nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng trichoderma sp phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua

K ết quả việc sử dụng của CPE chitinase từ Trichoderma BL2 và các tác nhân kháng n ấm khác trong phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua .... Chitinase của Trichoderma sẽ phân hủy vách

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Ph ạm Thị Lịch

CÂY CÀ CHUA

Thành ph ố Hồ Chí Minh – 2013

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

L ỜI CÁM ƠN

đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài này

Xin chân thành cám ơn PGS TS Đồng Thị Thanh Thu, TS Võ Thị Hạnh, TS Nguyễn

Hữu Phúc đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Thi ện Phú, cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh, phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, phòng thí

đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn

đình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của chính tôi Các số liệu,

kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác

Tác giả luận văn

Phạm Thị Lịch

M ỤC LỤC

L ỜI CÁM ƠN 1

LỜI CAM ĐOAN 2

M ỤC LỤC 3

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6

M Ở ĐẦU 7

1 Lí do ch ọn đề tài 7

2 M ục tiêu 8

3 Nhi ệm vụ 8

4 Đối tượng nghiên cứu 8

5 Ý nghĩa của đề tài 8

6 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Nấm Trichoderma spp 10

1.1.1 Vị trí phân loại 10

1.1.2 Đặc điểm sinh học 10

1.1.3 Cấu trúc của Trichoderma spp 11

1.1.4 Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng 12

1.1.5 Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp 14

1.2 Chitin và h ệ enzyme chitinase 16

1.2.1 Chitin 16

1.2.2 Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase 17

1.2.3 Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase 18

1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm 19

1.2.5 Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase 20

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp 21

1.2.7 Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase 23

1.3 Vi n ấm gây hại trên cà chua 27

1.3.1 Đặc điểm sinh thái cây cà chua 27

1.3.2 Các tác nhân vi nấm gây hại chủ yếu trên cây cà chua (giai đoạn cây con) 28

1.3.3 Biện pháp phòng trừ vi nấm trên cây cà chua 29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 V ật liệu 32

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.2 Hóa chất - Nguyên liệu 32

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 32

2.1.4 Các MT nghiên cứu đã sử dụng 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch 34

2.2.2 Phương pháp bảo quản mẫu bằng dầu khoáng 35

2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái NS 35

2.2.4 Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS 36

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase 37

2.2.6 Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase trên MT bán rắn 38

2.2.7 Phương pháp tách chiết dịch và thu nhận chế phẩm enzyme thô từ MT nuôi cấy 39

2.2.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE 39

2.2.9 Phương pháp thẩm tích CPE bằng màng cellophane 40

2.2.10 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ chitinase của NS 40

2.2.11 Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến các đặc tính lí hóa của CPE chitinase 41

2.2.12 Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh bởi CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác 42

2.2.13 Phương pháp khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác 43

2.2.14 Gây nhiễm nấm bệnh vào cây cà chua bằng phương pháp nhân tạo [6] 44

2.2.15 Xác định mật độ BT bằng phương pháp đếm KL [19] 45

2.2.16 Xác định mật độ BT bằng phương pháp đo mật độ quang [14] 45

2.2.17 Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp phòng vi nấm gây hại trên cây cà chua 46

2.2.18 Phương pháp xử lí số liệu thống kê 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48

3.1 Kết quả tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao 48

3.2 Ảnh hưởng của MT và các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma BL2 49

3.2.1 Ảnh hưởng của MT lên men bán rắn 49

3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng 51

3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất cảm ứng 53

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy 54

3.2.5 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy 55

3.2.6 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy 56

3.2.7 Động thái quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma BL2 58

3.3 Chiết tách dịch enzyme và thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 59

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính của CPE 59

3.3.2 Quy trình thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 60

3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố lí hóa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE 62

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 62

3.4.2 Ảnh hưởng của pH phản ứng 63

3.4.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 64

3.4.4 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hoạt độ chitinase của CPE 65

3.5 K ết quả khảo sát khả năng đối kháng của CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 phòng trừ vi nấm gây bệnh cây trồng 67

3.5.1 Khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh 67

3.5.2 Khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh 69

3.6 K ết quả việc sử dụng của CPE chitinase từ Trichoderma BL2 và các tác nhân kháng n ấm khác trong phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua 74

3.6.1 Ở các lô gây nhiễm Phytophthora sp 74

3.6.2 Ở các lô gây nhiễm Fusarium sp 76

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

PHỤ LỤC 88

M Ở ĐẦU

1 Lí do ch ọn đề tài

Khí hậu nước ta có nhiều thuận lợi để phát triển sản xuất nông nghiệp, song cũng tạo điều kiện tốt để các sinh vật gây hại sinh trưởng, phát triển và phá hại nghiêm trọng mùa màng Trong đó, bệnh hại cây trồng do vi nấm trong đất là một vấn đề mà người nông dân còn gặp nhiều khó khăn trong việc quản lý và phòng trừ

Vi nấm đất gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài kể cả trong điều

kiện không có cây ký chủ Chúng bảo tồn bằng các sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử

trứng và những bào tử có vách dày ở trong đất và trên tàn dư cây trồng Nấm xâm nhiễm, gây hại cây trồng làm cho rễ và các tế bào mạch dẫn của cây không còn khả năng hút nước

và chất dinh dưỡng từ giá thể Vì vậy mà các triệu chứng của các bệnh do vi nấm trong đất gây ra thường rất giống nhau, đều héo vàng, còi cọc và chết cây, làm giảm năng suất thu

hoạch Riêng đối với cà chua, theo thống kê của ngành Bảo vệ Thực vật Lâm Đồng (năm 2012), tại 2 huyện Đơn Dương và Đức Trọng:

Bệnh xoăn lá nhiễm trên diện tích gần 600 ha, tỷ lệ hại 2,9 - 20%

Mốc sương: bệnh nhiễm trên 1.236,6 ha tại Đơn Dương, Đức Trọng, tỷ lệ hại 8,4 - 30%, tăng 271,1 ha so với kỳ trước

Đốm lá vi khuẩn: bệnh nhiễm tại Đơn Dương 1.620 ha, tỷ lệ hại 16,7 - 30%, tăng 120

trồng bằng nhiều cơ chế như kí sinh, sinh kháng sinh, tiết các enzyme ngoại bào,… Hệ

enzyme ngoại bào của Trichoderma đóng vai trò rất quan trọng trong đấu tranh sinh học, đặc biệt là enzyme chitinase

Chitinase của Trichoderma sẽ phân hủy vách tế bào chủ của các loài nấm gây hại, vì

chitin là một trong những thành phần cấu tạo chính của vách tế bào vi nấm gây bệnh trên cây trồng

Từ những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tạo

chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp để phòng trừ vi nấm gây hại trên

cây cà chua”

2 M ục tiêu

Tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng nấm mốc Trichoderma sp có khả năng

phòng trừ vi nấm gây hại trên cà chua

3 Nhiệm vụ

Tuyển chọn chủng Trichoderma sp có khả năng sinh enzyme chitinase cao trong các

chủng Trichoderma khảo sát

Nghiên cứu điều kiện môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng

hợp chitinase của chủng tuyển chọn

Thu nhận enzyme chitinase và tạo chế phẩm enzyme

Nghiên cứu các đặc điểm lí hóa của chế phẩm enzyme chitinase

Thử nghiệm khả năng phòng – diệt nấm bệnh trên cây cà chua của chế phẩm trong điều kiện in vivo

