chim [63] Năm 1955, Emmons phát hiện sự tồn tại của nhiều chủng Cryptococcus neoformans var neoformans

với độc lực rất thay đổi từ các mẫu phân chim bồ câu cũ tích tụ trên sân thượng [50] Tiếp theo nhiều nghiên cứu trên thế giới được thực hiện để xác định vai trò

của chim bồ câu đối với Cryptococcus neoformans var neoformans Năm 1974,

Swine – Desgaio báo cáo sự hiện diện của Cryptococcus neoformans var

neoformans trong bầu diều hâu với tỷ lệ khá cao 50%

Mặc dù Cryptococcus neoformans hiện diện trong phân chim bồ câu

nhưng khả năng phát hiện chúng khác biệt giữa các vùng: Luân Đôn: 7,6% [89]; Bangkok: 7,5 % [55]; Bỉ: 84% [58] Những yếu tố chi phối hiện tượng này do

pH, nồng độ acid uric, creatinine trong phân chim cũng như lượng ánh nắng mặt trời mà phân tiếp xúc Nói cách khác, thành phần hóa học trong phân chim bồ

câu góp phần quyết định sự phân bố của Cryptococcus neoformans var

neoformans [94] Ngoài chim bồ câu, một số chim khác cũng mang

Cryptococcus neoformans var neoformans như: chim hoàng yến, chim vẹt [26]

Ngược lại, nôi sinh thái của Cryptococcus neoformans var gattii không liên quan

đến chim bồ câu mặc dù kiểu huyết thanh này có khả năng đồng hóa creatinine

như Cryptococcus neoformans var neoformans Theo Kwon - Chung, sự thiếu cơ chế điều hòa quá trình hoạt hóa creatinine deiminase của Cryptococcus

neoformans var gattii đã ức chế sự phát triển của chúng trong phân chim [58] Ellis và Pfeifar công bố sự kết hợp giữa var gattii và cây Eucalyptus

camldulensis tại thung lũng Baosa năm 1990 [48] và ở Francisco năm 1991 [85]

Một năm sau, hai tác giả phân lập được vi nấm này trên cây Eucalyptus

tereticornic Nhiều nghiên cứu tiếp theo cũng tìm thấy kết quả tương tự ở Braxin, Mexico, Uruguay [48] Tuy nhiên khảo sát ở Châu Phi và Nam Mỹ vẫn chưa phát

hiện ra Cryptococcus neoformans var gattii trên cây Eucalyptus Như vậy, chứng

tỏ phải tồn tại một nôi sinh thái khác của Cryptococcus neoformans var gattii

Chủng var gattii phân lập từ môi trường đều thuộc kiểu huyết thanh B và đến nay

vẫn chưa xác định được nguồn nhiễm của serotype C trong tự nhiên [58]

Sự phân bố theo nguồn nhiễm như trên đã ảnh hưởng đến sự tồn tại khác nhau

của các nhóm serotype về địa lý và trên cơ địa bệnh nhân, Cryptococcus

neoformans var neoformans phổ biến tại các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới hiếm khi xâm lấn bệnh nhân suy giảm miễn dịch mắc phải [58]

Tại miền Bắc châu Úc, Cryptococcus neoformans var gattii chiếm 95%

[58], các mẫu bệnh phẩm phù hợp với sự hiện diện phong phú của bạch đàn tại

xứ này Dù vậy một số trường hợp nhiễm serotype B và C vẫn xảy ra ở vùng

không có giống cây bạch đàn (Eucalyptus), vì thế nguồn nhiễm trong tự nhiên của Cryptococcus neoformans var gattii thật sự chưa xác định rõ Kết quả khảo sát ở Mỹ cho thấy Cryptococcus neoformans var gattii hầu như được phân lập từ

bệnh nhân sống tại miền nam California [32]

Ở mức độ serotype, các chủng vi nấm gây bệnh phổ biến trong

Cryptococcus neoformans var neoformans thuộc serotype A, dao động từ 50 - 95% tùy vùng địa lý: Nhật Bản cao nhất 95%, Đông Nam Á thấp nhất 50% [58]

Sự xuất hiện serotype D vượt trội ở Đan Mạch, Ý, Thụy Sĩ với tỷ lệ trên 70% [57] Các đặc tính lí hóa, độc lực và mức độ thích nghi trên cơ thể ký chủ của

từng serotype có thể ảnh hưởng đến số liệu trên Đối với Cryptococcus

neoformans var gattii, Kwon - Chung và Benet ghi nhận serotype B gấp 4, 5 lần serotype C ở Mexico, Haiwaii và một vài nước châu Phi [58], [26]

Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào nói về nôi sinh thái Cryptococcus

neoformans nói chung và các kiểu huyết thanh nói riêng Tuy nhiên, Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á, có khí hậu nhiệt đới nên nhiều khả năng phân

bố các serotype tương tự các nước trong khu vực Thật vậy, năm 2002 Nhữ Thị Hoa phân tích các chủng phân lập từ bệnh nhân thu thập trong vòng 1 năm (1996

- 1997) đã công bố 25,7 % thuộc chủng var gattii [10], tương đồng với đánh giá

ở Thái Lan năm 1988, nhưng cao hơn so với Trung Quốc với Ấn Độ năm 1993 [22], [68]

