so sánh hiệu quả đực hóa cá bảy màu (poecilia reticulata peters, 1860) bằng methyltestosterone và spironolactone

Đã có những nghiên cứu thực nghiệm chứng minh rằng Methyltestosteron và Spironolactone đều có khả năng gây đực hóa ở cá Bảy màu, trong đó Spironolactone là một hoạt chất trên thị trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Võ Ngô Th ị Lưu Ngọc Giàu

MÀU (Poecilia reticulata Peters, 1860)

VÀ SPIRONOLACTONE

Thành ph ố Hồ Chí Minh - 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Võ Ngô Th ị Lưu Ngọc Giàu

MÀU (Poecilia reticulata Peters, 1860)

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Thành ph ố Hồ Chí Minh - 2013

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các

được và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào!

TÁC GI Ả LUẬN VĂN

Võ Ngô Th ị Lưu Ngọc Giàu

L ỜI CẢM ƠN

và động viên của rất nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Tường Anh đã tận tình

hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức chuyên môn và giúp tôi hoàn thành luận văn

này

Trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh, Sở giáo dục và đào tạo Tây Ninh, Ban

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã

TÁC GI Ả LUẬN VĂN

Võ Ngô Th ị Lưu Ngọc Giàu

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MT : Methyltestosterone

SP : Spironolactone

TN1 : Thí nghiệm cho cá mẹ mang thai ăn khẩu phần có trộn MT, SP

TN2 : Thí nghiệm ngâm cá bột trong nước có pha MT, SP

MTH1 : nghiệm thức trộn MT Hà Lan với liều 325 mg/kg thức ăn

MTH2 : nghiệm thức trộn MT Hà Lan với liều 350 mg/kg thức ăn

MTT1 : nghiệm thức trộn MT Trung Quốc với liều 325 mg/kg thức ăn

MTT2 : nghiệm thức trộn MT Trung Quốc với liều 350 mg/kg thức ăn

SP1 : nghiệm thức trộn SP với liều 500 mg/kg thức ăn

SP2 : nghiệm thức trộn SP với liều 700 mg/kg thức ăn

ĐCE : nghiệm thức đối chứng thức ăn có trộn ethanol

MTHn1 : nghiệm thức pha MT Hà Lan với liều 4 mg/lít nước xử lý

MTHn2 : nghiệm thức pha MT Hà Lan với liều 5 mg/lít nước xử lý

MTTn1 : nghiệm thức pha MT Trung Quốc với liều 4 mg/lít nước xử lý

MTTn2 : nghiệm thức pha MT Trung Quốc với liều 5 mg/lít nước xử lý

SPn1 : nghiệm thức pha SP với liều 8 mg/lít nước xử lý

SPn2 : nghiệm thức pha SP với liều 10 mg/lít nước xử lý

ĐCEn : nghiệm thức pha đối chứng ngâm trong nước có pha ethanol

ĐC1 : nghiệm thức pha đối chứng bình thường (không steroid, không ethanol) ĐC2 : nghiệm thức đối chứng thực tế

EU : Tổ chức liên minh châu Âu

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Nuôi cá cảnh là một hình thức thư giãn tốt, có thể giúp con người thoải mái về

mặt tinh thần, tránh nguy cơ bị “stress” trong cuộc sống bận rộn hiện nay Cá cảnh không chỉ được nuôi ở những vị trí vốn có của nó là những nơi sang trọng như: nhà hàng, khách sạn hay những căn hộ cao cấp… mà nó ngày càng len lỏi vào những ngóc ngách của cuộc sống đời thường Cá cảnh hiện diện khắp nơi, từ những bể cá

to nằm trong phòng khách, một hòn non bộ nằm ở góc sân đến những chậu cá xinh

xắn trang trí trên bàn học Những hoạt động văn hóa cũng từ đó dần dần phát triển theo Những cuộc triển lãm cá cảnh, những hội thi cá cảnh, cá chọi ngày càng được quan tâm và phát triển với quy mô ngày càng lớn hơn

Nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới và thuộc khu vực Đông Nam Á, Việt Nam là một trong ba khu vực có nguồn cá cảnh nổi tiếng của thế giới (Nam Mỹ, Phi Châu

và Đông Nam Á) Khí hậu nhiệt đới ở Việt Nam rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loài cá cảnh nội địa lẫn nhập nội, cả nước mặn và ngọt Những năm gần đây, một số loài cá tự nhiên trong các thủy vực nước ngọt thuộc các nước Đông Nam Á cũng được khai thác dùng làm cá cảnh, đặc biệt là Việt Nam đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà kinh doanh cá cảnh ở các nước vì ở đây có nhiều loài cá nhiệt đới lạ, đẹp và quý hiếm

Với sự đa dạng và phong phú của nhiều chủng loại cá như hiện nay, mỗi người

có thể lựa chọn được loại cá cảnh yêu thích và phù hợp với điều kiện của mình Trong số đó, cá Bảy màu Poecilia reticulata là một loài cá cảnh phổ biến và được

nhiều người ưa thích Cá tuy nhỏ nhưng lại có màu sắc thân và đuôi rất đẹp, đa dạng

và phong phú, nhất là cá đực Một đặc điểm nữa của cá Bảy màu là rất dễ nuôi, sinh

sản nhiều, giá thành thấp hơn nhiều so với các loài cá khác nên được người dân ưa

chuộng nhiều

Nhìn chung, cá là một đối tượng được sử dụng phổ biến khi nghiên cứu về di truyền học Nhờ những thành tựu về sinh học giới tính của ngành di truyền học hiện đại, các nhà chọn giống đang và sẽ có thêm những phương pháp di truyền hữu hiệu

Để nuôi một loài cá vừa đáp ứng nhu cầu thẩm mĩ của người nuôi cá cảnh vừa ứng

dụng rộng rãi khi nghiên cứu di truyền học thì cá Bảy màu Poecilia reticulata là

thích hợp nhất Bởi xuất phát từ thị hiếu của người dân về cá Bảy màu, nhất là cá

thể đực, thì việc điều khiển những cá thể cái thành những cá thể đực có màu sắc sặc

sỡ cung cấp cho nhu cầu thẩm mĩ của con người, đồng thời cũng nhằm nâng cao được hiệu quả kinh tế của người nuôi và sản xuất cá cảnh là điều tất yếu, được quan tâm nhiều