4 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm Trichoderma nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm

Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM

Chủng Fusarium sp nhận từ Bộ môn Bảo vệ thực vật – Khoa Nông học Đại học

Nông Lâm

Chủng Phytophthora sp nhận từ Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam

5 Ý nghĩa của đề tài

 Ý nghĩa khoa học

Góp phần tìm hiểu về khả năng phòng trừ nấm bệnh gây hại cà chua của chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp

 Ý nghĩa thực tiễn

Dựa vào kết quả thu được và chế phẩm tạo ra trong đề tài có thể ứng dụng làm chế

phẩm sinh học để phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây cà chua

6 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 12/2012 – 8/2013

Địa điểm: phòng Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP HCM

C HƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần lớn Trichoderma spp ưa độ ẩm, riêng T hamatum và T pseudokoningii có thể

chịu độ ẩm cao hơn so với những loài khác Tuy nhiên, các loài Trichoderma spp thường

không chịu được độ ẩm thấp vì thế số lượng Trichoderma giảm đáng kể trong nơi có độ ẩm

KL nấm có màu trắng hoặc từ trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm Các

chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, KL có thể đạt đường kính từ 4 – 9 cm sau 4

ngày nuôi cấy ở 25oC

Hình thái KL và BT của Trichoderma khác nhau khi ở những điều kiện nhiệt độ

khác nhau Ở 35oC chúng tạo ra những KL rắn, dị thường với sự hình thành BT nhỏ và mép

KL bất thường, ở 37o

C không tạo ra BT sau 7 ngày nuôi cấy Hầu hết các loài Trichoderma

không có giai đoạn sinh sản hữu tính, chúng sinh sản vô tính bằng BT đính từ khuẩn ty Khuẩn ty của Trichoderma không màu, cuống sinh BT phân nhánh nhiều Ở cuối nhánh

phát triển thành một khối tròn mang các BT trần không có vách ngăn, thường không màu

BT có dạng hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ ngắn Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 10 µm, được bao bọc bởi thành tế bào Thành tế bào không chứa cellulose như thực vật mà chứa chitin và một số thành phần khác như polysaccharide, lipit, protein, hexozamin, chất màu Màng tế bào chất dày khoảng 7 µm chứa lipit (40%) và protein (38%) [62]

Trichoderma spp có thể sinh tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylanase, pectinase, cellulase…để phân hủy các nguồn xác bã hữu cơ

thực vật và vách tế bào nấm bệnh [13]

1.1.3 Cấu trúc của Trichoderma spp

Bề mặt tế bào của hầu hết các loại nấm bao gồm 3 lớp: màng nhày, vách tế bào, màng tế bào Cấu trúc vách tế bào của Trichoderma thuộc dạng chitin-β-glucan Tuy nhiên,

chitin hiện diện ở hệ sợi nấm lại không có ở BT của T viride Vách tế bào của một vài

chủng Trichoderma đã được phát hiện chứa galactose và N-acetyl-β -D-galactosimin lectin

[43], [66]

Trichoderma spp có nhân điển hình, được bao quanh bởi một màng đôi BT đính

thường chứa nhiều hơn 1 nhân Trichoderma spp có số lượng nhân khác nhau, một số đơn

nhân, một số đa nhân T reesei hình thành nhân nhỏ sau khi xử lý colchicin do sự phân chia

nhân bất bình thường Hàm lượng DNA trung bình của những nhân nhỏ này bằng khoảng 30% của nhân bình thường, gọi là đa bội lệch Những nhân này có thể hữu ích cho việc vận chuyển những lượng DNA nhỏ vào trong thể nguyên sinh [43], [66]

Nghiên cứu gần đây cho thấy trong tế bào của chúng có tất cả các bào quan của một eukaryote Cấu trúc của 1 số bào quan (như thể golgi) thì khác biệt so với eukaryote nhưng

vẫn chưa biết rõ những đặc tính về sinh hóa có khác nhau hay không Một vài loài

Trichoderma spp ch ứa một lượng lưới nội chất khá lớn và nhiều nhất là ở chủng T reesei

[43], [66]

1.1.4 Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng

Nấm đối kháng là những nhóm VSV phổ biến của hệ vi sinh trong đất Chúng thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc cạnh tranh điều kiện

sống với nấm gây bệnh

Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh trên cây

và giúp cây hồi phục, sinh trưởng phát triển

Trichoderma cũng là một trong những giống nấm có khả năng ức chế một số nấm gây bệnh như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia… gây

bệnh trên nhiều loài cây trồng

S ự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế

 Cơ chế kí sinh

Vào năm 1932, Weinding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây

bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “Giao thoa sợi nấm” [68]

Hi ện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn như sau:

Giai đoạn 1: Sợi nấm Trichoderma hướng về sợi nấm gây bệnh (nấm kí chủ) Hiện tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma spp., chúng sẽ hướng về nơi có chất hóa

học do nấm chủ tiết ra Khi tơ nấm Trichoderma đến gần tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng

tiếp xúc và cuộn xung quanh sợi nấm chủ, sau đó hình thành cấu trúc móc hoặc ép sát sợi

nấm kí chủ và phát triển song song với nấm kí chủ [68]

Giai đoạn 2: Sau khi vây quanh, sợi nấm Trichoderma sẽ thủy phân vách nấm kí chủ

bằng cách tiết ra các enzyme ngoại bào như: chitinase, glucanase, cellulase [68]

Giai đoạn 3: Cuối cùng sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng màng sinh chất

của tế bào nấm kí chủ, làm cho chất nguyên sinh trong nấm kí chủ bị phân hủy và dẫn đến

nấm bệnh bị chết [68]

 Cơ chế cạnh tranh

Một cơ chế khá phổ biến đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là sự

cạnh tranh của nấm đối kháng với nấm bệnh tại vùng rễ Trichoderma spp có thể biểu hiện

tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú

Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nguồn gây bệnh cây Do đó, chúng

chiếm chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh [27]

 Cơ chế tiết kháng sinh

Một số chất như trichozianine, trichothecene, trichotoxin A, viridin, ergokonin A…

là kháng sinh có hoạt tính kháng nấm được phát hiện nhiều ở loài T harzianum, T

polysporum, T viride, T longibrachiatum [27]

 Cơ chế tiết enzyme

Cơ chế quan trọng giúp Trichoderma đối kháng hiệu quả với nấm gây bệnh cây trồng

là nhờ vào khả năng tiết ra nhiều loại enzyme

Các loại enzyme do Trichoderma tiết ra gồm có: Endochitinase, glucanase

1,3-β-glucosidase, chitobiosidase, trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, N-acetyl- β glucusaminidase (NAGase) [46]

-Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase Trichoderma phổ biến hiện nay là dựa vào

vị trí thủy phân, gồm 3 nhóm:

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer tạo thành sản phẩm là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính của endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa [46]

Chitin 1,4- β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer [(GlcNAc)n, n>3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 [46]

β-N-acetyl hexosaminidase (exochitinase) phân cắt các chitooligomer hay chitin một

cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) [46]

Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong, trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên Một số enzyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì không Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid Tóm lại chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên [50], [54]

Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ

chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng β-N-

acetyl hexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-N-acetyl hexosaminidase nhưng không là cơ chất

của endochitinase hay chitobiosidase Chính vì thế, có thể sử dụng (GlcNAc)2 để phân biệt

hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetyl hexosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine [54]

