Tạo các hạt nanochitosan tripolyphosphate có kích thước khác nhau bằng phương pháp liên kết ion và đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chúng

Với nhiều tính năng như tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học và được sử dụng làm nguyên liệu

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ KIM DUNG

TẠO CÁC HẠT NANOCHITOSAN-TRIPOLYPHOSPHATE CÓ KÍCH THƯỚC KHÁC NHAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT ION VÀ ĐÁNH

GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CHÚNG

Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60.42.40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG

Hà Nội - 2013

Đồng thời, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc cùng các anh chị em trong Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hoá sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn

Vi sinh vật học đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để cho tôi có thể hoàn thiện đề tài

Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, những người

đã không ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, Ngày tháng năm 2013

Học viên

Trần Thị Kim Dung

MỤC LỤC

trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Chitosan

1.1.1.Cấu trúc của chitosan

1.1.2 Tính chất của chitosan

1.1.3 Cơ chế kháng khuẩn của Chitosan

1.1.4 Ứng dụng của chitosan trong các lĩnh vực khoa học công nghệ

1.2 Tổng quan về nano chitosan

1.2.1 Các phương pháp chế tạo nano chitosan

1.2.2 Ứng dụng của hạt nano chitosan

1.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan

1.3 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm

1.3.1 Bacillus subtilis

1.3.2 Bacillus cereus

1.3.3 Micrococcus luteus

1.3.4 Listonella damsela

1.3.5 Candida albicans

1.3.6 Fusarium oxysporum

1.3.7 Aspergillus awamori Nakazawa

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Hóa chất và dụng cụ thiết bị

2.1.1 Hóa chất

2.1.2 Dụng cụ

2.1.3 Thiết bị

2.1.4 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan

bằng phương pháp liên kết ion

2.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP

2.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khuấy, tốc độ khuấy

2.2.2 Tạo các loại hạt nano chitosan có kích thước khác nhau bằng phương pháp liên kết ion

2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các loại hạt nano chitosan có kích thước khác nhau

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan - TPP

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa CS và TPP

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thời gian khuấy lên quá trình tạo hạt nano chitosan

3.2 Tạo các loại hạt nano chitosan có kích thước khác nhau

3.3 Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các loại hạt nano chitosan có

kích thước khác nhau (CF2: 1000 nm, CF1: 450 nm, CF6: 100 nm)

3.3.1 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại hạt nano chitosan có kích thước khác nhau

3.3.2 Đánh giá khả năng kháng nấm của các loại hạt nano chitosan có kích thước khác nhau

3.3.2.1 Khả năng kháng nấm men Candida albicans của các loại hạt

nano chitosan 3.3.2.2 Khả năng kháng nấm mốc của các loại hạt nano chitosan có kích thước khác nhau KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CF2 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thước 1000nm

CF1 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thước 450nm

CF6 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thước 100nm

MIC90 Minimum Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

MBC Minimum bactericidal Concentration - Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MFC Minimum Fungicidal Concentration - Nồng độ diệt nấm tối thiểu

DD Degree of Deacetylation (Độ deacetyl hóa)

FE-SEM Field Emission Scanning Electron Microscopy (Kính hiển vi điện tử

M15 Aspergillus awamori Nakazawa

KLPTTB Khối lượng phân tử trung bình

CS Chitosan không xử lý

C5 Chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 5 phút

C10 Chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 10 phút

η o : Độ nhớt đặc trưng

M: Khối lượng phân tử trung bình

NMR: Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) - phổ cộng hưởng từ hạt nhân

cs: Cộng sự

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt phương pháp điều chế hạt nano chitoan làm chất dẫn các loại

thuốc, protein hoặc gen khác nhau

Bảng 2.1 Thành phần môi trường MPA

Bảng 2.2 Thành phần môi trường Hansen

Bảng 2.3 Thành phần môi trường Czapek-Dox

Bảng 3.1 : KLPTTB của Chitosan xử lý và không xử lý

Bảng 3.2: Kích thước hạt nano chitosan thu được ở các điều kiện khác nhau

Bảng 3.3: Khả năng ức chế vi khuẩn của các hạt nanochitosan (%)

Bảng 3.4: Giá trị MIC90 và MBC của các chế phẩm với các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Bảng 3.5: Khả năng ức chế Candida albicans của các hạt nanochitosan (%) Bảng 3.6: Giá trị MIC90 và MFC của các chế phẩm với chủng Candida albicans

Bảng 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc của các hạt nanochitosan (%)

Bảng 3.8: Giá trị MIC90 và MFC của các chế phẩm với các chủng nấm sợi nghiên cứu

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Quy trình thu nhận chitin và chitosan

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của chitin và chitosan

Hình 1.3 : Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương

Hình 1.4 : Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ, kết tủa

Hình 1.5 : Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo giọt nhũ tương

Hình 1.6: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo

Hình 1.7: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp liên kết ion

Hình 1.8: Hình thái của Bacillus subtilis

Hình 1.9: Hình thái của Bacillus cereus

Hình 1.10: Hình thái của Micorcoccus luteus

Hình 1.11 Hình thái của Photobacterium damselae

Hình 1.12 Hình thái của Candida albicans

Hình 1.13 Hình thái của Fusarium oxysporum

Hình 1.14 Hình thái của Aspergillus awamori Nakazawa

Hình 3.1: Kích thước hạt nanochitosan với chitosan xử lý bằng lò vi sóng

Hình 3.2: Kích thước hạt nanochitosan với chitosan không xử lý

Hình 3.3: Dung dịch nano chitosan điều chế từ các tỷ lệ CS/TPP khác nhau (từ trái qua phải): 4:1, 5:1, 6:1

Hình 3.4: Kích thước hạt nanochitosan với tốc độ khuấy1500v/2h

Hình 3.5: Kích thước hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 4000v/2h

Hình 3.6: Kích thước hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/2h

Hình 3.7: Kích thước hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/1h

Hình 3.8: Kích thước hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/3h

Hình 3.9: Kích thước hạt nanochitosan được báo cáo theo số lượng (a) và theo cường độ (b) của mẫu CF2

Hình 3.10: Điện thế zeta của hạt nanochitosan thu được từ mẫu CF2

Hình 3.11 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan của mẫu CF2

Hình 3.12: Kích thước hạt nanochitosan được báo cáo theo số lượng (c) và theo cường độ (d) của mẫu CF1

Hình 3.13 : Điện thế zeta của hạt nanochitosan thu được từ mẫu CF1 Hình 3.14 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan của mẫu CF1 Hình 3.15 :Kích thước hạt nanochitosan được báo cáo theo số lượng (c) và theo cường độ (d) của mẫu CF6 Hình 3.16: Điện thế zeta của hạt nanochitosan thu được từ mẫu CF6 Hình 3.17 Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan mẫu CF6

MỞ ĐẦU

Chitosan là dạng deacetyl hóa từ chitin, có cấu trúc polysaccharide, được tìm thấy ở loài động vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm Với nhiều tính năng như tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại, nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng dược sinh học và được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong những năm gần đây vì những tính chất

ưu việt của nó ở kích thước nano

Hạt nano chitosan có thể được tạo ra bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking), phương pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp liên kết ion (ionic gelation) và phương pháp mixen đảo (reverse micellar) Hiện phương pháp được sử dụng nhiều nhất là liên kết ion, ưu điểm của phương pháp này là quá trình chuẩn bị đơn giản và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và thực phẩm chức năng Hạt nano chitosan tạo ra không những vẫn giữ được các tính chất của chitosan ban đầu mà còn tỏ ra vượt trội hơn bởi kích thước nhỏ gọn, có diện tích tiếp xúc lớn hơn chitosan thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan

Hoạt tính đối kháng vi sinh vật của nano chitosan không chỉ phụ thuộc vào từng chủng loại vi sinh khác nhau mà còn phụ thuộc nhiều vào kích thước và zeta của hạt, do vậy việc lựa chọn quy trình tạo hạt nano chitosan và đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của chúng cũng đang là một vấn đề cần được nghiên cứu để có thể ứng dụng nó không chỉ đối với lĩnh vực y sinh, mà còn có thể ứng dụng trong các lĩnh vực khác như bảo quản trái cây, thực phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước

và hướng tới xuất khẩu

Như đã biết Việt Nam là nước có nhiều loại trái cây, phong phú về chủng loại

và nhiều loại độc quyền toàn thế giới, có giá trị xuất khẩu cao, tuy nhiên việc bảo quản các loại trái cây này còn là một vấn đề rất nan giải, bởi vì nếu bảo quản không

tốt sẽ làm quả chín nhanh, tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm của các loài vi sinh vật,

từ đó làm giảm giá trị dinh dưỡng cũng như giá thành của sản phẩm Vấn đề đặt ra

là tạo các chế phẩm sinh học bảo quản vừa an toàn, hiệu quả vừa thân thiện với môi trường để thay thế cho các chế phẩm hóa học trước đây

Vì vậy, đề tài luận văn "Tạo các hạt nano chitosan-tripolyphosphate có kích thước khác nhau bằng phương pháp liên kết ion và đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chúng" sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm

tiến tới sử dụng nano chitosan để tạo chế phẩm bảo quản quả tươi sau thu hoạch

Mục tiêu của đề tài:

1 Tạo hạt nano chitosan-tripolyphosphate với kích thước khác nhau bằng phương pháp liên kết ion

2 Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các loại hạt nano chitosan tạo thành

Nội dung nghiên cứu:

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan-tripolyphosphate bằng phương pháp liên kết ion (khối lượng phân tử chitosan, tỷ lệ chitosan:TPP, thời gian khuấy, tốc độ khuấy)

 Tạo các loại hạt nano chitosan-tripolyphosphate có kích thước khoảng 1000 nm,

500 nm và 100 nm

 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn (gram âm, gram dương) của các loại hạt nano chitosan thu được ở trên bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu Xác định được giá trị MIC90 (nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) của các hạt nano chitosan có kích thước khác nhau đối với mỗi chủng vi khuẩn khác nhau

 Đánh giá hoạt tính kháng nấm (nấm men, nấm sợi) của các loại hạt nano chitosan thu được ở trên bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu Xác định được giá trị MIC90 (nồng độ ức chế tối thiểu) và MFC (nồng độ diệt nấm tối thiểu) của các hạt nano chitosan có kích thước khác nhau đối với mỗi chủng nấm khác nhau

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Chitosan

Chitosan là một polysaccharide tuyến tính gồm β-(1-4)-D glucosamine và N-acetyl-D glucosamine Chitosan được sử dụng trong thương mại và có thể sử dụng trong điều trị y khoa

phương pháp deacetyl hóa

chitin, đó là yếu tố cơ cấu

trong các bộ xương ngoài

của động vật giáp xác (cua,

tôm, vv) và thành tế bào của

nấm Mức độ deacetylation

(% DD) có thể được xác

định bằng phổ NMR

Chitin lần đầu tiên

được tìm thấy trong nấm bởi

nhà khoa học người Pháp

Braconnot vào năm 1811, và

nó cũng đựơc tách ra từ biểu bì của sâu bọ, bởi nhà khoa học người Pháp Odier vào năm 1823 Và chất đã được khử acetyl từ chitin đã được khám phá bởi Roughet vào năm 1859; và được đặt tên là chitosan bởi nhà khoa học người Ðức Hoppe Seyler vào năm 1894 Chitosan, là polime hữu cơ tự nhiên mang điện tích dương do có những nhóm amino tự do tích điện dương, những điều này tạo cho chitosan những thuộc tính đặc biệt và đáng kinh ngạc

Hình 1.1: Quy trình thu nhận chitin và chitosan [11]

1.1.1.Cấu trúc của chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-NHCOCH3) ở vị trí C2 Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [24], [25]

1.1.2 Tính chất của chitosan

 Không độc, tính tương ứng sinh học cao và có khả năng phân huỷ sinh học nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trường

 Cấu trúc ổn định

 Tan tốt trong dung dịch acid loãng (pH < 6,3) và kết tủa ở những giá trị pH cao hơn, hóa tím trong dung dịch iod

 Có tính kháng khuẩn tốt

 Là hợp chất cao phân tử nên khối lượng phân tử của nó giảm dần theo thời gian

do phản ứng tự cắt mạch Nhưng khi khối lượng phân tử giảm thì hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm không bị giảm đi

 Có khả năng hấp phụ cao đối với các kim loại nặng

 Ở pH < 6,3, chitosan có tính điện dương cao

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của chitin và chitosan

 Trong phân tử chitosan có chứa nhóm –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl-D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là alcol vừa là amine, vừa là amide Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-

 Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer được nối với nhau bởi các liên kết α-(1-4)-glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất như: acid, baz, tác nhân oxy hoá và các enzyme thuỷ phân [24], [25]

1.1.3 Cơ chế kháng khuẩn của Chitosan

Chitosan và rất nhiều dẫn xuất của nó thể hiện khả năng kháng khuẩn rất tốt Tác động kháng khuẩn thường diễn ra rất nhanh (trong vài giờ) Phổ kháng khuẩn của chúng rộng, bao gồm cả vi khuẩn gram âm và gram dương Tuy nhiên, cần nhắc lại là khả năng này bị hạn chế do tính tan hạn chế của chitosan (không tan trong môi trường pH > 7) Cơ chế tác động chính xác của chitosan và các dẫn xuất lên tế bào

vi sinh vật thực tế vẫn chưa rõ ràng và còn nhiều tranh cãi Nhiều cơ chế khác nhau

đã được đề xuất để giải thích khả năng này Ví dụ như tính chất đa điện tích dương của chitosan và các dẫn xuất khởi đầu cho quá trình gắn kết lên màng tế bào vi sinh

vật có điện tích âm Khi Hwang và cs (1998) quan sát tế bào E.coli sau khi xử lý

bằng dung dịch chitosan và các dẫn xuất qua kính hiển vi điện tử truyền (TEM), thấy màng sinh chất của tế bào bị tách ra khỏi màng trong Sau khi gắn vào tế bào, chitosan và dẫn xuất gây ảnh hưởng đến tính thấm của tế bào, làm rò rỉ các thành phần sinh chất và tế bào chết đi do thiếu hụt các thành phần này [14]

Hay theo một giả thiết khác là chitosan và các dẫn xuất hoạt động như tác nhân kẹp lấy các kim loại dạng vết trong tế bào chất của tế bào trong khi các kim loại này đóng vai trò tối quan trọng trong chức năng sinh hóa của vi khuẩn Sự thiếu hụt các kim loại này ức chế sự tạo thành độc tố, enzyme và sự tăng trưởng của tế bào Bên cạnh đó, chitosan và các dẫn xuất cũng được cho là ức chế quá trình phiên

mã tạo thành mRNA và quá trình dịch mã tạo protein khi đi được vào trong nhân tế bào (chitooligosaccharide) [5]

