khảo sát quá trình chín trái ở cây cà phê chè ( coffea arabica l

Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong quá trình tăng trưởng và phát triển trái .... Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thức vật trong trái cà phê qua các giai đoạ

Nguyễn Nữ Thảo Trân

_

Nguyễn Nữ Thảo Trân

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Bùi Trang Việt

TS Lê Thị Trung

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào

Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định

TP Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 09 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Nữ Thảo Trân

LỜI CẢM ƠN

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- PGS TS Bùi Trang Việt, người đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức quý báu, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn Thầy đã gợi ý đề tài, hướng dẫn nghiên cứu và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian tôi thực hiện đề tài

- TS Lê Thị Trung, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này Cô đã truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong học tập, nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc

- Khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh

- Phòng Sau đại học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh

- Chị Hồ Thị Mỹ Linh - Cán bộ Phòng Thí nghiệm Sinh lý thực vật, trường Đại

học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người đã động viên và giúp đỡ tôi hết mình trong thời gian tôi thực hiện đề tài này

ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Định nghĩa trái 3

1.2 Quá trình chín trái 4

1.2.1 Định nghĩa 4

1.2.2 Sự biến đổi của trái trong giai đoạn chín 4

1.3 Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong quá trình tăng trưởng và phát triển trái 8

1.3.1 Auxin 8

1.3.2 Gibberellin 9

1.3.3 Cytokinin 9

1.3.4 Abscisic acid 9

1.3.5 Ethylene thể hiện vai trò trung tâm trong sự chín trái 9

1.4 Cây cà phê và các nghiên cứu liên quan 15

1.4.1 Cây cà phê 15

1.4.2 Lịch sử phát hiện 15

1.4.3 Đặc điểm của cây cà phê 17

1.4.4 Các nghiên cứu liên quan đến cây cà phê 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Vật liệu 22

2.2 Phương pháp 23

2.2.1 Quan sát sự phát triển của trái cà phê ngoài vườn 23

2.2.2 Quan sát hình thái giải phẫu 23

2.2.3 Xác định kích thước,trọng lượng tươi và khô của trái cà phê 23

2.2.4 Đo cường độ hô hấp 24

2.2.5 Đo hàm lượng đường tan, tinh bột, acid hữu cơ và carotenoid 24

2.2.6 Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 27

2.2.7 Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái cà phê trong phòng thí nghiệm 29

2.2.8 Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái cà phê trong vườn 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 31

KẾT QUẢ 31

3.1 Quan sát sự phát triển của trái cà phê ngoài vườn 31

3.2 Quan sát hình thái giải phẫu 34

3.3 Kích thước, trọng lượng tươi và trọng lượng khô 41

3.4 Cường độ hô hấp 41

3.5 Hàm lượng đường, tinh bột, carotenoid và acid hữu cơ 42

3.6 Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 42

3.7 Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái cà phê trong phòng thí nghiệm 44 3.8 Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái cà phê trong vườn 49

3.8.1 Xử lý chất điều hòa sinh trường thực vật lên từng trái riêng lẻ 49

3.8.2 Xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên cành mang trái 52

3.8.3 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của trái sau xử lý 57

THẢO LUẬN 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

IAA Indol - 3-acetic acid

NAA Naphthalene aceticacid

Rf

“Retardation factor” hoặc “ratio to front” - Hệ số di chuyển: đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích được tính bằng tỷ lệ

giữa quãng đường di chuyển của mẫu và quãng đường di chuyển

của dung môi

Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh

UV Ultraviolet radiation

v/v Thể tích/thể tích

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thời gian trung bình giữa các giai đoạn chín của trái cà phê (ngày) 32

Bảng 3.2 Tỷ lệ trái mỗi giai đoạn chín trên cành cà phê 32

Bảng 3.3 Kích thước, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của trái qua các giai

đoạn chín 41

Bảng 3.4 Cường độ hô hấp của vỏ trái cà phê qua các giai đoạn chín 41

Bảng 3.5 Hàm lượng đường tổng số, tinh bột, acid hữu cơ và carotenoid qua các

Bảng 3.8 Thời gian trái chín khi xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên

trái riêng lẻ trong vườn 50

Bảng 3.9 Tỷ lệ trái chín sau 10, 15 và 20 ngày xử lý các chất điều hòa sinh trưởng

thực vật lên trái riêng lẽ trong vườn 51

Bảng 3.10 Tỷ lệ rụng trái non và tỷ lệ trái chín trên cành sau 15 ngày sử dụng các

chất điều hòa sinh trưởng thực vật 53

Bảng 3.11 Kích thước, trọng lượng tươi và khô của trái chín sau khi xử lý chất điều

hòa sinh trưởng thực vật 57

Hình 1.1 Nguồn gốc của trái và hạt (Bùi Trang Việt, 2000) 3

Hình 1.2 Quá trình sinh tổng hợp ethylene theo chu trình Yang (Wang, 2002) 11

Hình 1.3 Ethylene sản xuất ở C arabica trong quá trình chín (Pereira et al, 2005) 13

Hình 1.4 Con đường dẫn truyền tín hiệu của ethylene (Gao et al.,2003) 14

Hình 1.5 Cà phê Coffea arabica L (Jackson, 1940) 18

Hình 2.1 Cây cà phê 6 năm tuổi trồng tại vườn cà phê ở Lạc Dương, Đà Lạt (tháng 11/2013) 22

Hình 2.2 Vườn cà phê tại Lạc Dương, Đà Lạt (tháng 11/2013) 22

Hình 2.3 Vị trí đặt thước đo đường kính trái 24

Hình 2.4 Sơ đồ ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 27

Hình 3.1 Thời gian trái cà phê cần để hoàn tất sự tăng trưởng và chín 32

Hình 3.2 Các giai đoạn phát triền của trái cà phê 33

Hình 3.3 Mặt cắt ngang của trái cà phê qua các giai đoạn chín 34

Hình 3.4 Lát cắt ngang vỏ trái cà phê giai đoạn trái trưởng thành (10) 35

Hình 3.5 Lát cắt ngang vỏ trái cà phê giai đoạn trái bắt đầu chín (10) 36

Hình 3.6 Lát cắt ngang vỏ trái cà phê giai đoạn trái chín muộn (10) 36

Hình 3.7 Bề mặt biểu bì trái cà phê giai đoạn trái trưởng thành (40) 37

Hình 3.8 Bề mặt biểu bì trái cà phê giai đoạn trái bắt đầu chín (X40) 38

Hình 3.9 Bề mặt biểu bì trái cà phê giai đoạn trái chín muộn (40) 38

Hình 3.10 Hạt cà phê ở giai đoạn trái trưởng thành 39

Hình 3.11 Phôi cà phê ở giai đoạn trái trưởng thành (5) 40

Hình 3.12 Cắt dọc phôi cà phê ở giai đoạn trái trưởng thành (5) 40

Hình 3.13 Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thức vật trong trái cà phê qua các giai đoạn chín 43

Hình 3.14 Trái cà phê bắt đầu được xử lý (đổ 10 ml nước cất lên đĩa Petri, nhúng vào dung dịch xử lý 30 giây, 2 ngày/lần) 46

Hình 3.15 Trái cà phê đối chứng (nhúng vào nước cất) sau 7 ngày 46

Hình 3.16 Trái cà phê được xử lý IAA 5 mg/l sau 7 ngày 47

Hình 3.17.Trái cà phê được xử lý NAA 2 mg/l sau 7 ngày 47

Hình 3.18 Trái cà phê được xử lý GA3 5 mg/l sau 7 ngày 48

Hình 3.19 Trái cà phê được xử lý ethrel 200 mg/l sau 7 ngày 48

Hình 3.20 Tỷ lệ trái chín trên cành sau khi xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật 15 ngày 53

