tạo phôi bò (hoặc phôi heo) từ nguồn trứng đông lạnh bằng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

TÓM TẮT Đề tài tiến hành nhằm nghiên cứu việc bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa, đồng thời tạo phôi từ nguồn giao tử này bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghi

SV Đỗ Hoàng Hùng

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/2011

TÓM TẮT

Đề tài tiến hành nhằm nghiên cứu việc bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa, đồng thời tạo phôi từ nguồn giao tử này bằng

kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization_IVF) và kỹ thuật tiêm

tinh trùng vào bào tương trứng (Intracytoplasmic Sperm Injection _ICSI) Thu nhận trứng từ buồng trứng của bò cái bị giết mổ bằng phương pháp chọc hút Những trứng có ít nhất từ 3 lớp cumulus và đồng nhất về tế bào chất được chọn

để nuôi chín trong môi trường C3 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG +

EGF) ở 38,5oC và 5% CO2, hơi nước bão hòa Nội dung 1: Sau 22 - 24 h nuôi cấy, chọn những tế bào trứng chín theo quan sát hình thái đem bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ qua 2 bước: trứng được cho vào dung dịch cân bằng VS1 (TCM-199 + 10% FBS + 10% DMSO + 10% EG) để trong 45 giây, tiếp theo cho vào dung dịch thủy tinh hóa VS2 (TCM-199 + 10% FBS + 20% DMSO + 20% EG + 1 M sucrose) để trong 25 giây, sau đó nạp từ 5 - 7 tế bào trứng vào cọng rạ (0,25 ml) và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng (khoảng 45 giây

kể từ khi trứng tiếp xúc với dung dịch bảo quản) Giải đông tế bào trứng như sau: (i) lấy cọng rạ chứa tế bào trứng ra khỏi bình nitơ lỏng và để trong không khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 37oC trong 10 giây, sau đó chuyển tế bào trứng vào đĩa nhựa trống (Φ35); (ii) Các tế bào trứng lần lượt được chuyển qua môi trường rã đông thứ nhất (RĐ1: TCM-199 + 10% FBS + 0,25 M sucrose) trong 1,5 phút,

RĐ2 (TCM-199 + 10% FBS + 0,15 M sucrose) khoảng 1,5 phút và RĐ3

(TCM-199 + 10% FBS) trong 5 phút; (iii) Tiếp tục chuyển tế bào trứng qua môi trường

C3 trong khoảng 3 phút Quá trình giải đông tiến hành ở nhiệt độ phòng (25oC) Chọn những trứng còn nguyên vẹn về hình thái đem IVF (nội dung 2) và ICSI (nội dung 3) Kết quả nội dung 1: Đông lạnh 3154 trứng dùng cho IVF, thu được 80,07 ± 2,72% trứng còn nguyên vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái); Đông lạnh 837 trứng dùng cho ICSI, thu được 79,89 ± 5,28% trứng còn nguyên vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái) Kết quả nội dung 2: Tiến hành thụ

tinh cho 1970 trứng sống tốt sau khi giải đông, chỉ có 306 trứng được thụ giai đoạn phôi 2 tế bào, chỉ đạt tỷ lệ 15,21 ± 3,48% Trong khi ở lô đối chứng, tỷ

tinh-đến giai đoạn phôi nang trong khi ở lô đối chứng có 93 phôi (23,25%) Kết quả

nội dung 3: Tiến hành ICSI cho 595 trứng sống tốt sau khi giải đông và 375

trứng tươi chưa qua đông lạnh Tỷ lệ thụ tinh ở lô thí nghiệm chỉ đạt 8,95% (23/240 trứng) so với 30,82% (89/288 trứng) ở lô đối chứng; có 2 phôi phát triển

đến giai đoạn phôi nang so với 16 phôi (5,44%) ở lô đối chứng

This research aimed at bovine embryo production, using cryopreserved mature bovine oocytes by vitrification, and cryopreserved sperms The cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from cow ovaries by aspiration COCs with three or more layers of cumulus cells and homogeneous cytoplasm were selected to be cultured in C3 medium (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF) under the condition at 38.5oC with humidified atmosphere of 5% CO2 in air Experiment 1: After 22 - 24 h incubation, matured oocytes were cryopreserved by vitrification method in straws in two steps: (i) oocytes were first equilibrated in the VS1 solution (TCM-199 + 10% FBS + 10% DMSO + 10% EG) for 45 seconds; (ii) The oocytes were then transferred in the VS2solution (TCM-199 + 10% FBS + 20% DMSO + 20% EG + 1 M sucrose) for 25 seconds Each straws were loaded with 5-7 oocytes Straws were plunged directly into liquid nitrogen within 45 seconds at the beginning of the exposure to second step After storage in liquid nitrogen, thrawing was performed by exposing the straw to air for 5 seconds, and plunged into warm water (37oC) for 10 seconds, and then transfered were oocytes into clean dish (Φ35); Oocytes were directly expelled into RD1 medium (TCM-199 + 10% FBS + 0.25 M sucrose) 1.5 minutes, RD2 medium (TCM-199 + 10% FBS + 0.15 M sucrose) 1.5 minutes and

RD3 (TCM-199 + 10% FBS) medium 5 minutes; This oocytes were tranferred to

C3 medium and holding for 3 minutes The thrawing was performed in a room at

25oC Survival oocytes by morphology used for IVF (Experiment 2) and ICSI (Experiment 3) In experiment 1: 3154 oocytes were vitrificatin which used for IVF, morphological intact recovered rate was 80,07 ± 2,72%; 837 oocytes were vitrification which used for ICSI, morphological intact recovered rate was 79,89

± 5,28% In experiment 2: After 22-24h incubated with sperm, 306/1970 (15,21 ±

3,48%) vitrified oocytes were fertilized while the rate of fertilized oocytes in the

control samples is 234/400 (58,5 ± 4,89%); the rate embryo developed into

blastocyst stage in experiment and control was 4,14% (82 embryos) and 23,25% (93 embryos), respectively In experiment 3: After 22-24h incubated with sperm,

oocytes in the control samples is 234/400 (58,5 ± 4,89%); 2 embryos developed

into blastocyst stage in experiment and control was 16 embryos

MỤC LỤC

Tóm tắt đề tài (tiếng Việt và tiếng Anh) i

Mục lục v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vi

Danh mục từ viết tắt iv

PHẦN MỞ ĐẦU viii

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Cách tiếp cận đề tài 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Phạm vi nghiên cứu 3

6 Nội dung nghiên cứu 3

7 Sản phẩm đề tài 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG 6

1.1.1 Khái niệm đông lạnh trứng 6

1.1.2 Mục tiêu của đông lạnh trứng 6

1.2.3 Những nét cơ bản về bảo quản trứng đông lạnh bằng

phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification) 7

1.2.4 Đông lạnh trứng trưởng thành bằng

phương pháp thủy tinh hóa 9

1.2 KHÁI QUÁT VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 10

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 10

1.2.2 Cơ sở khoa học của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm 11

1.3 KHÁI QUÁT VỀ KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG

VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN 16

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 16

1.3.2 Cơ sở khoa học của kỹ thuật ICSI 17

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả ICSI 21

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 NỘI DUNG 1: ĐÔNG LẠNH TRỨNG BÒ TRƯỞNG THÀNH

BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA

TRONG CỌNG RẠ 24

2.1.1 Thu nhận và nuôi trứng 24

2.1.2 Đông lạnh trứng 25

2.1.3 Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng 27

2.2 NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI BÒ BẰNG KỸ THUẬT THỤ TINH

TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 27

2.2.1 Chuẩn bị tinh trùng 27

2.2.2 Thụ tinh trong ống nghiệm 28

2.2.3 Nuôi phôi và đánh giá phôi 29

2.2.4 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm từ trứng tươi 29

2.3 NỘI DUNG 3: TẠO PHÔI BẰNG KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG (ICSI) 30

2.3.1 Chuẩn bị hóa chất 30

2.3.2 Chuẩn bị trứng 30

2.3.3 Chuẩn bị hệ thống thao tác 31

2.3.4 Tiến hành ICSI 31

2.3.5 ICSI trứng tươi 32

2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ NỘI DUNG 1 33

3.2 KẾT QUẢ NỘI DUNG 2 .35

3.3 KẾT QUẢ NỘI DUNG 3 40

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

Phụ lục DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả đông lạnh trứng dùng cho IVF 33

Bảng 3.2 Kết quả đông lạnh trứng dùng cho ICSI 34

Bảng 3.3 Kết quả IVF từ trứng đông lạnh 35

Bảng 3.4 Các giai đoạn phát triển của phôi 37

Bảng 3.5 Sự chuyển tiếp của phôi lên các giai đoạn chính

ở trứng đông lạnh 38

Bảng 3.6 Kết quả ICSI từ trứng đông lạnh 40

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của phôi 14

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí toàn bộ thí nghiệm trong đề tài 24

Hình 2.2 Cọng rạ chứa trứng 26

Hình 2.3 Lấy cọng rạ chứa tinh trùng ra khỏi bình nitơ lỏng 28

Hình 2.4 Giải đông tinh trùng trong nước ấm 28

Hình 2.5 Đĩa bố trí các vi giọt cho ICSI 30

Hình 3.1 Trứng chín 33

Hình 3.2 Biểu đồ kết quả đông lạnh trứng 34

Hình 3.3 Biểu đồ kết quả thụ tinh từ nguồn trứng đông lạnh 36

Hình 3.4 Phôi 2 tế bào từ trứng đông lạnh (X10) 37

Hình 3.5 Biểu đồ các giai đoạn phát triển của phôi

từ trứng đông lạnh 38

Hình 3.6 Các giai đoạn chính của phôi tạo ra từ trứng đông lạnh 39

Hình 3.7 Biểu đồ kết quả ICSI từ trứng đông lạnh 43

Hình 3.8 Trứng trước khi vi tiêm 43

Hình 3.9 Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) 43

Hình 3.10 Trứng sau khi vi tiêm thành công 43

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm

ICSI Intracytoplasmic Sperm

Injection Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

Reaction

LAMP Loop-Mediated

Isothermal Amplification

IVM In Vitro Maturation Nuôi trưởng thành trong ống nghiệm

ICM Inner Mass Cell Khối tế bào bên trong

TE Trophectoderm Cell Tế bào nuôi phôi

ZP Zona Pellucidas Màng trong suốt, màng thụ tinh

CPA Cryoprotectant additive Chất bảo quản lạnh

PVP Polyvinylpyrolidone

FBS Fetal Bovine Serum

FCS Fetal Calf Serum

PHẦN MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

hế kỷ XXI được mệnh danh là thế kỷ của Công nghệ Sinh học hiện đại Kỷ nguyên này sẽ tạo ra những bước nhảy vọt về năng suất, chất lượng giống cây trồng, vật nuôi và trên hết là khả năng ứng dụng thực tiễn trên con người Trong đó phải kể đến Công nghệ hỗ trợ sinh

sản, nổi bật là kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization_IVF),

tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intracytoplasmic Sperm Injection _ICSI), đông lạnh Chúng ta có thể tạo ngân hàng phôi, giao tử phục vụ cho các nghiên cứu khoa học (chuyển gen, nhân bản, thu nhận tế bào gốc phôi…) đồng thời có thể nhân nhanh số lượng lớn đàn giống cao sản, lai tạo hoặc chọn lọc các cá thể chất lượng cao thông qua việc sử dụng trứng và tinh trùng chất lượng tốt

Hiện nay, nhằm đáp ứng mục tiêu của “Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020” do chính phủ đề ra, nhiều phương pháp đã được áp dụng nhưng thực

tế vấp phải rất nhiều hạn chế khi đưa vào sản xuất trên qui mô công nghiệp như

kỹ thuật IVF, ICSI thành công chưa cao vì phụ thuộc nhiều vào nguồn mẫu Có thể thấy rõ điều này khi ứng dụng kỹ thuật IVF, ICSI để nhân nhanh đàn bò sữa nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ sữa bò ngày càng gia tăng trong những năm trở lại đây do chất lượng, nguồn cung cấp mẫu không ổn định, hạn chế trong việc vận chuyển và bảo quản mẫu… Vì thế, nghiên cứu và sử dụng nguồn trứng đông lạnh trở thành giải pháp hữu hiệu cho những vấn đề trên Tuy nhiên, quá trình thụ tinh với nguồn trứng đông lạnh sẽ cho kết quả thấp hơn so với bình thường Điều này là do trong quá trình đông lạnh – giải đông, trứng đã bị những tổn thương về thoi vô sắc, nhiễm sắc thể, và đặc biệt là màng tế bào, gây trở ngại cho quá trình thụ tinh Cho đến nay, người ta đã thu nhận được một số kết quả thụ tinh trong ống nghiệm từ tế bào trứng đông lạnh: năm 2003, Shinichi Hochi đã thành công với tỷ lệ trứng bò thụ tinh sau giải đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst

T

là 5% [44]; năm 2008, Morato đã đưa ra tỷ lệ thụ tinh đối với tế bào trứng bò sau khi thủy tinh hóa bằng vi giọt là 46,1% và sau sự thụ tinh trong ống nghiệm 5,3% trứng bò phát triển đến giai đoạn phôi nang [37] Vì thế, các nghiên cứu nhằm nâng cao tỷ lệ tạo phôi nang (blastocyst) từ trứng bò đông lạnh vẫn đang được thực hiện ở nhiều nước

Tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm từ trứng bò đông lạnh ở nước ta mới chỉ có Nguyễn Thị Thương Huyền và cs thực hiện (2009) với tỷ lệ thụ tinh là 11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang [3] Những công trình nghiên cứu theo hướng này còn rất ít cũng như tỷ lệ thành công còn thấp Chính vì vậy, chúng tôi

đề xuất đề tài “Tạo phôi bò (hoặc phôi heo) từ nguồn trứng đông lạnh bằng

kỹ thuật hỗ trợ sinh sản” Hy vọng kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp

phần thúc đẩy và hoàn thiện công nghệ tạo phôi in vitro từ nguồn trứng bò đông

lạnh nói riêng và trứng đông lạnh của động vật hữu nhũ nói chung tại Việt Nam

• Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm: Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông lạnh trứng, thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bò heo tại Viện Chăn nuôi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do TS Otoi (Người Nhật)

và các cán bộ của viện đảm trách…

• Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngoài nước

• Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ thuật vi thao tác, PCR…

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Phương pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa, giải đông trứng, tạo phôi từ trứng đã đông lạnh…

• Phương pháp xử lý tinh trùng để chọn tinh trùng tốt thụ tinh với trứng

6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

• NỘI DUNG 1: Đông lạnh trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ

• NỘI DUNG 2: Tạo phôi bò bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

• NỘI DUNG 3: Tạo phôi bò bằng kỹ thuật tịêm tinh trùng vào bào

tương trứng (ICSI)

