khảo sát về mặt thực vật học và tác dụng kháng vi sinh vật của cây lục bình eichhornia crassipes (mart ) solms

Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao chiết từ cây Lục bình với các dung môi khác nhau.. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Khảo sát về mặt thực vật học và khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

ĐÀO THỊ KIM ANH

KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA

CÂY LỤC BÌNH [EICHHORNIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

ĐÀO THỊ KIM ANH

KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA

CÂY LỤC BÌNH [EICHHORNIA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Trương Thị Đẹp

TS Nguyễn Tú Anh

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào

Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định

TP Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 11 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Đào Thị Kim Anh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trương Thị Đẹp, TS Nguyễn Tú Anh - người

đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Trường, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, bộ môn Sinh học thực nghiệm - Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh,

bộ môn Thực vật, bộ môn Vi sinh - Kí sinh - Trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này

Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

TP Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 11 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Đào Thị Kim Anh

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

III ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 2

V PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

VI Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 2

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY LỤC BÌNH 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 3

1.1.3 Phân bố 3

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Bộ phận dùng 4

1.1.6 Tác dụng dược lí 4

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH 5

1.2.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình 5

1.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình 6

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU 7

1.3.1 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 7

1.3.1.1 Sự hòa tan 7

1.3.1.2 Sự khuếch tán 8

1.3.1.3 Sự thẩm thấu 8

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 8

1.3.2.1 Nguyên liệu 8

1.3.2.2 Dung môi 9

1.3.2.3 Kĩ thuật chiết 10

1.3.3.1 Phương pháp ngâm 10

1.3.3.2 Phương pháp ngấm kiệt 11

1.3.3.3 Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng 11

1.4 MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH 12

1.4.1 Staphylococcus aureus 12

1.4.2 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 12

1.4.3 Streptococcus faecalis 13

1.4.4 Escherichia coli 13

1.4.5 Pseudomonas aeruginosa 13

1.4.6 Candida albicans 14

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT 14

1.5.1 Phương pháp khuếch tán 14

1.5.2 Phương pháp pha loãng 14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 15

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 15

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Vật liệu khảo sát về thực vật học 15

2.2.2 Nguyên liệu chiết xuất 15

2.2.3 Vi sinh vật thử nghiệm 16

2.2.4 Hóa chất 16

2.2.5 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật 16

2.2.5.1 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 16

2.2.5.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật 17

2.2.6 Thiết bị sử dụng 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học 18

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái 18

2.3.1.2 Đặc điểm giải phẫu 18

2.3.2 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu 19

2.3.2.1 Phương pháp chiết nguội 19

2.3.2.2 Phương pháp chiết nóng 19

2.3.2.3 Phương pháp chiết phân đoạn 20

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 21

2.3.5 Phương pháp xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật 22

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC 24

3.1.1 Đặc điểm hình thái 24

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu 30

3.2 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT 38

3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết 38

3.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao Lục bình sau khi chiết

phân đoạn 43

3.3 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN

VI KHUẨN (MIC) 44KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48TÀI LIỆU THAM KHẢO 49PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture Collection - Bộ sưu tập chủng

chuẩn của Mĩ CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute - Tiêu chuẩn

thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh DMSO Dimethyl sulphoxide

OD Optical Density - Mật độ quang

MHA Mueller - Hinton Agar

MHB Mueller - Hinton Broth

MIC Minimum Inhibitory Concentration - Nồng độ tối thiểu

ức chế sinh trưởng vi sinh vật SDA Sabouraud Dextro Agar

TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh

TSA Trypticase Soy Agar

TSB Trypticase Soy Broth

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Tỉ lệ khối lượng khô từng bộ phận của cây Lục bình 38 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao toàn phần 39 Bảng 3.3 Tác động kháng khuẩn của cao EtOH từ căn hành với phương pháp

chiết và dung môi khác nhau 42

Bảng 3.4 Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết từ căn hành của cây

chưa ra hoa ở môi trường nước đứng 43

Bảng 3.5 Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết toàn cây của cây

đang ra hoa ở môi trường nước đứng 43

Bảng 3.6 MIC của mẫu căn hành ở cây chưa ra hoa trong môi trường nước đứng 44 Bảng 3.7 MIC của mẫu toàn cây ở cây đang ra hoa trong môi trường nước đứng 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Phương pháp chiết nguội 19

Hình 2.2 Phương pháp chiết nóng 20

Hình 2.3 Sơ đồ chiết phân đoạn 21

Hình 3.1 Cây Lục bình với lá mọc thành hình hoa thị 25

Hình 3.2 Phiến lá hình thận hoặc hình tim 26

Hình 3.3 Lục bình ở các môi trường sống khác nhau 26

Hình 3.4 Các cá thể Lục bình nối với nhau nhờ căn hành 27

Hình 3.5 Lục bình với rễ chùm 27

Hình 3.6 Rễ Lục bình 27

Hình 3.7 Cụm hoa 28

Hình 3.8 Hoa màu xanh nhạt hoặc xanh tím 28

Hình 3.9 Các phiến rời của bao hoa 29

Hình 3.10 Đài và tràng hoa 29

Hình 3.11 Hoa có 6 nhị (3 dài, 3 ngắn) 29

Hình 3.12 Hạt phấn 30

Hình 3.13 Bầu noãn cắt ngang 30

Hình 3.14 Vi phẫu rễ Lục bình 32

Hình 3.15 Một phần vi phẫu căn hành ở các môi trường sống khác nhau 33

Hình 3.16 Vi phẫu căn hành 34

Hình 3.17 Vi phẫu phiến lá 35

Hình 3.18 Một phần vi phẫu cuống lá 36

Hình 3.19 Một phần vi phẫu phần phình cuống lá 37

Hình 3.20 Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S aureus 41

Hình 3.21 Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S faecalis 41

Hình 3.22 MIC của mẫu căn hành ở cây chưa có hoa trong môi trường nước đứng 46

Hình 3.23 MIC của mẫu toàn cây ở cây có hoa trong môi trường nước đứng 46

MỞ ĐẦU

I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Kháng sinh là một trong những nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hay bán tổng hợp thường có độc tính cao, nhiều tác dụng phụ không mong muốn Bên cạnh đó, thực trạng kháng thuốc kháng sinh ngày càng tăng, đã và đang trở thành một thách thức đối với các bác sĩ lâm sàng Do đó, các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm các hoạt chất mới có tính kháng vi sinh vật, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc thực vật Vì hợp chất thiên nhiên thường an toàn trong sử dụng và hiện tượng kháng thuốc xảy ra chậm hơn

Cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms] có xuất xứ từ Brasil, được du

nhập và trồng làm cảnh ở Hà Nội (Việt Nam) từ năm 1905 Với đặc điểm sinh sản rất nhanh, Lục bình lan ra khắp nơi một cách nhanh chóng và phổ biến ở ao, hồ, kênh, rạch trong cả nước

Lục bình từ lâu đã được người dân biết đến như là một loài cây có nhiều công dụng: dùng làm thức ăn cho người, vật nuôi, làm phân bón hoặc dùng làm thuốc chữa sưng tấy, viêm đau Ngoài ra, nhờ khả năng hấp thu một số kim loại nặng mà Lục bình được sử dụng để giảm ô nhiễm môi trường, đặc biệt là môi trường nước Tuy nhiên, khi Lục bình sinh sản quá mức, chúng có thể gây tắc nghẽn dòng chảy

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về công dụng của cây Lục bình nhưng phần lớn đều tập trung vào tác dụng xử lí môi trường và chống ô nhiễm nguồn nước Trên thế giới cũng có một số nghiên cứu đề cập đến khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của loài cây này Vì vậy, đề tài này tiến hành khảo sát về mặt thực vật học và tác dụng

kháng vi sinh vật của cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms]

II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Sàng lọc những dược liệu có nguồn gốc từ thực vật thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

III ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms]

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

1 Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu của cây Lục bình ở môi trường nước đứng và môi trường nước chảy, bổ sung những điểm khác biệt của Lục bình ở hai môi trường (nếu có); tìm hiểu nguyên nhân ảnh hưởng đến sự sai khác

2 Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao chiết từ cây Lục bình với các dung môi khác nhau Từ đó, xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao dược liệu đối với các chủng vi sinh vật trên

V PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Khảo sát về mặt thực vật học và khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình được thu hái tại sông Sài Gòn (TP.HCM) và các ao nước đọng ở Bình Dương, tại các vị trí môi trường nước đứng và môi trường nước chảy trên các chủng vi sinh vật thử nghiệm gồm các chủng vi khuẩn chuẩn của ATCC được lưu giữ tại Bộ môn Vi sinh – Kí sinh

(Khoa Dược – Trường Đại học Y dược TP.HCM): Staphylococcus aureus ATCC

29213, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 và nấm men Candida albicans ATCC 10231

VI Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

1 Ý nghĩa khoa học: góp phần xây dựng thư viện dữ liệu về các cao chiết có khả năng kháng vi sinh vật có nguồn gốc từ thực vật ở Việt Nam

2 Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp số liệu thực nghiệm nhằm giải thích dựa trên những bằng chứng khoa học một số bài thuốc dân gian sử dụng Lục bình để chữa một số bệnh nhiễm khuẩn ngoài da Kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho

các nghiên cứu tiếp theo đánh giá khả năng kháng khuẩn in vivo của cao chiết

từ Lục bình

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY LỤC BÌNH

Loài Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms]

Tên khác: Bèo tây, Bèo sen, Bèo Nhật Bản hay Lộc bình

Tên nước ngoài: Water hyacinth (Anh), Jacinthe d’eau (Pháp) [4], [8]

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Cây thảo sống nhiều năm, nổi ở nước hoặc bám trên đất bùn, căn hành dài, mang một chùm rễ dài và rậm ở phía dưới Kích thước cây thay đổi tùy theo môi trường sống

có nhiều hay ít chất màu

Lá mọc thành hoa thị, có cuống phồng lên thành phao nổi, gân lá hình cung, phiến lá hình tròn hay hình tim

Cụm hoa bông hay chùy ở ngọn thân Hoa không đều, màu xanh nhạt hay tím; đài và tràng cùng màu, dính liền với nhau ở gốc, cánh hoa trên có một đốm vàng; 6 nhị (3 dài, 3 ngắn); bầu trên, 3 ô, chứa nhiều noãn nhưng chỉ có một cái sinh sản Quả nang [4], [8]

Lục bình thường ra hoa từ khoảng tháng 10 đến tháng 11 hàng năm [8]

1.1.3 Phân bố

Cây gốc ở Brasil, năm 1905 được đem về trồng làm cảnh ở Hà Nội Về sau lan ra khắp nơi một cách nhanh chóng Phổ biến ở các ao, hồ, kênh, rạch trong cả nước Ngoài ra còn phân bố ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới, đặc biệt là các nước vùng

Nam Á và Đông Nam Á Do khả năng tạo nhánh khỏe từ các chồi gốc, cây nhanh chóng phát triển thành những đám hay bè mảng lớn Cây còn được nuôi trồng hạn chế trên các ao hồ thả cá, làm thức ăn cho lợn, trâu bò và là nguồn phân xanh tốt [4], [8]

Ở Bengal (Ấn Độ) người ta ước tính diện tích mặt nước có Lục bình chiếm giữ đến 30.000 hecta [8]

1.1.4 Thành phần hóa học

Toàn cây Lục bình chứa 92,6% là nước, 2,9% protein, 0,9% đường, 2,2% xơ, 1,4% tro – trong đó có 40,8% calci, 0,8% phospho, 0,86% carotenoid, 20% vitamin C Thành phần vô cơ trong cây là SiO2, Ca, Mg, K, Na, Cl, Cu, Mn, Fe Trong lá có Ca,

Fe, P, Mg, Zn, Cu, Na, K, S Ngoài ra, còn có các vitamin B2, B1, E, B6, B12, protein, acid béo tự do, đường, acid amin Trong hoa có delphinidin diglucosid [4], [8]

1.1.5 Bộ phận dùng

Dùng phần cuống lá phồng lên thành phao nổi để làm thuốc Sau khi lấy cây về, rửa sạch, bỏ thân và rễ, chỉ lấy lá, chủ yếu là phần phình của cuống lá Có nơi dùng toàn cây [6]

1.1.6 Tác dụng dược lí

Vị nhạt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, chống nóng, lợi tiểu, giải độc, giảm sưng, giảm đau Dùng chữa sưng tấy, viêm đau như sưng bắp chuối, bị áp xe sau khi tiêm, sưng nách, viêm khớp ngón tay, viêm hạch: lá tươi cả cuống, rửa sạch, thêm muối (8 – 10g muối cho 100g lá), giã nát, đắp lên chỗ sưng, băng lại, sau 10 – 12 giờ tháo ra, thay thuốc khác, làm 2 – 3 lần Nên đắp cách đêm, từ tối hôm trước đến sáng hôm sau Trong khi chữa không phải tiêm hay uống thuốc kháng sinh [4], [8]

