nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ bacillus subtilis có trong natto nhật bản hướng tới thực phẩm chức năng

Các enzyme protease chiếm vị trí quan trọng do được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau: Chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, gia cầm, trong ngành công nghiệp dược

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Bùi Thị Nhung

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ

HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Bùi Thị Nhung

HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số : 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN HỮU PHÚC

Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu được trình bầy trong phần kết quả của luận văn này là do chính tôi thực hiện và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả luận văn

Bùi Thị Nhung

LỜI CẢM ƠN

Sau hai năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Sinh học Để đạt được thành quả như ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn:

 Toàn thể quý Thầy, Cô khoa sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp HCM đã truyền

đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong thời gian tôi theo học tại trường

 TS Nguyễn Hữu Phúc – giáo viên hướng dẫn của tôi, một người thầy nhưng cũng

rất gần gũi và luôn tận tâm đối với học trò của mình Người đã hết lòng hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong những lúc khó khăn Thầy đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này

 Sở Giáo Dục - Đào Tạo tỉnh Bình Dương, Trường THPT An Mỹ đã tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi trong thời gian đi học

 Ths Dương Nhật Linh và Ths Nguyễn Văn Minh (Đại Học Mở) đã nhiệt tình

giúp đỡ và hỗ trợ tôi làm thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài

 Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) và toàn thể các bạn học viên cao học khóa 22 đã luôn giúp đỡ, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

 Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ tôi, là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có được ngày hôm nay

Xin chân thành cảm ơn

Bùi Thị Nhung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6

MỞ ĐẦU 7

1 Lí do chọn đề tài 7

2 Mục tiêu nghiên cứu 8

3 Nội dung nghiên cứu 8

4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Khái quát chung về protease 10

1.1.1 Khái niệm và phân loại 10

1.1.2 Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease 13

1.1.3 Enzyme protease kiềm 19

1.1.4 Enzyme Nattokinase 26

1.2 Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn 30

1.2.1 Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn 30

1.2.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme 30

1.2.3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn 31

1.3 Đại cương về Bacillus subtilis 31

1.3.1 Lịch sử phát triển 31

1.3.2 Vị trí phân loại 32

1.3.3 Đặc điểm phân bố 32

1.3.4 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 32

1.4 Giới thiệu bệnh huyết khối 34

1.4.1 Khái niệm về huyết khối 34

1.4.2 Nguyên nhân hình thành huyết khối 34

1.4.3 Biến chứng của bệnh huyết khối 35

1.4.4 Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37

2.1 Vật liệu 37

2.1.1 Nguyên vật liệu 37

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 37

2.1.3 Hóa chất 37

2.2 Môi trường nghiên cứu 37

2.3 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát) 39

2.3.1 Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto 40

2.3.2 Phương pháp cấy truyền VSV 41

2.3.3 Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng 41

2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc 42

2.3.5 Phương pháp nhuộm Gram 42

2.3.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A Peskop 43

2.3.7 Phương pháp xác định khả năng sinh catalase 43

2.3.8 Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM 44

2.3.9 Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét 44

2.3.10 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử 44

2.3.11 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 45

2.3.12 Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân 46

2.3.13 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến 47

2.3.14 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 49

2.3.15 Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase 50

2.3.16 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease của chủng B subtilis N18 51

2.3.17 Phương pháp làm natto 54

2.3.18 Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men 55

2.3.19 Phương pháp tách chiết enzyme 56

2.3.20 Phương pháp thu nhận enzyme 56

2.3.21 Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol58 2.3.22 Phương pháp xử lí số liệu 58

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60

3.1 Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao 60

3.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản 60

3.1.2 Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao 61

3 2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi 66

3.2.1 Đặc điểm hình thái 66

3.2.2 Định danh đến chi theo hình thái 68

3.3 Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử 68

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease của chủng B subtilis N18 69

3.4.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành 69

3.4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường 71

3.4.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men 72

3.4.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu 73

3.4.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống 75

3.4.6 Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ 76

3.4.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease 77

3.4.8 Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm 78

3.5 Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase 82

3.5.1 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của Nhật Bản 82

3.5.2 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn 86

3.5.3 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis 91

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96

PHỤ LỤC 103

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm của quá trình thủy phân này có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn, nhiều enzyme protease còn

có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin Protease là các enzyme công nghiệp quan trọng hàng đầu, chiếm ít nhất một phần hai tổng sản lượng thị trường enzyme trên toàn thế giới (Rao et al.,1998) Các enzyme protease chiếm vị trí quan trọng do được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau: Chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, gia cầm, trong ngành công nghiệp dược phẩm, công nghiệp thuộc da, sản xuất các chất tẩy rửa, công nghiệp dệt và thu hồi bạc từ phim ảnh…

Vi sinh vật là nguồn quan trọng nhất trong sản xuất enzyme Trừ một số ít protease được sản xuất từ động vật, thực vật như trypsin, chymotrypsin, papain, bromelain, ficin, còn lại hầu hết đựợc sản xuất từ vi sinh vật [2], trong đó vi khuẩn là nguồn đóng góp chủ yếu, thứ đến là nấm mốc

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết do các bệnh tim mạch (nhồi máu cơ tim và đột quy), mà nguyên nhân là hậu quả của chứng huyết khối Theo ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỷ USD (Cong et al., 2009) [26] Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán đột quỵ có liên quan đến huyết khối Huyết khối xuất hiện khi sợi protein có tên là Fibrin tích lũy trong lòng mạch Huyết khối là nguyên nhân gây tắc nghẽn các dòng mạch máu tới nuôi mô và cơ tim Nếu dòng mạch máu bị chẹn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm hoặc không còn Điều này dẫn đến chứng đau thắt ngực và cơn đau tim Huyết khối trong các tâm thất của tim có thể di chuyển lên não gây tắc nghẽn các mạch máu não và gây ra các biến chứng như tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ

Các chất làm tiêu sợi fibrin đường tĩnh mạch như streptokinase, urokinase và hoạt hóa plasminogen mô ( t-PA ) đã được sử dụng điều trị làm tan huyết khối từ những năm 1960,

1970, 1980 Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học của các chất này tồn tại không lâu nên

có trường hợp huyết khối lại xuất hiện trở lại và nguy cơ biến chứng gây xuất huyết (Kumar A.,(2010) [40] Năm 1980 đã có một phát minh vô cùng lý thú đó là enzyme Nattokinase

(NK) NK là một enzyme hoạt huyết mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật Bản có tên là Natto Nó là một loại gia vị dân gian và là một phương thuốc cổ truyền chữa bệnh tim mạch Natto được sản xuất bằng lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis – một loại vi khuẩn có ích, khi ủ ấm với hạt đậu nành sản sinh ra enzyme NK Bác sỹ Hyroyuki Sumi là tác giả đầu tiên phát hiện Natto làm tan huyết khối năm 1980

Dựa trên nguồn gốc thực phẩm và hoạt tính làm tan huyết khối tương đối mạnh,

NK có lợi thế về y tế và thương mại hóa nhờ tác dụng phòng ngừa và hiệu quả kéo dài, uống thuận tiện và sự ổn định trong đường tiêu hóa (Sumi et al., 1990) NK tăng cường

hoạt hóa plasminogen và bất hoạt plasminogen activator inhibitor (Sumi et al, 1987, Urano et al 2001)[52] Các sản phẩm NK ngày nay đang được bán rộng rãi trên thế giới

và sử dụng như một thực phẩm chức năng, hầu như không có phản ứng phụ

Nguyên liệu để sản xuất NK chủ yếu là đậu nành, ngoài ra có thể sử dụng các sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến thực phẩm như cám mì, cám gạo, trấu, các loại vỏ đậu (đậu xanh, đậu đỏ ), vỏ tôm Công đoạn lên men có thể thực hiện bằng lên men bán rắn hoặc lên men chìm, nhiệt độ lên men từ 30-40oC. Ngoài các chủng Bacillus subtilis phân lập từ Natto, chúng ta có thể tìm kiếm ở Việt nam nhiều chủng Bacillus sp khác từ các sản

phẩm lên men truyền thống hoặc trong đất, nước của Việt nam Tất cả những điều kiện như vậy đều có thể đáp ứng ở Việt nam