Như vậy, nhờ sự kết hợp của cơ chế tiết các enzyme ngoại bào và các cơ chế đối

kháng khác mà Trichoderma spp đã thể hiện khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh một cách tối ưu, hiệu quả

1.1.5 Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp

 Kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật

Trong trường hợp này, Trichoderma spp đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với

rễ, kích thích hệ thống miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật Khả năng đề kháng của

thực vật tăng khi tăng: nồng độ của chất chuyển hoá; các enzyme liên quan đến cơ chế tự

bảo vệ (phenylalanine ammonio-lyase, chalcone synthase); các enzyme liên quan tới sự tổng

hợp phytoalexin, chitinase và glucanase Sự có mặt các chất trao đổi của Trichoderma kích

thích sự tổng hợp phytoalexin ở thực vật Đây là những protein liên quan đến sự kháng bệnh

của cây Nhờ đó, hệ thống gen thực vật có thể chủ động phản ứng lại các tác nhân gây bệnh

và các nhân tố kích thích khác.Cơ chế tự bảo vệ thực vật có thể hoạt động mà không nhất thiết đòi hỏi sự kích thích của các sinh vật sống [41]

Ví dụ, lúa mạch có sức đề kháng với sự nhiễm Fusarium tăng lên khi có mặt của

endochitinase từ T atroviride Thuốc lá và khoai tây mang gen mã hóa chitinase từ T

harzianum có sức chịu đựng cao hơn với điều kiện bất lợi của MT và hoàn toàn kháng lại

nấm bệnh Alternaria alternate, Alternaria solani, Botrytis cinerea trên lá và với nấm bệnh

từ đất như Rhizoctonia solani Những kết quả tương tự đã đạt được với enzyme chitinase

trong dâu tây; chitinase và β-1,6-glucanase trong dưa và cây cà chua Sự kích hoạt các phản ứng tự bảo vệ thực vật sử dụng các nhân tố kích thích có thể là một chiến lược có giá trị như

một thay thế cho việc sử dụng các thực vật biến đổi gen, để bảo vệ thực vật chống lại tác nhân gây bệnh [8]

 Kích thích s ự tăng trưởng của thực vật

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khi cây được xử lí và rễ bị xâm nhiễm bởi

những loài Trichoderma một cách thường xuyên sẽ làm tăng cường sự phát triển hệ rễ và

năng suất cây trồng, tăng sức đề kháng với những điều kiện vô sinh, tăng khả năng hấp thu

và sử dụng dinh dưỡng Năng suất cây trồng trong các cánh đồng có thể tăng lên đến 30% sau khi bổ sung T hamatum hay T koningii Các thử nghiệm tiến hành trong điều kiện nhà

kính, đã cho thấy có sự tăng sản lượng đáng kể khi hạt giống cây được xử lí với các

BT Trichoderma trước khi gieo trồng [41]

Yedidi chỉ ra rằng sự thúc đẩy sinh trưởng hiệu quả khi có sự hiện diện

của Trichoderma spp ở vùng rễ giúp rễ hấp thu được nhiều chất dinh dưỡng có sẵn trong

đất, ngay cả trong điều kiện MT đất hạn chế dinh dưỡng [69]

Ngoài khả năng kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật và kích thích sự tăng trưởng

của thực vật, Trichodema spp còn có khả năng tái tạo lại quần thể, làm tăng BT trong đất để

kháng các vi nấm gây hại Chính vì vậy mà hiện nay trên thị trường có nhiều dạng chế

phẩm nấm Trichoderma:

Chế phẩm dạng sợi nấm: là loại chế phẩm được sản xuất từ sinh khối của sợi nấm, trong đó nấm chuyên tính được nhân sinh khối theo phương pháp lên men chìm hoặc lên men xốp (lên men trong giá thể có bổ sung dinh dưỡng, lên men trên MT bán rắn) Sau khi sinh khối hệ sợi nấm đạt cao nhất, thu hoạch hệ sợi rửa sạch và loại bớt nước bằng cách ly tâm và phơi trong không khí để đạt độ ẩm 40% Sản phẩm dạng này phải được bảo quản trong điều kiện lạnh cho đến khi sử dụng Ưu điểm của sản phẩm này là dễ làm, ít tốn kém song không bảo quản được lâu, có nguy cơ bị tạp nhiễm cao và hiệu lực không ổn định [8]

Chế phẩm dạng BT: người ta nhân sinh khối nấm trong MT xốp đến khi BT nấm hình thành và chín, thu hồi sinh khối nấm cùng giá thể sau đó phơi khô và nghiền mịn Ưu điểm của chế phẩm dạng này là có thể bảo quản được lâu, ít tạp nhiễm, có hiệu lực cao, ổn định Để tránh tạp nhiễm từ bên ngoài các thao tác nuôi, trồng, thu hoạch và chế biến phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, người sản xuất phải có kinh nghiệm và trang thiết

bị đắt tiền [8]

Chế phẩm dạng lỏng: bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Nông Lâm TP.HCM đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Trichoderma dạng lỏng dùng cho rau sạch và ứng dụng thử

nghiệm thành công ở Hóc Môn, Củ Chi, Chế phẩm Trichoderma sau khi nhân đạt mật độ

BT cao nhất có thể sử dụng ngay để trừ bệnh trên đồng ruộng, tuy nhiên sẽ tốn công vận chuyển, khó bảo quản và nhanh bị thối [8]

1.2 Chitin và h ệ enzyme chitinase

1.2.1 Chitin

 Khái niệm

Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polymer sinh học được

tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới

chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g/ 1 năm/1 m2 bề mặt trái đất Trong

tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào

của nấm và một số tảo Chlorophiceae Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu

trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn

thể, giáp xác và giun tròn… Ở động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai

mực, hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng [30], [53]

Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là từ vỏ cua và tôm Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như: CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ… nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm

bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính

chất của chitin [30], [53]

 Cấu trúc phân tử

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc, người ta thấy

rằng chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết

với nhau bởi liên kết 1- 4 glucoside [53]

Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ; sự khác nhau này thể hiện ở sự

sắp xếp các chuỗi Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau; nhưng có một cặp xếp cùng chiều Ở chuỗi β–chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định Chuỗi γ–chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc [53]

1.2.2 Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase

1.2.2.1 Định nghĩa

Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin

thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1

và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin [50]

1.2.2.2 Phân loại

 D ựa vào phản ứng phân cắt

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4- β-chitobiosidase, acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase)

N-Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách

ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide [30], [54]

Chitin-1,4- β-chitobiosidase: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính

là các dimer chitobiose [30], [54]

N-acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ

một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine [30], [54]

 D ựa vào cấu trúc phân tử

Enzyme chitinase được xếp vào 3 họ Glycohydrolase

- Enzyme chitinase thu ộc họ Glycohydrolase 18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc eukaryote, prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ

yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase

và N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase này hoạt động thông qua một cơ chế

kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-monomer Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas

hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serrati marcescens…[50]

- Enzyme chitinase thu ộc họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn

Streptomyces griceus, vi khu ẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với

một vòng xoắn Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV [50]

- Enzyme chitinase thu ộc họ Glycohydrolase 20

Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-glucosamine acetyl hexosaminidase từ

vi khuẩn, Streptomyces và người [50]

 D ựa vào trình tự amino acid

Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận

biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm [61]:

Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine hoặc proline ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận

biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase

ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình

tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

1.2.3 Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase

có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa [38], [58]