Ở Ấn Độ, hoa được dùng làm thuốc chữa bệnh về đường hô hấp Người dân ta còn dùng Lục bình làm thuốc chữa các vết thương trên cơ thể bị nhiễm chất độc hóa học Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn cây làm thuốc trị cảm mạo phát nhiệt, tiểu tiện

đỏ đau, mụn nhọt sưng đỏ [4], [8]

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH

1.2.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng vi sinh vật của

Lục bình

Bikash Baral và Bijaya Laxmi Maharjan (2011) khi khảo sát năm loài thực vật ngoại lai ở Nepal đã phát hiện khả năng kháng khuẩn của chúng, trong đó có Lục bình Dịch chiết methanol và dịch chiết nước của Lục bình được thử tác dụng trên mười loài

vi khuẩn và chín loài nấm Kết quả cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật của các dịch chiết thay đổi tùy thuộc vào loại dung môi sử dụng, phương pháp chiết xuất và chủng

vi sinh vật [13]

Một nghiên cứu khác của Bikash Baral và cộng sự (2011) đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của Lục bình khi sử dụng chloroform và ethanol để chiết xuất Dịch chiết nóng với chloroform cho thấy vùng ức chế vi khuẩn tăng trưởng có đường kính < 13 mm, ở nấm có đường kính vòng kháng < 12 mm; trong khi dịch chiết lạnh có khả năng kháng nấm với đường kính vòng kháng < 13 mm nhưng lại không có hoạt tính kháng khuẩn Tương tự, dịch chiết nóng với ethanol có đường kính vùng ức chế vi khuẩn tăng trưởng < 19 mm, ở nấm có đường kính vòng kháng < 20 mm, trong khi dịch chiết lạnh cho kết quả đường kính vòng kháng khuẩn < 10 mm và khả năng kháng nấm với vùng ức chế nấm tăng trưởng có đường kính < 14 mm Nghiên cứu cho thấy phương pháp chiết nóng dùng để chiết xuất các hợp chất kháng vi sinh vật ở cây Lục bình có kết quả tốt hơn so với phương pháp chiết lạnh [14]

P Lalitha và cộng sự (2012) nghiên cứu dịch chiết từ lá Lục bình tươi với các dung môi khác nhau, tất cả đều có hoạt tính kháng vi sinh vật đáng kể khi thử trên một

số chủng vi khuẩn và vi nấm (Rhodospirillum rubrum, Aspergillus fumigates, Micrococcus luteus, Monoscus ruber) Trong số các dung môi thử nghiệm thì dịch

chiết Lục bình với etyl acetate có khả năng kháng khuẩn tốt nhất [16]

Sanaa Shanab và cộng sự (2012) nghiên cứu hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của Lục bình Dịch chiết methanol cho thấy cây chứa các hợp chất có

tính kháng khuẩn và kháng nấm, trong đó hoạt tính kháng khuẩn cao đối với S faecalis với đường kính vòng kháng khuẩn khoảng 14 ± 0,2 mm [21]

Hiba Hazim Hamid và cộng sự (2013) nghiên cứu khả năng chống oxi hóa và kháng khuẩn của một số chiết xuất từ lá Lục bình Dịch chiết với ethanol có hoạt tính

kháng khuẩn rõ ràng đối với tất cả các chủng vi khuẩn thử nghiệm, ức chế tốt nhất S aureus (đường kính vùng ức chế 20 mm) Dịch chiết với nước thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn rất yếu, trong khi chiết xuất với chloroform cho hoạt tính kháng khuẩn tốt đối

với S faecalis với vùng ức chế là 16 mm [17]

P Lalitha và cộng sự (2013) nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các dịch chiết từ Lục bình Kết quả thể hiện khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của cây đối với chủng thử nghiệm, trong đó khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với khả năng kháng nấm Dịch chiết acetone của Lục bình thể hiện hoạt tính cao hơn so với các dung môi khác [19]

Từ các công trình trên cho thấy, dịch chiết từ cây Lục bình có chứa các chất kháng khuẩn và kháng nấm Tuy nhiên, mức độ kháng vi sinh vật lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: dung môi chiết xuất, phương pháp chiết xuất và loại vi sinh vật thử nghiệm

1.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình

Các nghiên cứu về khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình ở Việt Nam ít được quan tâm Chỉ có một nghiên cứu của Trần Đình Bình và cộng sự (2012) khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số loài cây thuốc ở Huế, tác giả đã tìm thấy 18 cây thuốc thường dùng trong dân gian, trong đó Lục bình có hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn khác nhau Kết quả cho thấy dịch chiết của các cây thuốc ở nồng độ

0,05 - 0,1 g/ml có tác dụng kháng P aeruginosa, S aureus, E coli [1]

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước cho thấy Lục bình mang lại nhiều tác dụng tốt nhờ thành phần hóa học đa dạng với các hợp chất có khả năng kháng được nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh ở người

Trong đời sống, từ lâu người dân đã biết dùng Lục bình để chữa trị những vết thương ngoài da Tuy nhiên, Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng

kháng vi sinh vật của cây Lục bình Dù Lục bình du nhập vào Việt Nam khá lâu nhưng đến nay các nghiên cứu vẫn thường tập trung vào khả năng xử lí môi trường hoặc làm thức ăn cho vật nuôi Vì vậy, đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của Lục bình cần được thực hiện để có thể khai thác một cách hiệu quả loài cây này như một ứng viên dược phẩm tiềm năng

Dược liệu có nguồn gốc từ thực vật được sử dụng bằng nhiều cách khác nhau như sao thuốc, sắc thuốc, chưng thuốc, hãm thuốc, ngâm thuốc, xông thuốc,… trong

đó chiết xuất hoạt chất từ dược liệu là một trong những phương pháp được dùng khá phổ biến

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU

Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất [6]

Trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống, chất tan có thể nằm bên trong

tế bào, cách biệt với môi trường bên ngoài bởi vách tế bào Vì vậy, các chất sau khi hòa tan phải vượt qua vách tế bào để đi vào dịch chiết Do vậy, quá trình chiết chất tan

từ các tổ chức sinh học thường được gọi là quá trình “chiết xuất” [6]

1.3.1 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất

Trong chiết xuất có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra là: sự hòa tan, sự khuếch tán và sự thẩm thấu qua vách tế bào [6], [7]