1.3.4 Chẩn đoán

 Chẩn đoán xác định

Cryptococcus neoformans là một loại vi nấm hạt men hình tròn, được bao quanh bởi vách mucopolysaccharide với độ dày 1 - 3 µm và không bắt màu phẩm nhuộm Đặc điểm này được áp dụng vào phương pháp soi trực tiếp DNT sau khi

nhuộm mực Tàu để chẩn đoán Cryptococcus neoformans Ngưỡng mật độ cho

phép phát hiện mầm bệnh là 103 – 104 CFU/ml DNT [37], trong khi số lượng tế

bào nấm ở đa số bệnh nhân VMN không AIDS dao động trong khoảng 103 – 107CFU/ml DNT, ở cơ địa AIDS là 105 - 107 CFU/ml DNT [85] Nói cách khác

chẩn đoán vi nấm học không khó khăn vào thời kỳ toàn phát, nhưng giai đoạn khởi phát khả năng kiểm soát của kỹ thuật bị hạn chế, chỉ khoảng 80% trên bệnh nhân nhiễm AIDS, 30 - 50% trên bệnh nhân không AIDS [61] Khi đó xét nghiệm cặn ly tâm DNT là cần thiết giúp gia tăng độ nhạy Ngoài ra, âm tính giả

có thể xảy ra khi kích thước tế bào nấm nhỏ, bao nang mỏng khó nhận biết

Nhìn chung tuy kỹ thuật đơn giản trả lời kết quả nhanh, giá thành thấp nhưng phương pháp nhuộm mực Tàu không phải là lựa chọn ưu tiên trong đánh giá điều trị vì các tế bào nấm dù đã chết, vẫn hiện diện trong DNT một thời gian,

đôi khi nhiều tháng, với hình dạng có vẻ không thay đổi dưới kính hiển vi quang học, dẫn đến dương tính giả và ước lượng sai mật độ vi nấm

Những khuyết điểm quan sát trực tiếp được khắc phục phần nào bằng kĩ thuật cấy bệnh phẩm Tuy nhiên, trên canh cấy bao nang polysacharide thường mỏng hơn ở mô ký chủ [31], gây khó khăn cho việc định danh Kích thước bao nang bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ ủ, nồng độ glucose, CO2, Fe, pH và các thành phần dinh dưỡng khác cúa môi trường cấy [54] Do đó, một số trường hợp phải gây nhiễm trên chuột để phục hồi bao nang cho các chủng phân lập từ canh cấy Sabouraud Dextrose Agar (SDA), nhưng phương pháp này phức tạp, đòi hỏi nhiều thời gian Việc định danh các chủng được phân lập từ canh cấy SDA trở nên dễ dàng và chính xác hơn khi Staib Ajello phát hiện khả năng hình thành các

khúm màu nâu Cryptococcus neoformans trên môi trường Birdseed Agar [92] Cấy bệnh phẩm cho phép chẩn đoán các trường hợp nhiễm nhẹ, dù vậy âm tính giả vẫn xảy ra nếu số lượng vi nấm trong DNT quá ít Sử dụng toàn bộ căn ly tâm của 10 – 20 ml DNT sẽ làm tăng độ nhạy của kỹ thuật cấy, khắc phục hạn chế vừa nêu Ngoài ra, môi trường lỏng Brain Heart Infusion (BHI broth) với nguồn dinh dưỡng cao rất thích hợp trong việc kích thích quần thể vi nấm tăng sinh và duy trì phần nào độ nhạy của bao nang Đếm số khúm xuất hiện trên đĩa thạch SDA nhằm xác định mật độ nhiễm vi nấm giúp tiên lượng bệnh và theo dõi điều trị Tuy nhiên ở một số bệnh nhân, sau đợt sử dụng kháng nấm, canh cấy SDA âm tính không có nghĩa là vi nấm thật sự bị tiêu diệt, đặc biệt khi phết ươm nhuộm mực Tàu vẫn còn dương tính cao Ở các trường hợp này, sự hồi sinh rất

có khả năng xảy ra nếu cơ địa suy giảm miễn dịch nặng hoặc khi DNT được cấy vào môi trường giàu chất dinh dưỡng như cơ thể chuột hoặc BHI

Các kỹ thuật phát hiện kháng nguyên của vỏ Cryptococcus neoformans

trong dịch sinh học như: thử nghiệm ngưng kết hạt latex rất có giá trị, với độ nhạy, độ đặc hiệu khoảng 90 – 100% [ 25] Đo lường hiệu giá kháng nguyên giúp tiên lượng bệnh và theo dõi hiệu quả của phác đồ điều trị Tuy nhiên ở một số bệnh nhân, sau khi sử dụng thuốc kháng nấm, canh cấy SDA âm tính không có nghĩa là vi nấm thực sự bị tiêu diệt Ở trường hợp này, sự hồi sinh rất có khả năng xảy ra nếu cơ địa suy giảm miễn dịch nặng Tuy nhiên, khả năng âm tính giả sẽ xảy ra khi nồng độ kháng nguyên thấp [39], và xuất hiện dương tính giả

trong trường hợp nhiễm phối hợp với Trichosporon beigelii hoặc nồng độ kháng

nguyên tăng cao đột ngột khi vi nấm bị tiêu diệt

PCR cũng là một trong những công cụ chẩn đoán nhạy và chính xác, nhưng không phải là xét nghiệm sẵn có ở khắp nơi