Đã có những nghiên cứu thực nghiệm chứng minh rằng Methyltestosteron và Spironolactone đều có khả năng gây đực hóa ở cá Bảy màu, trong đó Spironolactone là một hoạt chất trên thị trường dược phẩm có giá thấp và phổ biến,

nếu như Spironolactone có hiệu quả cao trong việc gây đực hóa ở cá Bảy màu thì điều đó có thể mở ra một triển vọng mới cho các nhà điều khiển giới tính cá, sẽ

giảm được khoản chi phí lớn cho quá trình nghiên cứu, và thậm chí người chơi cá

cảnh cũng có thể điều khiển giới tính cá theo ý thích của mình tại nhà Để xác định được hàm lượng tối ưu của một vài chất phổ biến có hiệu quả đực hóa cá Bảy màu

tốt nhất, nên đề tài “So sánh hiệu quả đực hóa cá Bảy màu Poecilia reticulata Peters, 1860 bằng Methyltestosterone và Spironolactone” được chọn tiến hành thực

hiện

2 M ục tiêu nghiên cứu

So sánh hiệu quả của Methyltestosterone và Spironolactone được dùng để gây

đực hóa ở cá Bảy màu Poecilia reticulata

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Cá Bảy màu Poecilia reticulata ở các trại cá giống, cá cảnh trong địa bàn tỉnh

Tây Ninh

4 Nhi ệm vụ nghiên cứu

Xác định hàm lượng tối ưu của Methyltestosterone và Spironolactone trong

khẩu phần cho cá mẹ đang mang thai ăn 5 – 14 ngày trước khi đẻ

Xác định hàm lượng tối ưu của Methyltestosterone và Spironolactone pha trong nước khi ngâm cá bột trong túi PE có bổ sung OR 2 R trong 2 giờ

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

- Ý nghĩa khoa học: luận văn cho thấy rõ hơn về hiện tượng đực hóa nghịch lý; khi sử dụng Spironolactone là một chất cái hóa (ở người) nhưng có khả năng gây đực hóa ở cá thuộc họ Ăn muỗi

- Ý nghĩa thực tiễn: qua nghiên cứu đề tài này, có thể sử dụng Spironolactone

để thử nghiệm đực hóa ở những loài cá cảnh khác hay những loài cá thịt có giá trị kinh tế cao vì Spironolactone là một loại thuốc uống cho người, dễ được người tiêu dùng chấp nhận

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Các đặc điểm sinh học của cá Bảy màu

1.1.1 Ngu ồn gốc

Cá Bảy màu có tên khoa học là Poecilia reticulata (Peters, 1860) (Syn

màu và chữ “reticul” của tiếng Latinh nghĩa là mạng lưới Ngoài ra, nó còn có tên

tiếng Anh là “Guppy” (có lẽ do Robert John Lechmere Guppy là người đầu tiên tìm

thấy cá Bảy màu trên sông Trinidad vào năm 1866), “million fish” hay “rainbow fish” (có thể do cá mang lại lợi nhuận bạc triệu hoặc cá đực dạng thuần dưỡng để làm cảnh có rất nhiều màu sắc và sắc thái khác nhau) [2]

Cá Bảy màu đã được xác định và sắp xếp vị trí phân loại như sau[34]:

Ngành động vật Có dây sống : Chordata Phân ngành động vật Có xương sống : Vertebrata

Lớp Cá vây tia : Actinopterygii

Bộ cá Bạc đầu : Cyprinodontiformes

Họ cá Ăn muỗi : Poeciliidae

Phân họ cá Ăn muỗi : Poeciliinae

Giống cá Bảy màu : Poecilia

(Bloch & Schneider, 1801) Loài cá Bảy màu : Poecilia reticulata

(Peters, 1860) Guppy hoang dại sống tự nhiên ở các vùng nước ngọt và lợ ở Trung và Nam

Mỹ như Leser Antilles, Trinidad, Tabago, Venezuela và điểm cực Nam của sự phân

bố là Santos, vùng duyên hải đông Nam Brasil (Haskins et al, 1961; Fernando và

Phang, 1989) Guppy là loài đẻ con, ăn tạp, phàm ăn và có khả năng sống ở các vùng nước bẩn Năm 1940, cá được đưa vào châu Á để trừ muỗi Cũng từ đó, do

con đực có sự đa hình, màu sắc sặc sỡ trên thân, vây lưng và đuôi, cá Bảy màu được người nuôi cá cảnh chú ý và từ những năm 50, nghề nuôi cá Bảy màu thương phẩm

bắt đầu Bảy màu là loài cá cảnh được phổ biến khắp nơi Singapore, nước có nền công nghiệp nuôi và xuất khẩu cá cảnh nổi tiếng nhất thế giới trong những năm gần đây cũng sản xuất rất nhiều cá Bảy màu (Phang và Fernando, 1990) [2]

Cá cái to và trông đẫy đà hơn cá đực, nhất là khi mang thai thì bụng rất to, dễ nhận

biết Cá cái trưởng thành có chiều dài khoảng 4–6 cm, không có màu sắc thân nổi

bật, chỉ có đuôi thường có màu (đỏ, xanh, vàng…), đôi khi không màu Cá đực trưởng thành nhỏ hơn cá cái, dài khoảng 3–3,5 cm Màu sắc thân, hình dạng và màu

sắc vây rất đa dạng, phong phú, vây hậu môn biến thành chân sinh dục, là cơ quan

dẫn tinh khi giao phối Trong bể nuôi, cá đực thường linh hoạt hơn cá cái

Với những ưu thế nổi bật về hình thái của mình mà cá Bảy đực thường là sự

lựa chọn đặc biệt của người nuôi và chơi cá cảnh Nhu cầu về cá Bảy màu, nhất là

cá đực trên thị trường là rất lớn và việc xuất khẩu cá Bảy màu rất có tiềm năng phát triển [3]

phải tạo chỗ ẩn núp cho cá con hoặc phải theo dõi liên tục để vớt cá con ra khỏi bể [3],[19]

1.2 Điều khiển giới tính ở cá Bảy màu Poecilia reticulata

1.2.1 Nguyên lý ki ểm soát giới tính ở cá

Vấn đề kiểm soát giới tính ở động vật có xương sống nói chung chịu sự chi

phối của các nhiễm sắc thể giới tính và hormon sinh dục

Đối với động vật có xương sống, người ta cho rằng bộ nhiễm sắc thể quyết định loại hormon nào sẽ tiết ra, còn các hormon thì thực hiện sự cân bằng của biệt hóa giới tính Tuyến sinh dục của phôi thai trong những giai đoạn đầu phát triển có

cả hai loại tổ chức, lớp vỏ ngoài có bản chất buồng trứng, lớp tủy có bản chất tinh sào Trong thời gian đầu, cả hai giới tính phát triển song song, sau đó một loại tổ

chức trong tuyến sinh dục có uy lực vượt trội so với tổ chức tổ chức kia và sự biệt hóa giới tính bắt đầu Khi sự phát triển về giới tính đã được xác lập hoàn toàn thì các nhiễm sắc thể đình chỉ ảnh hưởng của mình và các hormon sinh dục tiếp tục công việc biệt hóa và duy trì giới tính theo hướng đực hoặc cái [1]