• Đã thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm cho 1970 trứng đông lạnh với tỷ lệ thụ tinh đạt 15,21 ± 3,48% và đã có 4,14 ± 1,86% (82 phôi) phát triển đến giai đoạn phôi nang; 400 trứng tươi với tỷ lệ thụ tinh đạt 58,5 ± 4,89% và đã

có 23,25 ± 2,94% (93 phôi) phát triển đến giai đoạn phôi nang

• Đã thực hiện tiêm tinh trùng vào bào tương trứng cho (1) 595 trứng đông lạnh: 240 vi tiêm thành công, 23 trứng đã thụ tinh (8,95 ± 7,49%) và đã có được 6 phôi phát triển đến giai đọan phôi dâu, 2 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang; (2) 375 trứng tươi: 288 trứng vi tiêm thành công, 89 trứng đã thụ tinh (30,82 ± 4,27%) và đã có được 23 phôi phát triển đến giai đọan phôi dâu, 16 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang

Kết quả đào tạo

02 cử nhân

Đỗ Hoàng Hùng: Thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro

fertilization_IVF) trên tế bào trứng bò, 2010

Lương Thiện Nghĩa: Khảo sát hiệu quả thụ tinh của trứng bò đông lạnh bằng kỹ thuật ICSI (intracytoplasmic sperm injection), 2009

Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố

• 01 bài đăng trong tạp chí Công nghệ Sinh học, 2009 (Tạo phôi bò bằng kỹ

thuật thụ tinh in vitro từ nguồn giao tử đông lạnh) Tập 7, Số 2, Trang

161-167

• 01 bài báo cáo tại hội nghị Công nghệ hỗ trợ sinh sản Châu Á thường

niên, 2009 (Experiment on frozen in vitro bovine embryo transfer after

sexing by LAMP method), Tại Cambodia, Trang 108

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG

1.1.1 Khái niệm đông lạnh trứng

Đông lạnh trứng là kỹ thuật bảo quản chức năng bình thường của trứng trong một thời gian dài khi giảm nhiệt độ sinh lý của trứng (từ 37OC, 5% CO2) xuống dưới nhiệt độ xảy ra các phản ứng sinh hóa ở -196OC (nhiệt độ dưới nhiệt

độ sinh lý) [5]

Theo các nhà khoa học trên thế giới, quy trình đông lạnh và giải đông trứng thường được tiến hành qua 5 bước chính: (1) Đặt trứng vào dung dịch chất bảo quản; (2) Làm lạnh xuống nhiệt độ dưới 0oC; (3) Bảo quản ở nhiệt độ dưới -

196oC; (4) Làm ấm và giải đông trong dung dịch thích hợp; (5) Chuyển trứng vào môi trường nuôi cấy [5, 8, 28]

1.1.2 Mục tiêu của đông lạnh trứng

Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng của trứng Trong đó, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công Do vậy, mục tiêu của đông lạnh trứng bao gồm việc giảm thể tích vật chứa, giảm tính độc chất bảo quản, tăng gradient nồng độ, thay đổi tỷ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích (SA/V) của tế bàolà nhằm giảm stress cho trứng trong quá trình đông lạnh [5, 8] Các phương pháp đông lạnh thông thường thực hiện quá trình khử nước rất lâu, hình thành nhiều tinh thể đá, điều này làm giảm khả năng sống của trứng sau giải đông Chính vì vậy, mục tiêu của quy trình đông lạnh trứng nói chung và đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa nói riêng là hoàn tất sự thủy tinh hóa nội bào, loại trừ tinh thể đá cả trong và ngoài tế bào với tốc độ làm lạnh cực nhanh nhằm duy trì khả năng sống, ngăn stress cho tế bào đồng thời lại phải

dễ dàng trong thao tác [28]

1.2.3 Những nét cơ bản về bảo quản trứng đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification)

• Lịch sử nghiên cứu

Phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [42] Vài năm sau đó, kỹ thuật này được thực hiện rộng rãi trên gia súc Tuy nhiên, quy trình này chỉ được Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 và sau

đó vài tháng, được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane Ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời [28, 34, 53]

Hiện nay, đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đang là một kỹ thuật được các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm lớn trong khu vực và thế giới đưa vào ứng dụng trong thực tiễn điều trị và đang dần thay thế phương pháp hạ nhiệt

độ chậm trước đây Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng không ngừng thực hiện những kiểm chứng lâm sàng nhằm chứng minh kỹ thuật này thật sự an toàn đối với con người

• Khái niệm về phương pháp thủy tinh hóa

Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh Sau khi được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao (4 – 8M), nồng độ thẩm thấu vào khoảng 4000mOSm, tốc độ khử nước rất nhanh và trứng ngay lập tức được đặt vào nitơ lỏng (-1960C) Nước ở điều kiện này không chuyển thành đá (ice) thông qua sự kết tinh (crystallization)

mà chuyển thành dạng giống như thủy tinh (glass – like) Ở dạng thủy tinh, phân

tử nước và các chất hòa tan được giữ nguyên vị trí Kỹ thuật này giúp tế bào tránh được những tổn thương do sự hình thành tinh thể nước đá gây ra trong quá trình đông lạnh Mẫu trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, không qua quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong đông lạnh chậm Tốc độ làm lạnh của phương pháp này cực nhanh (ultra – rapid), khoảng 20000 – 25000oC / phút [28, 33, 49]

Thủy tinh hóa có thể được thực hiện theo hai cách: tăng tốc độ hạ nhiệt; tăng nồng độ chất bảo quản Chính vì hai phương thức đó, chất bảo quản đông lạnh được sử dụng với một lượng tối thiểu (khoảng 1µl) nhưng nồng độ rất cao

và tốc độ làm lạnh thường dùng vào khoảng 15.000oC – 30.000oC /phút [28] Với quy trình đông lạnh sử dụng phương pháp làm lạnh cực nhanh, tế bào đặt trong chất bảo quản (thường ở nhiệt độ phòng) có nồng độ rất cao trong khoảng thời gian ngắn nhất có thể, trứng được chứa trong các dụng cụ chứa chuyên biệt (straw, cryotop, cryoloop) có thể tích nhỏ, sau đó được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng mà không thông qua quá trình hạ nhiệt từ từ Sự khử nước được thực hiện rất nhanh do nồng độ rất cao của chất bảo quản, đồng thời nhiệt

độ thấp của nitơ lỏng (-196OC) sẽ làm tế bào đông đặc nhanh chóng khiến nước trong tế bào không kịp hình thành tinh thể đá gây tổn thương đến tế bào [28, 49] Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa cao gấp 4 – 5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp đông lạnh chậm trước đây Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn Kết quả là không có sự hình thành tinh thể đá bên trong tế bào, nhờ đó tế bào có thể tránh được những tổn thương màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra [12, 14, 15, 28]

Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả đông lạnh cần lưu ý một số vấn đề sau:

- Loại và nồng độ chất bảo quản đông lạnh sử dụng Mỗi loại hóa chất bảo quản khác nhau sẽ thích hợp với loại tế bào trứng khác nhau và mỗi loại sẽ có nồng độ bảo quản khác nhau tùy vào quy trình và loại tế bào cần đông lạnh

- Nhiệt độ của dung dịch thủy tinh hóa mà tế bào tiếp xúc

- Khoảng thời gian mà trứng tiếp xúc với chất bảo quản đông lạnh lần cuối trước khi nhúng vào nitơ lỏng Thông thường thời gian tiếp xúc với nồng độ cao nhất (cuối cùng) không quá 30 giây

- Tốc độ làm lạnh càng nhanh càng nâng cao tỷ lệ sống của trứng

- Loại dụng cụ dùng trong phương pháp thủy tinh hóa

- Chất lượng và trạng thái phát triển của trứng đem đông lạnh

Trên thực tế, tốc độ làm lạnh bị giới hạn, một giới hạn sinh học mà tại đó tế bào có thể chịu được nồng độ chất bảo quản đông lạnh trong suốt quá trình thủy tinh hóa Vì thế, việc cân bằng giữa tốc độ làm lạnh cực đại với nồng độ chất bảo quản tối thiểu là rất quan trọng [16, 18, 28, 49]