1.3.1.1 Sự hòa tan

Khi cho dược liệu tiếp xúc với dung môi, dung môi sẽ thấm vào tế bào dược liệu Các chất tan sẽ hoà tan vào dung môi xung quanh nó tạo thành dung dịch Sự hoà tan chủ yếu là quá trình vật lý trong đó chất tan được solvat hóa và kéo vào dung môi Tuy nhiên, quá trình hóa học đôi khi cũng xảy ra như khi hoà tan các chất kiềm trong dung môi có tính acid hay ngược lại [6], [7]

Quá trình hoà tan xảy ra nhanh hay chậm phụ thuộc vào khả năng hoà tan của chất tan trong dung môi, diện tích bề mặt tiếp xúc của chất tan với dung môi, nhiệt độ

và sự khuếch tán của chất tan trong dung môi [6], [7]

1.3.1.2 Sự khuếch tán

Khi cho dung môi tiếp xúc với các tiểu phần dược liệu, ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan, dung dịch có nồng độ cao hơn những nơi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan, tạo nên sự chênh lệch nồng độ Quá trình khuếch tán xảy ra nhằm cân bằng sự chênh lệch nồng độ này Các phân tử chất tan sẽ di chuyển từ nơi có nồng độ cao tới nơi có nồng độ thấp hơn, nhờ vậy chất tan có mặt đồng đều trong dung dịch

Sự khuếch tán trong dung dịch xảy ra do chuyển động nhiệt của phân tử (chuyển động Brown) chất tan cũng như của dung môi Sự khuếch tán thúc đẩy quá trình hoà tan và kéo chất tan từ các tế bào bị phá vỡ ra khỏi tế bào, đi vào dịch chiết [6], [7]

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán gồm: sự chênh lệch nồng

độ, nhiệt độ và độ nhớt của dung môi [6], [7]

1.3.1.3 Sự thẩm thấu

Vách tế bào thực vật có cấu tạo cellulose và hemicellulose với những kênh bào tương (các ống trao đổi) nối giữa các tế bào Khi khuếch tán qua các kênh bào tương, đường kính của các kênh sẽ quyết định kích thước và vận tốc của những phân tử có thể qua màng Các chất có kích thước nhỏ hơn kênh bào tương đa số là các chất chuyển hóa thứ cấp sẽ đi qua dễ dàng trong khi các chất có phân tử lượng lớn như protein, polysaccharid, sẽ khó qua hơn và được giữ lại trong tế bào Như vậy, sự thẩm thấu qua vách tế bào làm cho quá trình hoà tan, chiết xuất có tính chọn lọc hơn Quá trình hoà tan, chiết xuất giúp kéo chất tan ra khỏi các tế bào còn nguyên vẹn và đi vào dịch chiết So với sự hoà tan đơn giản, sự hòa tan, chiết xuất xảy ra chậm hơn và chọn lọc hơn [6], [7]

Các yếu tố chính ảnh hưởng tới quá trình thẩm thấu gồm: sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài tế bào, cấu trúc của vách tế bào, kích thước dược liệu, kích thước chất tan, nhiệt độ, độ nhớt của dung môi [6], [7]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

1.3.2.1 Nguyên liệu

Đặc điểm nguyên liệu: độ dày của vách tế bào hay chiều dài của các kênh bào

tuơng càng lớn thì quá trình hoà tan chiết xuất xảy ra càng chậm Nếu các nguyên liệu

là gỗ thì quá trình chiết sẽ chậm hơn các nguyên liệu là lá hay cánh hoa Đường kính các kênh bào tương càng lớn, các chất đi qua vách tế bào càng dễ dàng Quá trình chiết xuất càng xảy ra nhanh [6], [7]

Kích thước nguyên liệu: nguyên liệu càng được chia nhỏ thì quá trình hoà tan đơn

giản càng tăng và thời gian khuếch tán chất tan vào dịch chiết sẽ giảm, thời gian thẩm thấu qua vách tế bào giảm sẽ giúp quá trình chiết nhanh hơn Tuy nhiên, khi chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình hòa tan, chiết xuất sẽ giảm, dịch chiết xuất hiện nhiều tạp chất Vì vậy, lượng cao chiết tăng lên nhiều, đồng thời thành phần dịch chiết phức tạp và khó tách các chất thành phần [6], [7]

Chất tan: độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng

nhanh Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách

tế bào càng giảm Dạng thù hình của chất tan có ảnh hưởng nhiều đến tốc độ hoà tan Các chất tồn tại dưới dạng vô định hình sẽ hoà tan nhanh hơn do bề mặt tiếp xúc với dung môi lớn, lực liên kết giữa các phân tử trong pha rắn nhỏ, dễ bị phá vỡ Đa số các chất tan trong tế bào dược liệu khô tồn tại dưới dạng vô định hình, trong một hỗn hợp gồm nhiều chất nên sự hoà tan xảy ra nhanh hơn so với dạng tinh thể hay đơn chất Tuy nhiên, cũng có trường hợp các chất khác làm cản trở sự hoà tan do tạo phức hợp khó tan với chất tan như trường hợp tannat alkaloid hay ngăn cản sự tiếp xúc của dung môi với chất tan như khi chiết dược liệu nhiều chất béo với dung môi phân cực; chất nhầy, protein khi chiết dược liệu với dung môi không phân cực [6], [7]

1.3.2.2 Dung môi

Khả năng hoà tan của dung môi: khả năng hoà tan của dung môi với chất tan

càng lớn, quá trình hoà tan càng nhanh, làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn Khả năng hoà tan các chất trong các dung môi khác nhau thì khác nhau, phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và của dung môi Khả năng hoà tan chất tan của dung môi có thể dự đoán được dựa vào độ phân cực của dung môi, theo nguyên tắc: dung môi phân cực hoà tan các chất phân cực, dung môi kém phân cực hoà tan các chất kém phân cực

Độ phân cực của dung môi được đánh giá bằng hằng số điện môi Hằng số điện môi càng lớn, dung môi càng phân cực [6], [7]

Độ nhớt của dung môi: độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế

bào, sự khuếch tán của chất tan và dung môi xảy ra càng dễ dàng, quá trình chiết xảy

ra càng nhanh và ngược lại [6], [7]

Sự thấm dung môi qua vách tế bào: vách tế bào thực vật cấu tạo bởi cellulose Ở

trạng thái tươi, nước trên vách cũng như trong tế bào ngăn cản không cho dung môi kém phân cực, ít tan trong nước, thấm vào tế bào hay tiếp xúc với chất tan, làm quá trình chiết với dung môi này khó khăn hơn Ở tế bào khô, lớp nước ngăn cách này đã

bị bay hơi mất nên quá trình chiết sẽ dễ dàng hơn với dung môi kém phân cực [6], [7]