Với những lý do như trên chúng tôi thực hiện đề tài :

“Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có trong Natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ Natto Nhật Bản và xác định một số điều kiện tạo

chế phẩm protease giàu nattokinase

3 Nội dung nghiên cứu

1) Phân lập các mẫu B.subtilis từ Natto của Nhật Bản

2) Chọn lọc khả năng sản xuất protease của một số mẫu phân lập

3) Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của mẫu chọn lọc

4) Phân loại đến loài hai mẫuh Bacillus đã chọn

5) Xác định một số điều kiện lên men sản xuất protease của chủng chọn lọc

6) Nghiên cứu một số đặc tính của protease đã tinh sạch sơ bộ

7) Đề xuất quy trình tạo chế phẩm protease giàu nattokinase dạng bột khô

4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013

- Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới

Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Đại Học Mở Tp HCM

C HƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về protease

1.1.1 Khái niệm và phân loại

1.1.1.1 Khái niệm protease

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm của quá trình thủy phân này

có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn Nhiều enzyme protease còn có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin Phản ứng theo sơ đồ sau:

1.1.1.2 Phân loại protease

1.1.1.2.1 Dựa vào cơ chế xúc tác

Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm [11]:

Nhóm 1: Exo-peptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch Thủy phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptide Nếu xúc tác ở đầu gốc carboxyl tự do thì gọi là enzyme carboxypeptidase Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase

Dựa trên cơ chất enzyme sử dụng thì protease được chia thành hai nhóm: protease và peptidase

Nhóm 2: Endo-peptidase còn gọi là protease hay enzyme phân cắt nội mạch Xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide bên trong chuỗi polipeptidase

Cả hai enzyme endo-peptidase và exo-peptidase kết hợp với nhau một cách hiệu quả trong việc thủy phân phân tử protein, có thể nói rằng chức năng chính của endo-peptidase là tạo một lượng lớn những peptid có đầu tận cùng là nhóm carboxyl tự do và nhóm amin tự

do để tạo điều kiện cho exo-peptidase hoạt động

Hình 1.1 Cơ chế xúc tác của enzyme protease 1.1.1.2.2 Dựa vào hoạt động của pH

Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme protease được chia thành 3 loại

- Loại 1: Protease acid: pHopt trong khoảng2 – 5 Nhóm enzyme này xúc tác cho sự thủy phân các peptid và protein ở vùng pH acid Ngoài ra chúng còn có khả năng thủy phân một

số đi – tri peptid do có sự hiện diện của enzyme carboxylpeptidase

Loại protease này thường được thu nhận từ các loại nấm sợi như: A niger, A

1.1.1.2.3 Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động

Đây là cách phân loại chi tiết nhất, cách phân loại này dựa trên đặc điểm cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme nên phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme đó

Theo cách phân loại này protease được chia thành 4 nhóm

- Còn được gọi là thinol protease hoặc sulfhydryl protease

- Đặc trưng cho nhóm này là papain, bromelin, ficin và một số protease từ vi sinh vật

- Trung tâm hoạt động bao gồm 2 acid amin là cysteine và histidine

- Hoạt động trong vùng pH rộng trong khoảng 4,5 – 10, tuy nhiên vùng pHopt là 6 – 7,5, phụ thuộc vào cơ chất

- Có khả năng bền với nhiệt độ từ 60 – 800C ở pH tự nhiên

- Nhóm enzyme này rất nhạy với các phản ứng oxy hóa, vì vậy người ta thường dùng chúng kèm theo tác nhân khử (ví dụ cystein), hoặc dùng các chất có cấu trúc không gian

phức tạp như EDTA

- Bị ức chế hoạt động bởi chất sulfhydryl

- Nhóm II: Aspartic protease (EC 3.4.23)

- Còn được gọi là acid protease

- Đại diện cho nhóm các enzyme như rennin, pepsin

- Aspartic protease có nguồn gốc từ VSV, được chia làm hai nhóm là pepsin-like và rennin-like Nhóm pepsin-like thu nhận từ Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Asp

awamon, Penicilium spp và Trametes sanguinea…Nhóm rennin- like thu nhận từ Asp.usami,

Mucor pusillus…

- Phân tử aspartic protease có hai nhóm carbocyl, 1 ở miền tiếp xúc và một ở tâm hoạt

động Tâm hoạt động gồm: 2 aspartic acid và 1 tyrosine

- pH hoạt động trong khoảng 2 – 4 và còn gọi là protease-acid, riêng cathepsin D có

pHopttrong khoảng 6 – 7, cắt liên kết k – casein làm đông tụ sữa với tính đặc hiệu rất cao

- Hoạt tính enzyme bi ức chế bởi peptatin

- Nhóm III: Metallo - protease (EC 3.4.24)

- Các enzyme nhóm này gồm exopeptidase, dipeptidase, amino peptidase, carboxylpeptidase A & B, prolidase và một số protease thu nhận từ VSV như Bac cereus,

Bac megaterium, Bac subtilis, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae

- Hầu hết protease đều chứa các ion kim loại trong phân tử enzyme Phần lớn chúng chứa 1 mol Zn2+ trên 1 mol protein, nhưng với prolidase và prolinase thì thay bằng 1 mol

Mn2+ Trong đó kim loại đóng vai trò chất nhận điện tử trong enzyme carboxylpeptidase A,

nó thiết lập liên kết với carboxyl trong liên kết peptid và sẽ phân tách liên kết này

- Hoạt động trong vùng pH 6 – 9

- Các tác nhân vô hoạt là các chất có cấu trúc không gian phức tạp như EDTA hay natri

dodecylsulfate

- Nhóm IV: Serine protease ( EC.3.4.21)

- Đại diện cho nhóm này là các enyme có nguồn gốc từ động vật như trypsin, chymotrypsin, plasmin và thrombin Một số khác được tổng hợp từ VSV mà đặc biệt là từ

VK và nấm mốc như B.cereus, B.firmus, B.subtilis, Asp.flavus, Asp oryzae

- Hai acid amin hình thành trung tâm hoạt động là serine và histidine

- Khoảng pHopt là 7 – 11

- Các tác nhân làm mất hoạt tính của enzyme thuộc nhóm này là đi – isopropyl phosphoroflouridate (DFP) hay phenylmethenesulphosphate ( PMSF), coumarin và một số

chất ức chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành, aprotinin, chymostatin

- Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực nhất là nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng của nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác

1.1 2 Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease

1.1.2.1 Cơ chế phản ứng của protease

Việc thủy phân protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng Hoạt động của chúng được chia ra làm 2 loại như sau:

- Thủy phân giới hạn: Enzyme thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các liên kết peptide có trong phân tử protein và tạo thành các peptid phân tử nhỏ

- Thủy phân không giới hạn: Protein bị thủy phân thành những acid amin

Dưới tác dụng của protease, liên kết peptide -CO-NH- sẽ bị thủy phân tạo thành sản phẩm là aminoacid và một ít peptide có phân tử nhỏ

