nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật multiplex ligation dependent probe amplifitication để chẩn đoán đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen smn1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy

Ngày nay với sự phát triển của kĩ thuật di truyền có rất nhiều phương pháp được áp được các bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp tử mà không phát hiện được kiểu dependent Probe A

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Dương Thị Huệ

MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7,

HÓA CƠ TỦY

ố Hồ Chí Minh – 2013

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Dương Thị Huệ

MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7,

HÓA CƠ TỦY

Chuyên ngành: Sinh h ọc thực nghiệm

Mã s ố: 60 42 01 14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUY ỄN THỊ BĂNG SƯƠNG

Thành ph ố Hồ Chí Minh – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn Thạc sĩ Sinh học với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ

thu ật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy” là công trình nghiên cứu

TÁC GI Ả LUẬN VĂN Dương Thị Huệ

LỜI CẢM ƠN

văn này

Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực

đã tạo điều kiện cho tôi tiến hành thu thập mẫu nghiên cứu luận văn này

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận văn này

Qua đây con cũng xin được gửi lời biết ơn sâu sắc tới Bố Mẹ và các anh chị đã động viên hỗ trợ con trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận văn này

TÁC GI Ả LUẬN VĂN Dương Thị Huệ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

L ỜI CAM ĐOAN 1

L ỜI CẢM ƠN 2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 3

M ỤC LỤC 4

M Ở ĐẦU 6

1 Lí do ch ọn đề tài 6

2 M ục tiêu nghiên cứu 8

3 Đối tượng nghiên cứu 8

4 N ội dung nghiên cứu 9

5 Ph ạm vi nghiên cứu 9

6 Đóng góp của luận văn 9

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11

1.1 Đặc điểm của bệnh thoái hóa cơ tủy 11

1.1.1 Đặc điểm lâm sàng và tiêu chuẩn cận lâm sàng 11

1.1.2 Di truyền bệnh SMA 12

1.1.3 Bệnh học phân tử 14

1.1.4 Chữa trị bệnh SMA 22

1.2 Các phương pháp xác định đột biến gen smn1 23

1.2.1 Phương pháp Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification 23

1.2.2 Phương pháp PCR - Restriction fragment length polymorphism (PCR - RFLP) 26 1.2.3 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescent insitu hybridization -FISH) 27 1.2.4 Real - time PCR 28

1.2.5 Giải trình tự gen bằng máy tự động 29

1.3 Lược sử nghiên cứu của đề tài 29

1.3.1 Lược sử nghiên cứu trên thế giới 29

1.3.2 Lược sử nghiên cứu ở Việt Nam 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.2 Trang thi ết bị, dụng cụ và hóa chất 32

2.2.1 Quá trình nghiên cứu sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ sau 32

2.2.2 Hóa chất 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Xây dựng quy trình nghiên cứu 34

2.3.2 Quy trình lấy mẫu 35

2.3.3.Tách chiết DNA từ bạch cầu máu ngoại vi và dịch ối 35

2.3.4 Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA 36

2.3.5 Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở bệnh nhân SMA 37

2.3.6 Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định người lành mang gen bệnh ở bố mẹ bệnh nhân 42

2.3.7 Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở mẫu dịch ối 42

2.3.8 Những lưu ý khi thực hiện phản ứng MLPA 42

2.4 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu 43

2.5 V ấn đề đạo đức trong nghiên cứu 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

3.1 K ết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu của kit SALSA MLPA P021-A2 Beckman Coulter Genomelab GeXP 44