1.1.4 Ứng dụng của chitosan trong các lĩnh vực khoa học công nghệ

Hiện nay, chitosan là một trong những vật liệu mới đã và đang được ứng

dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, môi trường, công nghệ sinh học và vật liệu mới Tất cả các ứng dụng của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào các tính chất lý hóa và sinh học như: hoạt tính kháng khuẩn, điều chỉnh miễn dịch, làm lành vết thương và đông máu, liên kết với các enzyme, hấp thu kim loại, tạo màng và gel [5]

* Ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp:

Chitosan được sử dụng như một chất thay thế an toàn cho các chất hóa học từ lâu vẫn được sử dụng có thể gây hại đến môi trường và sức khỏe con người Các ứng dụng chủ yếu của chitosan trong nông nghiệp gồm có:

+ Giải phóng chậm các hợp chất vào trong đất

Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất điều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết Chitosan được sử dụng như chất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ từ các hợp chất mong muốn vào trong đất Chitosan phân hủy sinh học trong đất trong khoảng 2 tháng, kèm theo sự phóng thích các chất, do đó tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp lại khi dùng chitosan làm chất mang Các ứng dụng cụ thể gồm có bón phân tác dụng lâu hơn cho cây mà không cần sử dụng lượng phân thừa gây ô nhiễm trong mùa mưa khi phân bị rửa trôi theo dòng nước; kích thích và điều chỉnh thời điểm ra hoa và kết quả theo ý muốn, ngoài ra bản thân chitosan khi bị phân hủy trong đất còn giúp cải thiện đáng kể hệ vi sinh vật đất một cách chọn lọc Cụ thể như trên các

cánh đồng được bón chitosan, số lượng các vi sinh vật có ích như Acitnomyces tăng

lên cùng với sự suy giảm số lượng của các vi sinh vật có hại.[5]

+ Vỏ bao của hạt

Chitinase được gia tăng hoạt động trong giai đoạn nảy mầm khi bề mặt của hạt giống được bao bằng một lớp chitosan Khi sử dụng chitosan làm vỏ bao của hạt, khả năng kháng nấm và vi khuẩn của chitosan hỗ trợ hữu hiệu cho sự nảy mầm và

sự phát triển của cây trồng

+ Bảo quản nông sản

Trong bảo quản thực phẩm, chitosan không những phát huy khả năng kháng khuẩn và nấm, mà còn giúp điều chỉnh môi trường bên trong rau quả thông qua

kiểm soát quá trình trao đổi khí giữa rau quả và môi trường Dung dịch chitosan đã được dùng để tạo lớp màng bảo quản hoa quả và rau củ chống vi khuẩn và nấm Ở Nhật, dung dịch chitosan cũng được phun lên táo và cam cho mục đích này Nghiên cứu của André Bégin cũng đề xuất quy trình bảo quản dâu bằng chitosan Chitosan còn được sử dụng để làm bao bảo vệ chống sương giá [5]

* Ứng dụng của chitosan trong công nghiệp:

+ Xử lý nước thải, hấp thu kim loại nặng

Hiện nay, phương pháp hóa lý là phương pháp tiện dụng và phổ biến trong hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy công nghiệp Tuy nhiên, bất lợi chính của phương pháp này là nguy cơ gây ô nhiễm môi trường Vì thế việc tìm ra một phương pháp "xanh" (phương pháp an toàn với môi trường) là rất cần thiết Do có nguồn từ tự nhiên và có khả năng thủy phân sinh học, chitosan là một chất thay thế hợp lý Chitosan đã được sử dụng trong quá trình lọc nước từ khoảng 3 thập niên trước Các nghiên cứu đã cho thấy chitosan có khả năng hấp thu kim loại nặng do nhóm NH2 của chitosan có thể tạo phức với các ion kim loại Chitosan cũng có thể được sử dụng như một chất hấp thụ để tách các đồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước bị nhiễm phóng xạ và thu hồi Uranium từ nước biển và nước ngọt Chitosan

có khả năng loại bỏ 100% các polymer hiện diện trong nước thải, giảm mùi hôi khó chịu (do làm giảm số lượng vi sinh vật gây thối) Một số ứng dụng khác bao gồm xử

lý vệt dầu loang, xử lý nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước hồ bơi, thu hồi protein

và khoáng từ nước thải nông nghiệp, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong nước tiểu và tách các độc tố từ dung dịch [5]

+ Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm

Chitosan được dùng như một thành phần trong thực phẩm ở Nhật và Châu Âu

từ khoảng 20 năm trước Chất này có tác dụng ổn định màu, mùi vị của thực phẩm Ngoài ra, chitosan còn thể hiện tác dụng tuyệt vời trong bảo quản thực phẩm

Ở Mỹ, chất này được sử dụng để "bẫy" lipid trong thực phẩm chức năng chống béo phì Chitosan được ưa chuộng không chỉ vì có tác dụng như chất xơ, thành phần quan trọng trong khẩu phần ăn, mà còn gắn với lipid trong dạ dày và ruột tạo thành một dạng chất mà cơ thể không thể hấp thu và sẽ được loại thải ra ngoài Các

nghiên cứu cho thấy chitosan gắn được với lượng chất béo phì gấp 4 lần khối lượng của chúng

* Trong công nghiệp mỹ phẩm

Chitosan là loại polymer tích điện dương tự nhiên duy nhất có khả năng chuyển thành dạng dung dịch nhớt khi hòa tan trong môi trường acid yếu Nhờ tính chất này

mà chitosan đã được ứng dụng rất nhiều trong sản phẩm chăm sóc tóc như dầu gội, dầu xả và sản phẩm tạo nếp tóc Ngoài ra, chitosan cũng được dùng trong mỹ phẩm chăm sóc da, móng tay do có tính chất bảo vệ, duy trì độ ẩm, tạo màng trên da đồng thời gắn kết với các dưỡng chất cần thiết, tạo điều kiện cho các chất này hoạt động tích cực trên da Tính kháng khuẩn của chitosan cũng góp phần vào công dụng của chitosan trong các sản phẩm mỹ phẩm và chăm sóc cá nhân Các ứng dụng cụ thể của chitosan trong lĩnh vực này bao gồm: duy trì độ ẩm trên da, trị mụn, làm cho da khỏe hơn, tươi hơn, bảo vệ lớp biểu bì, giảm sự tích điện trên tóc (gây thương tổn tóc), trị gàu, giúp cho tóc mềm mại hơn [5]

* Ứng dụng của chitosan trong lĩnh vực y - sinh học

Chitosan dùng làm vật liệu y sinh học và dược phẩm: chitosan có khả năng tương hợp sinh học với mô và tế bào do đó có thể sử dụng trong việc cấy ghép vào

mô động vật Vì vậy, người ta đã tiến hành ứng dụng chitosan làm vật liệu y sinh học mới như chỉ khâu tự tan trong phẫu thuật, da nhân tạo trong điều trị bỏng và vết thương, kính áp tròng trong điều trị các tật về mắt Gần đây, người ta cũng đã tiến hành nghiên cứu sử dụng chitosan dạng ống nhằm mục đích tái sinh dây thần kinh Trong điều trị vết thương, chitosan có tác dụng cầm máu, đẩy nhanh quá trình phát triển các tế bào ở vùng mô bị thương, tăng cường hoạt động của chitinase và lysozyme, dẫn đến mau lành vết thương và giảm nhiễm trùng Chitosan được báo cáo là bền với dịch mật, dịch tụy và nước tiểu nên được dùng trong chỉ khâu phẫu thuật thay thế cho các loại vật liệu khác có thể bị chất dịch trong cơ thể tấn công và đứt trước khi vết thương lành hẳn [5]