Với 4 nhóm protease được chia theo đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt động sẽ có 4

cơ chế xúc tác khác nhau như sau:

Hình 1.2 Cơ chế xúc tác của

Serine - protease [62]

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của Cystein – protease[63]

* Cơ chế phản ứng của nhóm serine protease

Serine protease có chung nhóm phân loại (EC 3.4.21), là một trong số các enzyme được nghiên cứu khá rộng rãi Ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình tiêu hóa của động vật, serine protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ thể như làm tan huyết khối và hoạt hóa các bổ thể Trung tâm hoạt động của nhóm này có chứa amino acid aspartic, histidin và serine, trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế được trình bày trong hình 1.7

Hình 1.4 Cơ chế xúc tác của

Aspartic – protease[64]

Hình 1.5 Cơ chế xúc tác của Metallo – protease[65]

Hình 1.6 Các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease

Cơ chế theo hình 1.7 gồm 3 phản ứng:

- Phản ứng 1: Nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với

nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ diện (tetrahedral complex)

- Phản ứng 2: Ở trạng thái chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển điện tích

lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide đầu N và hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme mới

- Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại

và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease

1.1.2.2 Ứng dụng của enzyme protease[1][11][16]

Ngày nay việc khai thác và sử dụng enzyme đã phát triển thành một nghành công nghiệp với kỹ thuật hoàn chỉnh đã đem lại nguồn lợi không nhỏ

Người ta đã tìm ra trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ có 140 enzyme có thể thương mại được Năm 1997, thị trường về enzyme đã đạt 150 triệu USD

Trong đó các enzyme thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất, chiếm 59% lượng enzyme được ứng dụng Đặc biệt là enzyme protease kiềm được ứng dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn so với các loại enzyme khác

Ngoài ra protease còn được ứng dụng trong các lĩnh vực:

* Tro ng công nghiệp thịt

Có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt Ngoài papain có thể dùng chế phẩm protease của VSV thủy phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành phần của thịt Kết quả là chất lượng của các loại thịt được tăng cao

Để làm mềm thịt có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau:

- Ngâm thịt vào dung dịch có chứa hỗn hợp protease, giữ ở pH và nhiệt độ thích hợp Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến và thuận lợi hơn cả

- Tẩm bột làm mềm thịt (có chứa protease, muối, mì chính) trên bề mặt thịt

- Tiêm dung dịch enzyme vào mô thịt

- Tiêm enzyme vào máu động vật trước khi giết mổ

Thịt sau khi làm mềm có thể biến thành các thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao

* Trong công nghiệp sữa

Protease không những có khả năng phân giải protein mà còn có khả năng làm đông

tụ sữa Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó Tuy nhiên, tất cả các protease của VSV đều khác với rennin động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ được sữa mà còn có thể thủy phân sâu casein, do đó ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat

Trong sản xuất phomat người ta cố gắng tìm những chủng VSV tạo ra được protease

có tính chất giống rennin hoặc thay thế một phần rennin (25 – 50%) bằng protease của VSV

Ở Nhật, từ canh trường bề mặt Mucor, người ta có thể thu được chế phẩm protease dùng

trong sản xuất phomat Ở một số nước khác, người ta cũng thu được chế phẩm tương tự nấm

mốc Asp.candidus 11 hoặc từ Bacillus mesentericus

* Trong công nghiệp thuộc da

Trong công nghiệp thuộc da, protease của VSV cũng góp phần quan trọng trong hai quá trình: Làm mềm da và tách lông [60] Về mặt này, chế phẩm protease như là một phương tiện có hiệu quả để hoàn thiện kỹ thuật chế biến da

Protein là một phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Christner, 1996; Varela et al., 1997)

* Trong hương phẩm và mỹ phẩm

Protease sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt, kem đánh răng… Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết, làm cho da mịn Thuốc đánh răng có chứa protease có tác dụng chữa viêm lợi và diệt khuẩn Các loại xà phòng chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở áo quần, drap ở bênh viện… khá tốt

* Trong công nghiệp y dược

Trong công nghiệp y dược, các chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các MT dinh dưỡng hỗn hợp có proten dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các VSV khác

Ngoài ra người ta còn thường dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc tố để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch)

Chế phẩm protease thuần khiết được sử dụng trong y học để loại bỏ các tổ chức hoại

tử, hỗ trợ tiêu hóa, loại trừ cholesterol bám trên thành mạch máu và để chữa bệnh viêm tắc động mạch

Tác giả Phạm Thị Trân Châu đã kết hợp cùng với bệnh viện quân y 108 nghiên cứu

sử dụng chế phẩm protease có tên gọi Prozumabo để điều trị bỏng, kết quả cho thấy dả mạc rụng nhanh, vết thương nhanh khỏi [11]

* Trong kỹ nghệ phim ảnh

Protease vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu ảnh quang khác nhau như điện ảnh, giấy ảnh, phim rơnghen…Các protease sẽ phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý

* Ứng dụng protease để sản xuất các sản phẩm lên men giàu đạm

- Tương: Nguyên liệu trong sản xuất tương là gạo nếp, đậu tương Nấm mốc từ ngoài

không khí rơi vào xôi (được nấu lên từ gạo nếp) và phát triển thành phức hệ enzyme amylase – protease tham gia vào hai quá trình sinh hóa quan trọng là thủy phân protein của đậu nành thành các acid amin và thủy phân tinh bột thành đường Do vậy tương có vị ngọt của đường, vị đậm đà của chất đạm, vị mặn của muối ăn

- Nước mắm: Nước mắm là dịch thủy phân protein cá nhờ hệ enzyme protease của

hệ vi khuẩn có trong ruột cá, mang cá, trong đó chủ yếu là B.subtilis, B.mesentericus Nếu

để cá tự thủy phân trong quá trình ướp chượp, thời gian sản xuất sẽ kéo dài từ 6 tháng đến 1 năm Khi thêm nguồn protease từ động vật, thực vật hoặc VSV thì quy trình sẽ rút ngắn về thời gian Nếu dùng chế phẩm protease nấm mốc ở độ tinh khiết cao có thể giảm thời gian ướp chượp xuống chỉ còn 17 – 60 giờ với tỉ lệ enzyme : Cơ chất khoảng 10% Đây cũng là

cơ sở của việc sản xuất nước mắm ngắn ngày

- Chao: Là một sản phẩm làm từ đậu nành bằng phương pháp lên men VSV, hệ VSV

chủ yếu trong chao là nấm mốc Mucor: Actinomucor elegans, Mucor hiemalis, Mucor

silvaticus, mucor sultiliscimus, trong đó Actinomucor elegans là tốt nhất

- Nước chấm lên men: Nước chấm là tên chung chỉ các loại gia vị dạng lỏng chứa

chủ yếu là acid amin, muối ăn và hương vị đặc trưng Nước chấm được sản xuất từ các nguyên liệu giàu protein theo hai phương pháp hóa học và lên men vi sinh vật

Phương pháp lên men trong sản xuất nước chấm sử dụng phản ứng thủy phân protein nhờ xúc tác là enzyme protease từ vi sinh vật

* Trong chăn nuôi: Nhiều loại protease của vi nấm cũng có thể bổ sung vào khẩu phần ăn

trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nhằm tăng nhanh quá trình tiêu hóa thức ăn, tăng tốc độ tăng trọng của động vật, nhất là động vật non