Giới tính ở đại đa số cá được quyết định bởi các nhiễm sắc thể Y Cũng

giống như ở người và đa số động vật có xương sống trừ chim, những cá thể mang nhiễm sắc thể XX phát triển thành cá cái và những cá thể mang nhiễm sắc thể XY phát triển thành đực

Ngày nay, người ta còn biết thêm rằng sự kiểm soát giới tính từ khi trứng được thụ tinh đến khi cơ thể có tuyến sinh dục (giới tính) rõ ràng có hai giai đoạn Giai đoạn đầu được gọi là sự định đoạt giới tính (sex determination) và giai đoạn sau là sự hình thành hoặc biệt hóa giới tính (sex differentiation)

Sự hình thành giới tính cá cơ bản giống như sự hình thành giới tính ở động vật

có vú (Hình 1.6)

Định đoạt giới tính Bi ệt hóa giới tính

TDF (SRY, Dmy/Drmt1) Testosterone

AMDF

Kích thích

Ức chế

Hình 1.3 Sơ đồ hình thành giới tính ở động vật có xương sống

(Nguy ễn Tường Anh, 1999)

Nhiễm sắc thể

Mầm tuyến

Tế bào Leydig

Ống Wolf

Túi tinh và hệ sinh dục đực

Tế bào Sertoli

Buồng trứng

và hệ sinh dục cái

Ống Muller

Trong một bài tổng quan gần đây, Phan Khắc Vĩnh và Nguyễn Tường Anh (2011) thông báo SRY/Sry là gen định đoạt giới tính đực chỉ có ở động vật có vú Ở các lớp động vật có xương sống khác, kể cả cá, gen Dmy/Dmrt1 (Doublesex and mab – 3 related transcription factor 1) tương đương SRY/Sry về chức phận[11]

1.2.1.1 S ự định đoạt giới tính

Trong giai đoạn đầu, giới tính định đoạt bởi sự có mặt hay không có mặt của nhiễm sắc thể Y trong nhân tế bào Chỉ cần có một nhiễm sắc thể Y thì cơ thể phát triển theo hướng đực, còn nếu không có nhiễm sắc thể Y thì cơ thể tự động phát triển theo hướng cái Người ta còn cho rằng trên nhiễm sắc thể Y có gen TDF (Testis Determining Factor) mà gần đây được xác định cũng chính là gen SRY (Sex Region on Y chromosome) hay Dmy/Dmrt1 quyết định vai trò “định đoạt” của nhiễm sắc thể Y và ở đây con người không thể can thiệp gì Gen trên nhiễm sắc thể làm cho mầm tuyến sinh dục có hai loại tế bào đặc biệt quan trọng là tế bào Leydig

tiết ra hormon sinh dục đực là testosterone và tế bào Sertoli tiết ra ADMF (Anti – Mullerian Duct Factor, hoặc MIH – Mullerian duct inhibiting hormon, Yếu tố kháng ống Muller) [14]

Tế bào Leydig tiết ra testosterone làm cho mầm tuyến sinh dục phát triển theo hướng đực Tế bào Sertoli sẽ tiết ra AMDF (hoặc MIH) ngăn cản mầm tuyến sinh dục phát triển theo hướng cái

Con người có thể can thiệp và đổi hướng quá trình hình thành giới tính ở cá

bằng liều thuốc thích hợp, là hormon sinh dục đực như testosterone hay hormon sinh dục cái như estradiol hoặc các chất dẫn xuất của chúng Quá trình này được

thực hiện ở độ tuổi còn non (chưa biệt hóa giới tính) và trong một khoảng thời gian thích hợp Con người có thể làm cho những cá thể đáng lẽ phát triển thành cái (có

bộ nhiễm sắc thể XX) nhưng lại phát triển thành những con đực sinh sản được hoặc

những cá thể đáng lẽ phát triển thành đực (có bộ nhiễm sắc thể XY) lại phát triển thành những con cái cũng sinh sản được Tất nhiên, trong số những cá bị xử lý như trên, cũng có những cá thể mất khả năng sinh sản [14]

1.2.2 Ứng dụng của hormon sinh dục để điều khiển giới tính ở cá Bảy màu

Việc hình thành giới tính nào trong quá trình cơ thể phát triển là kết quả sự

hoạt động chức năng của genotyp và thông qua cái gọi là yếu tố kích thích giới tính

mà cho tới nay vẫn chưa hoàn toàn giải thích được bản chất của nó Tuy nhiên, trong quá trình biệt hóa giới tính thì ảnh hưởng của các yếu tố môi trường bên trong

và bên ngoài có thể là trái ngược với tác động của yếu tố di truyền Điều này có thể

dẫn đến việc tái xác định giới tính vốn đã được xác định bởi genotype Những yếu

tố thay đổi giới tính có thể nhắc đến là hormon steroid, nhiệt độ nước và những yếu

tố di truyền có vai trò thứ yếu khác [1], [13]

Pandian và Sheela (1995) đã tổng kết việc chuyển đổi giới tính bằng hormon được thực hiện trên 47 loài thuộc 15 họ gồm cá phân tính (34 loài, 9 họ) và một số loài lưỡng tính Các công trình này đã sử dụng 31 loại steroid (16 androgen và 15 estrogen) bao gồm cả steroid có nguồn gốc tự nhiên và nhân tạo Nồng độ hormon

xử lý cho việc chuyển đổi giới tính tăng giữa các nhóm phân loại theo thứ tự như sau: Cichlidae < Cyprinododidae < Anabantidae < Poecilidae < Salmonidae < Cyprinidae 17α –methyltestosterone và 17β – estradiol là những hormon được ưu tiên trong việc đực hóa và cái hóa tương ứng Trong đó những công trình đực hóa được tiến hành trên 25 loài, cái hóa 17 loài, và đã đạt được nhiều thành tựu quan

trọng trong việc chuyển đổi giới tính các loài cá kinh tế như Rô phi, cá Chép, cá Hồi

và một số loài cá cảnh như cá Bảy màu, cá Xiêm…[24]

Những sự kiện chính trong lịch sử chuyển đổi giới tính cá được trình bày trong bảng sau:

B ảng 1.1 Lịch sử chuyển đổi giới tính ở cá (Pandian và Sheela (1995)

Padoa (1937) Dùng hormon tổng hợp để chuyển đổi giới tính ở

cá Hồi Yamamoto (1955) Tạo con cái XY bằng Estrogen rồi phối với cá đực

XY bình thường để tạo cá siêu đực YY ở cá Sóc Muller (1969) Ghi nhận việc chuyển đổi giới tính nghịch lý ở cá

Rô phi Johnstone et al (1983) Lưu ý khả năng gây ô nhiễm do việc bài tiết của

99% hormon được đưa vào cơ thể cá Piferrer &Donaldson (1991) Bằng chứng cho thấy sự thơm hóa của androgen

nội sinh là nguyên nhân của việc chuyển đổi giới tính nghịch lý

Varadaraj & Pandian (1991) Tăng độ hòa tan của androgen ET

(ethyltestosterone) lên 10 lần nhờ sử dụng DMSO (dimethylsulfocide)