Tại Việt Nam, PCR và thử nghiệm ngưng kết hạt latex chưa phổ biến vì giá thành cao, ngược lại quan sát trực tiếp khi nhuộm mực Tàu, cấy trên môi

trường SDA là những phương pháp chủ yếu trong chẩn đoán Cryptococcus

neoformans, được áp dụng tại các phòng xét nghiệm vi nấm

 Phân biệt Cryptococcus neoformans var neoformans và Cryptococcus neoformans var gattii

Việc định danh các kiểu huyết thanh của Cryptococcus neoformans rất có

ý nghĩa trong các nghiên cứu của dịch tễ học liên quan đến phòng ngừa bệnh Vì thế đã từ lâu, y văn công bố nhiều phương pháp xác định serotype Năm 1982, Kwon - Chung dựa vào khả năng khả năng kháng canavanine và sử dụng glycine như nguồn carbon [58] trong môi trường canavanine glycine bromothymol blue (CGB) để phân biệt Cryptococcus neoformans var gattii và Cryptococcus

neoformans var neoformans [59] Cryptococcus neoformans var.gattii tiêu thụ carbon sinh ra ammoniac là tăng pH môi trường, chất chỉ thị bromothymol blue

sẽ chuyển qua màu kiềm dẫn đến sử biến đổi màu vàng của thạch thành màu

xanh dương Trong khi đó Cryptococcus neoformans var neoformans nhạy cảm

với canavanine, đồng thời không sử dụng glycine nên không phát triển trên CGB

và không là thay đổi màu canh cấy Sâu hơn nữa, để phân biệt serotype A (var

grubii) và D (var neoformans), Iokanulo đề nghị môi trường creatinine dextrose bromothymol blue thymine (CDBT) [56] Sau 5 ngày cấy trên thạch CDBT, ủ ở

28oC, serotype D phát triển thành khúm màu đỏ sáng và làm đổi màu từ vàng thành cam sáng Trong khi đó, khúm serotype A có màu tái và môi trường vẫn giữ nguyên màu nguyên thủy Tuy nhiên, việc xác định màu đôi khi gặp khó khăn vì sắc màu sinh ra không phải luôn luôn ở hai cực rõ ràng Có lẽ, do

Cryptococcus neoformans var neoformans gồm ba kiểu huyết danh A, D và AD, trong đó kiểu huyết thanh AD mang một số đặc điểm sinh học của A và của D

nên những thay đổi sinh hóa không ổn định

Kỹ thuật PCR cho phép thực hiện sự phân biệt này một cách chính xác nhưng giá thành cao, đòi hỏi dụng cụ, thiết bị đắt tiền nên chưa sử dụng rộng rãi

trong việc định danh các kiểu huyết thanh của vi nấm Cryptococcus neoformans

+ Làm thành tế bào nấm không dãn ra được

+ Làm suy yếu chức năng của màng tế bào dẫn đến thoát các thành phần

tế bào có trọng lượng phần tử thấp ra khỏi tế bào, kết quả là tế bào nấm sẽ

chết

+ Làm tăng hiệu quả của 5 - fluorocytosin (5 - FC) do làm tăng khả năng

hấp thụ của 5 - FC qua màng tế bào nấm đã bị suy yếu

Cách dùng: dùng đường tĩnh mạch và nội màng trong hầu hết trường hợp bệnh

nấm nội tạng

• Nystatin

Là loại thuốc kháng nấm nhóm polyen giống amphotericin B

Tác dụng: cản trở quá trình tổng hợp ergosterol của màng tế bào nấm Cách dùng: điều trị tại chỗ, chỉ định các loài nấm phát triển mạnh trong hệ tiêu hóa, thực quản, ở da, bộ phận sinh dục Không dùng cho điều trị nấm nội tạng do: thuốc không tan trong nước, không hấp thụ vào mô tế bào, độ độc cao khi dùng ngoài đường tiêu hóa

• Fluconazole

Là một loại thuốc kháng nấm phổ rộng mới hơn trong nhóm triazol

Cách dùng: dạng viên uống và dạng dung dịch dùng đường tĩnh mạch Rất hiệu quả trong điều trị nấm men gây bệnh ở niêm mạc và nội tạng, đặc biệt đối

với miệng, bệnh nấm Candida thực quản và bệnh viêm màng não do

Cryptococcus spp

• Fluorocytosine

Là chất kìm nấm, có thể thấm sâu vào tất cả các dịch lỏng trong cơ thể Tác dụng: 5 - FC ngăn cản sinh tổng hợp acid nucleic, xâm nhập vào tế bào qua phần nội bào, lấy từ trong tế bào khối chất DNA tổng hợp để tạo thành RNA làm ngăn cản việc tổng hợp protein

Cách dùng: thường dùng kèm với Amphotericin B đường tĩnh mạch để

tăng tác dụng trong việc điều trị viêm màng não do Cryptococcus spp

• Ketoconazole (Nizoral)

Là thuốc diệt nấm phổ rộng thuộc nhóm azol

Tác dụng: ức chế quá trình sinh tổng hợp ergosterol, là thành phần cấu tạo chính màng tế bào nấm Thiếu ergosterol, màng tế bào sẽ bị suy yếu, giảm độ hoạt hóa của enzyme liên quan tới màng tế bào và sự tổng hợp chất kitin (chất cần thiết để sinh tổng hợp thành tế bào nấm)