Thành phần chính của môi trường đông lạnh gồm:

- Chất bảo quản lạnh (Cryoprotectant additive _ CPA)

- Chất bảo quản ngoại bào

- Môi trường cơ bản: môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường nuôi cấy có bổ sung 20% huyết thanh [52]

1.2.4 Đông lạnh trứng trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa

Trứng trưởng thành ở hầu hết động vật có vú chứa thoi vô sắc bị trì hoãn ở giai đoạn MII Thoi vô sắc được tạo thành từ các vi ống liên kết với các nhiễm sắc thể của mẹ (Aigner và cs., 1992) Lúc này trứng có nhân và tế bào chất trưởng thành, thể cực thứ nhất bị đẩy ra, nhiễm sắc thể đặc lại và xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc [19, 28]

Nghiên cứu sử dụng trứng trưởng thành cho thấy khả năng sống của trứng sau đông lạnh và rã đông bị ảnh hưởng bởi một số nhân tố Về nhân tố hình thái, trứng mất cumullus trong suốt quá trình đông lạnh có thể tác động trực tiếp lên khả năng sống của chúng sau rã đông Trứng trưởng thành không đồng nhất trong

sự phân bố và tổ chức các bào quan trong bào tương có thể ảnh hưởng đến kết quả của quy trình đông lạnh [28]

Trứng ở giai đoạn MII dễ bị tổn thương do đông lạnh vì thoi vô sắc nguyên phân nơi NST bắt đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp Đông lạnh trứng trong thời gian ngắn có thể gây ra sự phá vỡ không phục hồi thoi vô sắc khi quá trình khử nước xảy ra nhanh ở nhiệt độ thấp [46]

Sự sắp xếp các vi sợi thoi vô sắc thích hợp là điều cần thiết để tách và sắp xếp đúng NST Vì vậy, trứng đông lạnh càng tăng khả năng bị đa bội thể sau khi thể cực thứ 2 bị đẩy ra ngoài Đông lạnh còn gây tổn thương cấu trúc xương tế bào, thay đổi cấu tạo các bào quan [46]

Theo một số nghiên cứu, ở tất cả các loài động vật có vú, các vi ống và thoi

vô sắc ở giai đoạn nguyên phân của trứng không tập trung và không kết hợp khi trứng tiếp xúc với nhiệt độ gần 0oC trong khoảng vài phút (Parks và Ruffing, 1992) Trứng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với các chất bảo quản đông lạnh khác nhau Johnson và Pickering (1987) cho thấy trường hợp trứng tiếp xúc lâu với DMSO kết quả là không tập trung thoi vô sắc và NST bị phân tán Tuy nhiên,

họ lại kết luận là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đó chất bảo quản đông lạnh không thể thấm vào tế bào một cách nhanh chóng, vì vậy có rất ít chất bảo quản đông

lạnh trong tế bào [25, 28, 46]

1.2 KHÁI QUÁT VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu [8], [28]

• Vài nét tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1954, lần đầu tiên kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization_IVF) được nhóm nghiên cứu do Dauzier đứng đầu thực hiện trên

thỏ Đến năm 1982, kỹ thuật này được Brackett ứng dụng vào chăn nuôi bò sữa

Từ đó, IVF được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi ở các nước có ngành chăn nuôi phát triển [5, 8]

Năm 1997, Shinichi Hochi và cs nghiên cứu khả năng thụ tinh của trứng bò đông lạnh rã đông ở các giai đoạn chưa trưởng thành, đang trưởng thành và trưởng thành Đến năm 2003, nhóm nghiên cứu này báo cáo tỉ lệ trứng thụ tinh sau rã đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst là 5% [45]

Năm 2007, Gupta và cs thử nghiệm quy trình thủy tinh hóa bằng cách sử dụng kết hợp EG và DMSO đối với trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện Tuy nhiên, chỉ 3,4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là 20,1% [23]

Năm 2008, Morato và cs đã đưa ra tỷ lệ IVF đối với trứng bò sau khi thủy tinh hoá bằng vi giọt là 46,1% và 5,3% trứng bò phát triển đến giai đoạn blastocyst [37]

Năm 2010 nhóm nghiên cứu do Zhou XL và cs thuộc Trường Đại học Dublin, Ireland đã tiến hành IVF trên trứng bò trưởng thành được đông lạnh với

tỷ lệ thụ tinh là 11,3% và 4% phát triển đến giai đoạn blastocyst [51] Trong khi

đó nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Suranaree, Nhật Bản do Sripunya N báo cáo tỷ lệ phân chia là 41,6% và có 10,3% phát triển đến giai đoạn blastocyst khi tiến hành IVF từ trứng bò MII được thủy tinh hóa [38]

• Tình hình nghiên cứu trong nước

Kỹ thuật tạo phôi từ trứng đông lạnh đã được ứng dụng vào Việt Nam từ vài năm qua Tuy nhiên chủ yếu áp dụng trên người, đi đầu là bệnh viện Từ Dũ nhằm giúp hỗ trợ cho các đôi vợ chồng hiếm muộn Các nghiên cứu và ứng dụng

kỹ thuật đông lạnh trong bảo quản trứng, mô, phôi trên động vật hữu nhũ ở Việt Nam còn rất ít [53]

Năm 2003, trường hợp thai lâm sàng đầu tiên từ cả trứng và tinh trùng người đông lạnh được thực hiện ở bệnh viện Từ Dũ [53]

Ngày 24/05/2004, trường hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh tại bệnh viện Từ Dũ Và cho đến nay, bệnh viện Từ Dũ đã trữ lạnh trứng cho 12 trường hợp; thực hiện rã đông trứng và tạo phôi cho 8 trường hợp

Việc trữ lạnh phôi người được thực hiện đầu tiên ở bệnh viện Từ Dũ vào tháng 3/2002 Đến tháng 7/2003, bệnh viện bắt đầu triển khai chương trình trữ lạnh trứng Em bé đầu tiên ra đời từ trứng trữ lạnh vào 25/4/2004 [53]

Tuy nhiên, các nghiên cứu, thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm từ trứng bò đông lạnh mới chỉ có ở lab của ThS Phan Kim Ngọc (2009) với tỷ lệ thụ tinh là 11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang [3, 7]

1.2.2 Cơ sở khoa học của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

1.2.2.1 Khái niệm

Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization_IVF) là quá trình kết hợp

giữa tinh trùng (giao tử đực) với trứng (giao tử cái) để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ - trong phòng thí nghiệm với môi trường sinh học nhân tạo có các điều kiện thích hợp: nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, yếu tố dinh dưỡng, pH,

áp suất thẩm thấu… cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải được đảm bảo bình thường gần giống như trong cơ thể mẹ [5, 8, 28]

Quy trình IVF gồm những bước cơ bản: thu nhận và chọn lọc giao tử đực

và cái; thụ tinh; nuôi hợp tử phát triển thành phôi; cấy truyền phôi tươi hoặc phôi đông lạnh cho con cái nhận phôi Mỗi bước trong quy trình đều đóng vai trò quan trọng như nhau nhằm đảm bảo được khả năng hình thành và phát triển phôi tối