Devlin et al (1994) Sử dụng DNA của nhiễm sắc thể Y làm mẫu dò để

phân biệt kiểu gen giới tính sau khi đực hóa bằng hormon

Varadaraj et al (1994) Đưa ra bằng chứng về sự thay đổi của nhiệt độ,

chu kì quang và chế độ ăn ảnh hưởng đến hiệu quả

của steroid trong chuyển đổi giới tính George & Pandian (1995a) Sản xuất cá Trân châu cái ZZ

Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh vai trò trực tiếp của các hormon sinh dục trong việc xác định giới tính của con non ở cá, cũng như việc hình thành các đặc điểm sinh dục phụ bất chấp sự tiền định của các yếu tố di truyền là nhiễm

sắc thể giới tính Nói cách khác, người ta có thế biến những con vật có cấu trúc di truyền giới tính XX (con cái di truyền) thành những con đực có kiểu hình ở những

mức độ khác nhau, từ biểu hiện bên ngoài hình thái, tập tính đến mức có khả năng

hoạt động sinh dục và sinh sản được Đối với những con đực di truyền XY cũng

vậy, những hormon sinh dục cái có thể biến đổi chúng thành những con cái chức năng

Đối với những động vật có xương sống bậc thấp như cá, ếch, nhái… hormon sinh dục có thể làm thay đổi hoàn toàn giới tính được quy định bởi di truyền – các nhiễm sắc thể giới tính Con vật được đổi giới tính có thể sinh sản được

Những thí nghiệm dùng hormon sinh dục, kể cả tiêm và trộn vào thức ăn cho

cá để đổi giới tính được bắt dầu từ những năm 30 Nhưng phải thực sự đến những thí nghiệm của Yamamoto (1953) trên cá Sóc thì việc đổi giới tính cho cá mới được

chứng minh một cách rõ ràng, trọn vẹn, phong phú và đa dạng về chủng loại Hiện nay, người ta áp dụng những thành tựu này trên các loại cá Rô phi, cá Chạch, cá

Hồi, cá Bảy màu, cá Hồng kim….những đối tượng quan trọng của nghề nuôi cá nước ngọt nói chung và cá cảnh nói riêng Nhiều tác giả của các công trình điều khiển giới tính ở cá bằng hormon sinh dục có một số nhận xét chung là : khi dùng

liều càng cao thì tỷ lệ sống sót của cá được xử lý càng thấp Ở những loài cá đã đổi

giới tính thì khả năng sinh sản bị hạn chế Theo Pandian và Sheela (1995) kết luận rằng xử lý hormon sinh dục làm trì hoãn sự sinh sản của cá noãn thai sinh và thai sinh

Riêng với cá Bảy màu Poecilia reticulata, việc thay đổi giới tính bằng

hormon sinh dục có nhiều thuận lợi Những điều cơ bản cần chú ý trong quá trình

xử lý bằng hormon là: loại hormon, liều lượng và cách thức đưa vào cơ thể cá (thông qua thức ăn sống hoặc thức ăn nhân tạo, hòa tan trong nước nuôi cá; cũng có

thể bằng cách tiêm nhưng cách này phức tạp trong thao tác và tốn thời gian) Ngoài

ra, người ta cịn phải chú trọng đến vấn đề thời gian: thời điểm bắt đầu (theo tuổi

hoặc kích thước cá) và thời gian xử lý

Khi tiến hành quá trình “đực hĩa”, người ta sử dụng các hormon sinh dục đực để biệt hĩa giới tính, một hiện tượng cĩ vẻ nghịch lý là khi dùng các hormon sinh dục đực cĩ khả năng “thơm hĩa” (aromatisable androgens) như testosterone thì

hiệu quả đực hĩa của thuốc chỉ tăng cùng với sự tăng của liều xử lý đến một giá trị

nhất định, liều xử lý quá cao sẽ làm tỷ lệ cá cái tăng lên Hiện tượng này gọi là “cái hĩa nghịch lý” (Paradoxical Feminization), cĩ thể giải thích hiện tượng này là ở liều cao quá ngưỡng một số hormon sinh dục đực được huyển hĩa thành hormon sinh

dục cái nhờ enzym aromataza nội sinh Điển hình như hormon sinh dục đực tiêu

biểu testosterone dễ dàng biến thành hormon sinh dục cái khá mạnh là 17β – Estradiol [24], [26]

Hình 1.4 Ph ản ứng thơm hố của hormon sinh dục

Đối với cá Gambusia affinis, một loại cá ăn muỗi thuộc họ Poeciliidae, khi

được xử lý bằng Spironolactone đã đực hĩa cá cái qua việc biến vây hậu mơn thành ống sinh dục đực (gonopodium)

OH

Aromataza

OH

Hormon sinh dục đực

17-betaestradiol

Testosterone (hormon sinh dục đực)

17β - Estradiol (hormon sinh dục cái)

Spironolactone là một steroid đối kháng của aldosterone (hormon ở phần vỏ tuyến thượng thận gây cao huyết áp) ở người và cả kháng androgen Khi được xử lý

bằng cách ngâm với nồng độ 1mg/lít đã dẫn đến hiện tượng “đực hóa nghịch lý”

(Paradoxical Masculinization), đã biến cá Gambusia affinis thành cá đực sau 21

ngày[21]

1.2.3 M ột số công trình nghiên cứu sử dụng hormon gây đực hóa ở cá

B ảy màu

Trên thế giới và trong nước đã có rất nhiều nghiên cứu về việc điều khiển

giới tính ở cá bằng các steroid, đã tiến hành đực hóa trên 25 loài với các loại hormon 417α-methyltestosterone, 19 – Nor- ethyltestosterone, Androstenedione,

trong đó phổ biến nhất là 17α-methyltestosterone Sau đây là một số công trình

nghiên cứu gây đực hóa cá Bảy màu 4Poecilia reticulata 4tiêu biểu:

- 4Dzwillo (1962) 4đã đạt được 100% đực hóa khi ngâm cá cá Bảy màu 8 ngày

tuổi trong nước chứa 3mg MT/lít trong 24 giờ

- Takahashi (1975a) đã thu được 100% tỷ lệ đực khi cho cá được cá Bảy màu

mẹ mang thai ăn khẩu phần có chứa 400 mg MT/kg thức ăn trong 8 – 10 ngày trước khi đẻ

- Pandian (1993) đã đực hóa được cá Bảy màu khi cho cá mẹ mang thai ăn khẩu phần có chứa 400 mg MT/kg thức ăn cho ăn trong 7 – 8 ngày trước khi đẻ

- Lâm Minh Trí và Nguyễn Tường Anh (1997) đã đực hóa được cá Bảy màu khi cho cá mẹ mang thai ăn khẩu phần có chứa 250 mg MT/kg thức ăn cho ăn trong