1.1.3 Enzyme protease kiềm

Thế giới ngày nay người ta tập trung quan tâm vào các sản phẩm thân thiện môi trường và đầu ra của sản phẩm Nhiều quá trình hóa học đang được thay thế bằng quá trình thực hiện bằng enzyme Protease kiềm là một trong những nhóm quan trọng nhất của enzyme vi sinh do được sử dụng có hiệu quả trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia súc, công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa học Các protease kiềm quan trọng cho

công nghiệp từ nguồn vi khuẩn đã được nghiên cứu rộng rãi, trong đó Bacillus sp được công

bố nhiều Hầu hết các protease kiềm quan trọng trong công nghiệp chịu được nhiệt độ cao 50-70oC (Bảng 1.1 và Hình 1.8)

Bảng 1.1 Thị trường enzyme toàn cầu dựa trên cơ sở các lĩnh vực ứng dụng (triệu USD)

Lĩnh vực

ứng dụng 2005 2006 2007 2012

Tăng trưởng % 2007-2012

Kỹ thuật 1075 1105 1140 1355 3

Thực phẩm 775 800 830 1010 4

Tổng cộng 2090 2165 2250 2740 4

Protease kiềm, 25%

Các protease khác, 21%

Trypsin, 3%

rennins, 10%

Amylase, 18%

Carbohydratase khác, 10%

Lipase, 3%

ezyme phân tích và y học, 10%

Hình 1.7 Thị trường của các enzyme trên thế giới (Rao el al., 1998)[47]

1.1.3.1 Nguồn thu nhận protease kiềm

Protease kiềm được thu nhận từ các nguồn VSV khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi và một số ít nấm men

Trong tất cả các nguồn vi sinh thu nhận protease kiềm thì vi khuẩn là nguồn đặc biệt quan trọng do được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt, công nghiệp da, thực phẩm và thức ăn gia súc…

Nguồn lớn nhất protease kiềm vi khuẩn là từ các loài Bacillus Một số loài nấm được

biết có sản xuất protease kiềm và được sử dụng trong công nghiệp thuộc các loài thuộc chi

Aspergillus Chỉ có một vài nghiên cứu về nấm men sản xuất protease kiềm Protease kiềm

được sản xuất từ nấm men như Aureobasidium pullutans, Yarrowia lipolytica, Issatchenkia

orientalis và Criptococcus aureus có pH tối ưu 9-10 và nhiệt độ tối ưu 45-50oC, đã có công

bố về sản xuất một số peptid có hoạt tính sinh học mạnh

Hiện tại các protease kiềm từ nấm ăn đã được nghiên cứu và công bố Bảng 1.2 liệt

kê các vi sinh vật sản xuất protease kiềm

Bảng 1.2 Các protease kiềm từ vi sinh vật (V.K.Nigam et al., 2012)[51]

Vi sinh vật Ứng dụng Tài liệu

Pseudomonas aerugenosa Dùng trong điều trị thay Najafi et al., 2005

PD 100 collagen, xử l í chất thải, tẩy

vết máu và tẩy lông

Bacillus pumilus Cbs Thuốc tẩy, tẩy lông Jaouadi et al.,2011

Streptomyces sp Ab1 Tẩy lông, thủy phân lông vũ Jaouadi et al.,2011

Bacillus subtilis PE-11 Thuốc tẩy Adinarayana et al.,2003

Bacillus sp.SSBi Công nghiệp chất tẩy rửa Singh et al.,2005

Bacillus licheniformis RP1 Trích ly chitin, thủy phân

lông vũ, tẩy lông Hadda et al., 2011 et al.,

Vi sinh vật Ứng dụng Tài liệu

Bacillus coagulans

Bacillus licheniformis Lĩnh vực công nghiệp Asokan et al al.,2010

Bacillus clausii Lĩnh vực công nghiệp Vadlamani et al.,2011

Bacillus cereus Chất tẩy rửa , tẩy vết máu Abou- elela et al., 2011

Bacillus sp.K-30 Loại bỏ protein trong cám

gạo, chất tẩy rửa Naidu et al.,2005

Bacillus cereus 1173900 Tẩy lông Ravindran et al.,2011

Bacillus subtilis Loại bỏ lông trong công

nghiệp thuộc da Mukhtar and Haq et al., 2008

Pseudomonas fluorescens Chất tẩy rửa, công nghiệp dệt Sunitha et al.,2009 Kalaiarasi and

Microbacterium AR-68 Chất tẩy rửa, công nghiệp

thuộc da Gessesse et al.,1997

Stenotrophomonas

maltophila MTCC 7528

Chất tẩy rửa cho vào khi giặt với nước lạnh, bảo vệ môi trường vùng lạnh

Kuddus et al.,2011

Shewanella oneidensis

MR-1 Lĩnh vực công nghiệp Anbu et al.,2009

Streptomyces

orantiograceus EGS-5 Công nghiệp nhiệt độ cao Ahmad, 2011

Aspergillus oryzae (kỹ

thuật di truyền) U 1521 Công nghiệp thực phẩm và thức ăn động vật Samarntar et al.,1999

Aspergillus Aspergillus terreus Công nghiệp da và thực phẩm Chellapandi, 2011

Aspergillus aidulans

Ha-10

Công nghiệp thực phẩm, công nghiệp y dược và công Charles et al.,2008

Aspergillus flavus Công nghiệp chất tẩy rửa,

tổng hợp peptid Yadav et al., 2011

1.1.3.3 Sản xuất protease kiềm

Để có thể sử dụng enzyme protease kiềm trong công nghiệp, đòi hỏi phải sản xuất công nghiệp Hiện tại phương pháp lên men bán rắn và phương pháp lên men chìm đều được sử dụng

Các thành phần môi trường đặc biệt là nguồn carbon và nitơ cũng như các thông số lên men như nhiệt độ, pH, chế độ oxy hòa tan, chế độ đảo trộn trong lên men bán rắn và chế

độ khuấy trộn trong lên men chìm là những yếu tố có ảnh hưởng rất quan trọng đến năng suất lên men (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Thông số hóa l í sản xuất protease kiềm (V.K.Nigam et al., 2012)[51]

Vi sinh Nguồn

carbon Nguồn nitơ pH Nhiệt độ

( 0 C)

Tốc độc lắc, khuấy (rpm)

Tài liệu

B.licheniformi

Bột đậu nành tách

Nadeem et al., 2008

Bacillus

subtilis CR

179

Tinh bột, maltose

Cao ngô 8 45 150 Akhavan et

tách dầu 10,5 37 200 Banerjee et al., 1999

Pseudomonas

Kalaiarasi et al.,2009

Streptomyces

al.,2009 Mỗi chủng VSV sản xuất protease kiềm đều đòi hỏi những điều kiện khác nhau, một

số chủng vi sinh đòi hỏi phải có các ion kim loại dưới dạng các muối cho vào môi trường

Vì chi phí giá cả của môi trường lên men liên quan đến giá thành sản phẩm, đồng thời theo xu hướng sản xuất sạch hơn, một số chất thải trong nông nghiệp có thể được sử dụng có hiệu quả trong công nghiệp sản xuất protease kiềm như cám gạo, cám lúa mì, trấu lúa, vỏ đậu các loại.v.v Hầu hết các vi sinh vật sản xuất protease kiềm ở pH 8-9 và nhiệt độ

32 - 45oC

Để đạt được năng suất tối đa và sử dụng tiết kiệm các nguồn nguyên liệu, vật tư, năng lượng, các nhà nghiên cứu đã liên tục nghiên cứu tối ưu các điều kiện sản xuất Theo truyền thống các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu từng biến số theo thời gian, mỗi biến số cho một tối ưu độc lập Điều này tốn rất nhiều thời gian, chi phí tốn kém và không phản ảnh đúng giá trị tối ưu khi có một số lượng lớn các biến số tham gia và can thiệp bởi sự tương tác giữa chúng