1.3.2.3 Kĩ thuật chiết

Sự khuấy trộn: sự khuấy trộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch

bên ngoài các tiểu phần dược liệu, giúp “giải toả” lớp dịch chiết đậm đặc ngay sát tiểu phần dược liệu bằng phương pháp cơ học Sự chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài

tế bào tăng lên nên quá trình thẩm thấu xảy ra nhanh hơn [6], [7]

Nhiệt độ: tăng nhiệt độ làm tăng khả năng hoà tan của chất tan vào dung môi và

đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làm tăng chuyển động nhiệt của phân tử và giảm độ nhớt của dung môi, dẫn tới tăng khả năng và tốc độ hoà tan, tăng quá trình khuếch tán, làm cân bằng nồng độ [6], [7]

Áp suất: tăng áp suất sẽ làm tăng tốc độ thấm dung môi vào nguyên liệu Tăng áp

suất thường đi kèm với tăng nồng độ dung dịch [6], [7]

1.3.3 Phương pháp chiết xuất dược liệu

Phương pháp chiết xuất thường chỉ tác động đến các yếu tố bên ngoài, nhằm đạt được hiệu quả chiết xuất cao trong thời gian ngắn đối với từng loại nguyên liệu Tùy theo đặc điểm của từng loại dược liệu để chọn phương pháp chiết xuất thích hợp Một

số phương pháp chiết thường gặp: phương pháp ngâm, phương pháp ngấm kiệt, phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng… [6]

1.3.3.1 Phương pháp ngâm

Phương pháp ngâm: là một phương pháp chiết gián đoạn, trong đó dung môi tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút ra

khỏi thiết bị cùng một lúc Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm một hoặc vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu [6]

Sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng,… có thể được

sử dụng để gia tăng hiệu suất quá trình chiết [6]

- Phương pháp ngâm lạnh: dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng Thông thường, thời gian ngâm không dưới mười hai giờ với các dược liệu mỏng hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được hoàn tất Trong suốt quá trình ngâm sẽ tạo cân bằng về nồng độ hoạt chất giữa bên trong và bên ngoài thành tế bào Thời gian ngâm có thể rất khác nhau tùy theo dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất [6]

- Phương pháp ngâm nóng là phương pháp ngâm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi [6]

Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn [6]

1.3.3.2 Phương pháp ngấm kiệt

Ngấm kiệt là phương pháp chiết liên tục, trong đó dung môi đi qua dược liệu theo một hướng nhất định với tốc độ nhất định Quá trình hòa tan xảy ra ở phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp đến nơi có lượng hoạt chất cao hơn Do vậy, quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn so với phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt… có thể dùng để gia tăng hiệu suất của quá trình chiết [6]

1.3.3.3 Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng

Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố [6]

Để đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của cao Lục bình thường sử dụng một số

chủng vi sinh vật gây bệnh ngoài da, bệnh đường ruột hay bệnh đường hô hấp như S aureus, MRSA, S faecalis, E coli, P aeruginosa, C albicans

1.4 MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH

1.4.1 Staphylococcus aureus

S aureus là cầu khuẩn Gram dương, thuộc họ Staphylococcaceae, sắp xếp đặc trưng dạng chùm nho, không di động, kị khí tùy ý, không sinh bào tử, có khả năng

chịu được nhiệt độ 600

C trong 30 phút So với những vi khuẩn khác, chúng có khả năng chịu chất tẩy trùng (phenol, clorid thủy ngân) và chịu được tác động của áp suất thẩm thấu Vi khuẩn có khả năng tiết β-lactamase nên đề kháng được kháng sinh nhóm

lactam S aureus sống cộng sinh trên da, mũi, họng của người Thông thường, chúng

không nguy hiểm, nhưng có thể gây bệnh khi vượt qua hàng rào bảo vệ của da hoặc

lớp màng nhày, đó là khi lớp da bị tổn thương S aureus gây vết thương mưng mủ và

hoại tử mô, có thể dẫn đến vết thương ở tĩnh mạch, đặc biệt là những khối huyết nhiễm

khuẩn có thể gây viêm màng trong tim, viêm phổi, viêm màng não, viêm tủy S aureus gây nhiễm vết thương trên da, dưới da, niêm mạc: trên da gây mụn nhọt, chốc

lở, gây biến chứng nhiễm khuẩn huyết S aureus gây bệnh Ritter, còn gọi là hội chứng

“bỏng da” S aureus chủ yếu gây bệnh chốc lở, nhiễm trùng xảy ra ở bề mặt nông hơn, xuất hiện những nốt phồng rỉ nước vàng S aureus sản sinh độc tố, gây sốt, nôn mửa,

tiêu chảy, sau đó đau họng, đau cơ, phát ban rồi tróc da, nhất là lòng bàn tay và bàn chân Huyết áp tăng đột ngột dẫn đến sốt và trụy tim [12]

1.4.2 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

MRSA là cầu khuẩn Gram dương có khả năng đề kháng nhiều loại kháng sinh MRSA gây nhiễm khuẩn “Staph” không đáp ứng điều trị với kháng sinh thông thường MRSA là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn khá phổ biến trong môi trường bệnh viện Năm 1974, tỉ lệ bệnh nhân nhiễm MRSA trên tổng số các ca nhiễm “Staph” là 2%; năm 1995, con số này là 22%, năm 2004 tăng lên 63% MRSA thường xuyên nhất ở những bệnh nhân thực hiện các thủ thuật y khoa xâm lấn hoặc người có hệ thống miễn dịch suy yếu và nằm điều trị tại bệnh viện MRSA ở môi trường bệnh viện thường gây

ra những bệnh nhiễm khuẩn nghiêm trọng và đe dọa sự sống như nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn vết mổ và viêm phổi Bệnh nhân nhiễm vi khuẩn đề kháng kháng sinh như MRSA sẽ làm kéo dài thời gian điều trị và tốn kém chi phí hơn [22]

1.4.3 Streptococcus faecalis

S faecalis là vi khuẩn Gram dương, xếp thành chuỗi đặc trưng, không di động,

không sinh bào tử, sống trong hệ tiêu hóa của người và động vật có vú, có thể sống

trong đất đến 77 ngày S faecalis hiện diện nhiều trên vết thương và vết bỏng Chúng

có khả năng gây bệnh viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính và

viêm van tim S faecalis đề kháng với nhiều kháng sinh như aminoglycosid,

aztreonam, cephalosporin, clindamycin, các penicillin bán tổng hợp, nafcillin, oxacillin và trimethoprim-sulfamethoxazole, tình trạng kháng vancomycin cũng đang trở nên phổ biến hơn [25]