Cách dùng: dùng tại chỗ hay đường uống, có tác dụng trong bệnh nấm bề mặt, nấm da, bệnh nấm nội tạng

• Clotrimazole

Là thuốc thuộc nhóm azol, ức chế quá trình sinh tổng hợp ergosterol

Tác dụng: kìm nấm ở nồng độ 10 µg/ml và diệt nấm ở nồng độ cao hơn

Có hiệu quả với lớp nấm da (Dermatophytes), nấm men, nấm sợi, nấm gây bệnh thể lưỡng tính và loài Trichomonas spp ở nồng độ rất cao

Cách dùng: Tại chỗ dưới dạng dung dịch 1% hoặc kem bôi

 Phác đồ điều trị

Hiện nay các hoạt chất kháng nấm được sử dụng chủ yếu (đơn thuần hay

phối hợp) trong điều trị VMN do Cryptococcus neoformans là amphotericin B,

flucytosine, fluconazole, trong đó flucytosine thấm qua hàng rào máu não cao nhất đạt 60 - 80% nồng độ thuốc huyết thanh, fluconazole chiếm vị trị kế tiếp sau cùng là amphotericin B với 2 - 3% nồng độ trong huyết thanh Mặc dù vậy, gần nửa thế kỷ qua amphotericin B vẫn là thuốc kháng nấm chủ lực Những nghiên cứu trước kỉ nguyên AIDS đã công bố tỷ lệ thành công của amphotericin là 60 - 80% Theo Bennett, với liều lượng 0,4 mg/kg/ngày × 10 ngày amphotericin B đã

khống chế được 68% tình trạng nhiễm Cryptococcus neoformans ở hệ thần kinh

trung ương bao gồm cả bệnh nhân có vấn đề chức năng miễn dịch [26] Trên bệnh nhân AIDS, mức độ thành công thấp hơn theo đánh giá của Saag và cộng

sự, chỉ 40% với liều lượng 0,5 mg/kg/ngày [73]

Sự ra đời của flucytosine tưởng rằng sẽ thay thế được amphotericin B

trong điều trị VMN do nồng độ vi nấm Cryptococcus neoforman trong DNT cao nhưng khả năng tạo ra những dòng Cryptococcus neoformans kháng thuốc đẩy

lùi hiệu quả của hoạt chất 5 - fluorocytosine Thật vậy, tỷ lệ tái phát sau khi áp dụng phác đồ flucytosine đơn thuần rất cao, khoảng 30 - 40%

Như thế, không có nghĩa là flucytosine bị đi vào quên lãng Nhiều nghiên cứu tiếp theo khôi phục vai trò của 5 - fluorocytosine qua sự kết hợp với amphotericin B Sự kết hợp giữa 2 hợp hoạt chất kháng nấm đã hạn chế khả năng kháng flucytosine đồng thời giảm hiệu quả, rút ngắn thời gian điều trị của

amphotericin B đến mức tối thiểu nhờ đó giảm được phần nào tác dụng độc đối với thận David theo dõi 202 bệnh nhân AIDS được điều trị bằng flucytosine 100 mg/kg/ngày phối hợp với amphotericin B đã ghi nhận tỷ lệ thành công, khi so sánh giữa các nhóm điều trị 6 tuần bằng amphotericin B 0,3 mg/kg/ngày + flucytosine 150 mg/kg/ngày và nhóm điều trị 10 tuần bằng amphotericin B đơn thuần 0,4 mg/kg/ngày [41], theo Bennette nhận thấy số trường hợp được chữa khỏi cao hơn, tỷ lệ tái phát hoặc thất bại thấp hơn dù chưa có ý nghĩa thống kê và 100% mẫu DNT ở nhóm phối hợp trở nên vô trùng vào ngày thứ 14 Khi phối hợp amphotericin B 0,3 mg/kg/ngày + flucytosine 150 mg/kg/ngày trong 6 tuần được so sánh với phác đồ tương tự nhưng chỉ kéo dài 4 tuần

Đối với fluconazole, do tác dụng kiềm nấm và nồng độ thấm vào DNT không cao nên việc chữa khỏi thực sự VMN do vi nấm trên bệnh nhân AIDS không phải mục đích của fluconazole liều đơn thuần 400 mg/kg/ngày không hiệu quả bằng amphotericin B (0,5 mg/kg/ ngày như ghi nhận của Saag và cộng sự thành công về lâm sàng và vi nấm học so với 40%; 18% tử vong so với 14 % tử vong xảy ra sớm hơn ở nhóm fluconazole; thời gian trung bình để canh cấy DNT

âm tính là 42 ngày đối với fluconazole Vì vậy, hiện nay phác đồ có amphotericin

B thường được sử dụng trong điều trị tấn công VMN nấm Cryptococcus

neoformans hơn là fluonazole hoạt chất thường dùng để điều trị duy trì ở giai đoạn tiếp theo hoặc đang điều trị dự phòng trên bệnh nhân AIDS có CD4+