Gần đây một số phương pháp thống kê như phương pháp Taguchi, thiết kế Placket- Burman và phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) cho kết quả tối ưu hóa nhanh hơn, giúp ta hiểu biết tốt hơn sự tương tác giữa các biến số (bảng 1.4)

Bảng 1.4 Các phương pháp thống kê tối ưu hóa sản xuất protease kiềm

độ khuấy

1,72 lần Bhuniaa et al.,

2012 Phương pháp

Plackett-Burman

Bacillus subtilis

DKMNR

Nguồn carbon, nitơ 4,4 lần Kezia et al., 2011 Plackett-

Burman và

Bacillus subtilis C4

Thành phần môi trường, và tốc độ 2,2 lần

Romsomsa et al.,

2010

RSM khuấy

subtilis HB04

Thành phần môi trường nhiệt độ

Thành phần môi trường, pH và nhiệt độ

2 lần Reddy et al.,

2008 Phương pháp

Thành phần môi trường, và tốc độ khuấy

4 lần Oskouie et al.,

2007 Phương pháp

Box –Beehnken

Aspergillus oryzae

Nguồn carbon, nitơ, nhiệt độ,pH 3 lần Babu et al., 2007

1.1.3.4 Đặc tính protease kiềm

Protease kiềm từ các nguồn vi sinh khác nhau được xác định các đặc tính để sử dụng

trong các mục đích cụ thể, thí dụ protease kiềm với pH hoạt động rộng, ổn định ở nhiệt độ cao được ứng dụng trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp da Các protease

kiềm phân lập từ Pseudomonas aerugenosa hoạt động ở pH 6 - 11, nhiệt độ 25 – 650

C, các nghiên cứu thấy rằng enzyme tinh khiết giữ được hoạt tính của nó trong các chất hoạt động

bề mặt và các chất tẩy rửa trắng Với các đặc tính này có thể sử dụng trong công nghiệp tẩy rửa

1.1.3.5 Cố định enzyme protease kiềm

Mặc dù việc sử dụng phương pháp enzyme có nhiều lợi điểm, nhưng bên cạnh đó vẫn còn có giới hạn, do giá chi phí cho enzyme cao và thiếu ổn định

Để khắc phục khó khăn đó, kỹ thuật cố định enzyme đã phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây Nhiều chất mang như agar, gelatin, calcium alginate, polyacrylamide, carageenan, mùn cưa, perlit đã được sử dụng như những chất mang để cố định các enzyme

protease, nhờ vậy chi phí cho việc sử dụng enzyme đã được giảm do có thể sử dụng được nhiều lần, ngoài ra nhiều đặc tính enzyme được cải thiện tốt hơn (bảng 1.5)

Bảng 1.5 Các protease kiềm cố định bằng các vật liệu khác nhau

Tăng hoạt tính Kumar et al., 2010

Bacillus

subtilis

PE-11

Calcium alginate, k-carageenan, polyacylamide

Tăng hoạt tính, sử dụng kéo dài, tái sử dụng

Adinarayana et al.,2005

Bacillus

circulans

Agar, calcium alginate, Tăng hoạt tính Kocher et al.,2009

Bacillus

subtilis K30

Calcium alginate polyacylamide, agar, gelatin

Tăng hoạt tính, sử dụng kéo dài, tái sử dụng

Naidu et al.,2011

Bacillus

licheniformis

Calcium alginate, k-carageenan, agar Tăng hoạt tính Admed et al.,2010

B pumlus

Calcium alginate polyacylamide, aga

Tăng hoạt tính Kumari et al., 2009

al.,2011

Myceliophtho

ra sp

Hạt calcium alginate

Tăng nhiệt độ tối ưu, nhiệt độ ổn định, tái sử dụng trên 7 lần

Zanpholin et al.,2010

Tăng giá trị Km, pH tối ưu, tăng tính ổn định trong môi trường acid, kiềm

Sharma et al.,2006

licheniformhs dụng, ổn định với EDTA

1.1.4 Enzyme Nattokinase

1.1.4.1 Công dụng của nattokinase

NK làm tan huyết khối bằng cách phân cắt các liên kết chéo của sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành huyết khối) Nattokinase rất hữu dụng trong việc tiêu hủy huyết khối nội sinh ở người vì hoạt tính cao được duy trì ở nội mạc trong thời gian dài bằng liều uống Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng làm tăng nguy cơ hình thành huyết khối NK cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể

bằng cách chuyển plasminogen thành plasmin (Kim et al.2008)[39]

Nattokinase làm giảm huyết áp bằng cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE) ACE khiến mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao Nattokinase có khả năng ức chế ACE, ngăn cản dày nội mạc mạch [38][41]

Tăng cường lưu thông máu: Nattokinase trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ bù trừ trong tuần hoàn Nó cũng được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch

(Sumi H Healthy Mirobe “Bacillius Natto” – Japan Bio Science Laboratory)

tự như enzyme này Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết khối thông thường khác như Urokinase, Streptokinase và tissue Plasminogen Activator (t-PA)

Nó là một hoạt chất thiên nhiên làm tan huyết khối hữu hiệu, không gây dị ứng và có độ an toàn cao Một số nghiên cứu chứng minh rằng Nattokinase là một serine protease thuộc họ subtilisin, có trọng lượng phân tử 28kDa [35]

Huyết khối làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và bệnh trĩ NK hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích tuyệt vời cho những người bệnh này

1.1.4.2 Cơ chế tác dụng của Nattokinase trên huyết khối

Huyết khối được hình thành khi các sợi fibrin tích lũy trong mạch máu Huyết khối trong các mạch máu có thể di chuyển lên não làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não

gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: Tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ

Theo hình 1.9 thì Nattokinase tiêu hủy fibrin theo 3 cách[54][56][57][60]:

- Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu và giải tỏa những khu vực mà dòng máu lưu thông bị cản trở

- Bằng cách kích thích cơ thể tăng cường sản xuất plasmin từ Urokinase, Nattokinase không những giúp làm tan huyết khối đã hình thành mà còn hoạt động như một thành phần chống hình thành huyết khối

- Nattokinase giúp tăng cường t-PA để sản sinh plasmin Đây là enzyme nội sinh tiêu hủy fibrin tự nhiên trong cơ thể

Hình 1.8 Hiệu ứng của Nattokinase lên fibrin 1.1.4.3 Các công trình nghiên cứu Nattokinase ở Việt Nam và trên thế giới

Natto với nghĩa là “Đậu nành lên men” ngày nay, đã xuất hiện ở Nhật vào năm

1068

Năm 1894, nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông về sự lên men của Natto, ghi lại rằng “Natto - một loại phomat thực vật”

Vào năm 1905, TS Shin Sawamura (Đại học Tokyo) đã thành công trong việc tách 2 loại vi khuẩn Natto từ đậu nành nấu chín, trong đó vi khuẩn gây ra mùi hương đặc biệt làm

hạt đậu lên men (Bacillus subtilis Natto) cũng như vi khuẩn tạo chất nhờn rất dẻo dai (Bacillus mesentericus) tạo vị ngọt