 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3 – 10 ở thực vật bậc cao và tảo; pI từ 4,7 – 9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở VSV [49]

Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml) [49]

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở VSV hoạt động là 400C, ngoại

trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối

thích là 50OC [34] Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme chitinase có thể

có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III

và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu

đựng nhiệt độ cao đến 800

C Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin

mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp từ 30 – 450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus

sp BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40 – 600

C [49]

Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng T harzianum Rifai

nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25 – 600C, nhiệt độ tối ưu là 400

C [54]

 Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH tối thích của hệ enzyme chitinase từ 4 – 9 đối với các enzyme chitinase ở

thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4.8 – 7.5 và ở VSV là 3.5 – 8.0

pHtối thích của enzyme chitinase có thể phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối ưu khoảng 5.0 khi cơ chất là chitin Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4.0 – 8.5 [53] Chitinase của vi nấm cho hoạt tính cao nhất ở pH = 5.0 trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8.0 [48]

 S ự ổn định hoạt tính

Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2 năm Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 37oC trong trường hợp không có mặt của cơ

chất Chu kì bán hủy ở 37oC là 40 ngày và ở 5oC là 230 ngày [49]

1.2.4 Ngu ồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm

Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật: thực vật, động vật, vi khuẩn, vi

nấm Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng Tuy nhiên trong các MT nuôi cấy VSV, người ta đều cho thêm chitin – cơ chất của enzyme chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính enzyme chitinase sau quá trình chiết tách [37], [41]

Ở vi nấm, chitinase chủ yếu được tổng hợp bởi các loại NS Các chủng NS cho

enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia… Riêng đối với

Trichoderma spp cơ chế cảm ứng hệ enzyme chitinase là chủ đề được nhiều nhà khoa học

quan tâm Sự cảm ứng enzyme ngoại bào rất hiệu quả khi nuôi cấy Trichoderma trong MT

có chitin, vách tế bào nấm hoặc hệ sợi nấm [43]

Các enzyme khác nhau thì cơ chế cảm ứng khác nhau Ví dụ: N-acetyl-glucosamine

chỉ cảm ứng đặc trưng cho việc tạo ra β-N-acetyl-hexosaminidase mà không cảm ứng tạo ra endochitinase hoặc chitobiosidase ở Trichoderma Trong quá trình kí sinh của Trichoderma

trên những kí chủ khác nhau thì mức độ cảm ứng và thành phần các sản phẩm tạo thành khác nhau, chủ yếu là 1,4-β-N-acetyl-glucosaminidase 102 kDa và 72 kDa và một vài enzyme endochitinase của nhóm II Inbar và Chet đã chứng minh sự tạo thành enzyme chitinase của chủng T harzianum kí sinh được bắt nguồn bởi việc tiết ra chất trung gian

tương tác với kí chủ là lectin Hiện tượng này xảy ra khi có sự cảm ứng của chitooligomer Lectin là hệ thống nhận biết kì chủ của vi nấm kí sinh và có giá trị trong nghiên cứu pha

sớm của quá trình kí sinh nấm Sự hoạt động của hệ enzyme chitinase của Trichoderma bị

ảnh hưởng bởi các hoạt động của những hợp chất cảm ứng khác như các enzyme phá hủy vách (protease, glucanase), các liên kết protein trong vách tế bào chất, permease và chất kháng sinh [37], [41], [43]

Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về

mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển

và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào

nấm Chitinase còn giữ vai trò chính trong hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng với các loài nấm gây bệnh thực vật

1.2.5 Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase

 Phương pháp nuôi cấy chìm – MT nuôi dạng lỏng

NS được nuôi trong dung dịch chitin huyền phù có bổ sung nguồn nitơ vô cơ để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều chitinase Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp ôxy cho NS phát triển Để thu nhận enzyme, dịch enzyme được cô đặc ở nhiệt độ thấp [16]

 Phương pháp này có ưu điểm:

- NS được cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ

tiếp xúc với dịch dinh dưỡng

- Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa

 Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:

- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối

- Trong quá trình nuôi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục

- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

- Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất cảm ứng

để NS sinh enzyme ở mức tối đa

 Phương pháp nuôi cấy bề mặt – MT bán rắn

Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT Nguyên liệu chính thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, hoặc tấm gạo,… được bổ sung trấu để làm tăng độ thoáng khí MT được bổ sung chitin và một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60% Hấp thanh trùng ở 1 – 1,5 atm /45 – 60 phút, để nguội rồi cho BT nấm vào MT đã cấy giống được trải lên các khay sạch với chiều dày từ 2 – 5 cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp Sau khoảng thời gian nuôi cấy, người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 400C để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ Hoặc thu

dịch chiết enzyme, li tâm loại bỏ BT, sợi nấm và các tạp chất; sau đó lắng tủa bằng tác nhân

tủa phù hợp; sấy khô, xay mịn Đây chính là chế phẩm enzyme dạng thô [16]

 Phương pháp này có nhược điểm là:

- Tốn diện tích mặt bằng

- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình

- Chi phí nhân công, điện nước cho một đơn vị sản phẩm cao

Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đó nuôi trên MT này thì độ thoáng khí cao Nồng

độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm MT không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm VSV lạ cũng dễ dàng xử lý Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản, dễ vận chuyển và ít tổn hao hoạt tính enzyme Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần thu enzyme tinh khiết, rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao

về trang thiết bị [21], [39], [40]

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp

1.2.6.1 Nguồn dinh dưỡng

 Nguồn dinh dưỡng cacbon

NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau, trong đó nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong MT nuôi cấy NS sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn cacbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase [31] Nhìn chung sự hiện

diện của chitin trong MT nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả năng kích thích tạo chitinase cao nhất Trong hầu hết các trường

hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1 – 1,5% là VSV có khả năng tạo chitinase [51]

Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào

nấm, vỏ tôm, cua ) để tạo chitinase từ NS nuôi cấy trên MT bán rắn Việc tận dụng phế

liệu này vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa góp phần giảm thiểu ô nhiễm MT

Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các đồng tác giả chỉ ra rằng hệ enzyme chitinase

của Trichoderma sp có thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae,

Phytophthora primulae), vách t ế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes

versicolor) hoặc chitin vỏ tôm, trong đó vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp

hệ enzyme chitinase của Trichoderma tốt hơn chitin từ vỏ tôm [7]

 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Nguồn nitrogen có ý nghĩa lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của NS Khi loại urea ra khỏi MT nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng tổng hợp chitinase Takashi và cộng sự (2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ NS Aspergillus sp đã chỉ ra rằng hoạt tính

chitinase cao khi sử dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4 [25]

Theo Nampoothiri và cộng sự (2003), khi bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào MT nuôi cấy bán rắn thì khả năng tạo chitinase ở Trichoderma harzianum tăng đáng kể Tuy

nhiên, theo Kovacs và cộng sự (2003), trong nuôi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào

MT cám gạo-chitin không ảnh hưởng đến khả năng tạo chitinase Suresh và Chandrasekharan (1999) cũng ghi nhận sự gia tăng sản lượng enzyme này khi MT nuôi cấy

T harzianum được cung cấp muối amonium phosphat và cao nấm men

 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia thành phần cấu tạo protein, enzyme, điều hòa pH của MT nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme nói chung, chitinase nói riêng [26], [57]