3.2 K ết quả đặc điểm tuổi và giới tính của bệnh nhân 46

3.3 K ết quả xác định đột biến mất đoạn gen SMN1 của bệnh nhân 47

3.3.1 Kết quả bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử exon 7 và 8 48

3.3.2 Kết quả bệnh nhân bị đột biến mất đoạn dị hợp tử exon 7 và 8 49

3.3.3 Kết quả bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn exon 7 và 8 50

3.3.4 Kết quả các dạng đột biến của bệnh nhân 51

3.3.5 Sự phân bố đột biến mất đoạn của gen SMN1 53

3.4 K ết quả xác định kiểu gen dị hợp tử ở bố mẹ bệnh nhân 55

3.4.1 Kết quả điện di mao quản xác định kiểu gen dị hợp tử của bố mẹ bệnh nhân SMA55 3.4.2 Kết quả các cặp bố mẹ có kiểu gen dị hợp tử 57

3.5 K ết quả chẩn đoán trước sinh 60

3.5.1 Kết quả phân tích thai nhi của gia đình bệnh nhân SMA57 60

3.5.2 Kết quả phân tích thai nhi của gia đình bệnh nhân SMA11 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 66

PH Ụ LỤC 73

MỞ ĐẦU

1 Lí do ch ọn đề tài

Thoái hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy - SMA) là bệnh di truyền do gen lặn nằm

(người Australia) vào năm 1891 [10] Đây là một trong những bệnh thần kinh cơ di truyền thường gặp Tần suất mắc bệnh 1/10.000 - 1/25.000 và tần suất người bình thường mang

Người ta đã phát hiện 4 gen liên quan đến bệnh, mỗi gen gồm hai bản sao có trình tự tương đối giống nhau: gen SMN (Suvival motor neuron: gồm SMN1 và SMN2); Neuroral apoptosis inhibitory protein gene (NAIP và ΨNAIP); Basal transcription factor subunit p44 (p44t và p44c); H4F5c và H4F5t [34]

SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh vận động

ứng, tuy nhiên do sự khác nhau ở một vài nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có

gen SMN1 đột biến chuyển thành exon 7 của gen SMN2 Các bệnh nhân bị đột biến mất hai exon 7 (SMN1) đa số kèm theo đột biến mất exon 8 của gen SMN1, tuy nhiên có trường

Ngày nay với sự phát triển của kĩ thuật di truyền có rất nhiều phương pháp được áp

được các bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp tử mà không phát hiện được kiểu

dependent Probe Amplification (MLPA) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến mất đoạn ngắn, lặp đoạn cũng như phát hiện kiểu gen dị hợp tử với độ chính

định được mất đoạn đồng hợp tử gen SMN1 thì kỹ thuật MLPA còn giúp phát hiện các cơ

người lành mang gen bệnh [28], [36] Bên cạnh đó, kĩ thuật MLPA còn giúp khảo sát các gen khác liên quan đến bệnh SMA như NAIP và ΨNAIP,…

Cũng như các bệnh di truyền khác, trong bệnh thoái hóa cơ tủy, người con mắc bệnh không

người con thì cần phải xác định kiểu gen của bố mẹ bệnh nhân Nếu bố và mẹ là người

ối và chẩn đoán xem thai nhi có bị đột biến không để tư vấn di truyền và có hướng xử lý kịp

kĩ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy”

2 M ục tiêu nghiên cứu

thoái hóa cơ tủy

3 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm ch ứng: Gồm 30 người bình thường, không mắc bệnh SMA trong đó có 15

đối chứng khi tiến hành phản ứng MLPA cùng với mẫu bệnh nhân.

năng bú, ảnh hưởng tới cơ hô hấp: Tiếng khóc bé, thở nông)

(2) Xác định kiểu gen dị hợp tử của bố mẹ bệnh nhân: 07 cặp vợ chồng là bố mẹ của các bệnh nhân được xác định có đột biến mất đoạn exon 7, 8 của gen SMN1 sẽ được phân tích gen để phát hiện kiểu gen dị hợp tử

Điều kiện chọn lựa: Bố mẹ của bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu

được thực hiện chẩn đoán trước sinh

Điều kiện chọn lựa: Gia đình của bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu

4 N ội dung nghiên cứu

thoái hóa cơ tủy

5 Ph ạm vi nghiên cứu

6 Đóng góp của luận văn

pháp MLPA

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

* Ý nghĩa khoa học

chưa điều trị được ở Việt Nam Phần lớn chỉ điều trị triệu chứng để kéo dài thời gian sống