Trong những năm 1920, các nhà nghiên cứu đã tìm ra cách sản xuất Natto từ môi

trường có chứa B subtilis Natto thay vì lên men đậu nành

Sumi et al.,(1987)[52] TS Hiroyuki Sumi đã nghiên cứu các enzyme thủy phân huyết khối, tìm kiếm các loại thực phẩm tự nhiên có khả nằng hòa tan huyết khối - nguyên nhân gây bệnh đột quỵ và bệnh nhồi máu cơ tim Năm 1980, Sumi phát hiện Nattokinase khi ông làm việc như nhà nghiên cứu chuyên về hóa l í ở Đại học Y khoa Chicago Sau khi thử trên 173 loại thực phẩm tự nhiên về khả năng thủy phân huyết khối Sumi phát hiện thấy khi nhỏ Natto vào huyết khối nhân tạo (fibrin) trong đĩa petri và để ở 37oC (nhiệt độ cơ thể) thì Natto hòa tan dần dần và hòa tan hoàn toàn huyết khối trong vòng 18 giờ Sumi đặt tên cho enzyme mới này là “Nattokinase” có nghĩa enzyme trong Natto

Sumi et al.,(1990)[53] đã tiến hành thử nghiệm trên chó bằng cách cho ăn chế phẩm Nattokinase, kết quả thử nghiệm thấy rằng Nattokinase dùng như loại thuốc để xử l í bệnh tắc nghẽn mạch máu, đồng thời cũng sử dụng để phòng ngừa vì Nattokinase rất an toàn nên

có thể sản xuất lớn

Sumi et al.,.(1995) [54] tiếp tục thử nghiệm ảnh hưởng Nattokinase trên chó, tác giả

đã gây ra huyết khối ở các con chó đực, sau đó cho mỗi con 4 viên thuốc con nhộng chứa Nattokinase (250mg/viên) hoặc 4 viên giả dược cho mỗi con chó Kết quả đo tia X mạch máu thấy rằng những con chó uống Nattokinase tuần hoàn máu trở lại bình thường (không

có huyết khối) sau 5 giờ uống thuốc Các huyết khối ở các con chó uống giả dược vẫn không có dấu hiệu thay đổi sau 18 giờ thử nghiệm Các nhà nghiên cứu phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và của JCR Pharmaceutical Co ở Kobe, Nhật Bản đã thử khả năng tan huyết khối ở động mạch cảnh của chuột Kết quả cho thấy các con chuột sử dụng Nattokinase đạt 72% lưu lượng máu, trong khi ở chuột uống plasmin chỉ đạt 15,8% lưu lượng máu

Một thí nghiệm khác giữa JCR Pharmaceutical, Đại học bang Oklahoma, (Mỹ) và Trường Đại học y Miyazaki phối hợp thử nghiệm trên cơ thể người (in vivo) Thí nghiệm tiến hành trên 12 người Nhật tình nguyện (6 nam và 6 nữ) tuổi từ 21- 55 Họ cho các tình nguyên viên mỗi người 200g Natto (không phải loại thực phẩm) trước bữa ăn, sau đó kiểm tra khả năng thủy phân fibrin trong huyết thanh Các kiểm tra thấy Natto có hoạt tính cao làm tan huyết khối Kết quả đã giảm 48% trong vòng 2 giờ thử nghiệm và giữ khả năng làm tan huyết khối 2-8 giờ Ở đối chứng, các nhà nghiên cứu sau đó cho các tình nguyện viên ăn một lượng tương đương đậu nành luộc chín và kiểm tra hoạt tính hòa tan fibrin Kết quả cho thấy không có thay đổi có ý nghĩa

Okamoto Akiko et al., (1995) [45] đã xác định khả năng ức chế enzyme biến đổi

Angiotensin I thành Angiotensin II của 11 loại lên men khác nhau như nước mắm, cơm rượu, rượu Sake, nước tương, dấm ăn, phomat, Miso, Temphe, và Natto… Các sản phẩm

có hoạt tính ức chế Angiotensin (ACE) mạnh là nước tương, nước mắm, Natto và phomat Các sản phẩm không ức chế ACE là cơm rượu, rượu sake và dấm ăn

Xie et al., (1999) [58] đã trích ly Nattokinase từ Natto - loại thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản và thấy có hoạt tính thủy phân mạnh fibrin Họ cũng đã phân lập chủng vi khuẩn từ Natto và xác định điều kiện sinh Nattokinase trong môi trường dịch thể

có pH 7, nguồn carbon là xylose 2%, nguồn nitơ là protein đậu nành 3%, giống 2% trong 24 giờ, lên men trong bình tam giác 100ml chứa 10 ml môi trường Với điều kiện như vậy hoạt tính Nattokinase đạt được 78.71 đơn vị/ml

Ruei - Lin Hsu et al., (2009) [48] đã nghiên cứu protein có dạng amyloid in vivo có

liên quan đến nhiều bệnh như bệnh Alzhemer, bệnh bò điên (prion) Tác giả thấy rằng Nattokinase có khả năng phân giải amyloid Các serine protease như Subtilisin có khả năng phân giải amyloid, khả năng này cũng thấy có ở Protease K, Subtilisin Carlsberg nhưng không thấy có ở Trypsin và Plasmin

Yeon Kyoung Kim et al.,(2011)[61] đã tiến hành thử nghiệm trên chuột được ăn khẩu phần cao cholesterol (0,5% cholesterol + 0,5% acid cholic) để tạo huyết áp cao tự phát, sau 11 tuần thí nghiệm, các dấu hiệu sinh học đã được theo dõi như huyết áp tâm thu, hoạt tính rennin, angiotensin II trong thận, trong huyết tương, hoạt tính thủy phân fibrin Kết quả cho thấy huyết áp tâm thu giảm đáng kể ở lô thử nghiệm so với đối chứng Hoạt tính rennin trong huyết tương, trong thận giảm mạnh khi có dịch chiết Natto Hoạt tính angiotensin II trong thận giảm rõ rệt trong khi trong huyết tương bằng nhau ở đối chứng và thử nghiệm

Từ các kết quả trên các tác giả cho rằng cơ chế giảm huyết áp liên quan đến hệ rennin angiotensin và hoạt tính thủy phân fibrin

Jiun –Min Wang et al.,(2012) [37] đã đánh giá ảnh hưởng bảo vệ thần kinh trung ương của Nattokinase gây ra do thiếu máu cục bộ ở chuột Nattokinase đã làm giảm mức độ nhồi máu so với đối chứng Tuy nhiên vai trò bảo vệ hệ thần kinh trung ương của Nattokinase thì còn chưa rõ, vì vậy cần nghiên cứu tiếp cơ chế bảo vệ hệ thần kinh của Nattokinase

Lê thị Bích Phượng vctv., (2012) đã chọn lọc được hai chủng Bacillus 7.2 và Bacillus

NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enyme (nattokinase) làm tan huyết khối [12]

Qua các công trình nghiên cứu có thể chứng minh rằng, NK có tiềm năng làm tan huyết khối mạnh mẽ

1.2 Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn

1.2 1 Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn

Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn là một quá trình trong đó sự sinh trưởng của VSV và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề mặt của nguyên liệu gần như không có mặt của nước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp phụ trong mạng chất rắn Hoạt động sống của VSV diễn ra chủ yếu trên bề mặt rắn Sự trao đổi nhiệt và khí hầu như là trực tiếp giữa pha rắn hay pha khí không qua chất lỏng trung gian Các phản ứng sinh học và sự chuyển hóa thực hiện trực tiếp giữa tế bào VSV và cơ chất tại nơi tiếp xúc

Lên men trên môi trường bán rắn đã được sử dụng từ nhiều năm qua Ngày

nay, lên men bán rắn đang được quan tâm trở lại một cách mạnh mẽ và được sử dụng rộng rãi nhằm gia tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, các phế

liệu nông nghiệp và chất thải công nghiệp [21]