1.2.6.2 Điều kiện nuôi cấy

Ảnh hưởng của độ ẩm

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 50 – 60%, nếu

độ ẩm dưới 50% thì hoạt tính enzyme sẽ giảm Độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng khí của MT, còn khi độ ẩm thấp sẽ kìm

hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV Đối với T harzianum, hoạt tính chitinase cao

nhất ở độ ẩm MT là 65% [55]

Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH của MT ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng NS Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH ban đầu của MT nuôi cấy thích hợp là acid, trung tính hay kiềm Nhìn chung, các chủng Trichoderma có thể

phát triển ở MT acid (pH = 6), khoảng tối ưu là 5 – 6.5, một số chủng phát triển tốt ở pH <3

và một số ít phát triển ở pH > 9 [43], [56] Các nghiên cứu trên T harzianum chỉ ra rằng pH

thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4 – 6 [27]

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiệt độ có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển

của Trichoderma Nhiệt độ phát triển tối ưu của Trichoderma là từ 25 – 30oC Một vài loài phát triển tốt ở 35oC Một số ít phát triển tốt ở 40oC [39] Các loài, như T harzianum, thường được phân lập từ những vùng đất nhiệt đới ấm áp, trong khi đó T polysporum và T

viride l ại chủ yếu được tìm thấy ở những vùng có nhiệt độ lạnh Các loài Trichoderma có

thể sinh trưởng trong khoảng giới hạn nhiệt độ tương đối rộng, ở nhiệt độ thấp 0oC đối với

T polysporum hay ở nhiệt độ cao 40oC đối với T koningii Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng

tới sự sinh trưởng của các loài Trichoderma mà còn tác động tới hoạt động biến dưỡng của

chúng, đặc biệt là sự sinh tổng hợp kháng sinh và các enzyme ngoại bào [37]

1.2.7 Tình hình nghiên c ứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase

1.2.7.1 Khả năng ứng dụng của enzyme chitinase từ Trichoderma spp trong nông nghiệp

 Cơ sở khoa học ứng dụng enzyme chitinase trong phòng trừ nấm gây bệnh thực

v ật

Thành tế bào của vi nấm dày khoảng 0,2 µm, có tính phản quang rất mạnh nên có thể phân biệt rõ dưới kính hiển vi quang học Nhiều công trình đã chứng minh cấu tạo thành tế bào vi nấm vừa có cấu trúc bản mỏng vừa có cấu trúc sợi

Bảng 1.1 Cấu tạo chính của thành tế bào ở các nhóm nấm chủ yếu [1], [72]:

bào

N ấm nhầy Myxomyces Cellulose

N ấm tiếp hợp Zygomycetes Chitin – Chitosan

N ấm nang

N ấm đảm

N ấm bất toàn

Ascomycetes Basidiomycetes Deuteromycetes

của tế bào đối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân

giải ammoniac, phenylalanine làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật [45]

Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại các mầm

bệnh thực vật có liên quan đến việc sản xuất ra enzyme chitinase Theo các thí nghiệm invitro gần đây cho biết: trong quá trình sống kí sinh với nấm bệnh, Trichoderma tiết ra hệ

enzyme phân hủy chitin Bao gồm phức hợp với 6 enzyme khác biệt nhau, hai enzyme 1,4-N-acetyl glucosaminidase có trọng lượng phân tử lần lượt là 102, 73 kDa và bốn enzyme endochitinase có trọng lượng phân tử lần lượt là 52, 42, 33, 31 kDa Trong đó, endochitinase (42 kDa) có khả năng phân hủy vách tế bào Botrytis cinerea in vitro Quá

β-trình kháng nấm muốn đạt hiệu quả cao nhất cần có sự phối hợp hoạt động bổ sung cho nhau của cả 6 enzyme [30], [50]

 Ph ối hợp chitinase và chủng vi khuẩn Enterobacter cloeace kháng nấm

Đây là sự kết hợp giữa enzyme phân hủy thành tế bào nấm mốc với vi khuẩn kháng

nấm Enterobacter cloeace (vi khuẩn thường thấy trên bề mặt hạt và vùng rễ của thực vật)

Sự kết hợp này nhằm mục đích kìm hãm sự tăng trưởng và phát triển của các loài nấm mốc thông qua sự tác động kép: chitinase phân giải chitin thành tế bào nấm mốc tạo MT dinh

dưỡng cho Enterobacter cloeace tăng sinh trong tự nhiên, đồng thời tăng khả năng kiểm

soát sinh học nhờ tăng khả năng gắn vào thành khuẩn ty của nấm mốc (nếu dùng các loại

đường cơ bản như D-glucose, saccharose…trong MT nuôi cấy Enterobacter cloeace sẽ hạn

chế sự gắn vào thành khuẩn ty của nấm mốc của chủng vi khuẩn này) Các nhà khoa học đề nghị tỉ lệ endochitinase/chitin 1,4-β-chitobiosidase là 1/1 và tỉ lệ kết hợp hiệu quả với

Enterobacter cloeace trong khoảng 1 tế bào/1µg – 200.000 tế bào/1µg Hiện nay, người ta

sử dụng hỗn hợp này để bảo vệ hạt giống, lá, rễ, quả, vùng đất xung quanh hạt… Hỗn hợp này có thể dùng để kháng các loài nấm mốc gây bệnh thực vật như: Fusarium, Rhizoctonia,

trộn với 1 số tác nhân khác có hiệu quả tiêu diệt nấm mốc, côn trùng cao Khi phối trộn 2

chế phẩm này theo tỉ lệ 1:1 thì thu được hiệu quả cao hơn Đây có thể là do sự cộng hưởng

hoạt tính của 1 hệ sinh hóa phức tạp đa nhân tố Ngoài ra, người ta còn tìm cách tăng cường

hoạt tính kháng nấm thông qua tác động cộng hưởng giữa hỗn hợp chế phẩm trên với các tác nhân kháng nấm [8]

 Thu nh ận và ứng dụng enzyme chitinase từ T harzianum

Enzyme chitinase được thu nhận từ chủng T harzianum P1 (ATCC 74058) Chủng

này được nuôi cấy trong môi trường Richard cải tiến; sau 4 ngày, sinh khối NS được loại bỏ

bằng cách ly tâm và thu dịch nổi bên trên, đem thẩm tích để loại bỏ những phân tử có trọng lượng nhỏ Dịch MT lỏng được đem đi sắc kí để thu nhận 1 phân đoạn có hoạt tính

exochitinase và 1 phân đoạn có hoạt tính endochitinase

Những enzyme được tinh khiết này sẽ ức chế nấm và côn trùng chứa chitin Nấm

chứa chitin bị ức chế bởi những enzyme chitinase bao gồm: Fusarium, Rhizotonia,

Sclerotium,… Ở đây việc ức chế bằng những enzyme chitinase được thực hiện bằng cách cho enzyme tiếp xúc với nấm hay côn trùng Enzyme chitinase được sử dụng như là 1 dung

dịch và có nồng độ xác định (50 – 100 ppm) và được ứng dụng trong thuốc xịt hoặc được dùng như 1 loại thuốc bột [42]

1.2.7.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng

 Trên th ế giới

So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase thì hệ enzyme chitinase được nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn chế

Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces Những

nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm

Năm 1978, P.A Carroad và R A Tom có nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I G Cosio, R A Fisher, P A đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin

Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi

Trichoderma Năm 1991, Ulhoa nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase

của T harzianum [67]