Trong các trường hợp bị bỏng, chitosan có thể tạo dạng màng xốp hút nước mạnh và giúp cho oxy phân tán qua màng vào mô tổn thương rất dễ dàng, tạo điều kiện cho các mô này bình phục nhanh chóng

Trong lĩnh vực dược phẩm, chitosan được sử dụng như chất mang an toàn, có khả năng phóng thích thuốc dần dần trong cơ thể, kéo dài tác dụng của thuốc hay vật liệu cố định enzyme trong sản xuất và điều trị Chitosan còn được dùng để điều chế các chất làm giảm bớt độ chua trong dạ dày và các sản phẩm ngưng tụ của acid benzyl penicilic với chitosan đã được dùng để xác định độ nhạy của penicilin trong

cơ thể người [5]

1.2 Tổng quan về nano chitosan

Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu điều chế hạt nano chitosan trong những năm gần đây vì những tính chất ưu việt của nó ở kích thước nano Nano chitosan do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng đi qua màng tế bào, có thể đưa vào

cơ thể qua nhiều đường khác nhau như dùng ngoài da, dùng qua đường miệng, qua mũi… Nano chitosan có diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong sinh y học như mang thuốc, vaccine, vectơ chuyển gen, chống khuẩn, thuốc điều trị ung thư… Khi sử dụng nano chitosan làm chất dẫn thuốc, thuốc điều trị được bảo vệ bởi những hạt nano chitosan khỏi sự phân huỷ sinh học Do kích thước rất nhỏ, những hạt này có tác dụng thấm sâu vào cơ thể, đưa thuốc đến đúng mục tiêu, nâng cao hiệu quả điều trị [33]

Tình hình nghiên cứu nano chitosan trong và ngoài nước

Trên thế giới, hầu hết những công trình nghiên cứu gần đây đều nhằm mục

đích chế tạo ra những chất mang nano để dẫn truyền thuốc, protein, gen và phát triển vectơ chitosan mang thuốc hướng đích tới những tế bào ung thư Một số công trình tiêu biểu là điều chế chitosan composite với acid polyacrylic để điều khiển và kéo dài thời gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc đến mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi; tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [28] Ngoài ra, nano chitosan còn được nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [21] [32], ứng dụng trong thực phẩm chức năng [18] [19]

Ở nước ta, số lượng bài nghiên cứu về nano chitosan rất ít Hiện đã có một số tập thể khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu hướng vật liệu nano y sinh Năm

2008, Đề tài cấp Viện KH&CN Việt Nam: “Nghiên cứu chế tạo polime sinh học chitosan cấu trúc nano ứng dụng làm chất mang thuốc” do PGS TS Phạm Gia Điền (Viện Hóa học) chủ trì đã thu được những kết quả khả quan, làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng nano chitosan như vector chuyển thuốc Sở KH&CN tỉnh Bình Dương cũng đã nghiệm thu đề tài liên quan đến nano chitosan bạc ứng dụng trong nông nghiệp: Hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc trồng trị bệnh cây trồng Mifum 0,6DD từ bạc Nano Chitosan tan phục vụ nông nghiệp GS TSKH Nguyễn Xuân Phúc (Viện KH vật liệu) cùng các cs thực hiện đề tài độc lập cấp nhà nước:” Nghiên cứu công nghệ chế tạo các hạt nano vô cơ, hữu cơ được bọc bởi những polymer tương thích sinh học dùng trong y học” Năm 2010, PGS.TS Đỗ Trường Thiện (Viện Hóa học) đã báo cáo Đề tài KC02.09/06-10 “Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan ứng dụng trong dược phẩm, sinh học và nông nghiệp” Đã đánh giá được hiệu quả lên cây lúa khi sử dụng chế phẩm nano chitosan làm tăng năng suất lên gần 20% Tuy nhiên, việc nghiên cứu về những vấn đề có liên quan đến nano chitosan vẫn nhận được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì những tiềm năng to lớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang đến cho con người

1.2.1 Các phương pháp chế tạo nano chitosan

Hiện nay có nhiều phương pháp tạo hạt nano chitosan Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là liên kết ion , ưu điểm của phương pháp này là quá trình chuẩn bị đơn giản và không cần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do

đó phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và thực phẩm chức năng [33]

Bảng 1.1: Tóm tắt phương pháp điều chế hạt nano chitoan làm chất dẫn các loại

thuốc, protein hoặc gen khác nhau

Theo Agnihotri (2004), có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking), phương pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence), phương pháp liên kết ion (ionic gelation) và phương pháp mixen đảo (reverse micellar) [30]

* Phương pháp khâu mạch nhũ tương

Hỗn hợp nhũ tương nước trong

dầu (w/v) được tạo ra bằng cách

phân tán dung dịch chitosan

trong dầu Những giọt lỏng

được làm bền bởi chất hoạt

động bề mặt Dung dịch nhũ

tương sau đó được khâu mạch

bằng tác nhân tạo nối thích hợp

* Phương pháp giọt tụ/kết tủa

Phương pháp này sử dụng tính chất của

chitosan là không tan trong dung dịch

kiềm Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo

giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc

với dung dịch kiềm Dung dịch kiềm có

thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc

ethandiamine Dung dịch chitosan sẽ được

Hình 1.3 : Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp khâu

mạch nhũ tương

Hình 1.4 : Sơ đồ tạo hạt bằng phương

pháp giọt tụ, kết tủa

một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano [30]

* Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương

Phương pháp này lần đầu được sử

dụng vào năm 1999 Phương pháp này

sử dụng nguyên tắc của cả hai phương

pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết

tủa Thay vì sử dụng tác nhân tạo nối

ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các

giọt chitosan kết hợp với các giọt

NaOH Một hệ nhũ tương bền chứa

dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo

ra trong paraffin lỏng Đồng thời, một

hệ nhũ tương bền khác chứa dung dịch

chitosan và NaOH cũng được tạo ra

theo cách như trên Khi cả hai hệ nhũ

tương này được trộn lại với tốc độ

khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ [30]

* Phương pháp mixen

đảo

Trong phương pháp này, người

ta hòa tan chất hoạt động bề

mặt vào dung môi hữu cơ để

tạo ra những hạt mixen đảo

Dung dịch lỏng chứa chitosan

và thuốc được thêm từ từ với

tốc độ khuấy không đổi để

tránh làm đục dung dịch Pha

lỏng được giữ sao cho hỗn hợp

trở thành pha vi nhũ trong suốt Sau đó tác nhân tạo nối ngang được thêm vào và

Hình 1.5 : Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo

giọt nhũ tương

Hình 1.6: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo

khuấy qua đêm Cô quay loại dung môi Phần còn lại phân tán lại trong nước Dung dịch muối thích hợp được thêm vào để kết tủa chất hoạt động bề mặt Hỗn hợp được

ly tâm Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang thuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ Đông cô chất lỏng thu được cho ta bột thuốc [30]