đa

Nguồn trứng sử dụng cho IVF có thể thu từ những động vật sống được kích hoạt bằng kích dục tố để gây rụng trứng hàng loạt; từ buồng trứng động vật giết

mổ hay sử dụng trứng đông lạnh Theo Long và cs (1993), các nang trứng có

đường kính 2-8 mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc thu nhận các trứng chưa trưởng thành phục vụ cho kĩ thuật IVF Trong kĩ thuật IVF, nếu sử dụng các trứng chưa trưởng thành cần có sự hỗ trợ của quá trình nuôi

trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM) Ngoài ra, sử dụng trứng đông

lạnh trong quá trình IVF cũng là một thử thách lớn vì tỉ lệ thụ tinh và phát triển phôi không cao do những tổn thương khó phục hồi ở màng nội chất và màng thụ tinh của trứng trong quá trình bảo quản [8, 28]

Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các trứng đã được thực hiện với tinh tươi hoặc tinh đông lạnh qua giải đông Ở nhiều phòng thí nghiệm, do khó khăn trong bảo quản lạnh nên tinh tươi vẫn là nguồn tinh trùng chính cho các nghiên cứu IVF Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tươi có một số thành phần không có lợi cho hoạt động của tinh trùng Mục đích của các phương pháp thu nhận tinh trùng theo các nghiên cứu nhằm chọn được các tinh trùng bình thường có độ di động tốt, loại được các tế bào chết, các vi sinh vật và các chất độc, hoạt hóa đầu tinh trùng, tạo thuận lợi cho quá trình thụ tinh với trứng [13]

Hệ thống thụ tinh IVF đòi hỏi nghiêm ngặt về các điều kiện nhiệt độ, độ

ẩm, thời gian thụ tinh, áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy Hầu hết các môi trường IVF cần bổ sung những yếu tố có vai trò hoạt hóa tinh trùng, tăng khả năng hoạt động của chúng Ngoài ra, cũng bổ sung những yếu tố cần thiết giúp chúng duy trì khả năng thụ tinh Bên cạnh đó, môi trường IVF cũng ảnh hưởng

đến tỉ lệ thụ tinh đa tinh trùng Martinez-Mardrid và cs (2001) đã sử dụng hai

môi trường IVF khác nhau gồm môi trường đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi trường Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh Kết quả này cho thấy, trong mTALP tinh trùng có tỉ lệ xâm nhập cao hơn (92-94% so với 61-67%) Vì thế, lựa chọn môi trường IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng để giảm tối thiểu tỷ lệ đa tinh trùng nhưng đạt tỉ lệ thụ tinh cao [28, 31, 39]

1.2.2.2 Sự phát triển của phôi trong điều kiện in vitro

Trong điều kiện in vitro với môi trường chứa dịch muối cân bằng, các cơ

chất cung cấp năng lượng và protein và điều kiện môi trường 5% CO2 và ở 38,5oC, trứng bò sau khi thụ tinh vẫn có khả năng phát triển bình thường Sau khi thụ tinh, hợp tử phân chia bằng cách nguyên phân liên tục sau mỗi 24 giờ, tạo thành các tế bào phôi Cũng là quá trình nguyên phân nhưng nguyên phân ở tế bào phôi khác ở các tế bào sinh dưỡng là sau mỗi lần phân chia kích thước tế bào phôi gần bằng ½ kích thước tế bào mẹ trước đó Như vậy, sau mỗi lần phân chia,

số lượng tế bào phôi tăng lên trong khi đó kích thước phôi tổng thể không thay đổi Hơn thế nữa, mỗi tế bào phôi sẽ tự thiết lập một chương trình phát triển riêng

để chuẩn bị cho sự biệt hóa thành các dòng tế bào chức năng cho cơ thể [28, 39]

• Giai đoạn trứng hai tiền nhân: khoảng 16 – 18 giờ sau khi thụ tinh một trong hai tiền nhân chứa thông tin di truyền từ trứng và phần còn lại chứa thông tin di truyền từ tinh trùng Tính phân cực của tiền nhân và sự phân phát của hạch nhân giữa hai tiền nhân cho thấy chất lượng tiềm tàng của phôi đang trên đà phát triển Cuối cùng hai tiền nhân sẽ biến mất, hợp tử bây giờ đang trong giai đoạn chuyển thành phôi [21, 23]

• Giai đoạn phôi hai tế bào: Sau 18-20 giờ thụ tinh, hợp tử sẽ bắt đầu chu kỳ phân chia đầu tiên thành hai tế bào Sự phân chia được thực hiện trên trục và mặt phẳng phân chia lấy thể cực thứ hai làm mốc [33, 35]

• Giai đoạn phôi bốn tế bào và tám tế bào: Chu kỳ phân chia tế bào thứ hai xảy ra với mặt phẳng phân chia nằm vuông góc tại vị trí xích đạo của trục phân chia thứ nhất Kết thúc giai đoạn này, phôi tạo thành 4 tế bào có kích thước tương đối bằng nhau (42-54 giờ sau khi thụ tinh) Chu kỳ phân bào tiếp tục diễn ra Vào

ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, người ta có thể quan sát được phôi ở giai đoạn 8 tế bào [28, 35]

• Giai đoạn phôi dâu (morula) và phôi nang (blastocyst): Sau ngày thứ 4 các

tế bào phôi bắt đầu mất dần ranh giới giữa chúng Màng tế bào phôi trở nên khó phân biệt, lúc này phôi có hình dạng và kích thước rất khác nhau giai đoạn này gọi là giai đoạn nén (compaction) Ở giai đoạn này, phôi được gọi là phôi dâu Giai đoạn tiếp theo là sự hình thành khoang phôi (cavitation) khoảng 100 giờ sau khi thụ tinh Khoang phôi tích lũy dịch ngày càng nhiều và lớn dần, kích thước của khối tế bào bên trong (Inner Mass Cell _ICM) trở nên nhỏ và bắt đầu nén chặt, lớp tế bào nuôi phôi (Trophectoderm Cell _TE) cũng giảm dần kích thước sau lần phân chia và dẹp hơn Phôi ở giai đoạn này gọi là phôi nang khoảng ngày thứ 6 đến 8 sau thụ tinh [5, 8, 34, 35]

Giai đoạn 2 tiền nhân Phôi 2 tế bào Phôi 4 tế bào

Phôi 8 tế bào Phôi dâu Phôi nang

Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của phôi

1.2.2.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến phôi in vitro

Tạo phôi in vitro là một lĩnh vực tiềm năng của công nghệ sinh học sinh sản

trong việc tăng nguồn giống gia súc và là một công cụ quan trọng cho những nghiên cứu về phôi học Tuy nhiên, có một số dấu hiệu cho thấy rằng vẫn có những khác biệt về hình thái và cấu trúc phân tử của phôi giữa việc tạo thành

phôi in vivo và in vitro Điều này có thể do các nhân tố như chất lượng nang

trứng, trứng, môi trường nuôi phôi, thời gian thụ tinh…

• Kích thước nang trứng

Bình thường, sự trưởng thành của trứng bên trong nang trứng đòi hỏi một thời gian dài Trong suốt giai đoạn đó, trứng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết để thực hiện quá trình giảm phân tạo thành trứng trưởng thành cho quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi sau này Do đó, chất lượng của trứng liên quan chặt chẽ đến thành phần trong nang trứng Có nhiều báo cáo cho thấy có một mối liên hệ giữa kích thước nang trứng và khả năng của trứng Một số báo cáo cho thấy rằng những trứng thu từ những nang có đường kính hơn 2-3mm sẽ cho những phôi có tỷ lệ phát triển tốt (Yang và cs., 1998) Ngược lại, những trứng thu từ những nang có đường kính nhỏ hơn có tỷ lệ phát triển rất thấp, do những nang trứng chưa tích tụ đầy đủ những chất cần thiết cho trứng trải qua quá trình giảm phân [4, 5, 28]

• Thời gian thụ tinh

Cơ hội thụ tinh và sự phát triển sẽ tốt hơn nếu tiến hành thụ tinh cho trứng khoảng 4 giờ sau khi hình thành thể cực đầu tiên Ở các động vật như chuột, nếu thụ tinh muộn, trứng thường có cực đầu to và phôi phát triển không bình thường