1.2 2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme

Lên men bán rắn có những ưu điểm vượt trội so với lên men trong môi trường lỏng

Đó là việc không cần khuấy đảo hay thông khí, đặc biệt là thành phần môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền Chẳng hạn, các cơ chất dùng trong lên men bán rắn thường là các phế liệu của ngành nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm, tất cả đều là cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất enzyme ở quy mô lớn

Những ưu điểm khác so với lên men trong môi trường lỏng là nồng độ cơ chất cao hơn, ít bị nhiễm tạp, giảm năng lượng và lượng nước sản xuất đầu vào, lên men bán rắn không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi, chỉ cần

giữ ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp Do đó, việc vận hành cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa ít tốn kém Sau quá trình nuôi cấy, canh trường nuôi cấy bề mặt dễ dàng sấy khô và ít

bị tổn hao hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme Lượng enzyme được tạo ra từ lên men bán rắn thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy lỏng Đây là đặc điểm rất quan trọng để giải thích tại sao phương pháp lên men bán rắn đang phát triển trở lại một cách mạnh mẽ [21][15]

Mặc dù lên men bán rắn đang hấp dẫn nhưng việc ứng dụng vẫn còn mặt hạn chế

Thực tế, không thể kiểm soát hay điều chỉnh môi trường một cách chính xác theo ý muốn

và cũng vì vậy không thể áp dụng có hiệu quả các phương pháp tối ưu hóa như đối với lên men lỏng Ngoài ra, lượng cơ chất thừa gây khó khăn cho việc thu nhận sản phẩm tinh sạch,

do đó khả năng ứng dụng còn bị hạn chế Tuy nhiên, nếu xét toàn diện thì lên men bán rắn

có lẽ là công cụ khá hữu hiệu để tạo ra các sản phẩm, cụ thể là trong tổng hợp enzyme công nghiệp Ngoài ra, lên men bán rắn còn được dùng trong xử lý môi trường và nhiều lĩnh vực khác

1.2 3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn

Quá trình lên men có thể chia thành 2 pha:

* Pha thứ 1- pha sinh trưởng:

Các tế bào VSV còn non, sinh trưởng nhanh và tăng sinh khối - là quá trình sinh tổng hợp protein và xây dựng tế bào Môi trường nuôi cấy trong pha này giàu nguồn carbon, nitơ, phosphor Sản phẩm trao đổi chất của VSV ở thời kì này không có hoặc bắt đầu tích tụ với một lượng rất nhỏ và dần dần tăng lên đồng thời với sự phát triển của giống đến khi ổn định thì chuyển sang pha thứ 2

* Pha thứ 2 – pha tích tụ sản phẩm trao đổi chất:

Ở giai đoạn này, các tế bào VSV đã trưởng thành, sự phát triển sinh khối chậm lại hoặc ngừng hẳn, các sản phẩm trao đổi chất tích tụ chủ yếu trong pha này Trong môi trường nuôi cấy, các nguồn carbon, nitơ, phosphor còn rất ít hoặc cạn gần hết Thời kì đầu của pha này, tế bào VSV có khả năng tổng hợp cao, tích tụ nhiều sản phẩm trong môi trường Ở cuối pha, lượng sinh khối bắt đầu giảm đi do tế bào bắt đầu tự phân và quá trình tích tụ bị chậm lại, đồng thời một số sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng cho VSV Trong thực tế sản xuất, quá trình lên men thường được kết thúc trước điểm cuối pha thứ 2

để tránh tình trạng tự phân sẽ làm tăng độ nhớt gây khó khăn cho việc tách lọc [21]

1.3 Đại cương về Bacillus subtilis

1.3 1 Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chứa y học Nazi của Đức Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc sử dụng để phòng trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 – 1957

khi Henry, Albot và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó,

“subtilistherapie” có nghĩa là thuốc Subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa

Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong

Loài: Bacillus subtilis

Hình 1.9 Trực khuẩn Bacillus subtilis

1.3 3 Đặc điểm phân bố

B.subtilis có thể được phân lập từ nhiều loại môi trường khác nhau, đặc biệt chúng có nhiều trong rơm, cỏ Mức độ thích nghi cao của chúng là do khả năng hình thành nội bào tử

và tái tổ hợp DNA bộ gen với DNA lạ B.subtilis có khả năng kháng lại các điều kiện khắc

nghiệt của môi trường về pH, áp suất thẩm thấu, oxy và nhiệt độ

B.subtilis cũng được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật ăn thực vật,

nó đóng vai trò là một probiotic giúp duy trì hoặc khôi phục lại hệ vi khuẩn có lợi trong cơ thể

Vi khuẩn Bacillus subtilis thường có trong những môi trường thiếu hụt dinh dưỡng,

được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: Cỏ khô, bụi, đất, nước…Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu cfu/g Đất nghèo dinh

dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis [11]

1.3.4 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

1.3.4 1 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ 3 – 5 x 0,6

µm, tế bào thường nối với nhau thành chuỗi hoặc đứng riêng rẽ, có khả năng di động, gồm 8 – 12 lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,8 – 1,8 µm Vị trí của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể

lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm Bacillus subtilis là loài sinh vật tự dưỡng,

hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử Bacillus

subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành

phần và có thêm một số thành phần mới Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do

sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…

1.3.4.2 Đặc điểm sinh hóa

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxi, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 370C, pH 7 – 7,4, tối ưu ở pH 7,2 Vi khuẩn lên men không sinh khí các loại đường: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose và một số hoạt tính khác được liệt kê trong Bảng 1.6

Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động

của hemolysine Hệ enzyme Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease,

amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các nghành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase…

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L của acid glutamic Sản xuất kháng sinh subtilin va bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram

dương và Gram âm Tuy nhiên, đa số các chủng Bacillus subtilis không gây bệnh

Bảng 1.6 Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis

Di động + Phân giải tinh bột +

1.4 Giới thiệu bệnh huyết khối

1.4 1 Khái niệm về huyết khối

Bình thường, trong cơ thể, máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái thể dịch nhờ

sự cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá và ức chế đông máu Khi xảy ra tổn thương mạch máu, các yếu tố đông máu sẽ cùng với nội mạc mạch máu và tiểu cầu phối hợp xảy ra một loạt các phản ứng để tạo nút cầm máu tại vị trí tổn thương Tình trạng tăng đông máu xảy ra khi mất cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá và ức chế đông máu do tăng hoạt hoá đông máu hoặc

do giảm ức chế đông máu, tiêu sợi huyết dẫn đến huyết khối lan rộng quá giới hạn cần thiết, gây tắc nghẽn Huyết khối có thể được định nghĩa là một quá trình bệnh lý do một sự phát động và lan rộng bất hợp lý của phản ứng cầm máu của cơ thể dẫn đến hình thành huyết khối trong lòng mạch máu Tuỳ theo kích thước của huyết khối, đường kính mạch máu mà huyết khối có thể gây tắc mạch hoàn toàn hay bán tắc, nghẽn mạch….[20]

1.4 2 Nguyên nhân hình thành huyết khối

Huyết khối được tạo thành do 3 nguyên nhân:

- Tổn thương mạch máu: Khi mạch máu bị tổn thương do áp lực máu cao, những thứ

có trong mạch máu như cholesterol, tiểu cầu đến tích tụ ở những nơi bị tổn thương khiến mạch máu trở nên cứng và dày lên, lòng mạch máu dần dần hẹp lại