Hình 3.21 Cành cà phê bắt đầu xử lý (phun dung dịch xử lý, 2 ngày/ lần) 54

Hình 3.22 Cành cà phê đối chứng (phun nước cất) sau 15 ngày 54

Hình 3.23 Cành cà phê xử lý NAA 1 mg/l sau 15 ngày 55

Hình 3.24 Cành cà phê xử lý ethrel 100 mg/l sau 15 ngày 55

Hình 3.25 Cành cà phê xử lý ethrel 200 mg/l sau 15 ngày 56

Hình 3.26 Cành cà phê xử lý ethrel 500 mg/l sau 15 ngày 56

 Lý do ch ọn đề tài

Cà phê là một loại thức uống rất được ưa chuộng trên toàn thế giới được chế biến

từ hạt của trái cà phê chín, sau khi trải qua nhiều giai đoạn như phơi, rang, xay Thức

uống có hương vị thơm ngon và chứa chất caffeine gây hưng phấn thần kinh Cà phê

chế biến từ hạt của cà phê chè (Coffea arabica) được người tiêu dùng ưa thích vì vị đắng ít hơn và hương vị thơm hơn so với các loại cà phê khác (như cà phê mít Coffea

Ở Việt Nam, cà phê mang lại lợi ích kinh tế cho nhiều nông dân trồng trọt Cà phê được trồng chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên như Đồng Nai, Đaklak, Lâm Đồng, Kontum Tuy nhiên khi khảo sát tại một số trang trại trồng cà phê chè tại Đà Lạt cho

thấy tình trạng ra hoa không đồng đều dẫn tới chín trái không đồng đều Cụ thể: cà phê chè ra 3-4 đợt hoa vào tháng 2-3 dương lịch dẫn đền trái chín không đồng đều chia ra thành 4 đợt thu hoạch vào tháng 11-12 dương lịch

Sự chín trái không đồng đều gây ra khó khăn đối với quản lý và sản xuất cà phê

Những hợp chất tích lũy trong hạt của trái cà phê ở những giai đoạn khác nhau đóng vai trò quan trọng trong chất lượng của cà phê sau chế biến Trái cà phê chín đỏ sẽ cho

hạt có chất lượng tốt nhất Sự hiện diện của những trái hái quá xanh hoặc quá chín làm thay đổi nồng độ các alkaloid có trong hạt cà phê như caffeine và chlorogenic (CGA) làm thức uống tăng vị đắng (Leloup et al.,1995) từ đó làm giảm chất lượng sản phẩm

Để tránh điều này, người nông dân phải thu gom cà phê bằng tay, chia ra nhiều lần thu

hoạch hoặc lựa chọn lại sau thu hoạch, điều này làm chi phí tăng lên do phải thuê nhân công và tốn nhiều thời gian

Do vậy, đề tài “Bước đầu khảo sát quá trình chín trái ở cây cà phê chè (Coffea

 M ục đích nghiên cứu

Khảo sát về quá trình chín của trái cà phê Coffea arabica và tìm biện pháp giúp

trái chín nhanh, đồng đều hơn

 Nhi ệm vụ nghiên cứu

Khảo sát một số chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa trong quá trình chín của trái cà phê

Tìm hiểu sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình chín của trái cà phê từ đó tìm ra biện pháp giúp trái cà phê chín nhanh và đồng đều hơn

 Th ời gian, địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2014 đến tháng 9/ 2014 tại Phòng Thí nghiệm Sinh lý thực vật trường Đại học Sư phạm Tp HCM và Phòng Thí nghiệm Sinh lý thực

vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học quốc gia Tp HCM

1.1 Định nghĩa trái

Trái là kết quả biến đổi của bầu noãn, vách bầu noãn cho các mô vỏ trái Trái bao

gồm cả hạt và vỏ hạt Ở trái khô, vỏ trái hóa lignin Ở trái mập vỏ trái có phần giữa là nhu mô Hạt có nguồn gốc từ noãn Hạt bao gồm vỏ hạt, phôi nhũ và phôi (hình 1.1)

Hình 1.1 Nguồn gốc của trái và hạt (Bùi Trang Việt, 2000)

Tùy theo trạng thái sau cùng của sự thủy giải phôi tâm bởi phôi nhũ, và của sự

thủy giải phôi nhũ bởi phôi người ta phân biệt 3 kiểu hạt:

BẦU NOÃN

Vỏ noãn Phôi tâm

Vỏ trái Vỏ hạt Ngoại nhũ

(2n)

Phôi (2n)

Phôi nhũ (3n)

NHÂN TRÁI

HẠT

TRÁI

- Hạt có phôi nhũ và ngoại nhũ: sự thủy giải phôi tâm không hoàn toàn, phần còn

lại của phôi tâm được gọi là ngoại nhũ Ngoại nhũ cũng là mô dự trữ ( gặp ở Caryophyllaceae, Piperraceae, Rubiaceae )

- Hạt có phôi nhũ: sự thủy giải phôi tâm diễn ra hoàn toàn, hạt không có ngoại nhũ, chỉ có phôi nhũ Phôi thường có kích thước nhỏ

- Hạt không có phôi nhũ: phôi đã phân giải hoàn toàn phôi nhũ trong quá trình trưởng thành của hạt Khi đấy, các tử diệp của phôi có kích thước lớn vì tích lũy các chất dự trữ

- Trong vài trường hợp, phôi nhũ của hạt hoàn toàn không phát triển ( Họ Lan,

1.2.2 S ự biến đổi của trái trong giai đoạn chín

1.2.2.1 Bi ến đổi về sinh lý

 Đỉnh climax

Đỉnh climax đặc trưng trong sự chín của nhiều loại trái cây: cường độ hô hấp của trái tăng mạnh tới một đỉnh để khởi động quá trình chín trái Đỉnh này do sự tiêu thụ đường và acid hữu cơ, đi kèm với sự sản xuất ethylene (Bùi Trang Việt, 2000)

Dựa vào sự hô hấp và sự sản xuất ethylene, trái cây được chia thành 2 loại là trái

có đỉnh hô hấp (climaxteric) như chuối, cà chua, đào, táo và trái không có đỉnh hô

bột phát trong hô hấp và sản xuất ethylene, còn trái không có đỉnh hô hấp sản xuất ethylene từng ít trong suốt quá trình chín trái và không đáp ứng rõ rệt với việc xử lý ethylene ngoại sinh (Giovannoni et al., 2013)

Quá trình đường phân và chu trình Crebs tạo năng lượng cho sự hoạt động của trái trong quá trình chín đồng thời làm tăng sự sản sinh CO2

 S ự thay đổi màu sắc

Trong sự chín trái, dưới tác dụng của enzyme chlorophyllase , các diệp lục tố bị phân hủy để lộ ra các sắc tố khác có sẵn trong trái (như là carotenoid) làm trái mất đi màu xanh chuyển sang vàng (như trường hợp ở trái đủ đủ) Song song với quá trình này các sắc tố khác cũng được tổng hợp tạo nên các màu sắc khác cho trái Thường các sắc tố nằm ở trong mô ngoại vi (vỏ trái) nhưng cũng có thể nằm trong phần thịt trái

(Giovannoni et al., 2013)

Phần lớn các sắc tố trái thuộc về 2 nhóm: carotenoid (thích lipid không tan trong nước) và nhóm flavonoid (tan trong nước và tích tụ ở không bào) Các carotenoid như caroten, licopen, xanthophil cho màu đỏ, cam hoặc vàng Các flavonoid như flavon cho màu vàng hay cam và anthocyanin cho màu đỏ, tím hay xanh da trời tùy theo pH acid, trung tính hay base (Bùi Trang Việt, 2000)

 S ự thay đổi mùi hương

Sự chín hoạt hóa quá trình tổng hợp các chất tạo mùi thơm (bản chất là este, aldehyde hoặc acetone) liên quan đến hoạt động của các enzyme đặc trưng cho từng

loại trái (Quách Đĩnh và cộng sự,1996)