1.4.4 Escherichia coli

E coli là trực khuẩn Gram âm, có các tính chất cơ bản của vi khuẩn đường ruột:

lên men glucose, lactose nhanh, tạo acid, tạo gas, dễ phát triển trên các môi trường

nuôi cấy thông thường E coli sống bình thường trong ruột người và động vật, nhiều nhất ở ruột già Trước đây, E coli được xem như những vi khuẩn bình thường trong

ruột, hiện nay có nhiều chủng được xem là một trong những tác nhân gây tiêu chảy, đặc biệt ở trẻ em Chúng có thể sản xuất ngoại độc tố enterotoxin, hemolysin, enzyme β-lactamase phá hủy một số kháng sinh, bacteriocin Khả năng gây bệnh rất đa dạng tùy thuộc vào vị trí vi khuẩn xâm nhập Gồm hai loại: nhiễm khuẩn ngoài ruột (thường nhất là gây nhiễm đường niệu, có thể gây nhiễm bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm khuẩn huyết, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh), nhiễm khuẩn ruột (gây viêm ruột tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lị hay tiêu chảy hội chứng tả) [12]

1.4.5 Pseudomonas aeruginosa

P aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm Chúng chết nhanh chóng ở

1000C; trong môi trường ấm, thoáng và không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng có thể sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu, 50

C có

thể sống được hơn 6 tháng Trong cơ thể người, P.aeruginosa hiện diện thường xuyên

trong đường tiêu hóa và một số nơi ẩm ướt trong cơ thể như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay,… Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trưởng trong các môi trường như

chất khử trùng, xà phòng, nước cất,… P aeruginosa là loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội

như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh cấp tính hoặc mãn tính, khi dùng

corticoid lâu dài, sử dụng kháng sinh tùy tiện, vết bỏng, vết thương hở,… Chúng có

thể gây nhiều bệnh khác nhau như viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm

phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm

tủy xương, viêm tai, nhiễm trùng da, mô mềm,…[27]

1.4.6 Candida albicans

C albicans là một loại nấm men có trên da và trong niêm mạc như âm đạo,

miệng hoặc đường ruột C albicans sống hoại sinh trong cơ thể người, thường trực ở

cơ quan tiêu hóa hoặc được tìm thấy ở môi trường sinh hoạt của người Thông thường

chúng không nguy hiểm nhưng khi tăng trưởng mạnh có thể gây nên những bệnh khá

nghiêm trọng như viêm miệng, viêm âm đạo, viêm đại tràng,… C albicans là tác nhân

gây bệnh nhiễm trùng âm đạo nội sinh (khoảng 90%), bệnh hay gặp ở phụ

nữ [24], [26]

Để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của một hợp chất, một số phương pháp

thường được sử dụng theo hướng dẫn của CLSI [18]

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT

1.5.1 Phương pháp khuếch tán

Nguyên tắc: chất thử từ đĩa giấy hay từ giếng đục trong thạch sẽ khuếch tán vào

môi trường thạch chứa chất dinh dưỡng thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật đã cấy vi

khuẩn hay vi nấm thử nghiệm trên mặt thạch Mức độ tác động của chất thử được đánh

giá dựa vào đường kính vòng kháng vi sinh vật [11]

1.5.2 Phương pháp pha loãng

Nguyên tắc: việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC dựa vào phương pháp

pha loãng trong môi trường rắn hoặc lỏng Chất thử được pha loãng ½ liên tục trong

môi trường, sau đó cho vào lượng vi khuẩn xác định Sau thời gian ấp, tìm nồng độ

thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của vi khuẩn khi quan sát bằng mắt thường [10]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian nghiên cứu

- Thu mẫu Lục bình tươi từ tháng 10/2013 – 2/2014, chia thành nhiều đợt Mẫu Lục bình tươi được dùng để khảo sát đặc điểm thực vật học Mẫu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô để có mẫu dược liệu khô

- Tiến hành chiết cao dược liệu và xác định khả năng ức chế vi sinh vật của từng loại cao chiết từ tháng 3/2014 – 5/2014 Chọn các mẫu cao có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt nhất, tiến hành tách phân đoạn và xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Thu mẫu Lục bình tươi ở vùng nước đứng tại một số ao nước đọng thuộc địa phận tỉnh Bình Dương Mẫu Lục bình ở khu vực nước chảy được thu tại một số địa điểm trên lưu vực sông Sài Gòn ở thành phố Hồ Chí Minh

- Khảo sát đặc điểm thực vật của Lục bình tại Bộ môn Thực vật - Khoa Dược – Trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh

- Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao chiết từ Lục bình tại Bộ môn Vi sinh

- Kí sinh - Khoa Dược - Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Vật liệu khảo sát về thực vật học

Cây Lục bình tươi được thu từ sông Sài Gòn (TP.HCM) và các ao nước đọng ở Bình Dương tại các vị trí môi trường nước đứng và môi trường nước chảy

2.2.2 Nguyên liệu chiết xuất

Mẫu cây được rửa sạch, tách riêng từng bộ phận lá, căn hành và phát hoa; phơi dưới bóng râm khoảng 7 – 10 ngày, bảo quản ở nhiệt độ thường, để nơi khô ráo, tránh

ẩm ướt Mẫu sau khi phơi khô được nghiền nhỏ làm vật liệu nghiên cứu và đánh số thứ tự:

(1): lá và căn hành của cây chưa ra hoa ở môi trường nước đứng

(2): lá của cây chưa ra hoa ở môi trường nước đứng

(3): căn hành của cây chưa ra hoa ở môi trường nước đứng

(4): lá, phát hoa và căn hành của cây đang ra hoa ở môi trường nước đứng

(5): lá của cây đang ra hoa ở môi trường nước đứng

(6): căn hành của cây đang ra hoa ở môi trường nước đứng

(7): phát hoa của cây đang ra hoa ở môi trường nước đứng

(8): lá và căn hành của cây chưa ra hoa ở môi trường nước chảy

(9): lá của cây chưa ra hoa ở môi trường nước chảy

(10): căn hành của cây chưa ra hoa ở môi trường nước chảy

(11): lá, phát hoa và căn hành của cây đang ra hoa ở môi trường nước chảy (12): lá của cây đang ra hoa ở môi trường nước chảy