được người lành mang kiểu gen dị hợp tử thì gen bệnh sẽ lan truyền trong cộng đồng và tỷ

cơ tủy để phát hiện sớm các thai nhi mắc bệnh, có hướng xử trí thích hợp Ở Việt Nam,

đích trên nên có ý nghĩa khoa học như sau:

- Ứng dụng kĩ thuật MLPA trong chẩn đoán bệnh thoái hóa cơ tủy giúp giảm tỉ lệ mắc

* Ý nghĩa thực tiễn

sinh

C HƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm của bệnh thoái hóa cơ tủy

1.1.1 Đặc điểm lâm sàng và tiêu chuẩn cận lâm sàng

Đây là bệnh di truyền với các đặc điểm lâm sàng như sau:

Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh

các đặc trưng là: Yếu cơ đối xứng gốc chi, trương lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm

trong vòng năm đầu tiên của cuộc đời do biến chứng viêm phổi và suy hô hấp [9]

Theo hội nghị quốc tế về SMA - tháng 6/1992 tại Bonn, Đức bệnh có tiêu chuẩn như sau [37]

được Có biến chứng cong vẹo cột sống và nuốt khó Trẻ phát triển tinh thần bình thường

khăn hơn Có các biểu hiện của yếu cơ gốc chi, co cứng cơ, cong vẹo cột sống Trẻ phát

người lớn, thường xảy ra sau tuổi 30 Các triệu chứng: Bắt đầu teo cơ cột sống thường là

Các xét nghiệm cận lâm sàng của bệnh bao gồm:

- Xác định hoạt độ enzyme creatine kinase (CK): Creatine kinase là một loại

enzyme có vai trò chuyển hóa năng lượng giúp cho quá trình co cơ Khác với một số bệnh thần kinh cơ di truyền như loạn dưỡng cơ Duchenne có nồng độ enzyme CK trong huyết thanh tăng rất cao (30 - 40 lần so với bình thường), trong bệnh thoái hóa cơ tủy, tổn thương

cơ là do sự thoái hóa của tế bào sừng trước tủy sống, do vậy hoạt độ CK huyết thanh chỉ tăng nhẹ (2 - 9 lần) hoặc không tăng [8]

- Đo điện cơ đồ: Đây là phương pháp được sử dụng để chẩn đoán phân biệt bệnh lý

teo cơ do tổn thương ở cơ hay do tổn thương thần kinh

Bệnh nhân thoái hóa cơ tủy có hình ảnh bất thường trên bản điện di cơ [11]

+ Ở trạng thái nghỉ: Có sự xuất hiện các hoạt động điện thế tự phát kiểu sóng nhọn dương và co giật sợi cơ, co giật bó cơ và phóng điện lặp lại phức hợp

+ Ở trạng thái co cơ: Khoảng điện thế của đơn vị vận động dài ra, biên độ tăng và số lượng các pha tăng

+ Ở trạng thái co cơ tối đa: Điện thế của đơn vị vận động giảm kết hợp với giao thoa không hoàn toàn với các nhịp phóng điện của từng đơn vị vận động nhanh hơn

1.1.2 Di truy ền bệnh SMA

Cơ chế di truyền của bệnh: Bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường

cho con Khi người con nhận một allele bệnh từ người mẹ và một allele bệnh từ người bố sẽ

Trường hợp bố và mẹ có kiểu gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh như sau (hình 1.1):

ố con là người lành mang gen bệnh

- 25% số con là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh

Hình 1.1 Sơ đồ cơ chế di truyền bệnh SMA

(Ngu ồn: [62])

Trường hợp người bố hoặc người mẹ bình thường, kết hôn với người mang gen bệnh

trường hợp được thể hiện trong bảng 1.1)