 S ự thay đổi vị

Các hợp chất như acid hữu cơ, tanin, alkaloid bị phân hủy nhanh chóng do hoạt động của các enzyme, đồng thời các đường đơn (glucose, fructose) xuất hiện giúp vị

ngọt tăng (Quách Đĩnh và cộng sự,1996)

 S ự thay đổi tính chất cơ lý

Một tính chất đặc trưng trong quá trình chín trái đó là trái mềm đi Quá trình này

xảy ra do sự rối loạn tế bào như độ lớn và hình dạng tế bào, thể tích liên tế bào, sự toàn

vẹn, bề dày của màng tế bào, áp suất thẩm thấu

Sự thoái hóa thành tế bào là kết quả hoạt động của các enzyme thủy phân được

tổng hợp trong lúc trái chín và dẫn tới sự phá hoại cấu trúc tế bào và mô Cho dù sự rối

loạn của tế bào được xem như nguyên nhân chính làm thay đổi cấu hình trái, còn có

những biến cố khác được quan sát trong quá trình chín trái như mất đi sự kết dính giữa các tế bào và những thay đổi áp suất thẩm thấu, cũng làm cho trái mềm đi (Quách

Đĩnh và cộng sự,1996)

- Protopectin

Protopectin là phức chất giữa pectin với cellulose, hemicellulose, không tan trong nước, làm nên cấu trúc vách tế bào Khi trái xanh, hàm lượng protopectin rất cao, tập trung chủ yếu ở thành tế bào, giúp gắn kết các tế bào thực vật với nhau và hình thành vách tế bào, làm cho trái cây có độ cứng nhất định

Khi trái chín, dưới tác dụng của acid hữu cơ và xúc tác của emzyme protopectinase, protopectin bị thủy phân thành các sản phẩm như acid pectic, acid polygalacturonic, glucose, galactose, arabinose, methanol làm giảm cường lực liên

kết giữa các tế bào, vỏ tế bào trở nên mỏng, tế bào mềm dần ra, làm cho trái bị nhũn

và cấu trúc trái bị phá hủy (Quách Đĩnh và cộng sự,1996)

- Áp su ất thẩm thấu

Độ cứng của trái cũng có liên quan đến thành phần hóa học của trái Quá trình

giảm độ cứng của trái không chỉ do thủy phân các chất pectin, mà còn do thủy phân cellulose, hemicellulose và tinh bột

Khi trái cây chín, dưới tác dụng của hệ enzyme amylase, tinh bột chuyển dần thành đường, khiến cho nồng độ đường bên trong tế bào tăng lên Sự chênh lệch nồng

độ đường trong và ngoài tế bào tạo nên một áp suất thẩm thấu, nước từ bên ngoài môi trường đi vào bên trong tế bào, các tế bào luôn ở căng nước (Quách Đĩnh và cộng

sự,1996)

1.2.2.2 Bi ến đổi về sinh hóa

Trái cây cũng là những cơ thể sống, nên ngoài sự hô hấp, bên trong chúng còn

xảy ra những biến đổi hoá sinh học.Trong quá trình chín diễn ra chủ yếu nhất là các

phản ứng thuỷ phân các chất phức tạp thành các chất đơn giản hơn nhờ một loạt các enzyme thủy phân

Các acid di- và tricacboxylic rất phổ biến trong trái Thường nhất là acid malic (táo, lê), acid citric (cam, quýt, chanh), acid tartric (nho), acid isocitric (dâu tằm Morus

alba) và acid chlorogenic (cà phê) Hàm lượng các chất này thấp trong trái non nhưng tăng lên trong giai đoạn tăng kích thước tế bào và giảm mạnh trong quá trình chín trái

Sự giảm dần các acid hữu cơ trong quá trình chín trái do sự oxid hóa (do tăng

mạnh hô hấp) trở thành các tiền chất để tổng hợp đường và protein

Acid hữu cơ thường được dùng cho hô hấp ở nhiệt độ cao và tích tụ lại ở nhiệt độ

thấp (do đó khí hậu mát và ẩm sẽ làm cho trái chua) (Bùi Trang Việt, 2000)

 Bi ến đổi của carbohydrate

Đối với trái tươi thì các hợp chất carbohydrate là thành phần luôn có những biến đổi to lớn và mạnh mẽ nhất trong quá trình hình thành và chín trái Ở giai đoạn đầu

của quá trình phát triển, khi trái đang tượng hình, hàm lượng tinh bột tăng nhanh, nhưng trong quá trình trái chín, hàm lượng tinh bột giảm và hàm lượng đường khử tăng lên do quá trình đường hoá Nguyên nhân làm giảm tinh bột và tăng lượng đường

là do hoạt hoá của hệ enzyme amylase trong trái

Hàm lượng tinh bột trong trái có thể thấp hơn nhiều so với nhu cầu đường hóa, khi đó đường trong trái có thể được cung cấp bởi sự thủy phân các chất như saccharose, cellulose, hemicellulose, pectin hoặc bởi các acid hữu cơ như acid malic, acid citric có sẵn bên trong trái học vận chuyển về trái từ các bộ phận khác của cây:

6 acid malic + 6 acid tartric + 9O2  4 glucose + 12 H2O + 24 CO2 (Prescott, 1878)

Sự thủy phân các hợp chất thành đường sẽ làm cho trái cây có vị ngọt, giảm vị chua

 Bi ến đổi của các alkaloid

Alkaloid là các hợp chất chứa Nitơ và có hoạt tính dược học đối với người và động vật Ở cà phê có 2 alkaloid quan trọng nhất đó là caffeine và trigonelline

Caffeine: Caffeine phát hiện ở mức độ thấp trong xylem của cây cà phê (C

caffeine xảy ra trực tiếp trong các mô vỏ trái (Mazzafera và Gocalves, 1999) Trong

hạt cà phê, hàm lượng tuyệt đối của caffeine song song với đường cong trọng lượng khô, chiếm khoảng 1% trên cơ sở vật chất khô (DMB) tại thời điểm thu hoạch

Lưu ý rằng sự gia tăng lớn hàm lượng caffeine trong hạt xảy ra giữa các giai đoạn phát triển 8-12 tuần sau khi nở hoa và 16 tuần sau khi nở hoa ở hệ thống mô hình

phân tích cà phê Coffea arabica, tương ứng với thời gian phôi nhũ nhanh chóng mở

rộng Từ giai đoạn phát triển 16 tuần đến giai đoạn thu hoạch, phân tích hàm lượng caffeine cho thấy sinh tổng hợp dừng lại hoặc là vẫn tiếp tục tổng hợp ở vỏ trái nhưng

được vận chuyển đến hạt cà phê (Baumann et al., 1972)

Trigonelline: Trong khi rang, alkaloid trigonelline làm phát sinh nhiều hợp chất

mang mùi hương, như alkyl-pyridine và pyrrole (De Maria et al.,1994), điều này giải

thích lợi ích của chương trình nhân giống để tăng hàm lượng trigonelline trong hạt cà phê vối (Ky et al., 2001)

Trái ngược với caffeine, trigonelline được tổng hợp trong tất cả các thành phần

của cây cà phê nhưng tích lũy mức độ cao hơn trong các mô non như lá và nụ hoa, cũng như trong vỏ trái và hạt Trigonelline được tổng hợp nhiều trong vỏ của trái chưa chín nhưng giảm tổng hợp trong trái chín Trong trái hoàn toàn chín muồi, hàm lượng trigonelline tích lũy cao ngay cả khi không có hoạt động tổng hợp được phát hiện Điều này cho thấy sinh tổng hợp trigonelline diễn ra trong vỏ trái và trigonelline có thể được vận chuyển tiếp từ mô này đến phôi nhũ (Zheng và Ashihara, 2004)