* Phương pháp liên kết ion

Cơ chế của phương pháp này

dựa trên tương tác tĩnh điện giữa

chitosan tích điện dương và một

polyanion như tripolyphosphate

Kỹ thuật này có ưu điểm là giai

đoạn chuẩn bị đơn giản và thực

hiện trong môi trường nước Đầu

tiên chitosan được hòa tan vào

dung dịch acid acetic Sau đó

chitosan được trộn lẫn với

polyanion để tạo hạt nano

chitosan dưới điều kiện khuấy từ

liên tục tại nhiệt độ phòng Kích thước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan và polyanion khác nhau [30]

1.2.2 Ứng dụng của hạt nano chitosan

a) Chất mang dẫn truyền thuốc

Phân loại theo con đường sử dụng

Hạt nano chitosan có kích thước nhỏ nên nó thích hợp cho nhiều con đường sử dụng thuốc khác nhau [1]

• Sử dụng bên ngoài đường tiêu hóa

Các hạt nano có thể được dùng trong tĩnh mạch bởi vì đường kính của các mao mạch máu nhỏ nhất là khoảng 4µm Sự phân bố sinh học của các hạt nano có thể thay đổi tùy thuộc vào kích cỡ, điện tích bề mặt và tính kỵ nước của chúng Các hạt

có bán kính lớn hơn 100 nm sẽ bị hấp thu nhanh chóng bởi hệ lưới-nội mô trong gan, lá lách, phổi và tủy xương Ngược lại, những hạt nhỏ hơn có xu hướng có thời

Hình 1.7: Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp

liên kết ion

gian luân chuyển kéo dài [33] Các loại thuốc hứa hẹn nhất đã được nghiên cứu rộng rãi để dẫn truyền theo cách này là những tác nhân kháng ung thư Sau khi tiêm vào tĩnh mạch, nhiều hệ thống hạt nano bao gồm nano chitosan có xu hướng tích lũy lại trong một số khối u (Brasseur, 1980; Kreuter, 1994) Những hạt nano chitosan mang doxorubicin làm chậm sự tăng trưởng của khối u và nâng cao tỷ lệ sống sót của những con chuột bị cấy khối u Ngoài ra, những hạt nano chitosan có kích thước nhỏ hơn 100 nm được tạo ra cho thấy đã tránh khỏi hệ lưới-nội mô và luân chuyển trong máu được lâu hơn [33]

• Sử dụng qua đường uống

Ý tưởng hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị enzyme phân hủy trong bộ máy tiêu hóa dẫn đến sự phát triển các hạt nano thành những hệ thống dẫn truyền những phân tử lớn, protein và polynucleotide Phương pháp này được nghiên cứu rộng rãi sau khi có báo cáo rằng lượng đường trong máu của những con chuột mắc bệnh tiểu đường giảm sau khi uống những hạt nano insulin (Damge,1990) Kích thước hạt nhỏ hơn 500nm là một yếu tố then chốt cho phép vận chuyển qua niêm mạc ruột theo cơ chế endocytotic Bên cạnh enzyme, màng nhầy ngăn cản sự khuyếch tán của thuốc và hạt nano, những rào cản hấp thụ biểu mô là chướng ngại chính chống lại sự hấp thụ thuốc protein qua thành ruột Do đó, hoạt tính của thuốc

có thể được cải thiện bằng cách kiểm soát kích thước hạt cùng với việc kéo dài thời gian lưu giữ thuốc trong bộ máy tiêu hóa Trong số những hạt nano polymer, hạt nano chitosan là chất dẫn thuốc lý tưởng vì chúng làm tăng mức hấp thu thuốc [33]

Khả năng cải thiện mức hấp thu của chitosan đã được nghiên cứu rộng rãi Đặc tính bám dính của chitosan là do tương tác giữa chitosan tích điện dương và niêm mạc tích điện âm Điều này làm kéo dài thời gian tương tác của thuốc và bề mặt hấp thụ [33]

• Sử dụng qua đường mắt

Các hạt nano được nhận thấy là chất mang tiềm năng để dẫn truyền qua đường mắt Nhiều thí nghiệm cho thấy hạt nano có khuynh hướng bám chặt vào bề mặt biểu mô mắt Kết quả kéo dài thời gian lưu giữ, tốc độ đào thải thuốc chậm hơn

so với những phương pháp điều trị mắt truyền thống, do đó cải thiện dược tính của

thuốc Vì vậy, những hạt nano đã được dùng để dẫn thuốc kháng viêm, kháng dị ứng cho những mục tiêu điều trị viêm mắt [33]

Phân loại theo ứng dụng trong điều trị bệnh

• Hoạt tính kháng ung thư

Mitra (2001) nghiên cứu bọc thuốc kháng ung thư doxorubicin trong hạt nano chitosan để ức chế khối u trong chuột thí nghiệm Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicin độc lập thì khối u ở chuột vẫn tăng lên 900 mm3

sau 50 ngày và chết, trong khi đó ở thí nghiệm ly giải chậm doxorubicin trong hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ còn 170 mm3

và chuột vẫn sống sau 90 ngày thí nghiệm [3] (L.) Qi (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nano chitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S 180 và hepatoma H

22 Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều uống 2,5 mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều 0,5 mg/kg là 43-53%, trong khi đó chitosan chỉ làm giảm 30 % khối lượng tế bào ung thư [3]

• Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc

Angela (2001) nghiên cứu thải chậm thuốc cyclosporine A (Cry A) bằng cách hấp phụ trong dung dịch chitosan và hạt nano chitosan Lượng thuốc phóng thích trong thí nghiệm hấp phụ trên hạt nano chitosan luôn luôn lớn hơn gấp 2,5-3 lần so với đối chứng là dung dịch Cry A Kết quả là nồng độ Cry A trong máu thỏ thí nghiệm luôn luôn cao hơn so với nhóm đối chứng và hấp phụ trong dung dịch chitosan [3] El-Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để cố định thuốc cycloporine A để uống, kích thước hạt nano là 150 nm Kết quả cho thấy hiệu suất mang thuốc là 94%, nồng độ cycloporine A trong máu là 2760 ng/ml, cao gấp 2,5 lần so với hạt nano sodium glycholate Hoạt tính của cyclosporine A cố định trong hạt nano chitosan tăng 72%, gelatin nano chitosan chỉ tăng 18%, riêng sodium glycholate lại giảm tới 36% so với đối chứng [3]

Zhang (2008) nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thu insulin qua niêm mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-nano chitosan, kích thước hạt nano là 150-300

nm Hiệu quả hấp thu insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-nano chitosan cao

hơn so với PEG-chitosan là 30-40% Kích thước hạt nano càng nhỏ, diện tích bề mặt hạt càng lớn và điện tích dương trên bề mặt càng cao là nguyên nhân ảnh hưởng đến khả năng hấp thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi Shedaghi (2008) sử dụng hạt nano trimethyl chitosan để làm vật liệu ly giải chậm insulin Kết quả cho thấy động học ly giải của insulin bọc trong hạt nano trimethyl chitosan ổn định và kéo dài hơn [3]

b) Chất mang dẫn truyền gen

Những hệ thống dẫn truyền không virus (non-virus) trong liệu pháp gen đã được đề xuất để thay thế những vectơ virus Chúng làm giảm tối thiểu phản ứng miễn dịch từ vật chủ Hơn nữa, chúng định được mục tiêu, dễ bảo quản và sản xuất lượng lớn Những lợi thế này tạo động lực cho sự phát triển của chúng Polymer cation được nhận thấy là chất mang hứa hẹn trong số những hệ thống dẫn truyền gen không virus Chất mang gen polymer ngày càng thu hút được nhiều sự chú ý với hiệu quả chuyển gen, xác định mục tiêu điều trị và khả năng tương thích sinh học tốt [20]