2004 – 2006, Harman và Howell đã có nhiều công trình nghiên cứu về hệ enzyme

thủy phân ở Trichoderma spp [41], [42], [46]

Dường như Trichoderma là chi nấm được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao,

ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật Đối với chi nấm

Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên MT bán rắn Những chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là A

Năm 2007, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh [13]

Năm 2010, tác giả Lê Thị Huệ đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase

của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma Và bước đầu thu chế

phẩm enzyme chitinase thô từ Aspergillus để phòng trừ sâu tơ và sản xuất glucosamine [12]

Năm 2012, tác giả Đinh Minh Hiệp đã nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ

Trichoderma spp và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh [8]

1.3 Vi n ấm gây hại trên cà chua

1.3.1 Đặc điểm sinh thái cây cà chua

Cây cà chua có tên khoa học là Lycopesium esculentum, có nguồn gốc từ Nam Mỹ, là

loại rau ăn quả, họ Cà (Solanaceae) [9], [73]

Cà chua là cây dài ngày, tự thụ phấn Quả cà chua mọng, khi chín có màu vàng hoặc

đỏ, có nhiều hình dạng: tròn, dẹt, có cạnh, có múi… Một năm có thể trồng 4 vụ cà chua: vụ

sớm, gieo hạt vào cuối tháng 7 đầu tháng 8; vụ chính gieo cuối tháng 9 đến đầu tháng 10; vụ

muộn gieo từ tháng 11 đến giữa tháng 1; vụ xuân gieo từ tháng 1 đến đầu tháng 2 Hiện nay, nhiều giống cà chua đang được trồng ở Việt Nam Có thể chia cà chua thành 3 loại dựa vào hình dạng [73]:

- Cà chua hồng: quả có hình dạng quả hồng, không chia múi Thịt quả đặc, nhiều bột, lượng đường trong quả cao Các giống thường gặp: Ba Lan, Hồng Lan của Viện cây lương

thực; giống 214, HP5, HP1 của Hải Phòng…

- Cà chua múi: quả to, nhiều ngăn tạo thành múi, là giống cây sinh trưởng vô hạn,

thời gian sinh trưởng dài, năng suất và khả năng chống chịu khá nhưng chất lượng không

bằng cà chua hồng

- Cà chua bi: quả nhỏ, chua, giá trị thấp

Cây cà chua có thể sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau như đất sét, đất cát, đất pha cát, có độ pH = 6 – 6.5 Đất có độ ẩm cao và ngập nước kéo dài sẽ làm giảm khả năng sinh trưởng của cây cà chua Nhiệt độ thích hợp cho cà chua để đạt năng suất cao, chất lượng tốt là khoảng 21 – 24o

C và thời tiết khô Nhiệt độ dưới 12o

C kéo dài sẽ gây thiệt hại nghiêm trọng, nhiệt độ trên 27oC kéo dài sẽ hạn chế ra hoa, đậu quả Các tế bào phôi và hạt

bị hủy hoại khi nhiệt độ trên 38oC Trước và sau thời gian thụ phấn nếu nhiệt độ ban đêm quá 21oC thì khả năng đậu quả kém

Ở nước ta, việc phát triển trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích, do đó cà chua là loại rau được khuyến khích

phát triển Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa được phát triển mạnh theo mong muốn vì cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở nước ta dễ mắc bệnh Nhiều bệnh gây hại như héo cây con, héo xanh, thán thư, mốc đen lá, héo muộn, sương mai… do vi khuẩn, vi nấm gây

ra Đặc biệt ở giai đoạn cây con, cà chua dễ bị các loài vi nấm trong đất (như

Phytophthora sp., Fusarium sp., Rhizoctonia sp …) tấn công gây bệnh

1.3.2 Các tác nhân vi n ấm gây hại chủ yếu trên cây cà chua (giai đoạn cây con)

1.3.2.1 Nấm Phytophthora sp

 Đặc điểm sinh học

Nấm Phytophthora là chi khá phổ biến thuộc lớp Oomycetes, bộ Pernoporales, họ

Pythiaceae, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thước không đồng đều [4] Túi BT hình trứng hoặc hình quả chanh, trên đầu có núm hoặc không có núm, không màu, trong suốt BT hình cầu có 2 roi di chuyển rất nhanh trong nước, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 25 - 300C, pH 6 - 7 Trong MT ẩm ướt hoặc khi nhiệt độ MT giảm, túi BT sẽ phóng thích những động BT Những động BT sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền, cuối cùng ngừng bơi, cuộn tròn và kết kén Sau một thời gian hình thành vách

tế bào Ở giai đoạn này BT gọi là kén nang BT vách dày ở dạng hình cầu hoặc hình oval thuộc cấu trúc nghỉ vô tính Cấu trúc hữu tính gồm túi giao tử đực và túi noãn Túi giao tử đực và túi noãn được hình thành qua quá trình giảm phân Đây là giai đoạn đơn bội trong

vòng đời của Phytophthora Giai đoạn lưỡng bội có vai trò chính trong chu kì sống [4], [70]

 Tri ệu chứng và tác hại

Ở cà chua, Phytophthora tấn công trên tất cả các bộ phận của cây Đặc biệt, trên lá

vết bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở đầu lá, mép lá hoặc gần cuống lá Vết bệnh lúc đầu có

màu xanh đậm như úng nước, sau đó vết bệnh có màu nâu đen, vết bệnh lớn dần, nếu trời

ẩm trên bề mặt vết bệnh có lớp tơ màu trắng bao phủ, bệnh nặng sẽ làm thối nhũn, nếu thời

tiết khô, vết cũng khô dòn dễ vỡ Ở rễ Phytophthora làm thối rễ, làm cho cây gặp khó khăn

trong việc hút nước và muối khoáng Các triệu chứng sẽ dần tồi tệ hơn cho đến khi cây chết [6], [15], [24]

1.3.2.2 Nấm Fusarium sp

 Đặc điểm sinh học

Fusarium là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách

ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già Fusarium sinh sản vô tính bằng

BT gồm: BT đính lớn, BT đính nhỏ và BT vách dày BT đính lớn dài, nhiều nhân, hình liềm

hoặc cong được sinh ra từ cuống BT Đầu và cuối BT lớn, thuôn và nhọn Một vài loại BT

lớn tách rời và không gắn trên cuống BT, những tế bào sinh BT lớn gọi là thể bình BT đính

nhỏ thường đơn nhân, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ một thể bình hay những

cuống BT phân nhánh hoặc không phân nhánh Tiểu BT đính thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu BT đính của Fusarium rất giống BT của Cephalosporium BT vách dày

hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả Chúng

có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc các ống mầm nếu BT gặp điều

kiện thuận lợi Hậu BT hay BT vách dày rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài [4], [70]

 Tri ệu chứng và tác hại [15]

Fusarium chủ yếu tấn công vào rễ, gốc thân, lá của cây cà chua Khi cà chua bị nhiễm Fusarium, cây thường bị còi cọc, kém phát triển, sau đó bị chết Cây trưởng thành bị

bệnh các lá phía gốc thường bị vàng, ban đầu là lá chét của một bên cây, sau đó lan ra toàn cây; lá héo rũ, màu vàng, không bị rụng Vết bệnh ở trên thân sát mặt đất hoặc ở cổ rễ thường có màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô tóp cả đoạn thân sát mặt đất, bộ rễ phát triển kém, rễ bị thối dần Khi cây bị nhiễm bệnh sẽ biểu hiện ra bên ngoài là chiều cao và hệ thống rễ sẽ bị ngắn lại Mức độ bệnh nặng hay nhẹ tùy thuộc vào thời gian mà rễ bị nhiễm bệnh cũng như giai đoạn sinh trưởng của cây Nếu cây ở giai đoạn nhỏ mà bị nhiễm bệnh thì

sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng hơn khi so sánh với cây bị nhiễm ở các giai đoạn sau Triệu chứng héo rũ hoặc biến vàng có thể xuất hiện một vài cành trên cây hay cả cây, cây bị nhiễm bệnh các lá bị vàng, héo sau khoảng 1 – 2 tuần cây sẽ chết hoàn toàn [6], [15], [24]