B ảng 1.1 Kiểu gen bệnh SMA của bố mẹ và tỉ lệ mắc bệnh ở thế hệ con

Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ Tần số con với các kiểu gen khác nhau

Lành

rr Bệnh

Rr Lành mang gen bệnh

Rr Lành mang gen

Rr

bệnh bệnh

RR Lành

Rr Lành mang gen bệnh

Rr Lành mang gen

bệnh

Rr

rr Bệnh

RR

Rr Bệnh

Hình 1.2 Sơ đồ vị trí gen SMN và sự

khác nhau gi ữa hai gen SMN1 và SMN2

A Cấu trúc vùng gen SMA gồm 4 gen:

do đột biến gen SMN (survival motor

cơ tủy bị mất cả hai bản sao của gen SMN1 còn khoảng 6% bệnh nhân rơi vào trường hợp

năng [4]

1.1.3.1 V ị trí, cấu trúc và chức năng của gen SMN1

nucleotide: Một ở intron 6 (A>G), một ở exon 7 (T>C), hai ở intron 7 (G>A, G>A) và một

ở exon 8 (A>G) (hình 1.2B) [15]

Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh

người với trọng lượng phân tử 38 kilodalton (kDa), gồm 294 amino acid

năng của protein SMN Đột biến exon 7 làm giảm khả năng tương tác của protein SMN với

mã, nghĩa là cho dù nucleotide bị thay đổi thì amino acid ứng với vị trí trên vẫn không bị thay đổi do đây là đột biến đồng nghĩa [52] Người ta chứng minh rằng đột biến C chuyển

Hình 1.3 Quá trình hoàn thi ện mRNA của gen SMN1 và SMN2

A Quá trình hoàn thi ện mRNA của gen SMN1 tạo mRNA hoàn thiện

B Quá trình hoàn thi ện mRNA của gen SMN2 tạo ra 90% mRNA thiếu hụt exon 7

(Ngu ồn: [16])

khác như SRp30c, hnRNP-Q, hnRNP-G sẽ thực hiện quá trình ghép nối, giúp hoàn thiện

đó sự bỏ qua exon 7 của gen SMN2 dẫn đến chỉ có 10% sản phẩm phiên mã của gen SMN2

có exon 7 (hình 1.3A) [17]

động, quá trình ghép nối sẽ đi theo xu hướng bị ức chế, protein tạo ra sẽ bị mất đoạn exon 7,

đi đáng kể Đồng thời, sự thay đổi này cũng làm xuất hiện một vùng ức chế mới nơi mà

Hình 1.4 S ự khác nhau về chức năng giữa gen SMN2 và gen SMN1

a Gen SMN1 và SMN2, b Ti ền mRNA của gen SMN2 và gen SMN1, c mRNA của gen SMN2 và gen SMN1, d Protein quy định bởi gen SMN2 và gen SMN1

(Ngu ồn: [48])

Protein SMN là một protein phổ biến trong tế bào người với trọng lượng phân tử 38

Hình 1.5 Vai trò c ủa protein SMN trong quá trình lắp ráp snRNPs

Chú thích: CBC: cap - binding - complex; CB: Cajal bodies - Th ể cuộn

(Ngu ồn: [43])

SMN được chia làm 3 mức độ: Mức độ cao trong não, tủy sống, thận và gan; ở mức độ vừa

snRNA đi

bà

Bào tương Phức hợp

SMN

lympho bào (lymphoblast) nhưng lại bị giảm đến 100 lần trong tủy sống so với người bình thường [22]

đoạn và đột biến chuyển đổi gen dẫn đến hậu quả làm thiếu hụt exon 7 (hoặc exon 7 và exon

Hình 1.6 Sơ đồ minh họa các loại đột biến gen SMN1

a Đột biến mất đoạn (một phần gen hoặc toàn bộ gen); b Đột biến chuyển đổi gen (từ

SMN1 sang SMN2); c Các điểm đột biếnđã xác định

(Ngu ồn: [48])

* Đột biến mất đoạn gen (deletion)