1.3 Vai trò c ủa các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong quá trình tăng trưởng và phát triển trái

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tác động ở những giai đoạn khác nhau của quá trình chín và phát triển của trái một cách chuyên biệt Hạt là trung tâm tổng hợp quan trọng các hormone sinh trưởng thực vật trong các giai đoạn phát triển của trái và

trưởng, trái bước vào giai đoạn chín (Biale, 1978, Bùi Trang Việt, 2000)

Như vậy, auxin có vai trò huy động các sản phẩm quang hợp do đó giúp trái tăng trưởng nhanh cạnh tranh với các cơ quan dinh dưỡng (Bianco - Trinchant, 1998) Auxin nồng độ thấp cũng rút ngắn thời gian cần để chín trái (Bùi Trang Việt, 2000)

1.3.2 Gibberellin

Nếu auxin và cytokinin đạt tới đỉnh trong giai đoạn phát triển sớm của trái (giai đoạn phân chia tế bào) thì gibberellin nhiều trong giai đoạn kéo dài tế bào và đạt tới đỉnh trước khi trái trưởng thành (Abdel - Rahman, 1997) Thông thường gibberellin làm chậm sự trưởng thành và chín trái (Bùi Trang Việt, 2000)

1.3.3 Cytokinin

Hoạt tính cytokinin cao trong phôi ở giai đoạn phát triển sớm của trái, sau đó

giảm khi trái tăng trưởng Cytokinin kéo dài thời gian cần cho chín trái (Bùi Trang

Việt, 2000)

1.3.4 Abscisic acid

Abscisic acid (ABA) cản sự tăng trưởng trái và kích thích sự rụng ở trái non Hàm lượng abscisic acid thấp ở giai đoạn khởi đầu của sự phát triển trái và tăng lên cao ở cuối giai đoạn phát triển trái và hạt Hàm lượng abscisic acid cao ở giai đoạn này

có liên quan mật thiết đến sự chín trái, rụng và sự ngủ của hạt Tình trạng stress do thiếu nước cũng liên quan tới sự tổng hợp abscisic acid trong lá (Bùi Trang Việt, 2000)

1.3.5 Ethylene th ể hiện vai trò trung tâm trong sự chín trái

Ethylene đã được chứng minh có ảnh hưởng lên sự phiên mã và dịch mã nhiều gene liên quan đến quá trình chín Thông thường đó là các gene mã hóa cho các enzyme thủy phân như amylase, protopeptinase, chlorophillase, hydrolase

(Giovannoni et al., 2013)

Vai trò trung tâm của ethylene trong sự chín trái được thể hiện qua nhiều sự kiện:

+ Có sự thoát ethylene ở các trái có climax (xảy ra trong điều kiện hiếu khí và

nhạy với nhiệt độ): trái đang chín (tỏa ethylene) thúc đẩy sự chín của các trái xanh để bên cạnh

+ Ở trái xanh có climax (đã đạt mức độ phát triển đủ), ethylene kích thích sự chín trái với các đặc trưng: đỉnh climax, tổng hợp mRNA của polygalacturonase và cả sự

sản xuất ethylene

+ Xử lí Ag+

(ion cản hoạt động của ethylene) sẽ làm chậm sự chín trái

+ Trái (hay mô trái) cà chua được xử lý gibberellin vẫn xanh, không nhạy cảm

với ethylene để khởi động quá trình chín mặc dù ethylene vẫn kích thích tạo đỉnh hô

hấp (bất chấp xử lý gibberellin), là bằng chứng thuyết phục về tính nhạy cảm của mô trái với ethylene (Bùi Trang Việt, 2000)

1.3.5.1 Sinh t ổng hợp và điều hòa ethylene trong quá trình chín trái

Quá trình sinh tổng hợp ethylene diễn ra theo chu trình của Yang (Yang và Hoffman, 1984) (hình 1.2)

SAM : S-adenosyl-L-methionine

MTA: 5’-methyladenosine

ACC: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic

ACS: S-andenosylmethionine synthase

ACO: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase

Hình 1.2 Quá trình sinh tổng hợp ethylene theo chu trình Yang (Wang, 2002)

 Methionine được chuyển hóa thành SAM nhờ sự hoạt hóa của ATP

 SAM sẽ được chuyển hóa thành MTA và ACC nhờ enzyme ACS ACC chính

là tiền thân trực tiếp của ethylene Enzyme ACS cũng là enzyme quan trọng nhất trong quá trình sinh tổng hợp ethylene Sự phosphoryl hóa ACS có thể bảo vệ các protein

khỏi phân hủy, dẫn đến sự tích lũy và tăng hoạt động của ACS, dẫn tới sự bùng nổ sản

xuất ethylene trong quá trình chín trái (Tatsuki và Mori, 2001 )

Ở giai đoạn trái còn xanh, methione được tổng hợp nhiều nhưng ACC lại tổng

hợp yếu hơn dẫn đến ethylene sản xuất ít ở thời kỳ đầu chín trái Quá trình này sẽ bị đảo ngược khi có dấu hiệu chín dần

 Enzyme ACO do gene ACO mã hóa, chuyển đổi ACC thành ethylene Phản

ứng này đòi hỏi sự có mặt của oxy Trong điều kiện yếm khí, sự hình thành ethylene bị

đình chỉ hoàn toàn Biểu hiện của gen ACO có thể được quy định bởi các yếu tố cụ thể

về môi trường phát triển hoặc mô (Song et al., 2005)

Trong chu trình (chu trình Yang), MTA cũng được tạo để tổng hợp lại methionine Vì thế ethylene có thể tự tổng hợp liên tục mà không cần bổ sung thêm methionine từ bên ngoài vào

Hai hệ thống điều hòa ethylene đã được chứng minh ở các loại trái có đỉnh hô

hấp Hệ thống 1 là chức năng trong quá trình sinh trưởng bình thường, ethylene tự động ức chế và chịu trách nhiệm sản xuất ra lượng ethylene cơ bản được phát hiện trong tất cả các mô bao gồm cả ở trái không có đỉnh hô hấp Hệ thống thứ 2 hoạt động trong quá trình chín của trái có đỉnh hô hấp và quá trình lão suy của một số cánh hoa khi sự sản xuất ethylene là tự xúc tác tổng hợp (autocatalytic): tiếp xúc với nồng độ

nhỏ ethylene ban đầu sẽ làm cho trái sản xuất một lượng ethylene lớn hơn cho đến khi

nồng độ ethylene đạt được đỉnh Tác dụng ethylene lên trái có đỉnh hô hấp nhưng chưa trưởng thành cũng có thể gây ra phản ứng tự xúc tác này, gây chín sớm và dẫn đến trái

có chất lượng kém Sự chín thường bắt đầu tai một khu vực trong trái sau đó lan rộng sang các khu vực lân cận vì ethylene có thể khuếch tán tự do từ tế bào này sang tế bào khác và tích lũy trong suốt quá trình chín của trái (Alexander, Grierson, 2002)

Nghiên cứu tổng hợp ethylene ở giai đoạn cuối cùng của sự trưởng thành trái cà phê chè đã cho thấy sự gia tăng nhanh chóng của sản xuất ethylene ở giai đoạn trái màu cam, sau khi kết thúc sự hình thành phôi nhũ hoàn chỉnh và giảm sản xuất ethylene ở giai đoạn chín đỏ chỉ ra một giai đoạn lão suy của trái trong quá trình chín

(Pereira et al, 2005) (hình 1.3)

Hình 1.3 Ethylene sản xuất ở C arabica trong quá trình chín (Pereira et al, 2005)

1.3.5.2 Con đường truyền tín hiệu của ethylene

Trong nghiên cứu của Muller và Stummann (2003), các tác giả đã đưa ra những

hiểu biết về mô hình truyền tín hiệu ethylene ở cây Arabidopsis thaliana (hình 1.4) Sử

dụng mô hình Arabidopsis thaliana cho thấy 5 gene mã hóa cho receptor của ethylene

thuộc hai họ phụ là ETR1, ETR2, ERS1, ERS2, EIN4 Các receptor dính trên màng lưới nội chất, có cấu trúc tương đồng với thụ thể của vi khuẩn gồm 2 thành phần là

một miền cảm biến (chia thành miền màng, miền GAP, miền histidine kinase) và miền

phản ứng ( một loại protein điều chỉnh phản ứng riêng biệt) cho phép vi khuẩn đáp ứng

với các điều kiện môi trường khác nhau (Bleecker et al., 2000; Schaller et al., 2002)