1.3.3 Bi ện pháp phòng trừ vi nấm trên cây cà chua

1.3.3 1 Biện pháp canh tác

Những biện pháp canh tác như thời vụ, làm đất, tưới nước, chăm sóc, luân canh, xen canh mà bất cứ hệ thống canh tác nào cũng thường xuyên thực hiện Nếu được trang bị những hiểu biết người ta có thể thực hiện các biện pháp này một cách có ý thức sẽ mang lại hiệu quả phòng trừ, hiệu quả kinh tế cao Biện pháp canh tác có tác dụng [15], [73]:

- Làm thay đổi điều kiện sinh thái, thay đổi ký chủ, nguồn dinh dưỡng của ký sinh vật gây bệnh

- Tiêu diệt hoặc làm hạn chế sinh vật gây bệnh, cản trở sự lây lan và tồn tại của sinh vật gây bệnh

- Biện pháp canh tác có giá trị phòng bệnh rất cao và không gây hại MT

1.3.3 2 Biện pháp hóa học

Biện pháp hóa học là một trong những biệt pháp phòng trừ bệnh cây tích cực, nhanh chóng, hiệu quả, do đó được ứng dụng rộng rãi, đem lại nhiều lợi ích kinh tế Tuy nhiên,

biện pháp hóa học có một số nhược điểm lớn như [15], [73]:

- Thuốc hóa học là những thuốc độc ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người và gia súc

- Phần lớn thuốc hóa học có khả năng tiêu diệt nấm bệnh nhưng đồng thời cũng tiêu

diệt vi sinh vật có ích, làm phá vỡ cân bằng sinh học, đặc biệt gây khó khăn cho những vùng

áp dụng biện pháp sinh học

- Nấm và vi khuẩn gây bệnh thường thích nghi quen dần với thuốc, vì thế phải tăng

liều lượng thuốc sử dụng ảnh hưởng đến tăng trưởng của cây

1.3.3 3 Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học phòng trừ dịch hại rất đa dạng dựa trên nguyên tắc chung: sử

dụng VSV có ích để hạn chế sinh vật có hại [13] Trong phạm vi đề tài này chỉ giới thiệu

biện pháp sinh học bằng cách sử dụng các CPSH

Các CPSH là những sản phẩm dạng bột, viên, lỏng có nguồn gốc trực tiếp từ VSV

hoặc từ các sản phẩm trao đổi của VSV [8] Những sản phẩm này có vai trò trong kiểm soát

bệnh hại cây trồng

CPSH không ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng, không gây ô nhiễm MT sinh thái Có tác dụng cân bằng hệ sinh thái trong MT đất nói riêng và MT nói chung Không làm hại kết cấu đất, không làm chai đất, thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất CPSH có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông sản phẩm Tiêu diệt sinh vật gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến MT như các loại thuốc có nguồn gốc hóa học Bên cạnh đó, CPSH còn tăng khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp

phần làm sạch MT [71]

Các CPSH ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm sản phẩm với các tính năng khác nhau: nhóm CPSH ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng; nhóm CPSH dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất

kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng; nhóm CPSH dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp Trong đó, nhóm CPSH ứng dụng cho phòng trừ sâu – bệnh hại là nhóm sản phẩm được ứng dụng khá rộng rãi và được ứng dụng sớm nhất trong lĩnh vực cây trồng

Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học…với sự canh tác trên đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ VSV trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một

số dịch hại không dự báo trước

Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng CPSH, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng chung của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung

C HƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 V ật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng nấm Trichoderma nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi

sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM

- Chủng Fusarium sp nhận từ Bộ môn Bảo vệ thực vật – Khoa Nông học Đại học Nông

Lâm

- Chủng Phytophthora sp nhận từ Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam

2.1.2 Hóa ch ất - Nguyên liệu

- Các loại đường chuẩn: glucose, succrose

- Các loại hóa chất khác: KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, KCl, NaNO3, HCl, H2SO4, NaOH, (NH4)2SO4, KCl, CaCO3, MnSO4, CaCl2, ZnSO4, NH4NO3, urea, tween

80, thuốc thử DNS (Trung Quốc)

- Cao nấm men, pepton, bột chitin, agar

- Giống cà chua bi (cherry) F1 (Green field seeds)

- Đất sạch Tribat: 54% chất hữu cơ, 8% mùn, 1,7% N tổng hợp, 0,4% K2O tổng số, 0,2%

P2O5 tổng số, vi lượng Mg, Mn, Zn, B, Cu, Mo, Fe

- Chế phẩm trừ nấm sinh học: Vi-ĐK (chế phẩm Bào tử Trichoderma spp – công ty cổ phần

thuốc sát trùng Việt Nam), enzyme β-glucanase (Viện Sinh học Nhiệt Đới)

- Các thuốc trừ nấm hóa học: Anvil, COC85

2.1.3 Thi ết bị và dụng cụ

- Nồi hấp cao áp ALP (Nhật Bản)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Kính hiển vi quang học (Nhật Bản)

- Máy đo pH Hanna (Mỹ)

- Máy li tâm (Rotina, Đức)

- Tủ cấy vô trùng Box laminer (Việt Nam)

- Tủ lạnh (National- Nhật Bản)

- Tủ giử mẫu (Sanyo- Nhật Bản)

- Máy lắc (Gerhardt- Đức)

- Cân điện (Sartorius -Đức)

- Máy quang phổ (Amersham – Thụy Điển)

- Tủ ấm (Sanyo- Nhật Bản)

2.1.4 Các MT nghiên c ứu đã sử dụng

 MT nuôi c ấy, giữ giống, bảo quản NS nghiên cứu

MT1 - (Môi trường YEA): Cao nấm men 4 g; glucose 20 g; agar 20 g; nước cất 1000 ml; pH = 5.5 – 6.0 [3]

MT2 - (Czapek – Dox cải tiến): NaNO3 3,5 g; KH2PO4 1,5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; KCl 0,5 g; FeSO4.7H2O 0,01 g (vết); glucose 20 g; agar 20 g; nước cất 1000 ml; pH = 6.5 [23]

 MT nuôi c ấy, giữ giống NS gây bệnh

MT3 - (Môi trường PDA): Khoai tây 300 g; glucose 50 g; agar 20 g, nước cất 1000

ml [14]

Cách ch ế dịch khoai tây: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch Cân 300 g, thái nhỏ, thêm 1000

ml nước, đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong [14]

MT4 - (MT carrot ): Carrot 200 g; glucose 20 g; agar 20 g; 1 ít CaCO3; nước cất

1000 ml [14]

Cách th ực hiện: Carrot gọt vỏ, rửa sạch Cân 200 g, cắt nhỏ, say nhuyễn, thêm 1000

ml nước cất, đun sôi trong 30 phút, sau đó cho 1 ít CaCO3vào Lọc lấy dịch trong, cho thêm glucose, agar, nước cất cho đủ 1000 ml