• Mật độ tinh trùng

Trong quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, người ta không thể xác định được chính xác tỷ lệ tinh trùng thực sự được hoạt hóa Do đó, để đảm bảo cho sự thụ tinh thành công, tinh trùng thường được sử dụng với một lượng rất lớn Trong điều kiện nuôi cấy thông thường, mật độ tinh trùng vào khoảng 105-106 tinh trùng/ml hoặc 104-105 tinh trùng/trứng Tuy nhiên, điều này sẽ gây ra tỷ lệ thụ

tinh đa tinh trùng trong điều kiện in vitro cao hơn nhiều lần so với trong điều kiện in vivo [11]

• Loại tinh trùng chết ra khỏi môi trường sau thụ tinh [9, 10, 17] Theo các nghiên cứu cho thấy, sự hiện diện của tinh trùng chết trong môi trường sau thời gian thụ tinh sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi Do đó, cần chuyển tế bào trứng cùng với tinh trùng bám vào màng thụ tinh ra khỏi phần tinh trùng đã chết để tránh tác động oxy hóa của các sản phẩm trao đổi chất của tinh trùng lên sự phát triển của phôi

1.2.2.4 Hệ thống đánh giá phôi sau khi thụ tinh

Có nhiều hệ thống đánh giá phôi sau khi thụ tinh, thường tiêu chuẩn hình thái được sử dụng để đánh giá chất lượng của phôi bao gồm: [28, 31]

- Số lượng tế bào phôi

- Kích thước, hình dạng, sự đối xứng, màu sắc bào tương của các tế bào phôi

- Tỷ lệ xuất hiện các mảnh vỡ tế bào trong bào tương

1.3 KHÁI QUÁT VỀ KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu

Từ một báo cáo ICSI đầu tiên trên chuột (Uehara và Yanagimachi, 1976)

kỹ thuật này đã được áp dụng trên nhiều loài động vật có vú khác, những con con được tạo ra bằng ICSI lần lượt được tạo ra trên thỏ (Hosoi và cs., 1988), bò (Goto

và cs., 1990), người (Palermo và cs., 1992), chuột (Kimura và Yanagimachi, 1995), cừu (Catt và cs., 1996), ngựa (Cochran và cs., 1998), mèo (Gomez và cs., 2000), heo (Martin, 2000), chuột cống (Hirabayashi và cs., 2002), khỉ Cynomolgus (Pickering và cs., 2002), dê (Wang và cs., 2003) và hamster (Horiuchi, 2006) [24, 22, 30, 32]

Rho và cs (2004) đã báo cáo sử dụng trứng bò sau đông lạnh để thực hiện ICSI [43] Trong đó ông thực hiện đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa Với tỷ lệ tạo thành phôi blastocyst ở trứng bò đông lạnh là 9,8% so với

16,3% ở trứng tươi, điều đó chứng tỏ có sự khác biệt giữa ICSI trứng đông lạnh

và trứng tươi [49]

H Abdalla và cs (2010) đã thực hiện thành công ICSI trên trứng bò đông lạnh (có hệ thống piezo) với tỷ lệ phân chia ngày thứ 2 là 68% và 8% phát triển đến giai đoạn phôi nang [27]

Nhìn chung, việc tạo phôi bò từ trứng đông lạnh bằng kỹ thuật ICSI hiện nay đang được nhiều nước nghiên cứu Riêng ờ Việt Nam, cho đến thời điểm này chưa có công trình nào công bố về hướng nghiên cứu này

1.3.2 Cơ sở khoa học của kỹ thuật ICSI

1.3.2.1 Khái niệm

Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (intracytoplasmic sperm injection _ICSI) là một trong những phương pháp hỗ trợ sinh sản có sử dụng đến máy móc trong đó toàn bộ một tinh trùng hay chỉ riêng phần đầu của tinh trùng được tiêm vào bào tương trứng Bởi vì ICSI chỉ cần số lượng ít tinh trùng hơn là các phương pháp

thụ tinh in vitro khác (IVF), nên nó có được đánh giá là có giá trị cao trong điều

trị vô sinh, đặc biệt khi số lượng tinh trùng từ nguồn cung cấp bị giới hạn [28]

Ưu điểm của kỹ thuật ICSI

ICSI có thể thực hiện được trong một số trường hợp không thể tiến hành IVF hoặc IUI Ngoài ra các trường hợp vô sinh đặc biệt liên quan tới nam giới: số lượng tinh trùng thấp, độ di động không cao, không có tinh trùng trong tinh dịch, tổn thương hay thiếu các ống dẫn tinh, các yếu tố miễn dịch (như số lượng các tế bào bạch cầu cao trong tinh dịch), sự xuất tinh bị thoái hóa, việc cắt bỏ ống dẫn tinh không thể phục hồi … cũng có thể giải quyết bằng phương pháp ICSI [5,

28, 35]

Riêng với trứng đông lạnh, do quá trình đông lạnh làm tổn thương đến zona pellucida khiến cho các phản ứng gắn của tinh trùng lên zona pellucida bị ảnh hưởng, điều này khiến cho phương pháp thụ tinh bằng IVF trở nên kém hiệu

quả Trong khi đó ICSI đã loại được rào cản này, mở ra cơ hội nâng cao hiệu quả thụ tinh [5, 28, 30]

Nhược điểm của kỹ thuật ICSI

ICSI là phương pháp sử dụng một tinh trùng để thụ tinh với trứng, sự chọn lọc này thông qua một số thao tác chọn lọc dựa trên độ di động và cảm quan của

kỹ thuật viên Cho nên việc chọn lọc ra tinh trùng khỏe mạnh nhất sẽ không ưu việt như trong thụ tinh tự nhiên Bởi thế tinh trùng được sử dụng trong ICSI có thể có chất lượng kém hơn, xấu hơn, các khiếm khuyết đồng thời có thể xuất hiện cao hơn trong tự nhiên cũng như các phương pháp hổ trợ sinh sản khác [5, 28, 30]

1.3.2.2 Quá trình thụ tinh xảy ra trong ICSI

ICSI liên quan đến một cơ chế tương tác giữa trứng và tinh trùng khác hẳn với thụ tinh theo cơ chế bình thường và sự tương tác của các giao tử cũng theo một quy tắc riêng biệt Bởi vì ICSI là một phương pháp không tự nhiên, trong đó các rào cản như lớp tế bào hạt xung quanh noãn, màng thụ tinh, màng bào tương trúng không còn tác động chọn lọc tinh trùng Vì vậy, hàng loạt các sự kiện theo thụ tinh bình thường đều không xảy ra như: (1) tinh trùng xuyên qua lớp tế bào hạt, (2) tinh trùng gắn với thụ thể ZP3 trên màng thụ tinh của trứng và xâm nhập vào màng, (3) tinh trùng gắn với màng bào tương và giải phóng nội quan vào bào tương trứng Diễn tiến các quá trình thụ tinh xảy ra trong thụ tinh bằng phương pháp ICSI như sau: [5, 28, 32]

Phản ứng cực đầu xảy ra trong bào tương noãn sau ICSI

Sau khi tiêm tinh trùng nguyên vẹn vào trong bào tương trứng, cực đầu của tinh trùng sẽ tồn tại nguyên vẹn từ 6-12 giờ, đồng thời nhiễm sắc chất vẫn chưa giải xoắn, phản ứng cực đầu bắt đầu xảy ra với sự phồng lên của cực đầu vào 16-24 giờ sau ICSI, cực đầu của tinh trùng xuất hiện những lỗ Ngoài ra phản