Ethylene tiếp xúc với thụ thể thông qua trung gian là một Cu-cofactor (Rodriguez

et al., 1999)

CTR1 là một protein kinase tương đồng với Raf là một tác nhân phân bào kích

hoạt protein kinase kinase kinase (MAP3K) đã được xác định là phần tiếp theo của con đường truyền tín hiệu CTR1 tương tác với hai thụ thể của ethylene, ETR1 và ERS1

(Clark et al., 1998) và mô hình hoạt động của ethylene cho thấy: khi ethylene vắng

mặt, CTR1 tương tác với hai thụ thể nên không kích hoạt được MAP3K và con đường

phản ứng bị chặn Khi có mặt ethylene, ethylene liên kết với các thụ thể giải phóng

CTR1 và cho phép phản ứng etylen xảy ra (Bleecker et al., 2000) Đây là con đường

dẫn truyền tín hiệu ethylene tiêu cực

Ngoài ra các protein khác, EIN2, EIN3, EIN5, và EIN6 là các protein dẫn truyền tính hiệu tích cực Khi có mặt ethylene, CTR1 truyền tín hiệu, EIN2 trên màn tế bào

được kích hoạt và một loạt các phiên mã liên quan đến các yếu tố phiên mã như EIN3/EIL và ERF được bắt đầu ERF1 trực tiếp kích hoạt phiên mã của một loạt các

gene liên quan đến quá trình đáp ứng ethylene bằng cách gắn vào hộp –GCC trên gene (Trentmann, 2000)

Ethylene ảnh hưởng đến mức độ dịch mã mRNA của nhiều gene, bao gồm cả

những gene mã hóa cellulase và các gene liên quan đến quá trình chín và sinh tổng hợp ethylene

Hình 1.4 Con đường dẫn truyền tín hiệu của ethylene (Gao et al.,2003)

Ethylene dùng trong thương mại để thúc chín trái cây Vì khó áp dụng ở trạng thái khí nên ethylene thường được dùng ở dạng hợp chất phóng thích ethylene là ethephone (acid 2-chloroethylphosphonic, chất được khám phá 1990 và có tên thương

mại là ethrel) Ethephone được phun ở dạng dung dịch nước nên dễ hấp thu và di chuyển trong thực vật Chất này sẽ phóng thích ethylene từ từ trong tế bào thực vật (ethephone tự phân hủy ở pH >3,5) nên được dùng để thúc chín, làm mất màu xanh ở trái cam, đồng nhất sự ra hoa và đậu trái thơm

Cl- CH2- CH2- PO3H2 + OH-  CH2 = CH2 + Cl- + H3PO4

CO2 ức chế quá trình chín ở những trái có đỉnh climax Trong những trái không

có đỉnh climax tác dụng của ethylene quan sát thấy không rõ ràng (Bùi Trang Việt, 2000)

Ngoài ra khi phun ethylene lên cây để thúc chín trái trên cây cần chú ý liều lượng

hợp lý vì ethylene có tác động lên quá trình lão suy có thể gây rụng lá, chồi non và hoa

1.4 Cây cà phê và các nghiên c ứu liên quan

1.4.1 Cây cà phê

Cây cà phê thuộc: Ngành : Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp : Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp : Cúc (Asteridae)

Thổ Nhĩ Kỳ và phía bắc Châu Phi Từ thế giới Hồi giáo, cà phê đến Ý, sau đó là phần còn lại của Châu Âu, Indonesia và Mĩ Hiện nay, cây cà phê được trồng tại hơn 50 quốc gia trên thế giới, trong đó có một số nước chuyên xuất khẩu cà phê

Chi Coffea có khoảng 100 loài chia thành 4 nhóm chính: Eucoffea K Schum;

Paracoffea Miq.; Argocoffea Pierre và Mascarocoffea Chev

Trong nhóm Eucoffea có 2 loài quan trọng là Coffea arabica L (cà phê chè) và

Trong đó cà phê chè chiếm 70% và cà phê vối chiếm 30% thị trường tiêu thụ cà phê trên thế giới (Marshall, 1985)

Cà phê là cây bụi, cho trái có hàm lượng caffeine trung bình từ 1,8-3,0% trọng lượng khô Bên cạnh đó, cà phê cũng chứ một hàm lượng đường tương đối, khoảng từ

6% đến 8,5% trong cà phê chè và 0,9-4,9% trong cà phê vối (Clifford, 1985; Campa et

minh mẫn Mặt khác nó còn có tác dụng lợi tiểu, tiêu mỡ, tiêu đạm, giải độc rượu và thuốc phiện (Lê Trần Đức, 1997) Tuy nhiên nếu dùng caffeine ở liều lượng cao (trên 2%) sẽ gây ra một số xáo trộn sinh lý (Bạch Văn Tương, 1998) Vì tác dụng hữu ích như thế, cà phê đã trở thành thức uống cao cấp được ưa chuộng nhiều nơi trên thế giới Theo tổ chức Cà phê Thế giới (ICO) nhu cầu cà phê của năm 2008 là 125 triệu bao loại 60kg

Tại Việt Nam, cây cà phê được người Pháp đưa về trồng từ những năm 1857, đến năm 1944, miền Nam bắt đầu trồng loại cà phê vối vì điều kiện nóng ấm Năm 1963-

1964, ở miền Bắc trông cà phê chè do điều kiện khí hậu lạnh (Phan Quốc Sủng, 1987)

Cà phê chè (Coffea arabica) có lá nhỏ, cây cao đến 6 mét, thân gỗ, thường được hãm thấp nên trông như cây chè Cành cơ bản khỏe, ít và tương đối ngắn Cành thứ

cấp phát triển từ cành cơ bản tạo thành hình tán dù, rũ xuống Vỏ cây mỏng, nhiều vết

nứt nhỏ tạo điều kiện cho sâu đục thân đẻ trứng phá hoại Lá bóng mượt, mép lá suôn

Mẫn cảm với bệnh gỉ sắt Lượng caffein trong hạt từ 1,8-2,0% Hương vị cà phê sau khi chế biến thơm ngon, được thế giới đánh giá cao và ưa chuộng (Phan Quốc Sủng, 1987)

không được đánh giá cao bằng cà phê chè do nhiều nguyên nhân:

+ Ở mức độ di truyền, cà phê chè là thể tứ bội ( 4n=44) Là một loài tự thụ phấn Điều này làm giảm sự đa dạng di truyền và gây khó khăn trong việc kết hợp những đặc điểm quan tâm (Charrier, Berthaud, 1985) Mặt khác, cà phê vối là thể lưỡng bội (2n =

22 nhiễm sắc thể) và không tự thụ phấn Điều này giải thích sự đa dạng di truyền cao hơn cà phê vối và dễ dàng cải thiện di truyền của nó bằng các kỹ thuật nhân giống thông thường (Montagnon, 2000)

+ Cà phê chè không được trồng nhiều bằng cà phê vối ở Việt Nam do độ cao không phù hợp, những vùng chuyên canh cà phê ở Việt Nam như Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk, Bảo Lộc, Lâm Đồng… đều chỉ có độ cao từ 500-1000 m so với mực nước

biển, loài cây này lại nhiều sâu bệnh hại, không kinh tế bằng trồng cà phê vối nên không được nông dân ưa chuộng