Đoạn exon 7 bị mất hoặc cả gen SMN1 bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau

1.7 B) [29])

Hình 1.7 Cơ chế đột biến vùng gen SMA (5q13)

A Chuy ển đổi gen, B Mất đoạn giữa của nhiễm sắc thể mang gen SMN1 và SMN2, C

M ất đoạn giữa của nhiễm sắc thể mang gen SMN2

(Ngu ồn: [29])

* Đột biến chuyển đổi gen (gene conversion)

đột biến chuyển đổi gen từ SMN1 sang SMN2 do nucleotide này có vai trò quan trọng trong

[57]

* Đột biến điểm (point mutations)

Đột biến điểm là những đột biến mà chỉ ảnh hưởng đến một vài nucleotide của gen

hoặc không ổn định Hiện nay các đột biến điểm được xác định ở hình 1.6.c [48] Các đột

nghĩa (missense) và đột biến vị trí cắt nối gen (splice site)

1.1.4 Ch ữa trị bệnh SMA

Đến nay bệnh SMA vẫn chưa có phương pháp chữa trị đặc hiệu chủ yếu chỉ là các biện pháp chăm sóc, hỗ trợ làm giảm các di chứng của bệnh, chế độ dinh dưỡng đầy đủ, điều trị

SMN2

Cơ chế phiên mã mRNA của exon 7 rất phức tạp đòi hỏi rất nhiều các yếu tố liên quan trong đó có các yếu tố tăng cường (điều hòa dương tính) và các yếu tố ức chế (điều hòa âm

protein SMA

Hình 1.8 Các y ếu tố điều hòa liên quan đến quá trình hoàn thiện exon 7 gen SMN

(Ngu ồn: [27])

Năm 2010, Yimin Hua và cộng sự đã nghiên cứu thiết kế đoạn antisense

thay đổi nucleotid ở vùng 5’ exon 7 của gen SMN2 sao cho đoạn antisense này có thể ngăn

chặn quá trình ức chế exon 7 và tăng cường sự phiên mã của exon này Đoạn antisense này được đưa vào cơ thể chuột, kết quả cho thấy có sự tăng cường sao chép mRNA và biểu hiện

Cho đến nay việc điều trị các bệnh di truyền nói chung và bệnh SMA nói riêng vẫn đang là khó khăn cho ngành y học do đó cách bệnh này vẫn là gánh nặng cho bản thân bệnh

1.2 C ác phương pháp xác định đột biến gen smn1

1.2 1 Phương pháp Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification

DNA đích đặc hiệu Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligoncleotide có kích thước khác nhau (đoạn

dò xuôi và đoạn dò ngược) Các probe sẽ gắn đặc hiệu vào các exon của phân tử DNA đích, sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang Đoạn đệm được thiết kế dài ngắn khác nhau nên khi phản ứng PCR khuếch đại sẽ tạo ra nhiều đoạn DNA có chiều dài khác nhau và được phân tách bằng điện di mao quản Nếu exon bị đột biến mất đoạn thì không có hiện tượng lai probe và probe đó sẽ không được khuếch đại, do đó khi điện di mao quản sẽ không thấy hình ảnh exon bị đột biến mất đoạn Nếu gen có đột biến lặp đoạn, kết quả trên hình ảnh điện di mao quản cho thấy đỉnh tín hiệu của probe tương ứng với exon bị đột biến sẽ tăng cao khác biệt so với bình

thường [40]

Đến nay có hơn một triệu phản ứng MLPA được thực hiện mỗi năm trên khắp thế giới

và được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người, di truyền tế bào và

xác

Ưu điểm của phương pháp này là có độ nhạy cao, chính xác với thời gian thực hiện

* Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh SMA

Thường được sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen SMN1 và phát hiện người lành mang gen bệnh

Ở gen SMN1 vị trí nối của đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược là nucleotide C, do đó nếu xảy ra đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 hoặc chuyển C thành T thì sẽ không xảy ra hiện tượng lai đặc hiệu với exon 7 của DNA đích và đoạn dò exon 7 sẽ không được khuếch đại Chính vì