< 200

mm3

Về đường sử dụng amphotericin B, việc tiêm trực tiếp qua màng cứng sẽ làm tăng nồng độ thuốc vào vị trí nhiễm trùng ở hệ thần kinh trung ương trong những trường hợp nặng, có thể là lựa chọn cuối cùng khi các biện pháp điều trị khác thất bại về mặt lâm sàng và vi nấm học Năm 1986, Bogaert và cộng sự thực hiện phác đồ amphotericin B phối hợp giữa tiêm tĩnh mạch và tiêm dưới màng nhện (tổng liều tiêm vào màng cứng là 20 mg) đã ghi nhận 5 - 6 bệnh nhân được chữa khỏi [30] Bất lợi trong đường tiêm này là nguy cơ xảy ra các biến chứng như viêm màng nhện do phản ứng thuốc hoặc bội nhiễm vi khuẩn Vì vậy, mặc dù tỷ lệ thành công cao, nhưng việc đưa thuốc qua màng cứng cần được cân nhắc với phác đồ phối hợp giữa amphotericin B và flutocytosine hoặc fluconazole, nếu hai hóa chất này sẵn có

Từ các cơ sở nêu trên Bộ Y tế Việt Nam đã chọn phác đồ phối hợp amphotericin B 0,7 mg/kg/ngày với flucytosine 100 mg/kg/ngày trong 2 tuần là phác đồ ưu tiên trong giai đoạn tấn công đối với các trường hợp nặng Nhưng thực tế do flucytosine không có sẵn nên bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới sử dụng phác

đồ thay thế chỉ là amphotericin B 0,7 mg/kg/ngày

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 V ật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả các bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não nhập viện BV Bệnh Nhiệt Đới TP.HCM được chỉ định cấy máu hoặc soi dịch não tủy trong khoảng thời gian từ tháng 12/2010 đến hết tháng 7/2011

 Thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB)

Loại thuốc nhuộm này làm chất nền khi ta quan sát tế bào vi nấm

Dung dịch này giúp ta thấy vi nấm rõ hơn, giết vi nấm và giữ mẫu kính được khá lâu (có mẫu kính giữ được hàng năm)

2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy

 MT1: Môi trường Sabouraud Dextrose Agar

 MT2: Môi trường thạch tim óc hầm (BHI)

Môi trường này dùng để cấy thể hạt men của vi nấm sinh bệnh ở nhiệt độ

2.1.3.2 Môi trường định danh

 MT3: Thạch Bird Seed (Staib 1987)

Thạch Bird Seed dùng để xác định nấm Cryptococcus neoformans gồm

 MT4: Thạch – Canavanine – Glycine – Bromthymol blue (CGB)

CGB được sử dụng cho việc nhận biết hai thứ Cryptococcus neoformans

var neoformans và Cryptococcus neoformans var gattii gồm các thành phần sau:

Sau khi trộn hỗn trên vào 100 ml nước cất điều chỉnh pH đến 5,6

Lọc dung dịch qua giấy lọc vô trùng giữ trong tủ lạnh 400C đến khi sử dụng

Dung dịch B

Bromothymol blue 0,4 g

Hòa tan Bromothymol blue vào NaOH, sau đó cho nước cất vào

Chuẩn bị môi trường (1lít)

Giữ ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong 6 tuần

Cho vào dung dịch A 20 ml dung dịch B được dung dịch C (1000 ml)

Sau đó, điều chỉnh dung dịch C đến pH = 5,7 bằng dung dịch HCl 4 mol/l rồi

đem hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

1 Lam kính, phiến kính mỏng

2 Kính hiển vi, kính lúp

3 Ống nghiệm cấy nấm, đĩa petri

4 Giấy lọc vô khuẩn

5 Máy hút chân không

6 Bình tam giác, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống đong

7 pH kế

8 Chai cấy máu (chứa máu bệnh nhân, cho vào máy Bactec để xác định sự có mặt của vi sinh)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Đây là nghiên cứu cắt ngang mô tả hàng loạt ca trong khoảng thời gian từ tháng 12/2010 đến 07/2011 tại Khoa Nhiễm E, Phòng xét nghiệm vi nấm BV

Bệnh Nhiệt Đới TP HCM

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Tính cỡ mẫu theo công thức sau:

 Liệt kê và định nghĩa các biến số

- Biến số phụ thuộc: loại thứ (variety), kiểu huyết thanh (serotype)

 Phương pháp thu thập số liệu

- Thu thập thông tin về.bệnh nhân dựa trên kết quả xét nghiệm trong hồ sơ bệnh án

• Chẩn đoán nhiễm Cryptococcus neoformans: phối hợp đồng thời 4

kỹ thuật:

+ Quan sát trực tiếp 25 µl DNT sau khi nhuộm mực Tàu tìm tế bào hạt men có bao nang không bắt màu mực Tàu

+ Cấy bệnh phẩm: phân lập vi nấm trên canh cấy SDA và định

danh dựa trên môi trường Staib Ajello

+ Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên vỏ của Cryptococcus

neoformans bằng phản ứng ngưng kết hạt latex

+ Phản ứng dương tính với urê

• Chẩn đoán thứ: Sử dụng môi trường Canavanine Glycine - Brommothymol blue (CGB)

• Chẩn đoán huyết thanh: Sử dụng môi trường thạch Creatinine dextrose Bromothymol blue thymin (CDBT)