- Xơ vữa động mạch (XVĐM): Chất béo tích tụ trong thành của các động mạch tạo

thành các mảng XVĐM Mảng XVĐM có thể ngày càng to dần gây hẹp lòng của động mạch Đôi khi mảng XVĐM bị vỡ ra làm cho máu tiếp xúc với lõi chất béo bên trong mảng Khi đó các tế bào tiểu cầu và hệ thống đông máu bị hoạt hóa dẫn đến hình thành huyết khối gây tắc động mạch

- Giảm sản sinh, giảm hoạt tính Plasmin: Plasmin là enzym duy nhất trong cơ thể có

khả năng làm tan huyết khối Khi giảm sản sinh và giảm hoạt tính plasmin, huyết khối sẽ dễ dàng hình thành và không bị loại bỏ [20]

1.4 3 Biến chứng của bệnh huyết khối

Huyết khối xuất hiện khi dải protein có tên là fibrin tích lũy trong lòng mạch Ở tim, huyết khối là nguyên nhân gây tắc các dòng mạch máu tới nuôi mô và cơ tim Nếu dòng máu bị chặn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm hoặc không còn Điều này dẫn đến chứng đau thắt ngực và cơn đau tim Huyết khối trong các tâm thất của tim có thể di chuyển lên não Trong não, huyết khối có thể gây tắc nghẽn các mạch máu lên não và gây ra các biến chứng: Tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ Một số biến chứng thường gặp do ảnh hưởng của huyết khối:

Bệnh động mạch vành: Bệnh này ảnh hưởng đến các mạch máu cung cấp máu cho

cơ tim Nếu động mạch bị nghẽn và dòng máu đưa vào tim bị hạn chế, có thể gây ra cơn đau tim đột qụy, bệnh động mạch vành cũng có thể gây ra cơn đau ngực Đột quỵ: Đột quỵ khi động mạch mang máu và oxy đến tim bị chặn lại, không có oxy, phần cơ này của tim không hoạt động và sẽ có cảm giác đau ở ngực Trong giai đoạn cấp, bệnh nhân yếu đột ngột hoặc liệt hẳn một nửa bên người kèm với yếu hoặc liệt nửa mặt cùng bên Người bệnh

có thể có những triệu chứng khác như: Nói khó, nuốt khó, rối loạn thị giác, mất thăng bằng Nặng hơn là rối loạn tri giác, lơ mơ hoặc hôn mê, thậm chí có thể ngưng thở và tử vong rất nhanh

Suy tim: Tim khoẻ mạnh sẽ bơm máu đến khắp cơ thể Một quả tim yếu sẽ không đủ khả năng làm việc bơm máu này một cách hiệu quả Khi tim không bơm đủ máu, sẽ bị suy tim

Xơ vữa động mạch: Khi các mạch máu bị tắc bởi sự tích tụ cholesterol, chất béo và

canxi (còn được biết đến như là những mảng bám), đây chính là điều kiện dẫn đến bệnh XVĐM Những mảng bám tạo thành trên thành của mạch máu, mạch máu trở nên kém mềm dẻo và sự lưu thông trong mạch máu cũng kém hơn, làm dòng máu khó chảy qua Đột quỵ hay cơn đau tim có thể xuất hiện nếu sự tích tụ mảng bám trở nên dày và mạch máu bị tắc nghẽn nên dòng máu không thể chảy qua được

Huyết áp cao: Huyết áp cao xuất hiện khi máu được đẩy đi trong mạch máu với áp

suất cao Khi huyết áp lên cao, thành mạch trở nên yếu và có thể gây ra các biến chứng như đột quỵ hay cơn đau tim

Những enzyme làm tan huyết khối được sinh ra ở thành tế bào trong lòng mạch máu có ở khắp cơ thể như: Trong động mạch, hệ thống mao mạch và mạch bạch huyết Ở người già việc sản sinh các enzym này bị suy giảm dẫn đến tình trạng hình thành các huyết khối ở bất kỳ vị trí nào trong cơ thể Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự tắc nghẽn dòng máu lên não có thể gây suy giảm và mất trí nhớ ở người cao tuổi [20]

Hình 1.10 Biến chứng của bệnh huyết khối

1.4.4 Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam

Hàng năm trên thế giới có khoảng 17 triệu người tử vong vì nhồi máu cơ tim và 5 triệu người tử vong vì đột quỵ Đây là hai trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay và đều xuất phát từ một nguyên nhân, đó là hậu quả của chứng huyết khối do XVĐM Theo dự báo của WHO thì huyết khối sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào năm

2020 Nhồi máu cơ tim thường xảy ra đột ngột, nhanh và rất nguy hiểm Khoảng 30% bệnh nhân chết trước khi kịp đến bệnh viện [57]

Trong số những người nhập viện, có 5 đến 10% chết do các biến chứng như suy tim, choáng tim, rối loạn nhịp tim Theo thống kê cứ 6 người bị nhồi máu cơ tim thì có 1 người

sẽ bị tái phát cơn nhồi máu cơ tim, đột quỵ, tử vong do tim mạch sau 1 năm

Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán đột quỵ Trong những năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh huyết khối ngày càng tăng cao và ngày càng có nhiều người trẻ tuổi bị huyết khối [57]

C HƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên vật liệu

- Chế phẩm natto của Nhật Bản bán tại Việt Nam

- Nguyên liệu làm cơ chất: Bột đậu nành, cám gạo, cám lúa mì

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

2.1.2.1 Dụng cụ

Que cấy vòng, que cấy nhọn, bình tam giác, ống nghiệm, bình định mức, pipetman, ống đong, ống ly tâm, eppendorf , đèn cồn, diêm quẹt, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc, khăn lọc, bông mỡ, bông thấm nước, lame, lamel…

đạm (Gerhardt, Đức), tủ giữ giống (Sanyo, Nhật)

2.1.3 Hóa chất

- Glucose, cao thịt, cao nấm men, peptone, bột đậu nành, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl, Na2CO3, Na2HPO4, CuSO4.5H2O, MnSO4, MnCl2, CaCl2, ZnSO4.7H2O, Casein, Albumin, Tyrosin, Fibrin, NaOH, HCl, Agar

- Thuốc nhuộm: Tím gelatin, lugol, xanh metylen, đỏ trung tính, fuchsin, phenolphtalein

2.2 Môi trường nghiên cứu

MT1: MT phân lập, giữ giống, nhân giống VK

Nước chiết đậu nành 200ml, Glucose 15g, Pepton 10g, Yeast extract 5g, K2HPO4 2g,

KH2PO4 3g, dung dịch A 5ml, dung dịch B 5ml, dung dịch C 5ml, agar 20g, Nước 1000ml,

pH 7,5 trước thanh trùng

Nước chiết đậu nành: 100g đậu nành ngâm 12 – 14 giờ, rửa sạch, cho 150ml nước

luộc chín, thanh trùng 1 atm trong 30 phút, nghiền mịn, lọc lấy nước, bổ sung nước cho đủ 200ml

Dung dịch C: Hòa 20g CaCl2vào 1 lít nước cất

MT2: Mô i trường thử hoạt tính catalase

MT3: Môi trường bán rắn sản xuất enzyme protease

Cám lúa mì 50g, Bột đậu nành 50g, dung dịch A 5ml,dung dịch B 5ml, dung dịch C 5ml, pH ban đầu 7,5, độ ẩm 60%

MT4: Môi trường thử hoạt tính enzyme protease

Thành phần Nồng độ

Thành phần Nồng độ

MgSO4.7H2O 12,3 g/l MnSO4.4H2O 0,223g/l ZnSO4.7H20 1,4g/l