Trong trường hợp có mặt cả hai exon 7 của gen SMN1 và gen SMN2 thì thông qua điện di

gen SMN2, kích thước 276nt) (theo protocol MRC-Holland)

Đối với việc xác định đột biến mất đoạn exon 8 sử dụng hai đoạn dò 1812-L1373 &

đỉnh 294nt và gen SMN2 với đỉnh 300nt trong điện di mao quản

B

Hình 1.9 K ết quả điện di mao quản phát hiện đột biến mất đoạn exon 7 và 8 của gen

SMN1

A Người bình thường (màu đỏ): Xuất hiện hai đỉnh của exon 7 và 8

B ệnh nhân (màu xanh): Không xuất hiện đỉnh exon 7 và 8

B Người bị mất đoạn dị hợp tử exon 7, 8 của SMN1: Xuất hiện đỉnh chỉ bằng ½ so với

m ẫu đối chứng

(Ngu ồn: Theo protocol MRC-Holland)

Đoạn dò exon 8 cũng có thể được sử dụng để xác định số lượng bản sao của gen SMN1 và SMN2, tuy nhiên trong trường hợp kết quả không trùng khớp với đoạn dò exon 7

đột biến chuyển đổi gen SMN1 thành SMN2: C chuyển thành T ở vị trí exon 7 trong khi đó

ở vị trí exon 8 vẫn giữ nguyên

1.2 2 Phương pháp PCR - Restriction fragment length polymorphism (PCR - RFLP)

Theo phương pháp của Van der Steege, sản phẩm PCR sau khuếch đại exon 7, exon 8

Hình 1.10 V ị trí và sản phẩm cắt của enzyme DraI

170bp (lúc này exon 7 của gen SMN1 bị đột biến và cũng bị cắt tạo thành 2 đoạn có kích thước 170bp và 20bp) [56] (hình 1.12)

Đối với exon 8, sản phẩm điện di sẽ xuất hiện 3 vạch ở người bình thường: 2 vạch thấp

là sản phẩm phân cắt exon 8 của gen SMN2 và 1 vạch cao là sản phẩm không bị phân cắt exon 8 của gen SMN1; khi bệnh nhi có đột biến mất đoạn exon 8 của gen SMN1, trên hình ảnh điện di chỉ xuất hiện 2 vạch thấp 120bp và 70bp (sản phẩm phân cắt exon 8 gen SMN2) [56]

Hình 1.12 K ết quả điện di sản phẩm cắt bằng DraI (exon 7) và DdeI (exon 8) của bệnh

nhân SMA

(Ngu ồn: [2])

Tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện được mất đoạn đồng hợp tử gen SMN chứ

do đó cần phải dựa vào các phương pháp xác định số lượng bản sao khác

1.2 3 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescent insitu hybridization

-FISH)

(microdeletion), hoặc để khẳng định nguồn gốc của các loại chuyển đoạn đặc biệt

Hình 1.13 FISH phát hi ện thai nhi mắc hội chứng Patau (trisomy 13)

(Ngu ồn: [61])

1.2.4 Real - time PCR

Đây là kĩ thuật được sử dụng nhiều để xác định số lượng bản sao của gen do đó có thể

gen SMN1 để phát hiện người lành mang gen bệnh (chỉ có một bản sao của gen SMN1)

SMN2 [58]

1.2.5 Gi ải trình tự gen bằng máy tự động

Kĩ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động dựa trên nguyên tắc sử dụng các

OH được thay bằng H khiến chúng không còn khả năng hình thành các nối phosphodiester

và do đó khi ddNTP gắn vào mạch đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ bị gián đoạn Các ddNTP này còn được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang có màu khác nhau Như vậy