Chitosan là một vectơ không virus thích hợp cho dẫn truyền gen Tương tác giữa chitosan và DNA là tương tác tĩnh điện (Roy, 1997; MacLaughlin, 1998) Tương tác điện này mạnh đến nỗi phức chitosan-DNA không bị tách ra cho đến khi

nó vào trong tế bào Chitosan và những dẫn xuất của chitosan tụ lại bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của DNase Những hạt nano chitosan/DNA có khoảng phân bố kích cỡ hẹp được tạo ra bởi quá trình giọt tụ Những hạt nano chitosan/DNA có kích thước từ 20-500 nm nhỏ hơn những hệ thống polymer khác nên thâm nhập vào tế bào thuận lợi hơn qua cơ chế endocytosis và/hoặc pynocytosis, làm tăng tốc độ gây nhiễm (Mao, 1997; Sato, 2001) [20] Kết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong

cơ thể sống đều cho thấy khi hạt nano chitosan/DNA vào trong cơ thể, chúng nhanh chóng di chuyển khỏi máu và bám trên những cơ quan khác nhau Kích cỡ hạt khác nhau thì phân bố trên những cơ quan khác nhau cũng khác nhau (Mao, 2001; Yoo, 2005) Hàng loạt nghiên cứu trong ống nghiệm và trong cơ thể sống cho thấy chitosan là vật liệu thích hợp để dẫn truyền vaccine DNA và gen không virus [20]

Những hệ thống dẫn truyền gen dựa trên chitosan cũng có thể gắn thêm

ligand để có tương tác tế bào cụ thể, như transferrin hoặc galactose (Mutara, 1996; Erbacher, 1998; Park, 2001; Christopher, 2001; Gao, 2003; Kim, 2004) [20]

c) Ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Sự phát triển những thực phẩm có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe tạo

ra cơ hội nâng cao sức khỏe cộng đồng Kết hợp những chất có hoạt tính sinh học vào trong thực phẩm như peptide, vitamine là cách thức đơn giản để tạo ra những thực phẩm chức năng mang lại những lợi ích sinh lý và giảm thiểu những rủi ro bệnh tật Tuy nhiên, hiệu quả ngăn chặn bệnh của những sản phẩm này nằm ở khả năng bảo quản được hoạt tính sinh học của những thành phần hoạt tính Đây là một thách thức lớn bởi vì hầu hết các phân tử này có thời gian lưu giữ trong dạ dày ngắn, tính thấm và độ tan kém trong ruột Hơn nữa chúng không bền trong những điều kiện chế biến thực phẩm hoặc trong bộ máy tiêu hóa (pH, enzyme, sự hiện diện của những dưỡng chất khác) Những hệ thống bao giữ (encapsulation system) có thể được sử dụng để vượt qua những giới hạn này Tuy nhiên, vì được dùng trong thực phẩm, những hệ thống dẫn truyền phải được công nhận là an toàn [18]

Trong số những hệ thống dẫn truyền này, hạt nano chitosan thu hút nhiều chú

ý trong những năm gần đây do khả năng bám dính vào niêm mạc và xuyên qua lớp niêm mạc Kích thước nhỏ giúp chúng kéo dài thời gian lưu giữ trong bộ máy tiêu hóa Những công trình mới nhất cũng chỉ ra toàn bộ những hạt nano chitosan có thể được hấp thu vào tế bào người [19]

β-lactoglobulin (βlg), một loại protein chính trong sữa của động vật nhai lại, được dùng nhiều trong thực phẩm do có giá trị dinh dưỡng Khả năng tạo gel, nhũ tương cho phép chúng trở thành nguyên liệu lý tưởng để bao giữ các hợp chất có hoạt tính sinh học Nó còn có khả năng kháng lại sự phân rã do pepsin có trong dạ dày [19]

Chen (2005) điều chế những hạt nano core-shell chitosan/β-lactoglubulin làm chất mang dưỡng chất Những hạt nano chitosan được phủ lớp protein βlg này

có khả năng bảo vệ những chất dinh dưỡng chống lại acid và pepsin trong dạ dày Khi tiến vào đường ruột, lớp phủ βlg bị phân rã bởi pancreatin, còn hạt nhân chitosan bám vào trong thành ruột, tạo thuận lợi cho sự hấp thu dưỡng chất [19]

Như vậy hạt nano chitosan phủ βlg có hai tác dụng: lớp vỏ bảo vệ dưỡng chất trong

dạ dày còn hạt nhân cải thiện thời gian lưu giữ dưỡng chất trong thành ruột, đồng thời điều khiển tốc độ phóng thích chúng

Protein thực phẩm đã được điều chế thành nhiều loại chất nền ở dạng gel, hạt micro, hạt nano đáp ứng yêu cầu cho những ứng dụng trong thực phẩm chức năng Khả năng kiểm soát kích cỡ hạt protein quyết định tốc độ phóng thích dưỡng chất

và lượng hấp thu vào cơ thể Ở dạng gel và hạt micro, những dưỡng chất được phóng thích khỏi chất nền để hấp thu vào thành ruột Trong khi đó, hạt nano cải thiện khả năng hấp thu dưỡng chất bằng cách kéo dài thời gian lưu giữ trong thành ruột hoặc hấp thu trực tiếp bởi biểu mô ruột [18]

1.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được nghiên cứu trong nhiều tài liệu Theo những nghiên cứu trước, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi trường acid là do sự proton hóa nhóm -NH2 tại vị trí C2 của D-glucosamine Chitosan mang điện dương sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ màng làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc ức chế sự truyền dưỡng chất vào trong tế bào [21]

Hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc lớn hơn chitosan thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan Qi (2004) đã nghiên cứu chế tạo nano chitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn của hạt

1.3 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm

1.3.1 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được phát hiện lần

đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ

chức y học Nazi của Đức

Theo khóa phân loại của Bergey, vi

khuẩn Bacillus subtilis thuộc Bộ:

Eubacteriales, Họ: Bacillaceae, chi:

Bacillus, Loài: Bacillus subtilis

Hình 1.8: Hình thái của

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis, còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô hoặc trực khuẩn cỏ, là một loài vi khuẩn Gram dương, catalase dương tính Bacillus subtilis có dạng hình

que, tròn hai đầu, kích thước 0,5 - 0,8 x 1,5 - 3μm., có khả năng tạo bào tử, có khả năng chịu đựng được các điều kiện môi trường khắc nghiệt Mặc dù loài này thường

được tìm thấy trong đất, tuy nhiên nhiều bằng chứng cho thấy Bacillus subtilis cũng

tồn tại trong ruột người, động vật [34]

Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000)

1.3.2 Bacillus cereus

Bacillus cereus là trực khuẩn Gram

dương, theo phân loại quốc tế thuộc giới

bacteria, ngành fimicutes, lớp Bacilli, bộ

Bacillales, họ Bacillaceaem, chi Bacillus, loài

Cereus

Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí,

bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha

bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca

nhiễm độc thực phẩm vào năm 1995 Bacillus cereus có khả năng tạo nội bào tử,

kích thước 0,5-1,5 x 2-4 μm Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di