5 -12 ngày trước khi đẻ đạt được 71,35% tỷ lệ đực

- Đặng Thị Cẩm Nhung và Nguyễn Tường Anh (2007) tạo cá Bảy màu toàn đực với genotype XX (và XY) bằng cách cho cá mẹ ăn thức ăn có MT với liều 375 mg/kg thức ăn trong khoảng 5-14 ngày trước khi đẻ thì tỷ lệ cá đực thu được là

96,17%

1.2.4 Ý nghĩa của việc điều khiển giới tính ở cá Bảy màu

Điều đặc biệt thuận lợi khi đổi giới tính cá Bảy màu thuộc thế hệ con bằng hormon là có thể dùng các chất này trộn vào thức ăn cho cá mẹ đang mang thai

Qua đó người ta có thể tạo ra những thế hệ cá Bảy màu gồm toàn đực là những cá

cảnh đẹp hơn và có giá trị thương mại cao hơn cá cái Những thực nghiệm về điều khiển giới tính và cho phép giao phối dựa trên những dấu di truyền màu sắc cá Bảy màu có thể phục vụ cho việc giảng dạy về môn Sinh học – Di truyền ở trường học

một cách hấp dẫn

1.2.5 T ổng quan về hóa chất thí nghiệm

- Bản chất: Steroid, công thức phân tử: CR20RHR30ROR2 R, khối lượng phân tử là

302 đvC (đơn vị cacbon) [31]

Hình 1.5 Công th ức cấu tạo của Methyltestosterone

- Danh pháp: 417α-Methyl-4-androsten-17β-ol-3-one,

17β-Hydroxy-17α-methyl-4-androsten-3-one, Mesterone, Methyltestosterone

- Công dụng:

17 – α Metyltestosterone (Methyltestosterone) là một androgen mạnh, được dùng khá phổ biến trong thủy sản để điều khiển giới tính cá ở nhiều loài như cá

Xiêm (Betta splendens), cá H ồi vân (Oncorhynchus nykiss), cá Bảy màu (Poecilia

cá đẻ con họ cá Ăn muỗi Poeciliidae cần dùng MT với liều cao [2]

So với các hormon là peptid hay prôtêin khác thì MT có những ưu thế: rất bền

với nhiệt, không hề bị mất hoạt tính ở 100 P

xuất, tránh thao tác nhiều lần ảnh hưởng đến hoạt tính của MT Nhiều nghiên cứu cho thấy MT có hiệu quả đực hóa trong nhiều thí nghiệm chuyển đổi giới tính ở cá

và đã được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn sản xuất (cá Rô phi (Oreochromis

trong thịt cá sau khi xử lý và có ảnh hưởng đến sức khỏe con người Để làm sáng tỏ

vấn đề này, Baroiller & Jalabert (1990) đã làm thí nghiệm và đưa ra kết luận là MT

hầu như không tích lũy trong xương cá, hai ngày sau khi ngưng cho ăn hầu như không có MT trong thân cá và sau 3 tuần thì không phát hiện MT trong cơ thể được

xử lý nữa Kết quả này được khẳng định một lần nữa với công trình sau đó của Goudie et al., (1996) đã thí nghiệm đo lượng MT bằng phóng xạ trên cá Rô phi xanh sau khi được xử lý MT là 99% hormon, nhưng 24 giờ sau khi ngưng cho ăn

thức ăn có trộn MT thì lượng MT đã giảm 90%, sau 2 ngày ngưng cho ăn MT thì

hầu như không còn MT và sau 3 tuần thì không phát hiện hoạt chất này nữa ( trích

bởi Nguyễn Tường Anh, 2005) [2]

- MT Hà Lan: Hãng sản xuất: Fluka; Nước sản xuất: Hà Lan; Thành phần

chứa hormon sinh dục 17 – α Metyltestosterone

1.2.5.3 Gi ới thiệu sơ lược về Spironolactone và lý do thí nghiệm với Spironolactone

- Spironolactone là hoạt chất có trong thành phần của một loại thuốc mang tên Verospiron hiện có bán rộng rãi trên thị trường, công dụng của thuốc là giúp

bệnh nhân lợi tiểu và hạ huyết áp Hãng sản xuất: Gedeon Richter; Nước sản xuất: Hungary

- Spironolactone bản chất là steroid, công thức phân tử là CR

24 RHR

32 ROR

4 RS, khối lượng phân tử là 416 đvC (đơn vị Cacbon) [32]

Hình 1.8 Công th ức cấu tạo của Spironolactone

- Danh pháp:

Pregnen-21-oic acid- 17α-ol-3-one-7α-thiol γ-lactone 7 –acetate

α-(Acetylthio)- 17α- hydroxy-3-oxopregnen-4-ene-21-carboxylic acid γ –lactone

Hình 1.9 H ộp thuốc Verospiron có chứa hoạt chất Spironolactone

- Công dụng [33]

Hoạt chất Spironolactone là chất đối kháng mineralocorticoid, tác động qua

việc cạnh tranh thụ thể với andosterone và các mineralocorticoid khác, tác dụng chủ

yếu ở ống lượn xa của thận, kết quả làm tăng bài tiết natri và nước

Spironolactone làm giảm bài tiết các ion Kali (KP

là 17 – α Thiomethylspironolactone và Canrenone

Spironolactone được hấp thu qua đường tiêu hóa, đạt nồng độ tối đa trong máu sau khi uống 1 giờ, nhưng vẫn còn với nồng độ có thể đo được ít nhất 8 giờ sau khi uống 1 liều Sinh khả dụng tương đối là trên 90% so với sinh khả dụng của dung

dịch Spironolactone trong Polyethylen Glycol

Thông thường điều trị lợi tiểu và hạ huyết áp dùng ở liều thấp hơn 100mg,

nếu dùng ở liều cao hơn và liên tục dễ dẫn đến tình trạng tăng Kali huyết như suy

giảm chức năng thận, tăng prolactin, thay đổi ngoại hình (to vú ở đàn ông), rối loạn kinh nguyệt (ở nữ)…

Trong một cuộc nghiên cứu của Hunsinger và Howell, 1991 Khi ngâm cá

Ăn muỗi (Gambusia affinis) cái (6 cá trong 1 bể chứa 10 lít nước) có pha

Spironolactone ở các liều 0,1mg/l, 1mg/l, 2,5mg/l Sau 21 ngày ngâm, cả 3 liều đều cho kết quả đực và cả 3 liều đều ảnh hưởng như nhau (hiện tượng đực hóa nghịch lý) [21]

Hiệp hội Y học Hoa Kỳ, 1991 (American Medical Association) dùng Spironolactone điều trị mãn tính sẽ gây ra các hiện tượng như nữ hóa đàn ông, bất

lực, giảm vẻ nam tính, vú to Ở nữ gây rối loạn kinh nguyệt, căng vú và ung thư vú