+ Năng suất khá thấp, chỉ khoảng 700-800 kg/ha/năm

Do cà phê chè mang nhiều ưu điểm như hạt to, thơm ngon nhưng kháng sâu bệnh kém, năng suất kém còn cà phê vối ngược lại, hạt nhỏ, chất lượng kém nhưng kháng được nhiều bệnh nguy hiểm, người ta đã thực hiện lai xa giữa chúng để kết hợp các đặc tính tốt Một số cây lai thành công như Hibrido de Timor, Catimor (kháng bệnh gỉ

sắt), Arabusta

1.4.3 Đặc điểm của cây cà phê

1.4.3.1 Hình thái c ủa hoa và trái

Hoa: có 4 cánh đều, màu trắng, dính nhau tạo thành hình ống dài 3-4 cm, đính 5

tiểu nhị mang bao phấn hướng nội, có đĩa mật thu hút côn trùng thụ phấn Bộ nhụy thường có 2 tâm bì hợp thành vòi nhụy mang 2 núm Bầu noãn có 2 buồng mang 2 noãn đính ngược Cây cà phê cho hoa thành chùm nằm ở nách lá Mỗi chùm mang nhiều hoa (10-100 hoa) (Nguyễn Sĩ Nghị, 1982)

Trái: hình trứng, lớp vỏ trong hóa gỗ Trái chín màu đỏ với đường kính từ 10-18

mm Vỏ ngoài mỏng, có màu xanh trong các giai đoạn đầu sau đó trở thành màu vàng

cam và sau đó màu đỏ ở giai đoạn cuối cùng của sự phát triển Vỏ giữa có nhiều đường, trở nên mỏng dần trong quá trình trưởng thành (hình 1.5)

Trái phê có 2 hạt, mặt phẳng của hạt áp vào nhau 5-10% trái cà phê chỉ có 1 hạt

gọi là cà phê hạt lép Hạt cà phê có lớp vỏ ngoài hóa gỗ Mặt phẳng của hạt có rãnh

hẹp ở giữa Hạt cà phê bao gồm phôi nhũ và ngoại nhũ Phôi nhũ cứng là nơi tích lũy các hợp chất và dự trữ chất dinh dưỡng được huy động cho phôi trong quá trình nảy

mầm của hạt cà phê Ngoại nhũ tồn tại đến giai đoạn trưởng thành của hạt tạo thành

một lớp lụa mỏng màu bạc (silver skin) bao bên ngoài phôi nhũ Phôi mầm nằm ở gần

cuối hạt, phía cuống trái (Nguyễn Sĩ Nghị, 1982)

Hình 1.5 Cà phê Coffea arabica L (Jackson, 1940)

Cây cà phê ra hoa khi được 2-3 năm tuổi Cây cà phê đạt năng suất cao nhất khoảng 15 năm Thường thì cà phê 25 tuổi đã được coi là già, không thu hoạch được

nữa Thực tế nó vẫn có thể tiếp tục sống thêm khoảng 70 năm nữa

Cà phê ra hoa một vụ trong năm, khoảng tháng 2-3 dương lịch Cà phê ra hoa trong điều kiện ngày ngắn Nếu chiếu sáng quá 14 giờ thì sự ra hoa ở cà phê bị ngưng

trệ (Nguyễn Sĩ Nghị, 1982)

Sự khô hạn là điều kiện cần thiết để cà phê phân hóa thành chồi hoa Trong điều

kiện tự nhiên, sự ngủ của chồi hoa thường bị phá vỡ bởi những cơn mưa đầu tiên trong mùa sau một thời gian khô hạn (khoảng 2-3 tháng khô) (Barros et al.,1999)

Giai đoạn ra hoa đòi hỏi một sự hô hấp mạnh, nhu cầu về nước cao gấp 6-7 lần bình thường Lúc này, hoa cà phê nở tỉ lệ với lượng mưa Ngưỡng mưa để hoa nở từ 3-

10 mm và nở nhiều nếu lượng mưa đạt 25-35 mm Nếu quá lượng mưa này thì số hoa

vẫn không tăng (Nguyễn Sĩ Nghị, 1982)

Vì vậy việc mưa sớm, mưa nhỏ rải rác hoặc tưới tiêu không đúng thời gian sẽ làm cho sự ra hoa bị ảnh hưởng Đây là một trong những nguyên nhân làm cho hoa nở thành nhiều đợt dẫn tới việc chín trái không đồng đều của cà phê trong tự nhiên

1.4.3.3 Các giai đoạn phát triển của trái cà phê

Sau khi thụ phấn, trái được hình thành và phát triển Bốn giai đoạn phát triển trái

cà phê đã được công nhận (Cannell, 1985; Barros et al.,1999) như sau:

+ Giai đoạn đầu tiên: 0-6 tuần đầu tiên sau khi thụ phấn, sự tăng trưởng là không đáng kể

+ Giai đoạn thứ hai: kéo dài khoảng 10 tuần (từ tuần 6 đến 26) của sự phát triển, trái tăng nhanh về kích thước và khối lượng tươi nhờ sự phân chia tế bào mãnh liệt Ngoại nhũ tăng trưởng nhanh, khoảng 11-12 tuần sau nở hoa, tại thời điểm đó phôi nhũ cũng đã bắt đầu được xác định

+ Giai đoạn tăng trưởng bị đình chỉ và kéo dài chậm: khoảng 2 tuần (tuần 26-28), hình thành phôi và phôi nhũ dần lấp đầy thay thế ngoại nhũ, phôi nhũ dần hóa rắn, lôi

kéo các chất dinh dưỡng chủ yếu làm thịt trái hạn chế phát triển Thể tích trái phát triển rất chậm Lượng chất khô vẫn còn thấp (do phôi nhũ chưa lấp đầy hoàn toàn) + Giai đoạn trưởng thành: từ tuần 28 đến 36, phôi nhũ tiếp tục phát triển dần dần, cho đến khi hoàn toàn chiếm không gian chỉ còn phần bên trong của ngoại nhũ đôi khi

được gọi là "lớp da bạc" (silver skin) (Castro et al., 2005) Lượng chất khô tăng

thường xuyên, với rất ít thay đổi trong khối lượng tươi Vật chất khô tích lũy trong phôi nhũ đã đạt tối đa trái còn xanh

+ Giai đoạn chín trái: từ tuần 36 đến 40 Hạt kết thúc sự phá triển Những thay đổi chủ yếu xảy ra trong vỏ trái, thịt trái phát triển làm tăng kích thước và khối lượng tươi và khô Trái trở thành màu vàng đến đỏ

1.4.4 Các nghiên cứu liên quan đến cây cà phê

Cà phê là một loại cây công nghiệp quan trọng trên thế giới vì thế những nghiên cứu về nó đã được thực hiện rất nhiều Đặc biệt sự chín trái không đồng đều ở cà phê

là một đặc điểm sinh lý ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và chất lượng cà phê vì thế ở những nước trồng cà phê lâu đời ớ Nam Mĩ như Brazil đã có nhiều nghiên cứu nhằm khắc phục hiện tượng trên

Crisosto et al (1991) thực hiện thí nghiệm trên cây cà phê với ethephon (2- (chloroethyl) axit photphoric, cũng là một dẫn xuất của ethylene) để tăng cường quá trình chín trái và làm giảm lực rụng trái (FRF)

Ethephon ở nồng độ 250-1000 mg/l được sử dụng khi những trái cà phê trưởng thành đầu tiên được chuyển màu đỏ (bắt đầu quá trình chín trái) sẽ làm giảm đáng kể

thời gian thu hoạch, tăng năng suất của lần đầu tiên thu hoạch, và giảm lực rụng trái

của cây cà phê Tuy nhiên, trong tất cả các trường hợp, cùng với những tác dụng có

lợi, còn thấy được hiện tượng rụng lá quá nhiều, bị bệnh chết mầm và thỉnh thoảng có

chết cây Nếu sử dụng ở nồng độ thấp của ethephon, vào lúc bắt đầu của giai đoạn chín trái cây, sẽ làm giảm thời gian thu hoạch và tăng thích ứng với thu hoạch bằng cơ học (tỷ lệ trái chín muồi/ chưa chín (màu xanh lá)), mà không có tác động tiêu cực đáng kể đến hiện tượng rụng lá và chất lượng cây trồng Thực hiện thí nghiệm trên 2 lô cà phê