động Vi khuẩn Bacillus cereus thường tồn tại trên nhiều loại thực phẩm như rau

quả, thịt và các loại thực phẩm đã và chưa qua chế biến Vi khuẩn này có khả năng tổng hợp ngoại độc tố và độc tố gây nôn mửa (emetic toxin), là nguyên nhân của các bệnh như nôn mửa, tiêu chảy [40]

1.3.3 Micrococcus luteus

Micrococcus luteus là vi khuẩn Gram

dương, có dạng hình cầu Theo hệ thống phân

loại nó thuộc ngành Actinobacteria, bộ

trong đất, bụi, nước, và không khí, trên da động vật có vú Micrococcus luteus được

phát hiện bởi Sir Alexander Fleming trước khi ông tìm ra Penicillin vào năm 1928 [37]

1.3.4 Listonella damsela

Listonella damsela còn có tên gọi khác là Photobacterium damselae (trước đây gọi là Vibrio damsela) được phát

hiện bởi Smith và cs năm 1991

Theo hệ phống phân loại nó thuộc

lông roi Là một loại vi khuẩn gây bệnh cho động vật biển và con người

1.3.5 Nấm men Candida albicans

Theo hệ thống phân loại Candida albicans thuộc giới Fungi, ngành

Ascomycota, lớp Saccharomycetes, bộ Saccharomycetales, họ Saccharomycetaceae,

chi Candida, loài C albicans [35]

C albicans là một loại nấm men

sinh sản bằng đơn bào nảy chồi Tế bào

có dạng hình tròn đơn lẻ, kích thước 2-4μ,

thành tế bào mỏng Bên cạnh có một số tế

bào nảy chồi Cạnh đó có tế bào dài, ngắn,

gắn vào nhau bằng điểm yếu dễ gẫy Ký

sinh trên bề mặt của da và niêm mạc, bệnh

nấm candida không chỉ biểu hiện ngoài da

mà còn tạo nên các vết loét hoặc giả mạc

trong thực quản, dạ dày, ruột hay bộ phận sinh dục nam nữ Tuy không gây tử vong nhưng bệnh thường tái nhiễm dai dẳng, gây khó chịu và ảnh hưởng lớn đến sức

Hình 1.11 Hình thái của

Photobacterium damselae

Hình 1.12 Hình thái của Candida

albicans

khỏe con người

Nấm Fusarium oxysporum là loại nấm sống trong đất và phân bố rộng rãi

trong các loại đất trồng trọt và đất cỏ, loài nấm này bao gồm hơn 100 dạng chuyên hoá và chủng nấm gây bệnh héo đối với nhiều loại rau,chuối, tiêu, cà chua, khoai tây, cây họ Bầu Bí Dưa và nhiều cây cảnh khác

1.3.7 Aspergillus awamori Nakazawa

Khuẩn lạc phát triển nhanh ở nhiệt độ

24 – 260C trong 10 ngày đạt đường kính 5 –

7 cm có khía vòng tròn, dai, sợi nấm thường

có mầu trắng thỉnh thoảng có các sợi nền

mầu vàng mang các đầu sinh bào tử trần;

nhiều bào tử lúc đầu mầu nâu lục sẫm sau

chuyển sang mầu nâu sô cô la tối Mặt trái

khuẩn lạc mầu vàng và ngả sang mầu vàng nâu lúc già, không có giọt tiết Đầu sinh bào tử trần hình cầu hình tia lỏng hoặc tách thành các hình cột Cuống sinh bào tử trần màng dày, nhẵn thường sẫm hơn ở cuối Bọng hình cầu, gần cầu mầu nâu nhạt, đường kính từ 22,5 – 42,5 m, có thể lên tới 70 - 80 m Thể bình bao phủ hết mặt bọng, ở các đầu nhỏ thể bình bao phủ ½ đến ¾ bề mặt bọng Thể bình hai tầng nhưng trên các đầu nhỏ (lúc còn non) chỉ có 1 thể bình trên 1 cuống thể bình tạo nên hình dạng của loại 1 tầng Cuống thể bình kích thước 12,5 - 15 m (có thể 40 m) x 7,5 – 8,5 m Thể bình kích thước 6 - 10 m x 2,5 - 3 m Bào tử cầu, gần cầu hơi ráp kích thước 3,5 - 5 m [2]

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Hóa chất và dụng cụ thiết bị

2.1.1 Hóa chất

♦ Hóa chất dùng để tạo hạt nano chitosan

- Chitosan (DD = 84,45%, Mv = 328KDa) được cung cấp bởi Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Tripolyphosphat (TPP) – Sigma

- CH3COOH, 99,5%, Trung Quốc

- Nước khử ion: phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

♦ Hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh vật: Agar (Ấn Độ), peptone (Đức) và các vi lượng muối khác (Trung Quốc)

Các hóa chất dùng cho thí nghiệm khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích

(Môi trường MPB lỏng không bổ sung agar)

* Môi trường 2: Môi trường nuôi cấy nấm men (môi trường Hansen)

Bảng 2.2 Thành phần môi trường Hansen

(Môi trường Hansen lỏng không bổ sung agar)

* Môi trường 3: Môi trường nuôi cấy nấm mốc (môi trường Czapek-Dox)

Bảng 2.3 Thành phần môi trường Czapek-Dox Thành phần môi trường g/l

- Đĩa petri, lọ nuôi thủy tinh, bình tam giác 250ml

- Cuvet, que trang

- Ống buret 25ml

2.1.3 Thiết bị

- Tủ ấm (Friocell, Đức)

- Tủ lạnh (Sanyo)

- Lò vi sóng Sam sung

- Máy khuấy từ gia nhiệt Are - Velp Italia

- Máy đồng hóa mẫu IKA T25 digital ULTRA - TURRAX (Đức)

- Tủ cấy vô trùng (Sanyo)

- Nồi khử trùng (Nhật Bản)

- Cân phân tích Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy đo OD - SP 3000 nano (optima -USA)

- Máy đo độ nhớt Petrotest, Đức tại Phòng nhiên liệu dầu mỡ, Viện Hóa học vật liệu

- Máy đo FE-SEM HITACHI-S4800, Nhật, Viện Khoa học vật liệu - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo Zetasizer Ver 6.20, Malvern Instruments Ltd, Viện Khoa học vật liệu - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.4 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm từ bộ sưu tập của phòng Công nghệ sinh

học - Viện Hóa sinh biển

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan

2.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan

B1: Chuẩn bị dung dịch chitosan nồng độ 0,5%(w/v) bằng cách hòa tan chitosan trong acid acetic loãng 1%

B2: Tạo chitosan có khối lượng phân tử thấp từ chitosan ban đầu bằng cách

xử lý dung dịch chitosan với lò vi sóng ở 600w trong 5 phút, 10 phút, 15 phút

B3: Xác định khối lượng phân tử các mẫu chitosan chuẩn bị ở trên theo phương pháp đo độ nhớt của dung dịch Phương pháp này dựa vào phương trình Kunl- Mark- Howink biểu diễn mối quan hệ giữa độ nhớt đặc trưng của dung dịch polime với khối lượng phân tử trung bình của nó:

η = k.Mα [27] Trong đó η là độ nhớt đặc trưng của dung dịch polime; k, α là các hệ số phụ thuộc bản chất của polime, hệ dung môi và điều kiện tiến hành thí nghiệm Với chitosan,

độ nhớt được tính toán theo phương trình thực nghiệm Robbert:

(ηt/η0-1)/C Đồ thị này được xây dựng bằng cách đo độ nhớt của các dung dịch

chitosan, với dung môi là hỗn hợp axit axetic 0,2M với natri axetat 0,3M Nồng độ

chitosan là 1.10-4 ÷ 10.10-4 (g/ml) (10 dung dịch)