 Công cụ thu thập số liệu

- Thông tin bệnh nhân

- Dụng cụ, môi trường xét nghiệm chẩn đoán Cryptococcus neoformans

2.2.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu

 Nguyên tắc

Vỏ polysaccharide của Cryptococcus neoformans được cấu tạo bởi thành

phần chính là glycronoxymannan (gmx) Cấu trúc kháng gmx được gắn vào trong

hạt latex Kết quả của sự ngưng kết giữa cấu trúc gmx và thành phần kháng gmx

sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường Phản ứng có ý nghĩa khi ta sử dụng ít nhất

50 ng/ml huyết thanh hoặc DNT

a/ Mẫu huyết thanh

+ Hút 120 µl bệnh phẩm vào một tube chứa nắp đậy chặt và thêm vào 20 µl enzyme pronase

+ Lắc trộn mạnh và làm nóng tới 560C trong 30 phút trong bể hấp cách thủy

+ Lấy ống ra và thêm vào 1 giọt dung dịch dừng phản ứng.Trộn đều hoàn toàn

b/ Mẫu dịch não tủy

+ Nếu dịch não tủy quá đục hay chứa nhiều hồng cầu, ly tâm trong 5 phút (2000 vòng/phút) và thu lượm dịch nổi

+ Xử lý giống như mẫu huyết thanh

+ Dừng phản ứng hoạt động của enzyme pronase bằng cách đun nóng tới

1000C trong bể cách thủy trong 5 phút Trộn đều hoàn toàn

+ Để nguội 3 - 4 phút trước khi bắt đầu ngừng ngưng kết

Chú ý: khi sử dụng bể hấp thủy không cho nước vào trong tube để tránh kết quả sai lệch

 Thực hiện phản ứng ngưng kết:

Cho 40 µl bệnh phẩm đã xử lý lên vòng tròn của phiến làm ngưng kết

Cạnh đó thêm vào một giọt Cryptococcus latex

Sử dụng thanh que trộn đều

Thực hiện phép đối chứng âm bằng cách trộn lẫn 40 µl đệm pha với 1 giọt latex

Đặt phiến lên máy lắc trong 5 phút ở nhiệt độ phòng 18 - 300C

Latex Cryptococcus : nhỏ 1 giọt trong chai Cryptococcus latex (1 ml) lên

phiến kèm theo sản phẩm Lấy một ít bệnh phẩm hay khuẩn lạc nuôi cấy từ bệnh

phẩm cho vào trong giọt dung dịch vừa nhỏ Cầm phiến lên và lắc đều trong 5 phút

 Yêu cầu kết quả

Nếu có sự ngưng kết: dung dịch ban đầu từ màu đỏ tươi chuyển sang đỏ

thẫm cùng các hạt lớn mà mắt thường có thể nhìn thấy thì đây chính bệnh phẩm

Máu lấy từ bệnh nhân được tiêm trực tiếp vào chai cấy Trẻ em sử dụng chai có dung tích 1 - 3 ml, người lớn 8 - 10 ml

Đánh số thứ tự của chai

Đưa vào trong máy

Theo dõi sự hiển thị thông báo của máy khi phát hiện ra trong máu có sự hiện diện của vi sinh vật (mẫu dương tính)

 Yêu cầu kết quả

Phát hiện được các chai cấy máu dương tính

 Soi tươi bệnh phẩm bằng mực Tàu

Sử dụng cho bệnh phẩm: dịch não tủy

Nhỏ 1 giọt mực tàu lên lam kính

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc nấm

Đặt mẫu nấm lên thuốc nhuộm

Dùng que cấy trộn đều

Đậy lamen lên và quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại 40x

Đem soi ở vật kính x40 và rút ra kết luận

 Yêu cầu kết quả

Nếu bệnh nhân bị nhiễm Cryptococcus neoformans, ta sẽ thấy các tế bào

hạt men có vùng sáng bao xung quanh Vùng sáng này là bao nang, phân biệt rõ

trên nền tối sẫm của lam kính do thấm mực Tàu

 Phản ứng urê dương tính

Cryptococcus neoformans cho phản ứng dương tính với urê, làm môi

trường urê chuyển sang màu hồng sau ít giờ dùng để phân biệt Cryptococcus

neoformans với tế bào nấm men khác

Lấy khuẩn lạc của vi nấm Cryptococcus neoformans trên MT1 sau khi đã

quan sát trên kính hiển vi cho vào môi trường thạch nghiêng urê

 Yêu cầu kết quả

Nếu sau vài giờ màu thạch nghiêng nào chuyển sang màu hồng ta kết luận

là Cryptococcus neoformans

 Kỹ thuật cấy phân lập vi nấm Cryptococcus neoformans trên MT1

Với các mẫu đem soi ta chỉ có thể kết luận rằng mẫu có chứa nấm hay không Để định danh chính xác tên vi nấm ta phải cấy lên MT1 để phân lập trước Khi có khuẩn lạc mọc trên môi trường ta mới sử dụng các kỹ thuật định

Các khuẩn lạc hình thành riêng rẽ nhau

 Kỹ thuật soi khuẩn lạc nấm sau khi cấy bằng lacto phenol cotton blue (LPCB)