2 năm tuổi phun ethephon 0, 50, 100 và 200 mg/l hòa vào nước tưới vào sáng sớm

quả ethephon 100 mg/l tăng tốc quá trình chín và giảm FRF (lực rụng trái) 15 ngày sau khi ứng dụng mà không ảnh hưởng xấu đến sản lượng Cần áp dụng thêm biện pháp

điều khiển thủy lợi (Crisosto et al.,1992)

Ngoài ra, còn có nghiên cứu kết hợp GA3 và ethephon trong việc đồng bộ hóa quá trình ra hoa và chín trái ở cà phê (Coffea arabica L.) được thực hiện bởi

Masarirambi (1991) vào cuối tháng Tám khi chồi hoa đang phân hóa sẽ phun của GA3

với nồng độ 50, 75, 100 mg/l kích thích tích lũy phần trăm hoa Ở nồng độ cao nhất có ứng dụng đáng kể khi các cây có tỷ lệ ra hoa cao nhất so với các nồng độ thấp hơn và phun nước cất

Sau khi ra hoa, trái cà phê trưởng thành và bắt đầu chín (chuyển sang màu đỏ) sẽ phun ethephon, sau hai tuần tại nồng độ 360 và 720 mg/l thì trái cà phê chín mọng

GA3 do đó có thể được sử dụng ở 100 mg/l để đồng bộ hóa hoa cà phê trong khi ethephon ở 360 mg/l hỗ trợ trong việc thúc đẩy cà phê chín mọng (Masarirambi et al.,

1991)

Tại Việt Nam, những người nông dân có kinh nghiệm thường áp dụng phương thức xử lý nước Vì cây cà phê cần một khoảng thời gian khô hạn để tượng hoa, sau thời gian đó cây cà phê cần được tưới đủ nước để ra hoa Vì thế áp dụng chế độ thủy lợi chính xác có thể giúp cây cà phê ra hoa và chín trái đồng loạt Tuy nhiên chưa có nghiên cứu chính thức công bố về vấn đề thủy lợi kiểm soát ra hoa cũng như về vấn đề chín trái ở cà phê

Chương 2 VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP 2.1 V ật liệu

Trái cà phê (Coffea arabica L.) ở các giai đoạn chín khác nhau thu ở những cây

cà phê có năng suất ổn định 6 năm tuổi (hình 2.1), trồng tại vườn ở Lạc Dương, Đà Lạt, Lâm Đồng (hình 2.2)

Vật liệu sinh trắc nghiệm: khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.), trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.), tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.)

Hình 2.1 Cây cà phê 6 năm tuổi trồng tại vườn cà phê ở Lạc Dương, Đà Lạt (tháng

11/ 2013)

Hình 2.2 Vườn cà phê tại Lạc Dương, Đà Lạt (tháng 11/2013)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Quan sát s ự phát triển của trái cà phê ngoài vườn

Chọn ngẫu nhiên 10 cây trong vườn Trên mỗi cây đánh dấu 30 trái non trên các cành bất kỳ Trái non được tính sau khi hoa nở 3 ngày, cánh hoa rụng, bầu noãn trắng mang vòi nhụy đã héo Theo dõi thời gian sinh trưởng của trái từ giai đoạn trái non đến trái trưởng thành

Những trái non không rụng có thể phát triển đến giai đoạn trưởng thành được tiếp

tục theo dõi để xác định thời gian chín của trái.Từ đó chia ra các giai đoạn chín của trái

cà phê theo màu sắc vỏ trái

Tỷ lệ trái mỗi giai đoạn chín khác nhau trên cành được xác định bằng cách đếm

số lượng trái mỗi loại trên 1 cành Lặp lại trên 5 cành bất kỳ khi chuẩn bị thu hoạch lần đầu tiên (khoảng tháng 10 âm lịch) Từ đó sẽ biết được số lần thu hoạch trong 1 vụ

2.2.2 Quan sát hình thái gi ải phẫu

Cắt ngang vỏ trái cà phê ở mỗi giai đoạn chín Không nhuộm Quan sát dưới kính

hiển vi quang học (40) cho thấy cấu trúc vỏ trái cà phê

Dùng dao lam cạo một lớp biểu bì mỏng trên bề mặt vỏ trái Không nhuộm Quan sát dưới kính hiển vi quang học (10) cho thấy sự thay đổi màu sắc từ khi trái trưởng thành đến khi trái chín do các sắc tố tổng hợp ở vỏ trái hay ở thịt trái

Cắt dọc hạt của trái cà phê trưởng thành qua phôi Xử lý với dung dịch javel và acid acetic 45% Nhuộm thuốc nhuộm 2 màu (xanh iod- đỏ carmin) (Deysson, 1967) Quan sát dưới kính hiển vi quang học nhằm theo dõi cấu trúc của phôi giai đoạn trái trưởng thành

2.2.3 Xác định kích thước, trọng lượng tươi và khô của trái cà phê

Đo đường kính trung bình của 1 trái cà phê ở mỗi giai đoạn chín bằng thước đo

kẹp ngang thân trái qua 2 hạt (hình 2.3)

Hình 2.3 Vị trí đặt thước đo đường kính trái

Cân 1 trái cà phê bất kỳ ở mỗi giai đoạn chín để xác định trọng lượng tươi Lặp

lại 30 lần

Dùng 30 trái mỗi loại ở trên để xác định trọng lượng khô bằng cách sấy mẫu vật

cc Ghi nhận trọng lượng khô trung bình của 1 trái ở mỗi giai đoạn chín (Grodzinxki A.và Grodzinxki D.,1981)

2.2.4 Đo cường độ hô hấp

Tách 1g vỏ trái cà phê mỗi giai đoạn chín Cường độ hô hấp của vỏ trái cà phê được đo bằng máy Hansatech, ở nhiệt độ 250

C, trong phòng tối để tính lượng oxygen được hấp thu với đơn vị: μO2/ g / phút Lặp lại 3 lần (Biale, 1978) Kết quả hiển thị trên màn hình và là số trung bình của 3 lần lặp lại

2.2.5 Đo hàm lượng đường tan, tinh bột, acid hữu cơ và carotenoid

Nhằm xác định hàm lượng đường, tinh bột, acid hữu cơ và carotenoid trong trái ở

mỗi giai đoạn trong quá trình chín trái

 Đo hàm lượng đường tổng số

- L ập đường chuẩn với saccharose

Pha saccharose theo các nồng độ từ 10- 80 mg/l Nhuộm dung dịch saccharose bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ saccharose: phenol 5%: H2SO4 đđ (1:1:5 v/v/v) Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 490 nm với chuẩn là nước cất: phenol 5%:

H2SO4 (1:1:5 v/v/v)

Hàm lượng đường được ly trích và đo ở trái ở các giai đoạn chín khác nhau Nghiền 1g vật liệu Chiết đường bằng cồn 900 nóng theo tỉ lệ cồn: mẫu (10:1 v/v) Lọc Lặp lại 3 lần Tiếp tục chiết đường còn lại trong phần bã bằng cồn 800

nóng

Lặp lại 2 lần Cô cạn các dịch lọc thu được rồi pha loãng với nước cất để thực hiện

phản ứng màu với phenol 5% và H2SO4 đđ theo tỉ lệ 1: 1: 5 (v/v/v) Đo mật độ quang ở

bước sóng 490 nm Tính hàm lượng theo đường saccharose chuẩn (Coombs et

al.,1987)