ứng cực đầu trong thụ tinh bằng phương pháp ICSI có thể diễn tiến lâu hơn quá trình thụ tinh tự nhiên do tinh trùng không được khả năng hóa đầy đủ trong quá trình chuẩn bị tinh trùng hay do các tổn thương của trứng trong quá trình đông lạnh [35]

Cực đầu bị loại bỏ sau ICSI

Cực đầu có thể được loại bỏ trước hay trong khi tinh trùng giải cô đặc nên phản ứng cực đầu có thể xảy ra trong bào tương noãn trong suốt quá trình hợp nhất tinh trùng và trứng hay cực đầu có thể được loại bỏ trước khi hình thành tiền nhân đực Nhiễm sắc chất tinh trùng sẽ được giải xoắn và màng nhân mới được tạo ra bởi lưới nội chất nhám của trứng Màng mới được tạo ra bên ngoài màng ban đầu Dịch cực đầu được giải phóng vào trứng Các phần còn lại của cực đầu được từ từ loại bỏ bởi lớp màng trong cực đầu thayvì được giải phóng bơi sự tạo thành túi trên màng [5, 28, 35]

Các sự kiện trong hoạt hóa trứng

Một cách tổng quát người ta cho rằng chính khi có sự kết hợp giữa trứng

và tinh trùng sẽ kích thích một lượng lớn Ca2+ nội bào được giải phóng từ các bào quan bên trong trứng như mạng lưới nội chất… Sự giải phóng Ca2+ sẽ khởi đầu cho sự thay đổi nồng độ Na+/H+ từ đó làm thay đổi pH nội bào Khi pH thay đổi, có thể giải phóng các protein ức chế, kết quả là hoạt hóa không thuận nghịch các con đường oxi hóa khử, sinh tổng hợp lipid và cuối cùng là tổng hợp DNA và protein Đây là những bước cơ bản cho sự phát triển của trứng [28, 35]

Người ta đưa ra giả thuyết về các sự kiện xảy ra trong quá trình thụ tinh bằng ICSI Màng tinh trùng bị phá vỡ trước khi ICSI là một trong những điều kiện tiên quyết cho hoạt hóa trứng Các tổn thương màng tinh trùng giúp nhân tinh trùng tiếp xúc với các nhân tố giải cô đặc nhân tinh trùng (sperm nucleus decondéning factor _ SNDF) trong trứng, làm cho nhân tinh trùng phồng lên

Đồng thời khi màng bị vỡ, nhân tố hoạt hóa trứng liên quan đến tinh trùng (sperm-asociated oocyte activating factor _ SAOAF) sẽ được giải phóng vào bào tương trứng Việc giải phóng SAOAF là một quá trình thụ động, tùy vào tương tác của tinh trùng và trứng Một tinh trùng chứa lượng SAOAF đủ cho hoạt hóa một trứng Do vậy, nhân tinh trùng phồng lên sau ICSI không phụ thuộc vào sự hoạt hóa trứng và SNDF khởi động việc giải phóng SAOAF [28, 36, 44]

Sự hợp nhất tinh trùng và hình thành tiền nhân sau ICSI

Sự hợp nhất của tinh trùng kèm theo giải cô đặc nhiễm sắc chất thường xảy ra trong tế bào chất của trứng trưởng thành, trong đó tiền nhân đực về sau thường ở trung tâm hơn, còn tiền nhân cái ở gần thể cực hơn Phần còn lại của màng cực đầu vẫn còn dính với đầu tinh trùng 3-6 giờ sau ICSI Sau đó màng nhân tinh trùng phồng lên để lộ 2 màng Tiền nhân đực và cái có thể được thấy vào khoảng 5-6 giờ sau ICSI, sớm hơn so với tinh trùng bình thường Có thể nhận thấy 3 tiền nhân, thường do thể cực thứ 2 chưa tách ra khỏi [28, 36, 44]

Tiền nhân đực và cái có cấu trúc bình thường sau khi tiêm chỉ một tinh trùng vào một trứng Tiêm nhiều tinh trùng vào một trứng thì nhiều tiền nhân đực được nhận ra sau 24 giờ cho thấy các giai đoạn khác nhau của quá trình giải cô đặc nhiễm sắc chất nhưng không có cực đầu nào của tinh trùng có trong vùng quanh tiền nhân Sự hợp nhất tinh trùng bất thường hay chậm được thấy trong các trứng không hình thành tiền nhân và nhiễm sắc chất tinh trùng vẫn chỉ được giải cô đặc một phần Thoi vô sắc bất thường của tinh trùng liên quan đến việc không hình thành tiền nhân và việc dừng phát triển ở giai đoạn tiền nhân cũng có

thể xảy ra [28, 36, 44]

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả ICSI [6]; [7]; [8]; [18]; [20];

1.3.3.1 Ảnh hưởng do quá trình thủy tinh hóa

Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng của trứng Trong đó, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích Trứng dễ bị tổn thương bởi quy trình đông lạnh do các nguyên nhân: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào Vì vậy, việc đông lạnh chúng là rất khó khăn (Vincent và Johnson, 1992) [49]

Bên cạnh đó, phương pháp thủy tinh hóa dường như đe dọa đến sự sống sau đông lạnh do nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế bào (Hotamisligil và cs., 1996) [25] Ngoài ra, chất lượng trứng sau thủy tinh hóa còn phụ thuộc các yếu tố như: những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đông lạnh và rã đông gây ra; đặc điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đông lạnh (A.Bernard và B.J.Fuller, 1996) [11] Kết quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đông lạnh có thể bị tác động bởi trạng thái trưởng thành của chúng, chất lượng hay các yếu tố

lý sinh trong quy trình đông lạnh đã sử dụng Ví dụ, khi trưởng thành, chất lượng

và kích thước trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hưởng đến kết quả đông lạnh [26]

Trứng ở giai đoạn Metaphase II dễ bị tổn thương lạnh do có đặc thù là DNA của nó được giữ trên thoi vô sắc giảm phân và toàn bộ nằm trong tế bào chất, không được bảo vệ trong màng nhân, mà thoi vô sắc nơi nhiễm sắc thể bắt đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp Làm lạnh trứng trong thời gian ngắn ở 20oC có thể gây ra sự phá vỡ không phục hồi bộ máy thoi vô sắc trong khi sự khử nước xảy ra nhanh chóng ở nhiệt độ thấp hơn 0oC Lúc này khả

năng sống của chúng đã giảm mạnh và hệ thống thoi vô sắc neo giữ nhiễm sắc thể (NST) bị phân tán Do đó, NST có thể không phân ly, hậu quả là tình trạng lệch bội lẻ hay đa bội xảy ra ở phôi hình thành sau khi trứng đông lạnh được thụ tinh Sự đứt gãy bộ xương tế bào dẫn tới bộ xương tế bào bất bình thường, giữ lại thể cực thứ hai, thay đổi cấu tạo và các bào quan [29, 41, 47, 48]

Các vi ống của trứng có thể bị tổn thương do chất bảo quản đông lạnh và

sự thay đổi của nhiệt độ (Pickening và cs., 1976 [40]; Van Blerkom và Davis, 1994) [47] Tổn thương thoi vô sắc giảm phân (meiotic spindle) có thể thay đổi

vị trí nhiễm sắc thể và hậu quả là giới hạn khả năng thụ tinh của trứng (Eroglu và cs., 1998) [20] Liên quan đến khả năng thụ tinh không chỉ do tổn thương thoi vô sắc mà còn do khả năng bất thường của nhiễm sắc thể (Aman và Parks, 1994) [9] Trứng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với các chất bảo quản đông lạnh khác nhau Johnson và Pickening (1987) [26] cho thấy trường hợp trứng tiếp xúc lâu với DMSO cho kết quả là không tập trung thoi sắc và nhiễm sắc thể bị phân tán Vincent và cs (1990) cũng phát hiện ra DMSO có ảnh hưởng lên trứng Tuy nhiên, họ đã kết luận tổn thương là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đó chất bảo quản đông lạnh không thể thấm vào tế bào một cách nhanh chóng và vì vậy rất ít chất bảo quản đông lạnh trong tế bào [48]