SMN thì phương pháp giải trình tự là lựa chọn tối ưu

1.3 L ược sử nghiên cứu của đề tài

1.3.1 Lược sử nghiên cứu trên thế giới

Năm 2006, Arkblad E.L và nhóm nghiên cứu của họ đã sử dụng phương pháp MLPA xác định được đột biến xóa một phần của gen SMN1 (exon 1-6) trong hai trường hợp bệnh nhân người Thụy Điển có phát hiện các dấu hiệu lâm sàng mà trước đó không được phát

Năm 2007 Chien - Hao Huang và nhóm nghiên cứu đã sử dụng kĩ thuật MLPA để phát

Trong chương trình nghiên cứu trên số lượng 107.611 phụ nữ mang thai từ 25 quận ở Đài Loan (thực hiện trong giai đoạn từ tháng một năm 2005 đến tháng 6 năm 2009) đã được xác định 2.262 người mang SMA (với một bản sao của gen SMN1) Tỉ lệ mang gen là

mang SMA Trong đó 47 cặp được xác định là có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh SMA Xét

truyền trước sinh, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội [51]

Năm 2010 Seoyoung Yoon, Chang Hoon Lee và Kyung - A Lee dùng phương pháp

gia đình mắc SMA Kết quả khảo nghiệm phát hiện được 2/100 người mang đột biến gen

gen này [59]

1.3.2 Lược sử nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 2004, Nguyễn Thị Hoàn, Trần Vân Khánh và cs đã có một nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán đột biến gene và mối tương quan giữa lâm sàng và kết quả phân

tích gen [39]

Năm 2007, một nghiên cứu tiếp theo của Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh cũng phối hợp với Trường Đại học Y Kobe - Nhật bản về xác định bản sao của gen SMN2 và gen NAIP để đánh giá mối tương quan với các thể lâm sàng Nghiên cứu này cho thấy hầu hết bệnh nhân SMA thể 1 chỉ mang 2 bản sao trong khi đó hầu hết bệnh nhân SMA thể 2, SMA thể 3 mang 3 - 4 bản sao của gen SMN2 và gen NAIP Kết quả này cho thấy đặc điểm di truyền phân tử của bệnh nhân SMA Việt Nam tương tự với bệnh nhân SMA của các chủng tộc khác trên thế giới

Những năm gần đây, nhóm nghiên cứu của Lê Thị Hương Lan, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh và các cs Bệnh viện Nhi Trung ương tiếp tục có một hợp tác nghiên cứu với Trường Đại học Y Kobe, Nhật Bản để đánh giá mức độ thương tổn gen trên bệnh nhân

định bệnh SMA bằng kỹ thuật PCR - RFLP, kết quả này là tiền đề hết sức quan trọng để tiến tới một nghiên cứu có quy mô, hoàn chỉnh hơn và đặc biệt là tiến tới xây dựng được quy trình chẩn đoán trước sinh và phát hiện người mang gen [55], [38]

Năm 2011, Lê Thị Hương Lan và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu trên người nhà bệnh nhân SMA để phát hiện người lành mang gen bằng kĩ thuật MLPA nhằm tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh Tuy nhiên chưa áp dụng phương pháp này để phát hiện bệnh nhân SMA và chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ có tiền sử gia đình mắc SMA [6], [7]

Tại Việt Nam, kĩ thuật MLPA vẫn đang trong giai đoạn bước đầu nghiên cứu ứng dụng tại các phòng thí nghiệm của các trường đại học và bệnh viện như: Trung tâm Y sinh học phân tử - Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Khoa di truyền và sinh học phân

C HƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Nhóm ch ứng: 30 người bình thường, không mắc bệnh SMA trong đó có 15 nam và

tiến hành phản ứng MLPA cùng với mẫu bệnh nhân

- Nhóm nghiên c ứu:

năng bú, ảnh hưởng tới cơ hô hấp: Tiếng khóc bé, thở nông )