 Đo hàm lượng tinh bột

Bã còn lại từ các trái ở trên sấy khô 800C trong 30 phút Thêm 5 ml nước cất vào

bã và đun cách thủy 15 phút Lấy mẫu ra và để nguội

Thủy phân bã bằng cách cho 2 ml acid percloric 9,2 N trộn đều trong 15 phút Thêm nước vào hỗn hợp cho đủ 10 ml dung dịch Li tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 4 phút Để riêng dịch lọc (1) Tiếp tục trích bã 3 lần với acid percloric 4,6 N pha loãng thành 10 ml rồi li tâm thu được dịch lọc (2) Gộp chung dịch lọc (1) và (2) sau

đó tiến hành xác định hàm lượng đường theo đường chuẩn với đường mẫu glucose

Qui đổi ra hàm lượng tinh bột theo công thức (Coombs et al.,1987):

a : lượng đường glucose sau khi thủy giải

 Đo hàm lượng acid hữu cơ

Nghiền 5g trái mỗi giai đoạn chín với 30 ml nước cất (10 lần lặp lại) Đun cách

thủy 15 phút, để nguội, lọc Thêm vào bã 20 ml nước cất, đun cách thủy 15 phút Để nguội, lọc Thêm nước cất vào các dịch lọc cho tới 100ml Lấy 20 ml dịch lọc, thêm vào vài giọt phenolphtalein, xác định lượng acid hữu cơ với NAOH 0,01 N Hàm lượng acid được tính theo đương lượng acid: µeq/g trọng lượng tươi (Bùi Trang Việt

và cộng sự, 2000)

 Đo hàm lượng carotenoid có trong vỏ trái

Nghiền 1g vỏ trái mỗi giai đoạn chín Bổ sung thêm 3 ml aceton và 0,2 g Na2SO4(10 lần lặp lại) Lọc và đo thể tích dịch lọc Mật độ quang được đo ở bước sóng 470

nm, 644,8 nm và 661,6 nm bằng máy đo UV Hàm lượng carotenoid tổng số được tính theo công thức (Boyer, 1993):

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh được ly trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992); Ley et al (1963); Loveys, Van Dijk (1988); Meiner (1984) và Yokota et al (1980)

 Ly trích và phân đoạn

Nghiền 3g trái mỗi giai đoạn chín Ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

của trái trong mỗi giai đoạn, dựa trên sự thay đổi pH và dung môi (methanol) Thực

hiện trong ánh sáng đỏ (Bùi Trang Việt, 1989) (hình 2.4)

Hình 2.4 Sơ đồ ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Bùi Trang Việt 1989)

Mẫu nghiền với methanol

Sắc ký

Zeatin

pH 7; Ether Ether

 S ắc ký bản mỏng

Phân ly các chất ly trích bằng phương pháp sắc ký trên bản mỏng silica gel F254

(20x20 cm) để phân tách các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Dung môi di chuyển

có tỉ lệ chloroform: methanol: acid acetic = 80:15:5 (v/v/v) (Yokota et al.,1980) Sau

khi phân li ở 250C, bản silica gel được chia thành 10 băng bằng nhau (tính từ mực gốc đến vạch dung môi) Ngâm từng băng giấy sắc kí trong nước cất để có các dung dịch được dùng trong các sinh trắc nghiệm Chuẩn là dịch trích chứa băng silica gel dưới

mực gốc

Vị trí các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được nhận diện bằng phương pháp chiếu tia UV 254 nm (auxin, abscisic acid và cytokinin), phun hỗn hợp H2SO4: etanol

= 5:95 (v/v) (gibberellin) và quan sát dưới tia UV (Yokota et al.,1980) rồi so với bản

sắc kí chứa dung dịch các chất điều hòa sinh tăng thực vật dạng hỗn hợp

 Sinh tr ắc nghiệm

Đo hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ở vật liệu sau khi ly trích và phân đoạn qua sắc kí bản mỏng: gồm các chất trích từ trái cà phê (ở các giai đoạn chín khác nhau) trong 10 băng trên bản mỏng silica gel

Hoạt tính auxin và abscisic acid (ABA) được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt

diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) (Bùi Trang Việt, 1989; Nguyen Thi Ngoc Lang, 1970)

Hạt lúa gieo trên bông ẩm trong tối ở nhiệt độ 310C ± 20C và đo chiều dài sai biệt sau

24 giờ Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong IAA tinh khiết 1 mg/l, hoạt tính ABA tỷ lệ nghịch với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong ABA tinh khiết 1 mg/l

Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách

(Lactuca sativa L.) Gieo hạt xà lách trên bông ẩm, nhiệt độ khoảng 310

C Sau 18 giờ

chọn hạt có rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ đặt trong các cốc thủy tinh nhỏ (100 ml) chứa

dịch trích sau sắc ký Các cốc thủy tinh được đặt dưới ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ 280C ± 20C Sau 72 giờ, đo sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn Hàm lượng gibberellin tỷ lệ thuận với chiều dài trụ hạ diệp trong GA3 tinh khiết 1 mg/l

(Cucumis sativus L.) Hạt dưa leo gieo trong tối, trên bông ẩm, ở nhiệt độ 310

C ± 20C Khi rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ hạt, thu các tử diệp, cân 10 tử diệp và đặt trên giấy thấm

ẩm chứa dịch trích cytokinin ở 280

C ± 20C, ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux Sau

48 giờ, đo và tính sai biệt trọng lượng tử diệp so với chuẩn Hoạt tính zeatin tỷ lệ thuận

với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa leo so với chuẩn nước cất và zeatin tinh khiết

1, 2, 5 mg/l, BA 5, 10, 20 mg/l; GA3 5, 10, 20 mg/l và ethrel 50, 100, 200 mg/l trong

30 giây sau đó cắm cuống trái vào giấy thấm Lặp lại sau 48 giờ Thêm nước hằng ngày

Mỗi nghiệm thức 5 trái lặp lại 5 lần

Quan sát thời gian trái cần để chín (đổi từ màu xanh-cam thành màu đỏ)

2.2.8 X ử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái ngoài vườn

2.2.8.1 X ử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên trái riêng rẽ

Xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nồng độ như mục 2.2.7 lên trái giai đoạn trưởng thành (màu xanh) nằm riêng lẻ trên cành Sử dụng tăm bông bôi lên toàn

bộ bề mặt trái vào 5g sáng Lặp lại sau 48 giờ

Mỗi nghiệm thức 30 trái lặp lại trên 3 cây ngẫu nhiên trong vườn

Ghi nhận lại thời gian trung bình trái cần để chuyển từ giai đoạn trưởng thành sang chín (từ màu xanh thành màu đỏ) Sau 10, 15, 20 ngày đếm số trái chuyển sang màu đỏ để xác định tỷ lệ trái chín ở mỗi nghiệm thức

2.2.8.2 X ử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên cành mang trái

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cho kết quả tốt sẽ được lựa chọn để xử lý lên cành mang trái

Trước khi xử lý chọn những cành ở giữa cây theo các hướng khác nhau, trên cành có khoảng 70% là trái trưởng thành, một số trái bắt đầu chuyển màu Đếm số trái non và trái trưởng thành trên cành trước khi xử lý

Dùng bình phun và phun trực tiếp dung dịch lên trái trên cành xử lý vào lúc sáng

sớm Điều kiện thời tiết không mưa Phun cách 48 giờ/ lần

Mỗi nghiệm thức 5 cành lặp lại trên 3 cây

Ghi nhận tỷ lệ trái non bị rụng và trái chín đỏ trên cành sau 2 tuần xử lý

2.2.8.3 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của trái sau xử lý

Đo kích thước của trung bình của 1 trái cà phê giai đoạn chín trong mỗi nghiệm

thức xử lý chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đối chứng (nước cất)

Trọng lượng tươi và khô trung bình của một trái cà phê giai đoạn chín trong mỗi nghiệm thức và đối chứng được thực hiện như mục 2.2.3 Lặp lại 10 lần trên 10 trái

2.2.9 Đánh giá thống kê

Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 dùng cho windown để phân tích số liệu và đánh giá thống kê với sai khác có ý nghĩa p=0,05