1.3.3.2 Polyvinylpyrplidone (PVP)

Một trong các nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả của ICSI là nồng

độ Polyvinylpyrolidone (PVP), một polimer được sử dụng để làm chậm tinh trùng tạo điều kiện cho ICSI Năm 1997, Gordon và Carroll đã khảo sát nồng độ của PVP ảnh hưởng đến kết quả ICSI trứng bò Kết quả ghi nhận là có sự ảnh hưởng của các nồng độ PVP lên sự hình thành phôi, nhưng sự ảnh hưởng của các nồng độ không đáng kể Tuy nhiên, độ nhớt của PVP đã làm ảnh hưởng đến áp lực hút và đẩy tinh trùng trong injection pipette, điều này làm tổn hại đến trứng cũng như không đảm bảo được thời gian thực hiện thao tác [28, 50]

1.3.3.3 Injection pippete

Thiết bị tiên quyết được dùng trong ICSI là injection pipette Injection pipette phải đảm bảo có đường kính đủ lớn để hút tinh trùng, đủ nhỏ để chứa một lượng môi trường tối thiểu cũng như giảm thiểu tổn thương cho trứng và có đầu

đủ nhọn để đâm thủng màng thụ tinh và màng noãn bào Sự thụ tinh và phát triển của trứng sau ICSI phụ thuộc vào đường kính trong (ID) và đường kính ngoài (OD) của ịnection pippette Với đường kính đảm bảo sẽ tạo điều kiện tốt cho thao tác và giảm thiểu sự tổn thương của trứng về cơ học cũng như lượng môi trường đưa vào trứng là tối thiểu từ đó giảm khả năng phát triển xa hơn của phôi [28, 50]

1.3.3.4 Nuôi phôi

Trứng sau khi vi tiêm đã bị tổn thương màng do tác động cơ học của quá trình tiêm, đồng thời phôi tạo ra rất mỏng manh nên yêu cầu về điều kiện môi trường nuôi cấy, chất hoạt hóa, pH phải được kiểm soát một cách chặt chẽ để đảm bảo cho sự phát triển bình thường của phôi [28]

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Toàn bộ thí nghiệm trong đề tài được bố trí theo Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí toàn bộ thí nghiệm trong đề tài

2.1 NỘI DUNG 1: ĐÔNG LẠNH TRỨNG BÒ TRƯỞNG THÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA TRONG CỌNG RẠ

2.1.1 Thu nhận và nuôi trứng

Chuẩn bị

NaCl 0,9%: bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và

Streptomicin 0,1 mg/ml (S9137, Sigma)

Dung dịch D – PBS: môi trường sử dụng để thu dịch nang trứng Trước khi

sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,1mg/ml

Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng

ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt

- Dụng cụ

Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mỹ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120µm, mouth pipette, bercher, erlen…

Tiến hành

Sau 22 – 24h nuôi, chọn những trứng chín đem đông lạnh theo phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) 2 bước: Trứng đang giữ trong môi trường C3 sẽ được cân bằng trong môi trường VS1 (TCM–199 + 10% FBS +10% DMSO + 10% EG) 45 giây, sau đó chuyển qua môi trường VS2 (TCM–199 +10% FBS + 20% DMSO + 20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây Sau đó chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vòng 30 giây

Cách chuyển trứng vào cọng rạ như sau: hút 1 khoảng môi trường VS2, sau

đó hút một khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn môi trường VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn môi trường VS2 (Hình 2.2) và hàn đầu cọng rạ bằng máy

ép nhựa Đưa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh)

Hình 2.2 Cọng rạ chứa trứng

Giải đông trứng (dùng cho nội dung 2 và 3)

- Hóa chất: Môi trường rã đông trứng được pha dựa theo protocol của Dong-hoon Kim (2007) và Cetin (2006) có sự biến đổi bao gồm:

Môi trường rã đông 1 (RĐ1): TCM 199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,25M Sucrose Môi trường rã đông 2 (RĐ2): TCM 199 + 10% FBS + 5% FCS + 0,15M Sucrose Môi trường rã đông 3 (RĐ3): TCM 199 + 10% FBS + 5% FCS

Môi trường ủ trứng chờ thụ tinh: C3

Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, nhúng vào nước ấm 33 – 35oC, dùng bông gòn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt một đầu, rồi sau đó cắt đầu còn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống

Dùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trường giải đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trường RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trường RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ phòng Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa môi trường nuôi trứng (C3), để trong

tủ nuôi (38,5oC, 5% CO2) khoảng 2-3 giờ để giúp trứng hồi phục hoàn toàn trước khi đánh giá sự sống chết của trứng

2.1.3 Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng

− Trứng sống: màng tế bào còn nguyên vẹn, tế bào chất sáng đều và không

bị co, không bị phân mảnh Những trứng này dùng cho thí nghiệm ở nội dung 2 và nội dung 3

Trứng chết: màng tế bào bị tổn thương trong quá trình đông lạnh, nên tế bào chất bị co hoặc phân mảnh, màng tế bào có thể bị gãy

2.2 NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI BÒ BẰNG KỸ THUẬT THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF)

Nguồn tinh trùng: Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ (giống Clovis,

Caraco và Pargor) mua tại Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao tiến bộ kỹ thuật chăn nuôi – Viện Chăn nuôi - Địa chỉ: 80 Nguyễn Văn Nghi, Phường 7, Quận Gò Vấp, Tp Hồ Chí Minh

Giải đông tinh trùng

Lấy cọng rạ chứa tinh trùng khỏi bình nitơ lỏng, giữ trong không khí 5 giây Giải đông cọng rạ trong nước ấm ở 35 – 37oC khoảng 30 giây Sau đó, cắt một đầu cọng rạ cho vào sát đáy ống falcon, nhanh chóng cắt đầu còn lại và thổi nhẹ

để chuyển toàn bộ tinh trùng vào đáy ống falcon

Hình 2.3 Lấy cọng rạ chứa tinh

trùng ra khỏi bình nitơ lỏng

Hình 2.4 Giải đông tinh trùng trong

nước ấm

Hoạt hóa tinh trùng

- Sau khi giải đông, cho 2ml môi trường hoạt hóa BO đã ủ ấm trước đó vào ống falcon chứa tinh trùng, đem li tâm với vận tốc 1500 vòng trong 4 phút Sau

đó hút bỏ dịch nổi, thu cặn lắng

- Đặt nghiêng ống falcon chứa cặn tinh trùng lên giá, hút 1,2ml môi trường IVF thả nhẹ lên phía trên tạo sự tách lớp và vào tủ ấm 38,5oC, 5%CO2 trong khoảng thời gian là 20 phút để tinh trùng bơi lên (swim up)

- Sau 20 phút, lấy ống falcon ra, hút môi trường IVF phía trên cho vào eppendorf Kiểm tra và điều chỉnh mật độ tinh trùng bằng môi trường IVF sao cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml Dung dịch này được dùng để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 ngăn (100µl/giọt), phủ dầu khoáng, giữ trong tủ ấm

2.2.2 Thụ tinh trong ống nghiệm

Chuẩn bị

- Đĩa chứa các vi giọt 100 µl tinh trùng được chuẩn bị sẵn

- Trứng đã được giải đông (nội dung 1)