 Nguyên tắc: thuốc nhuộm giết các vi nấm, giúp quan sát vi nấm tốt

hơn

 Cách tiến hành

Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm LPCB lên lam kính

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc nấm, nếu là khuẩn lạc của nấm men thì chỉ cần chạm nhẹ đầu que cấy xuống khuẩn lạc vào trong thạch

Đặt mẫu nấm lên thuốc nhuộm

Dùng que cấy trộn đều

Đậy lamen lên và quan sát trên kính hiển vi và rút ra kết luận

 Yêu cầu kết quả

Khuẩn lạc là nấm men, quan sát tìm các tế bào nấm men và cách nảy chồi của chúng cùng với đo kích thước của tế bào

 Kỹ thuật định danh các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans

Với các mẫu đem soi ta chỉ có thể kết luận rằng mẫu có chứa nấm hay không Để định danh chính xác ta phải cấy lên môi trường Sabouraud trước Khi

có khuẩn lạc mọc trên môi trường ta mới sử dụng các phương pháp định danh như sau:

Hình 2.2 Sơ đồ định danh vi nấm Cryptococcus neoformans

 Kỹ thuật định danh các chủng Cryptococcus neoformans trên

môi trường MT4

• Nguyên tắc

Sau khi soi và nuôi cấy trên MT1 xác định là Cryptococcus neoformans Để

định danh chính xác tên chủng vi nấm Cryptococcus neoformans, ta phải tiến

hành thực hiện trên MT4 Dựa vào khả năng khả năng kháng canavanine và sử dụng glycine như nguồn carbon trong môi trường canavanine glycine bromothymol blue (CGB) để phân biệt Cryptococcus neoformans var

neoformans.và Cryptococcus neoformans var gattii Cryptococcus neoformans var gattii tiêu thụ carbon sinh ra ammoniac là tăng pH môi trường, chất chỉ thị bromothymol blue Do đó, sẽ chuyển qua màu kiềm dẫn đến sử biến đổi màu

Loại

Âm tính

vàng của thạch thành màu xanh dương Trong khi đó Cryptococcus neoformans

var neoformans nhạy cảm với canavanine, đồng thời không sử dụng glycine nên không phát triển trên CGB và không là thay đổi màu canh cấy

Ghi tên bệnh nhân, mẫu bệnh phẩm, ngày cấy lên phía ngoài của đĩa thạch Dùng que cấy lấy một ít vi nấm Cryptococcus neoformans đã được ủ sau 2 - 3

ngày trên MT1 dàn đều trên mặt MT4

Đậy hộp petri lại, ủ trong nhiệt độ 250C

Sau 24 - 48 giờ quan sát sự hình thành màu sắc của khuẩn lạc Cryptococcus

neoformans

• Yêu cầu kết quả

+ Cryptococcus neoformans var neoformans: không làm đổi màu MT4

+ Cryptococcus neoformans var gattii: làm MT4 chuyển sang màu xanh dương

 Kỹ thuật định danh các kiểu huyết thanh Cryptococcus

neoformans trên môi trường MT5

• Nguyên tắc

Đối với chủng Cryptococcus neoformans var neoformans để định danh

chính xác tên các kiểu huyết thanh, ta phải tiến hành thực hiện trên MT5

• Cách tiến hành

Sau khi đã định danh được chủng Cryptococcus neoformans var

neoformans Ghi tên bệnh nhân, mẫu bệnh phẩm, ngày cấy lên phía ngoài của đĩa

thạch

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc Cryptococcus neoformans var

neoformans đã được ủ sau 2 ngày từ MT1 dàn đều trên mặt MT5

Sau 5 ngày cấy trên môi trường CDBT, ủ ở 28o

C và xem kết quả

• Yêu cầu kết quả

Serotype D phát triển thành khúm màu đỏ sáng và làm đổi màu từ vàng thành cam sáng Trong khi đó, khúm serotype A có màu tái và môi trường vẫn giữ nguyên màu nguyên thủy

 Kháng nấm đồ

 Lí do thực hiện kháng nấm đồ

Khảo sát độ nhạy cảm của vi nấm Cryptococcus neoformans với các thuốc

kháng nấm đang sử dụng để làm cơ sở lựa chọn thuốc điều trị hiệu quả nhất

 Cách thử độ nhạy cảm của thuốc kháng nấm

• Nguyên tắc:

Dựa vào tác động của thuốc với vi nấm Nếu thuốc đó nhạy cảm với

Cryptococcus neoformans thì sẽ hình thành vòng vô khuẩn Vòng càng rộng ảnh hưởng của thuốc đối vi nấm càng mạnh Nếu không có vòng hay vòng yếu thì thuốc không có tác dụng (hay tác dụng không đáng kể)

• Phương pháp :

Dùng que cấy lấy một ít vi nấm đã mọc trên môi trường Sabouraud (MT1) khoảng 48 giờ

Pha loãng với nước cất vô trùng đạt được nồng độ 0,5 McF

Dùng pipet nhỏ dịch nấm vào MT1, dàn đều dịch nấm men bề mặt MT1 Dùng kẹp đặt các đĩa thuốc kháng nấm vào

Ủ trong 24 giờ

Đo đường kính của vòng vô khuẩn và rút ra kết luận

• Yêu cầu kết quả:

Nếu vi nấm kháng thuốc sẽ không hình thành vòng vô khuẩn Nếu vi nấm nhạy cảm với thuốc sẽ hình thành vòng vô khuẩn Vòng càng rộng, khả năng nhạy cảm của vi nấm với thuốc càng cao

 Kỹ thuật bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans

 Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng

dung dịch BHI - glyxerol (ở nhiệt độ - 20 0

C)

• Nguyên tắc

Ở nhiệt độ - 200C, các vi nấm Cryptococcus neoformans sẽ bị ức chế các

hoạt động sống Vì thế thời gian lưu giữ mẫu sẽ được lâu hơn

• Cách tiến hành

Dùng que cấy phết nhẹ vào khuẩn lạc nấm

Hòa vào lọ chứa dung dịch BHI - glyxerol

Dùng parafin quấn quanh miệng nắp chai cho kín

Ghi chú tên bệnh nhân, bệnh phẩm, ngày giữ mẫu, tên vi nấm

Lưu mẫu vào tủ lạnh ở - 200 C

• Yêu cầu kết quả

Đảm bảo mẫu bảo quản phải vô trùng, không bị tạp nhiễm

 Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng

nước cất (ở nhiệt độ thường)

• Nguyên tắc

Vi nấm có thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt

• Cách tiến hành

Dùng que cấy phết nhẹ vào khuẩn lạc nấm

Hòa vào lọ chứa nước cất vô trùng

Dùng parafin quấn quanh miệng nắp chai cho kín

Ghi chú tên bệnh nhân, bệnh phẩm, ngày giữ mẫu, tên vi nấm

Lưu mẫu tại phòng thí nghiệm

• Yêu cầu kết quả

Đảm bảo mẫu bảo quản phải vô trùng, không bị tạp nhiễm

Hình 2.3 Bảo quản các chủng vi nấm

Cryptococcus neoformans bằng dung

dịch BHI

Hình 2.4 Bảo quản các chủng vi nấm Cryptococcus neoformans bằng nước cất

Chương III - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

hạt Latex để phát hiện kháng nguyên

của vi nấm Cryptococcus neoformans

Hình 3.2 Phản ứng dương tính với urê của

Cryptococcus neoformans với vỏ bao dày

khi soi mực Tàu

Bảng 3.1 Tỷ lệ cấy nấm dương tính trên bệnh phẩm DNT

Số mẫu cấy Dương tính Âm tính

450 74 (16,4%) 403 (83,6%)

Theo nghiên cứu này, tổng mẫu khảo sát là 1755 trong đó có 450 mẫu cấy

từ bệnh phẩm DNT và 1305 mẫu cấy từ bệnh phẩm máu Trong 450 mẫu cấy từ

bệnh phẩm DNT thì có 74/450 ca (chiếm 16,4%) nhiễm Cryptococcus

neoformans Tỷ lệ dương tính với Cryptococcus neoformans trong nghiên cứu

này thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây của một số tác giả trong và ngoài nước Theo Diamond và cộng sự năm 1974, có khoảng 50% bệnh nhân nhiễm

Cryptococcus neoformans được phân lập từ bệnh phẩm DNT trên cơ địa bệnh nhân HIV/AIDS [45]

Theo M Nadarajah năm 1976, tại Singapore, khi khảo sát các ca nhiễm HIV/AIDS xét nghiệm dương tính với Cryptococcus neoformans thống kê như

sau: từ năm 1959 - 1970 có 30 ca; 1968: 5 ca; 1970: 5 ca nhiễm Cryptococcus

neoformans [69]

Theo thống kê của Currie và cộng sự năm 1994, Cryptococcus

neoformans chiếm khoảng 5 - 10% trên tổng số bệnh nhân HIV/AIDS.[38]

Theo thống kê của Weinke và cộng sự năm 1988, khi phân lập từ các bệnh phẩm DNT ở các bệnh nhân HIV/AIDS viêm màng não, tỷ lệ này lần lượt như sau: ở Anh 3,2%; Pháp 5,8%; Đức 5,4%; Hà Lan 6,1% [98]; theo Clumeck và

cộng sự năm 1984, tỷ lệ dương tính với Cryptococcus neoformans ở Châu Phi là

30% [37]

Theo Meneze và cộng sự năm 2002, ở Brazil trong 54 mẫu DNT được phân tích trên bệnh nhân HIV thì có 9,25% dương tính với Cryptococcus

neoformans [72]

Tại Việt Nam, tình hình bệnh nấm Cryptococcus neoformans như sau:

theo Hồ Tấn Phước năm 1976, tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 1 ca nhiễm

Cryptococcus neoformans đầu tiên được báo cáo với biểu hiện viêm màng não vào năm 1928 [7]; theo thống kê của các bác sĩ Khoa Giải Phẫu Bệnh, BV Chợ

Rẫy từ tháng 4/1999 đến tháng 10/2001 tỷ lệ nhiễm nấm Cryptococcus spp là 5%

(2/40 ca) [5]

Theo Nguyễn Trần Chính, Nguyễn Hữu Chí và cộng sự năm 2004: tại BV

Bệnh Nhiệt Đới vào năm 2003, viêm màng não nấm do Cryptococcus

neoformans chiếm 12,2% [7] Theo Lê Hà Vân Anh tổng kết được 18 trường hợp

nhiễm Cryptococcus neoformans [2]