(13): căn hành của cây đang ra hoa ở môi trường nước chảy

(14): phát hoa của cây đang ra hoa ở môi trường nước chảy

2.2.3 Vi sinh vật thử nghiệm

- Vi khuẩn Gram dương: S.aureus, MRSA, S faecalis

- Vi khuẩn Gram âm: E coli, P.aeruginosa

- Nấm men: C albicans

2.2.4 Hóa chất

- Ethanol 96 (VN- CHEMSOL CO., LTD, Việt Nam)

- n – hecxan (VN- CHEMSOL CO., LTD, Việt Nam)

- Etyl acetat (VN- CHEMSOL CO., LTD, Việt Nam)

- Đĩa giấy tẩm kháng sinh Ciprofloxacin 5 µg/đĩa, Vancomycin 30 μg/đĩa (Công

ty TNHH Nam Khoa, Việt Nam)

2.2.5 Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật

2.2.5.1 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường Tryptic Soy Agar (TSA - Merck)

- Môi trường Tryptic Soy Broth (TSB - Merck)

2.2.5.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật

- Môi trường Mueller - Hinton Agar (MHA – Merck)

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Máy quang phổ Varian (Australia)

- Máy vortex CLP (Mĩ)

- Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật)

- Tủ lạnh Hitachi (Nhật)

- Máy ảnh Canon (Nhật)

- Các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm: đĩa Petri (đường kính 60 mm và 90 mm), Pipet (5 ml, 10 ml), Erlen (25 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml), ống nghiệm thủy tinh, Eppendorf, ống đong (25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml), pipetman, que cấy, chén sứ, đũa thủy tinh, giấy lọc, phễu, đèn cồn, bông thấm nước, bông không thấm nước,…

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái

Dùng kính lúp cầm tay, thị kính và kính hiển vi quang học để quan sát các bộ phận, chụp hình minh họa

Phân tích và mô tả đặc điểm hình thái của các bộ phận (thân, lá, hoa, căn hành)

2.3.1.2 Đặc điểm giải phẫu

- Phương pháp cắt vi phẫu

+ Cầm mẫu vật cần cắt đặt trên bàn, dùng dao lam cắt mẫu thành những lát thật mỏng Khi cắt, dao lam được đặt thẳng góc với mẫu vật

+ Vị trí cắt trên mẫu vật thay đổi tùy theo cơ quan:

Đối với phiến lá: Cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng không sát đáy phiến Đối với rễ: Cắt ngang đoạn rễ có đường kính lớn hơn 1 mm

Đối với cuống lá: Cắt ở 1/3 phía đáy cuống chừa phần sát chỗ nối cuống lá

và thân

- Phương pháp nhuộm vi phẫu:

+ Ngâm vi phẫu đã cắt trong nước javel đến khi mẫu trắng

+ Rửa sạch vi phẫu bằng nước (3 – 4 lần)

+ Ngâm vi phẫu đã rửa vào dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút

+ Rửa nước để loại bỏ hết acid acetic

+ Nhuộm mẫu trong dung dịch thuốc nhuộm (đỏ son phèn – lục iod) khoảng

15 – 20 phút

+ Rửa sạch vi phẫu bằng nước

+ Ngâm trong nước thường hay trong dung dịch glyceryl 50%

+ Lên tiêu bản và quan sát

Quan sát vi phẫu bằng kính hiển vi quang học Mỗi bộ phận quan sát từ 5

-10 lát cắt Mô tả và chụp hình cấu trúc vi phẫu

2.3.2 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu

2.3.2.1 Phương pháp chiết nguội

Hoạt chất từ 10 g mẫu dược liệu khô được chiết với 100 ml Ethanol 96% hoặc Ethanol 70% bằng phương pháp chiết nguội ở nhiệt độ phòng Tiến hành chiết 03 lần: lần đầu chiết 10 g dược liệu khô với 100 ml dung môi, phần bã dược liệu thu được tiếp tục chiết thêm 02 lần (mỗi lần chiết với 50 ml dung môi), bay hơi dung môi dịch chiết

ở 500C, thu cao lỏng tỉ lệ 1:1 (1 g dược liệu/1 ml cao lỏng) (hình 2.1)

Mẫu dược liệu khô

Cao lỏng 1:1 (1 g dược liệu/1 ml cao lỏng)

Dịch chiết cồn

Ethanol 96% hoặc 70%

Ngâm 24 giờ, lọc Chiết 03 lần (Dược liệu/dung môi: 1g/10ml)

Bay hơi ở 500

C

Hình 2.1 Phương pháp chiết nguội

2.3.2.3 Phương pháp chiết phân đoạn

Nguyên tắc: dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất trong dược liệu để tách thành các phân đoạn bằng dãy dung môi có độ phân cực tăng dần

Chọn mẫu dược liệu cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất để tiến hành tách phân đoạn theo hình 2.3 Các phân đoạn sau khi tách được dùng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ

Mẫu dược liệu khô

Cao lỏng 1:1 (1 g dược liệu/1 ml cao lỏng)

Dịch chiết cồn

Ethanol 96% hoặc 70%

Chiết 03 lần ở 700

C (Dược liệu/dung môi: 1g/10ml)

Bay hơi ở 500

C

Hình 2.2 Phương pháp chiết nóng

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật

Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán: vi sinh vật thử nghiệm được trải trên đĩa thạch chứa môi trường phù hợp, chất thử

ở dạng dung dịch được cho vào các lỗ đục trên bản thạch Sự khuếch tán của chất thử

ra đĩa thạch ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật tạo thành vòng ức chế Đường kính của vòng ức chế này tỉ lệ với hoạt lực kháng vi sinh vật

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: vi khuẩn khảo sát được phân lập trên môi trường

TSA, ủ ở 37 0

C trong 18 – 24 giờ Hoạt hóa vi khuẩn bằng cách lấy 3 - 5 khóm khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB, ủ từ 2 – 6 giờ ở 37 0

C Chỉnh độ đục vi khuẩn bằng môi trường TSB sao cho mật độ thu được tương đương OD600 ~ 0,08 – 0,1 (108CFU/ml) Tiếp tục pha loãng vi khuẩn bằng môi trường TSB đến khi mật độ vi khuẩn đạt (106

CFU/ml) Vi khuẩn đã chuẩn bị được sử dụng trong vòng 15 phút

Dịch chiết cồn

n - hexan

Etyl acetat

Dịch chiết Etyl acetat

Dịch chiết cồn

Chuẩn bị huyền dịch vi nấm: vi nấm C.albicans được phân lập trên môi trường

SDA, ủ ở 37 0

C trong 48 giờ Chọn 1 – 2 khóm vi nấm phân tán trực tiếp vào nước muối sinh lí vô trùng Chỉnh độ đục vi nấm sao cho mật độ thu được tương đương