Trên cơ sở các nghiên cứu về Spironolactone của Hunsinger và Howell,

1991 và cá Bảy màu Poecilia reticulata là loại cá cùng họ cá Ăn muỗi với cá

cá và sử dụng để tiến hành thử nghiệm đực hóa cá Bảy màu Hiện nay, trên thế giới

đã có nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm trên, nhưng trong nước vẫn chưa có nghiên cứu nào trên đối tượng cá Bảy màu được công bố Một công trình nghiên

cứu gần đây về việc dùng Spironolactone gây đực hóa cá Rô phi đạt 60 – 64,45% tỷ

lệ đực (Vũ Thành Nhân và Nguyễn Tường Anh, 2012), chúng tôi quyết định sử

dụng Spironolactone có trong thuốc Verospiron để làm thí nghiệm cho đề tài này

nhưng với nồng độ cao hơn cho đối tượng nghiên cứu là cá Bảy màu Poecilia reticulata

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Th ời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Th ời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được chúng tôi bắt đầu tiến hành từ tháng 8 năm 2012 và kết thúc vào tháng 8 năm 2013

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Quá trình thí nghiệm được thực hiện tại nhà riêng của tôi ở địa chỉ 161- Đường Trần Phú- ấp Ninh Trung- xã Ninh Sơn- thị xã Tây Ninh- tỉnh Tây Ninh Chúng tôi đã tận dụng không gian trong nhà và ngoài vườn để bố trí các thí nghiệm

2.1.3 V ật liệu nghiên cứu

Cá Bảy màu giống (cá bố mẹ) được lựa chọn một cách cẩn thận từ các trại cá

giống và cửa hàng cá cảnh trong địa bàn thị xã Tây Ninh (tỉnh Tây Ninh) Chúng tôi

đã cùng lúc tiến hành thí nghiệm trên 2 dòng cá Bảy màu Poecilia reticulata:

Cá “minơ” (tên thông dụng của đa số người nuôi cá cảnh) có đuôi đỏ hoặc đuôi xanh

Cá da rắn (còn gọi là cá da beo) có đuôi da rắn màu đỏ hoặc vàng

Hình 2.1 Các cặp cá Bảy màu Poecilia reticulata minơ (bên trái)

và da r ắn (bên phải)

Cá giống ban đầu được mua khi đã thành thục, cá đực có chiều dài toàn thân khoảng 3cm, cá cái dài khoảng 5 – 6 cm Cá minơ đực có đuôi xòe tròn, màu xanh

lơ hoặc đỏ rực, vi lưng và vùng vai có đốm màu xanh lơ phản quang, cá cái có đuôi màu hồng hoặc xanh rất nhạt, đuôi màu đen có hoa văn màu đỏ, thân không màu

hoặc nâu đen Cá da rắn đực thì toàn thân được bao phủ bởi “lớp da rắn” có rất nhiều hoa văn li ti, màu sắc sặc sỡ và cũng có lấp lánh phản quang hay còn gọi là phát ngũ sắc trông rất đẹp Cá da rắn có đuôi màu đỏ rực, xòe rộng và có nhiều

chấm đen nằm rải rác (đuôi da rắn hay đuôi da beo)

Ngoài ra chúng tôi còn nuôi và thử nghiệm thêm một số dạng cá Bảy màu khác để quan sát kiểu hình (phenotype) của chúng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thi ết bị, dụng cụ nuôi

Cá được nuôi trong bể kính có kích thước 80 cm x 20 cm x 20 cm, được ngăn

ra làm 4 ngăn Ngoài ra chúng tôi còn tận dụng thêm một số bể nuôi khác như các

lu (khạp chứa nước) lớn và nhỏ Khi cá đẻ, các cá con được vớt ra nuôi trong những

chậu xi măng

Máy lọc nước và máy thổi không khí được dùng khi cần lọc nước và đảm

bảo môi trường sống cho cá

Xô nhựa lớn dùng để chứa nước giếng (đảm bảo độ pH) để lấy nước nuôi cá Các dụng cụ dùng để xác định tính chất lý hóa của môi trường nước: nhiệt

kế, dung dịch kiểm tra pH…

Bình OR 2 Rnén để lấy khí OR 2, Rtúi polymer dùng trong thí nghiệm ngâm cá Chúng tôi cũng trang bị thêm một số dụng cụ giúp cho quá trình vệ sinh bể nuôi được thuận tiện như: ống bơm hút chất cặn bã, thức ăn thừa, ống nhựa, dụng

cụ lau kiếng, vệ sinh chậu xi măng…

Các hộp nhựa chất lượng đảm bảo, giấy bạc dùng để chứa thức ăn cho cá sau khi chế biến có trộn hormon với liều lượng thích hợp và được bảo quản trong tủ

lạnh

Một số vợt dùng để vớt cá, dụng cụ cho cá ăn…

2.2.2 Phương pháp đực hóa cá Bảy màu Poecilia reticulata bằng MT và

SP

Cá bố mẹ là những con to khỏe, không bị bệnh, không có dị tật Lúc lựa chọn ban đầu phải chọn những con cá bơi trong bể linh hoạt, nhanh nhẹn, nếu chọn được

cá chưa sinh sản lần nào thì càng tốt Đối với cá đực đặc biệt phải chọn những con

có màu sắc thân và đuôi sặc sỡ, các vi dài, đẹp, nhiều màu Cá cái được chọn là

những con to, khỏe, trông có vẻ đẫy đà hứa hẹn sẽ sinh sản tốt

Đối với cá Bảy màu Poecilia reticulata, việc chọn cá bố mẹ thông qua các

đặc điểm hình thái là một điều rất thuận lợi Các tính trạng này rất dễ quan sát được

bằng mắt thường Tuy nhiên, trong các thí nghiệm của chúng tôi, để đảm bảo tính chính xác, chúng tôi chỉ xác định cá đực, cái khi cá đã trưởng thành (60 – 90 ngày

tuổi)

mang thai ăn MT và SP

Trong các thí nghiệm, cá cái mang thai được ăn thức ăn có trộn thêm MT, SP với

liều lượng khác nhau trong khoảng 5 – 14 ngày trước khi đẻ với thành phần trọng lượng như sau: bột cá hay bột tôm xay nhuyễn - 5g; cám mịn và bột mì – 15g; lòng

đỏ trứng gà – 1 trứng, sau đó trộn steroid với các liều khác nhau rồi hấp cách thủy

Hình 2.2 Th ức ăn được chế biến có trộn steroid

Đối với MT, sau khi tham khảo một số tài liệu về các công trình thí nghiệm đực hóa ở cá, chúng tôi quyết định dùng liều 325 và 350 mg MT/kg thức ăn để làm thí nghiệm của đề tài này [1], [2], [8], [9], [10],[11]