+ Biến chứng cơ xương khớp: Cong vẹo cột sống, biến dạng lồng ngực, cứng khớp (2) Xác định kiểu gen dị hợp tử của bố mẹ bệnh nhân: 7 cặp vợ chồng là bố mẹ của

các bệnh nhân (đã được xác định có đột biến mất đoạn đồng hợp tử exon 7, 8 của gen

Điều kiện chọn lựa: Bố mẹ của bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu

Điều kiện chọn lựa: Gia đình của bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.2.1 Quá trình nghiên c ứu sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ sau

- Máy li tâm

- Máy luân nhiệt (Eppendorf Mastercycler): Dùng để lai các probe và khuếch đại các probe

2.2.2 Hóa ch ất

* Hóa ch ất để thu nhận mẫu

trong tube 2ml

* Hóa ch ất tách chiết DNA: Sử dụng bộ kit tách chiết QIAamp blood mini kit của

- QIAGEN Protease

- Reagents

- Tube 2ml

* Hóa ch ất thực hiện phản ứng MLPA: Sử dụng kit SALSA MLPA P021-A2 của Hà

Lan

- Dung dịch sample loading solution (hay formamide)

- Beckman D1-labeled CEQ size standard 600

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây d ựng quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được thực hiện như sơ đồ hình 2.1

Xác định đột biến mất đoạn exon 7, exon 8

c ủa gen SMN1 (kĩ thuật MLPA)

Xác định người mang gen

Hình 2.1 Sơ đồ xây dựng quy trình nghiên cứu 2.3.2 Quy trình l ấy mẫu

Quy trình được đảm bảo tuyệt đối vô trùng

2.3.3.Tách chi ết DNA từ bạch cầu máu ngoại vi và dịch ối

Sau khi thu nh ận mẫu ối cần xử lí như sau trước khi tách chiết DNA: Lấy 1 ml dịch ối

nước tinh khiết và tiến hành tách DNA dịch ối cũng như quy trình tách mẫu máu ngoại vi

* Nguyên t ắc: Tế bào máu ngoại vi hoặc tế bào dịch ối sẽ được giải bằng dung dịch AL

Hình 2.2 Quy trình tách chi ết DNA bằng QIAamp DNA blood mini kit

(Ngu ồn: QIAquick® Spin Handbook)

* Các bước:

Bước 1: Cho vào tube 1,5ml:

20µl QIAGEN protease (proteinase K)

200µl Buffer AL

C /10 phút

Quay ly tâm 8.000 vòng /1 phút

2.3.4 Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA

này đo nồng độ DNA dựa theo phương pháp đo mật độ quang (Optical Density - OD)

* Nguyên lý xác định nồng độ

Người ta có thể tính nồng độ các phân tử vật chất trong môi trường lỏng dựa vào mức

định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Nucleic acid có phổ hấp thụ cực đại ở ánh sáng tử

* Nguyên lý xác định độ tinh sạch

Thông thường, một dung dịch DNA có thể bị nhiễm tạp chất như phenol hay

2.3.5 S ử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở bệnh nhân SMA

2.3.5.1 Nguyên t ắc của kĩ thuật MLPA

đích đặc hiệu và vấn đề thiết kế các probe rất quan trọng

và đoạn dò ngược)

+ Đoạn dò xuôi gồm:

Đầu 5’: Chứa 19 nucleotide với trình tự giống nhau cho tất cả các đoạn dò, là vị trí

Đầu 3’: Chứa 21-30 nucleotide có trình tự đặc hiệu với đoạn DNA đích (gọi là trình

+ Đoạn dò ngược gồm 3 phần:

Đầu 3’: Gồm 36 nucleotide với trình tự giống nhau cho tất cả các probe, là vị trí gắn

Đầu 5’: Chứa 25 - 43 nucleotide, gắn đặc hiệu với DNA đích

370 nucleotide và được thiết kế dài ngắn khác nhau ở các đoạn dò tùy loại tác nhân đích

Hình 2.3 Nguyên t ắc của kĩ thuật MLPA

(Ngu ồn:[46])

Bi ến tính

PCR

Bi ến tính

PCR