OD530 là 0,08 – 0,1 (106 CFU/ml)

Chuẩn bị đĩa thạch chứa vi sinh vật: mỗi đĩa Petri cho 20 ml môi trường MHA

đối với vi khuẩn, môi trường SDA đối với vi nấm vào hộp Petri có đường kính 90 mm Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền dịch vi khuẩn, trải đều trên mặt thạch Để hộp trong tủ ấm 3 – 5 phút để khô măt thạch Đục lỗ bằng ống đục lỗ inox có đường kính 6 mm dạng chữ T đã tiệt trùng Cho 50 µl chất thử vào các lỗ đục trên đĩa thạch

đã trải vi sinh vật thử nghiệm tương ứng Mỗi thử nghiệm được tiến hành lập lại 03 lần

và lấy giá trị trung bình để xác định đường kính vòng ức chế

Mẫu chứng: chứng dương dùng đĩa giấy tẩm kháng sinh chuẩn (Ciprofloxacin 5

µl, Vancomycin 30 µl), chứng âm dùng dung dịch cồn 10%

Đọc kết quả: dùng thước đo có độ chia đến milimet đo đường kính vùng ức chế

*Sử dụng phần mềm “Statistical Product and Services Solutions” (SPSS) phiên bản 11.5 dùng cho Windows để xử lí các số liệu thực nghiệm thu được, từ đó đánh giá kết quả của các thí nghiệm

2.3.5 Phương pháp xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật

MIC (Minimal Inhibitory Concentration) là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật quan sát bằng mắt thường Vì cao chiết có khả năng tạo kết tủa nên sử dụng phương pháp pha loãng trên đĩa thạch sẽ cho kết quả chính xác hơn

Chuẩn bị dung dịch mẹ: chất thử được cân chính xác và pha với DMSO thành

dung dịch mẹ có nồng độ gấp 10 lần nồng độ cao nhất trong dãy Dung dịch mẹ phải được bảo quản lạnh trước khi dùng

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: vi khuẩn khảo sát được hoạt hóa trước bằng cách

lấy từ 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trường TSB, ủ từ 2 – 6 giờ ở 37 0

C Chỉnh

độ đục vi khuẩn bằng môi trường TSB sao cho mật độ thu được tương đương OD600 là 0,08 – 0,1 (khoảng 108 CFU/ml), pha loãng tiếp 10 lần để có mật độ khoảng 107 vi khuẩn/ml

Pha loãng trong môi trường rắn: môi trường được đun chảy rồi để nguội đến 45

– 50 0

C, chất thử được pha loãng ½ với Mueller-Hinton (MHB) theo dãy nồng độ từ cao đến thấp và cho vào đĩa môi trường MHA Chấm 1 µl huyền dịch vi khuẩn tương đương 104

CFU/ml lên các đĩa thạch có nồng độ chất thử khác nhau

Kết quả được đọc bằng sự hiện diện hay không của khóm vi sinh vật

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Lục bình là cây thủy sinh thân thảo sống nhiều năm, nổi ở nước hoặc bám trên đất bùn Lục bình phát triển nhanh chóng ở những nơi ngập nước như: sông, suối, hồ, mương và các vùng nước tù đọng Kích thước cây thay đổi tùy theo môi trường sống

có nhiều hay ít chất dinh dưỡng Ở những nơi nước chảy, cây thường xuyên bị trôi dạt nên chiều cao của cây thường thấp (dưới 50 cm) Trong khi đó, cây sống ở vùng nước đứng (ao, hồ) lại ít bị tác động nên mọc chen lấn nhau và thường cao gần một mét

Lá đơn, tập trung ở gốc tạo thành hình hoa thị Phiến lá hình thận hoặc hình tim, phẳng, dày, dài 8 – 19 cm, rộng 9 – 20 cm, màu xanh lục, nhẵn ở cả hai mặt, mặt trên màu sậm hơn; mép lá nguyên, không lượn sóng, gân lá hình cung (Hình 3.2) Cuống lá rất xốp, thường phình to tạo thành phao nổi (Hình 3.3)

Ở Lục bình, rễ và thân ngập trong nước trong khi lá và hoa mọc cao khỏi mặt nước Các cá thể Lục bình dính với nhau nhờ một đoạn căn hành nối liền cây mẹ và các cây con tạo thành đám lớn (Hình 3.4) Căn hành mọc ra từ nách lá của cây Lục bình mẹ, đường kính trung bình từ 1 đến 2,5 cm Các cây Lục Bình ở phần giữa đám thường có cuống lá dài và cứng, trong khi các cây ở rìa đám thường có cuống lá ngắn, mềm và phình to Một thời gian sau, phần căn hành nối liền giữa các cây có thể bị chết hoặc bị đứt gãy, cây sẽ tách rời khỏi đám

Rễ chùm, nhiều và rậm ở gốc thân (Hình 3.5, 3.6)

Cụm hoa mọc lên từ thân qua nách lá tạo thành bông hay chùy, mang từ 8 – 15 hoa hoặc có thể hơn Trục phát hoa thẳng đứng, có thể dài đến 50 cm, rộng 1 – 1,5 cm, tròn, đặc, màu xanh lục, mặt ngoài láng, mang 2 lá bắc ở khoảng 1/3 gốc trục hoa (Hình 3.7)

Hoa không đều, màu xanh nhạt hoặc xanh tím Bao hoa 6 phiến, cùng màu, dính nhau ở gốc trên rời, 6 phiến hình bầu dục không đều (dài 1,5 – 2,5 cm) cánh hoa trên

to hơn có một đốm vàng ở trung tâm và được bao quanh bởi một vòng xanh dương

Hoa có 6 nhị, trong đó có 3 nhị dài (2 cm) và 3 nhị ngắn (1 cm) đính trên ống bao hoa Chỉ nhị dạng sợi, thẳng đứng, phần dưới màu trắng, phần trên màu tím và hơi cong thành móc Bao phấn màu tím, hình dải, dài 0,3 cm, 2 ô, hướng trong, mở bằng đường nứt dọc (Hình 3.11) Hạt phấn rời, hình bầu dục, thuôn nhọn hai đầu, có rãnh ở giữa, màu vàng sậm (Hình 3.12) Bầu trên, ba ô, chứa nhiều noãn nhưng chỉ có một cái sinh sản, đính noãn trung trụ (Hình 3.13)

Phiến lá

Cuống lá Cụm hoa

Rễ

Hình 3.1 Cây Lục bình với lá mọc thành hình hoa thị