Đối với SP, do có hoạt tính thấp hơn so với MT và là lần đầu tiên thử nghiệm đực hóa ở cá Bảy màu nên chúng tôi quyết định dùng liều 500 và 700 mg SP/kg

(cồn) để đạt nồng độ 5 mg MT/1 ml cồn, sau đó lấy 3,25 ml cồn cho 50 g thức

ăn để được liều 325 mg/kg thức ăn, và 3,5 ml cồn cho 50 g thức ăn để được liều 350 mg/kg thức ăn

Đối với MT Hà Lan, hòa tan 200 mg trong 40 ml ethanol 96P

0

P

để đạt nồng độ

5 mg MT/1 ml ethanol, sau đó lấy 3,25 ml ethanol cho 50 g thức ăn để được liều

325 mg/kg thức ăn, và 3,5 ml ethanol cho 50 g thức ăn để được liều 350 mg/kg thức

ăn

Đối với SP, hòa tan 100 mg (4 viên thuốc 25mg) trong 20 ml ethanol 96P

0

Pđể đạt nồng độ 5 mg SP/1 ml ethanol, sau đó lấy 5 ml ethanol cho 50 g thức ăn để được liều 500 mg/kg thức ăn, và 7 ml ethanol cho 50 g thức ăn để được liều 700 mg/kg thức ăn

Đối chứng với nghiệm thức có trộn 5 ml ethanol cho 50 g thức ăn, và đối

chứng với 50 g thức ăn bình thường

Trong thời gian mang thai, cá cái được giữ riêng từng con, được nuôi bằng

thức ăn trộn thuốc và thức ăn đối chứng, sau khi sinh, cá mẹ được tách khỏi cá con

Từng bầy cá con thuộc một mẹ được nuôi riêng biệt cho đến khi phân biêt được đực cái (khoảng 90 ngày tuổi)

khảo một số tài liệu liên quan, chúng tôi quyết định dùng liều 4 và 5 mg MT/lít, 8

và 10 mg SP/lít cho thí nghiệm của đề tài này [8], [24]

Trình tự 4xử lý ngâm cá bột trong nước có pha MT, SP:

- 4Chuẩn bị steroid: MT và SP được hòa tan trong ethanol 96P

cốt có nồng độ 500 mg/lít, còn nước cốt SP có nồng độ 1g/lít

- 4Chuẩn bị cá bột: Cá mẹ mang thai được nuôi riêng từng con, được chăm sóc trong điều kiện bình thường, sau khi đẻ cá mẹ được vớt riêng ra, cá con được để qua 1 ngày rồi được ngâm trong nước có pha steroid

- 4Chuẩn bị dụng cụ ngâm: túi polyethylen (PE) 1kg, bình OR 2 R, vợt cá nhỏ

- 4Tiến hành ngâm: sau khi tính toán lượng nước và lượng androgen ở từng thí nghiệm, dùng xyranh 20ml bơm lượng nước cần dùng vào túi PE, tiếp đến dùng xyranh 1ml bổ sung lượng androgen cần dùng, sau đó dùng bình OR 2 Rbơm trực tiếp vào túi với lượng OR

2 R phải gấp đôi lượng nước xử lý, cột chặt để túi căng phồng, thời gian xử lý là 2 giờ

- 4Cá sau khi được xử lý được nuôi riêng trong chậu xi măng theo từng cặp

bố mẹ ban đầu

4

Đối với thí nghiệm đối chứng, chúng tôi cũng tiến hành tương tự nhưng chỉ

bổ sung thêm ethanol

- Thí nghi ệm 1 (TN1): cho cá mẹ mang thai ăn khẩu phần có trộn MT (Hà

Lan, Trung Quốc) hay SP 5 – 14 ngày trước khi đẻ với các nghiệm thức sau:

+ Nghiệm thức 1 (MTH1): MT Hà Lan với liều 325 mg/kg thức ăn

+ Nghiệm thức 2 (MTH2): MT Hà Lan với liều 350 mg/kg thức ăn

+ Nghiệm thức 3 (MTT1): MT Trung Quốc với liều 325 mg/kg thức ăn + Nghiệm thức 4 (MTT2): MT Trung Quốc với liều 350 mg/kg thức ăn + Nghiệm thức 5 (SP1): SP với liều 500 mg/kg thức ăn

+ Nghiệm thức 6 (SP2): SP với liều 700 mg/kg thức ăn

+ Nghiệm thức 7 (ĐCE): Đối chứng thức ăn có trộn ethanol

+ Nghiệm thức 8 (ĐC1): Đối chứng thức ăn bình thường (không steroid, không ethanol)

- Thí nghi ệm 2 (TN2): ngâm cá bột 1 ngày tuổi trong nước có pha MT (Hà

Lan, Trung Quốc) hay SP trong thời gian là 2 giờ với các nghiệm thức sau:

+ Nghiệm thức 1 (MTHn1): MT Hà Lan với liều 4 mg/lít

+ Nghiệm thức 2 (MTHn2): MT Hà Lan với liều 5 mg/lít

+ Nghiệm thức 3 (MTTn1): MT Trung Quốc với liều 4 mg/lít

+ Nghiệm thức 4 (MTTn2): MT Trung Quốc với liều 5 mg/lít

+ Nghiệm thức 5 (SPn1): SP với liều 8 mg/lít

+ Nghiệm thức 6 (SPn2): SP với liều 10 mg/lít

+ Nghiệm thức 7 (ĐCEn): Đối chứng ngâm nước có pha ethanol

+ Nghiệm thức 8 (ĐC1) : Đối chứng bình thường (không steroid, không ethanol)

Bước đầu chúng tôi nuôi 12 cặp cá Bảy màu Poecilia reticulata bố mẹ trong

điều kiện bình thường để khảo sát về điều kiện sống của cá ở nơi thực hiện đề tài,

khảo sát về tỷ lệ đực cái tự nhiên và tỷ lệ sống của cá đến lúc thành thục (khoảng 60

- 90 ngày tuổi) và dùng làm đối chứng thực tế (ĐC2)

Mỗi nghiệm thức ở 2 thí nghiệm được thực hiện 3 lần (ở 3 cặp bố mẹ khác nhau), kết quả ở các nghiệm thức được so sánh với đối chứng tiến hành song song trong quá trình thí nghiệm (ĐCE, ĐC1) và so với đối chứng thực tế (ĐC2)