MT5 - (môi trường CYA): NaNO3 3 g; K2HPO4 1 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; KCl 0,5 g; FeSO4.7H2O 0,01 g (vết); succrose 30 g; agar 20 g; nước cất 1000 ml; pH = 6.5 [13]

 MT c ảm ứng NS sinh enzyme chitinase

MT6 - Dùng [MT2] để thử hoạt tính enzyme ngoại bào với cơ chất tương ứng chitin thay đường glucose với hàm lượng tương đương [3]

 Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy phân chitinase

MT7: Trấu 50 g; cám 40 g; MgSO4.7H20 0,2 g; K2HPO4 1 g; KCl 0,2 g; NH4NO3 1,0 g; FeSO4.7H2O 0,002 g; MnSO4 0,002 g; bột chitin 10 g; pH = 5 – 6, nước cất 50 - 60%

[36]

MT8: Trấu 50 g; cám 40 g; pepton 1 g; urea 0,3 g; KH2PO4 0,2 g; CaCl2 0,3 g; Tween 80 1,2 g; (NH4)2SO4 0,4 g; MgSO4.7H20 0,3 g; bột chitin 10 g; pH = 5 – 6; nước cất

50 - 60% [45]

MT9: Trấu 50 g; cám 40 g; pepton 0,5 g, cao nấm men 0,5 g; glucose 1 g; KH2PO4 0,3 g; K2HPO4 0,7 g; MgSO4.7H20 0,5 g; FeSO4.7H20 0,5 g; ZnSO4 0,001 g; bột chitin 10 g;

pH = 5 – 6; nước cất 50 - 60% [40]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khu ếch tán trên MT thạch

 Nguyên t ắc

Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ không

tạo màu mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh KL [3]

 Cách ti ến hành phương pháp khoan lỗ thạch

- Thu dịch enzyme: Cho 1ml huyền phù BT nấm sợi vào mỗi bình tam giác chứa 10g MT đã chuẩn bị, sao cho mật độ BT là 105đến 106

bào tử/1 gam MT Nuôi ở nhiệt độ phòng Sau

thời gian nuôi cấy thích hợp thu dịch nuôi cấy

- Tiến hành lọc để loại bỏ cơ chất (trấu, cám…), sau đó ly tâm dịch nuôi cấy 5000 v/phút trong 10 phút Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng ta thu được

Nếu NS có hoạt tính chitinase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan chứa

dịch enzyme Vùng chitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt

 Đánh giá kết quả

- Đặt sấp hộp petri, dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đường kính lỗ thạch (d

= 9mm)

- Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng NS [3]

Quy ước:

D-d ≥ 25 mm: hoạt tính enzyme mạnh

D-d ≥ 20 mm: hoạt tính enzyme khá mạnh

D-d ≥ 15 mm: hoạt tính enzyme trung bình

D-d ≤ 10 mm: hoạt tính enzyme yếu

2.2.2 Phương pháp bảo quản mẫu bằng dầu khoáng

Cách ti ến hành: Chuẩn bị ống giống đã nuôi 5 – 7 ngày ở nhiệt độ phòng Dầu

khoáng chứa trong ống eppendorf hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khô ở 700C trong 1-2 giờ, để nguội Dùng que cấy lấy bào tử NS cho vào eppendorf chứa dầu khoáng vô trùng Hàn kín eppendorf bằng paraffin, bảo quản ở điều kiện lạnh Phương pháp này có thể

bảo quản trong 1 – 3 năm [23]

2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái NS

Quan sát đại thể nấm

NS sau khi nuôi cấy trong các ống thạch nghiêng 5 – 7 ngày, ta tiến hành tạo KL

khổng lồ như sau:

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng

- Dùng que cấy lấy một ít BT từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm Lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm

vào mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2-3 hộp

- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL Hàng ngày lấy ra quan sát:

+ Hình thái, kích thước KL

+ Màu sắc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc của KL

+ Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT, đặc điểm của mép KL

+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL……

 Quan sát vi th ể NS bằng phương pháp phòng ẩm

- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri

- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 9mm, khoan các khối thạch

- Chuẩn bị đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô

trùng

- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh

khối thạch Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch

- Các phiến kính có khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có

sẵn một ít bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng Các hộp petri này được bao và giữ trong tủ ấm 3 - 4 ngày

- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt dung dịch lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất

- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy

lá kính lên trên ta được tiêu bản thứ hai

- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm:

+ Hình dạng cuống sinh BT

+ Hình dạng thể bình

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

+ Đặc điểm BT đính, màu sắc, kích thước BT…

2.2.4 X ác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS

 Nguyên t ắc

Khi enzyme phân hủy chitin tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-β-D-glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrobenzoic acid), sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm [10]

* Thuốc thử DNS

- Dung dịch A: hòa tan 300 g muối Na-K tartrat kép vào trong 500 ml nước cất

- Dung dịch B: hòa tan 10 g 2-hydroxy 3,5-dinitrobenzoic acid vào 200 ml dung dịch NaOH 2N

- Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh không khí

 D ựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine

Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine như sau [10]:

- Thêm 5 ml nước cất vào mỗi ống, lắc đều, tiến hành đo OD ở bước sóng 535 nm

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase

 Nguyên t ắc: Hoạt độ enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng

glucosamine trong quá trình phân giải chitin Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan [3], [56]

 Cách ti ến hành thí nghiệm

Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1%

- Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin: Lấy 5 g chitin hòa tan trong 50 ml HCl đậm đặc Khuấy đều trong vòng 3 phút ở 400C Sau đó cho nước cất lạnh 50C từ từ tới 500 ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa

- Dịch huyền phù sẽ được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút) Rửa nước cất nhiều lần để pH đạt trung tính

- Sau đó bảo quản dịch huyền phù ở tủ lạnh (4 - 60

C)

Bước 2: Xác định hoạt độ enzyme chitinase

 V ới enzyme làm thí nghiệm

- Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày

- Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1 ml huyền phù chitin 1% và 1 ml dịch enzyme chitinase Hỗn hợp này được ủ ở 400

C trong vòng 60 phút

- Ngừng phản ứng bằng 1 ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút hoặc lọc, thu dịch nổi

- Cho 1 ml dịch nổi và 1ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh

- Thêm 5 ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sóng 535nm

 V ới dịch enzyme làm đối chứng

Cho 1 ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1 ml NaOH 1N, sau đó cho thêm 1 ml

dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên Lượng glucosamine tạo thành sau phản ứng thủy giải bởi enzyme chitinase được xác định theo phương pháp Elson- Morgan

m : khối lượng enzyme (g)

2.2.6 Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase trên MT bán rắn

 Nguyên t ắc: NS sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong MT để sinh trưởng, tổng

hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn

enzyme thô từ MT [21]

 Cách ti ến hành: Cân 10 gam MT bán rắn nuôi cấy NS thu enzyme chitinase vào

các bình tam giác 250 ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút, sau đó để nguội Dùng

giống trong ống thạch nghiêng, cho 10ml nước cất vô trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cà đều bề mặt lấy hết BT tạo dạng huyền phù Tiến hành đếm BT bằng buồng đếm hồng cầu Cho 1 ml huyền phù BT vào mỗi bình tam giác chứa MT đã chuẩn bị sao cho mật độ bào tử

a.n.v 1

v 2 t.m