Cá bố mẹ được nuôi trong các bể kính có kích thước 80x20x20cm, được chia làm 4 ngăn, mỗi ngăn nuôi 1 cá đực và 2 cá cái, ở mỗi ngăn đều được ghi nhãn cho

mỗi nghiệm thức thực hiện, các nghiệm thức được phân bố 1 cách ngẫu nhiên, cá con thu được từ mỗi cặp bố mẹ được vớt riêng ra nuôi trong chậu xi măng đã đánh

dấu nghiệm thức tương ứng

Hình 2.4 Các b ể kính nuôi cá bố mẹ và chậu xi măng nuôi cá con

2.2.4 Phương pháp chăm sóc cá trong thời gian thí nghiệm

Cá sống trong nước, vì vậy môi trường nước phải đảm bảo các tính chất lý hóa thích hợp cho sự sống của cá, nhất là trong lúc sinh sản Đối với cá Bảy màu trong các thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng nước giếng, để lắng tối thiểu 2 ngày, sau đó mới cho vào bể kính Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi thường xuyên theo dõi, kiểm tra để đảm bảo môi trường sống tốt nhất cho cá

Để cá được mau lớn, khoảng 1 tuần chúng tôi thay 1 phần nước cho cá, và định kỳ cứ 2 tuần một lần chúng tôi thay nước kết hợp với vệ sinh bể nuôi Quá trình thay nước cho cá đảm bảo không làm chúng hoảng sợ Chúng tôi sử dụng ống hút cao su rà sát đáy hồ, hút lấy chất cặn bã, chất thải, thức ăn thừa… ra khỏi bể Sau đó cho nước sạch vào bể một cách từ từ Nguyên tắc cơ bản là mỗi lần thay nước ta không thay hết hoàn toàn lượng nước cũ mà giữ lại khoảng 20% kết hợp với nước sạch để tránh làm thay đổi đột ngột môi trường sống của cá

Việc thay nước hồ cá được tiến hành khi bên ngoài trời nắng ấm, khô ráo Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nuôi cá trong điều kiện gần giống như trong

tự nhiên, nhưng tránh bị mưa và ánh sáng trực tiếp, thỉnh thoảng mở máy lọc và

máy thổi nhằm cung cấp đủ lượng khí oxi hòa tan trong nước

Điều thuận lợi đối với cá Bảy màu là chúng rất phàm ăn Trong bể nuôi chút

tôi để 1 ít rong đuôi chó Ceratophyllum demersum, vừa có thể tạo oxi do quá trình

quang hợp, vừa làm nguồn thức ăn thường xuyên cho cá Ngoài thời gian cho cá mang thai ăn thức ăn có hormon, chúng được cung cấp đầy đủ các loại thức ăn khác

như: lăng quăng, trùn chỉ Limnodrilus hoffmoistery, giáp xác Moina…Thức ăn

trong thời gian cá mang thai khoảng 5 – 14 ngày trước khi đẻ được bảo quản trong

tủ lạnh, sau mỗi lần cho ăn phải lưu ý lấy hết thức ăn thừa ra khỏi bể, tránh làm bẩn nước

Cá được cho ăn 2 lần/ngày vào buổi sáng sớm và chiều mát

Khi cá mẹ mang thai và đẻ con, chúng được chăm sóc cẩn thận hơn, không

để cá bị đói Phải cung cấp đầy đủ dưỡng chất cho cá trước và sau khi đẻ Điều đặc

biệt lưu ý khi nuôi cá Bảy màu là chúng có thể ăn cá con Do đó ngay sau khi cá đẻ,

cá con được vớt ra khỏi bể cho vào chậu nhỏ hoặc các dụng cụ chứa khác

Cá con mới sinh ra được chăm sóc đặc biệt hơn Sau khi vớt cá con khỏi cá

bố mẹ, phải chung cấp dưỡng khí thường xuyên cho cá, theo dõi nhiệt độ của nước Nước nuôi được giữ sạch và đặt nơi thoáng mát, yên tĩnh, có ánh sáng nhưng tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào Không được sử dụng máy lọc khi cá con còn nhỏ

- Thức ăn cho cá con: cá con mới nở trong vài ngày đầu chưa biết ăn Thức

ăn ban đầu cho cá con phải có kích thước rất nhỏ Nếu là thức ăn chế biến sẵn thì

phải xay nhuyễn, mịn Có thể cho ăn thức ăn có nguồn gốc động vật đầu tiên là bo

bo, khi cá đã lớn thì kết hợp với những loại thức ăn khác

- Từng bầy cá con thuộc một mẹ được nuôi riêng cho đến khi phân biệt được đực cái

- Cần phải lưu ý theo dõi sự biểu hiện về màu sắc đuôi và thân cá, đặc biệt là

cá đực, màu sắc được biểu hiện từ rất sớm

2.3 Phương pháp phân biệt đực và cái

Đối với động vật bậc thấp nói chung và ở cá nói riêng, việc phân biệt con đực hay con cái là một vấn đề phức tạp nếu chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái Cá

Bảy màu Poecilia reticulata là một trường hợp ngoại lệ, chúng ta hoàn toàn có thể

phân biệt cá đực hay cá cái bình thường thông qua các đặc điểm hình thái

Trong thí nghiệm, chúng tôi chỉ tiến hành xác định tỷ lệ đực cái khi cá đã trưởng thành (khoảng 90 ngày tuổi)

- Cá đực có kích thước nhỏ hơn so với cá cái cùng tuổi Màu sắc thân đậm hơn, các vi lưng và vi đuôi dài hơn và có màu sắc sặc sỡ hơn, vi hậu môn biến thành gonopodium (chân sinh dục), là cơ quan dẫn tinh khi giao phối với cá cái

- Đối với cá minơ: con đực có đuôi màu đỏ rực hoặc xanh đậm, xòe tròn trông rất đẹp Trên thân cá từ lưng đến vi đuôi có màu đen đậm và trên lưng có đốm xanh ánh bạc

- Cá cái có màu xám nâu, đuôi có màu hồng nhạt hoặc xanh nhạt Kích thước

lớn hơn cá đực và trông có vẻ đẫy đà hơn

- Đối với cá da rắn, cá đực toàn thân được bao phủ bởi lớp da rắn, vây đuôi xòe rộng, màu đỏ hoặc vàng, cá cái thân và đuôi hầu như không có hoa văn, vây đuôi không rộng

Để kiểm tra việc xác định giới tính trong một số trường hợp, chúng tôi quan sát và so sánh tập tính của cá với các cá thể khác có giới tính rõ ràng

Nhận dạng cá đực XX:

Ở cá Bảy màu Poecilia reticulata, trên nhiễm sắc thể Y có 19 và trên nhiễm

sắc thể X có 16 gen màu sắc chỉ thể hiện ở cá đực và trong một số trường hợp biểu

hiện yếu ở cá cái (Kirpichnikov, tổng quan, 1987) [23] Tuy nhiên, sự biểu hiện của các gen như thế không được mô tả tỉ mỉ ở các tài liệu mà chúng tôi có trong tay nên chúng tôi gặp khó khăn khi muốn sử dụng chúng như những dấu di truyền liên kết

với giới tính Vì vậy chúng tôi kết hợp sự theo dõi, quan sát với thí nghiệm đổi giới tính để xác định vị trí một số gen màu sắc trên nhiễm sắc thể X và Y một cách gián

tiếp [2]