B4: Tiến hành tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp liên kết ion với TPP

từ các mẫu chitosan đã được chuẩn bị ở trên

Pha TPP trong nước khử ion được dung dịch TPP nồng độ 0,33% Nhỏ giọt từ từ

TPP vào dung dịch chitosan trong điều kiện khuấy 4000 vòng / 90 phút Hạt nano

chitosan thu được ở mẫu xử lý vi sóng và mẫu không xử lý được xác định kích

thước bằng máy Zetasizer Ver 6.20

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP

Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến kích thước và sự phân bố hạt nano

chitosan được tiến hành khảo sát với các tỉ lệ lần lượt là 4:1, 5:1, 6:1 Nồng độ CS

được giữ cố định là 0,5%(w/v), xử lý CS bằng lò vi sóng 600w / 10 phút, pH= 3-4

Để đáp ứng tỉ lệ CS:TPP lựa chọn, bổ sung TPP 0,5%; 0,4%; 0,3%(w/v)

2.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khuấy và tốc độ khuấy

* Ảnh hưởng của tốc độ khuấy: Để xác định ảnh hưởng của tốc độ khuấy

lên kích thước hạt nano CS-TPP trong phản ứng ionic gelation, thí nghiệm được

tiến hành với tỉ lệ CS:TPP là 6:1, khuấy trong 2 giờ Tốc độ khuấy thay đổi 1500;

4000 và 8000 v/ph CS được xử lý trước bằng vi sóng ở 600 w trong 10 phút

* Ảnh hưởng của thời gian khuấy: Thời gian khuấy trong phản ứng tạo nano

chitosan bằng phản ứng ionic gelation cũng có ảnh hưởng đến kích thước hạt tạo thành Để xác định được thời gian khuấy tốt nhất tạo được hạt nano chitosan với kích thước mong muốn, tiến hành tạo hạt nano chitosan như thí nghiệm trên (tốc độ khuấy là 8000 vòng/phút) và thời gian khuấy sẽ thay đổi lần lượt là 1h, 2h và 3h Hạt tạo thành được đo kích thước trên máy Zetasizer Ver 6.20

2.2.2 Tạo các loại hạt nano chitosan-TPP có kích thước khác nhau bằng

phương pháp liên kết ion

Cân chính xác 1 lượng chitosan hòa trong acid acetic 1% tạo thành dung

dịch chitosan có nồng độ 0,5% (w/v) Xử lý dung dịch chitosan bằng lò vi sóng ở

600w trong 10 phút Chuẩn bị dung dịch TPP 0,3% (pha TPP trong nước khử ion),

tỷ lệ giữa CS/TPP là 6:1 Cho dung dịch TPP chảy qua ống buret 25ml, nhỏ giọt

chậm dung dịch TPP vào dung dịch chitosan dưới tác động của máy đồng hóa

IKA T25 digital ULTRA - TURRAX (Đức) với tốc độ khuấy lần lượt là 4000

vòng/phút trong 2h, 4000 vòng/phút trong 4h và 8000 vòng/ phút trong 1h

2.2.3 Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các loại hạt nano

chitosan kích thước khác nhau bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu của Ing và cs (2012)

B1: Hoạt hóa chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng

B2: Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 3ml môi trường thích hợp cho từng loại vi sinh vật có bổ sung nano chitosan ở các dải nồng độ khác nhau Đối chứng là ống nghiệm chỉ có môi trường nuôi cấy, không bổ sung nanochitosan.Bổ sung vi sinh vật kiểm định đến nồng độ cuối cùng 104 -105 CFU/ml môi trường

B3: Nuôi ở điều kiện nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật trong khoảng thời gian xác định (vi khuẩn nuôi ở 370C trong 12h - 24h, nấm men nuôi

300C trong 12h - 24h, nấm mốc nuôi ở 280C trong 24h - 48h), đánh giá bằng mắt thường sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

B4: Đổ đĩa thạch môi trường MPA (nuôi vi khuẩn), môi trường Hansen nuôi nấm men, môi trường Czapek nuôi nấm mốc

B5: Lấy 100μl canh trường nuôi từ các ống thí nghiệm ở trên (gồm ống đối chứng và ống có chế phẩm mà không phát hiện sự sinh trưởng của vi khuẩn), cấy

trải lên đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên Để khô, lật ngược đĩa và nuôi ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật Xác định sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường đặc sau 24h nuôi cấy (đối với vi khuẩn và nấm men), sau 48h (đối với nấm mốc) Tiếp sau 24h hoặc 48h nuôi trên môi trường đặc, nồng độ nano chitosan nào thấp nhất có thể tiêu diệt 99,9% lượng vi khuẩn được cho là nồng độ diệt khuẩn tối thiểu, nồng độ nào thấp nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy là nồng

độ ức chế tối thiểu [39]

Phần trăm ức chế được tính theo công thức:

% ức chế = (A0 – As)/A0 * 100% Trong đó A0 là số khuẩn lạc mọc trên đĩa đối chứng (CFU/ml), As là số khuẩn lạc mọc trên đĩa thí nghiệm (CFU/ml)

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan - TPP 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan

Trên quan điểm lý hóa việc tương tác của chitosan và TPP được chấp nhận là liên kết chéo trong phân tử của các loại ion tripolyphosphoric, sản phẩm của TPP phân ly trong dung dịch nước, với các nhóm NH3+của chitosan Ảnh hưởng của pH, lực ion và các điều kiện sản xuất khác và bản chất của chitosan lên các đặc điểm lý học của các hạt nano chitosan-TPP đã được nghiên cứu [13] Khối lượng phân tử của chitosan có vai trò quan trọng trong phản ứng liên kết ion để tạo các hạt nano có kích thước mong muốn Chitosan khối lượng phân tử khác nhau có thể nhận được bằng cách depolymerization có kiểm soát sử dụng các phương pháp khác nhau như thủy phân bằng acid (HCl, HNO2, v.v), các gốc tự do (H2O2, K2S2O8), enzymes,

chiếu tia (UV, γ rays), siêu âm, vi sóng, và xử lý nhiệt [7]

Để xác định ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan sử dụng lên một số đặc tính của hạt nano chitosan tạo thành, trước khi tiến hành phản ứng ionic gelation, chitosan được xử lý bằng vi sóng để cắt ngắn mạch, sau đó quá trình được

tiến hành như mô tả trong phần phương pháp

Xác định khối lượng phân tử trung bình của các mẫu chitosan được xử

2 phần phụ lục) Độ nhớt đặc trưng và khối lượng phân tử trung bình (KLPTTB)

của mẫu chitosan được xử lý và không xử lý được tính toán theo công thức trong phần phương pháp (2.2.1.1), kết quả được thể hiện như bảng dưới đây

Bảng 3.1 : KLPTTB của Chitosan xử lý và không xử lý

Từ kết quả bảng 3.1, có thể nhận thấy chitosan xử lý bằng lò vi sóng có khối lượng phân tử trung bình thấp hơn chitosan ban đầu, trong cùng 1 nhiệt độ, thời gian xử lý càng lâu thì khối lượng phân tử của mẫu càng giảm Từ mẫu chitosan ban đầu có KLPTTB là 328 kDa, sau khi xử lý bằng lò vi sóng ở 600w/ 5 phút, KLPTTB giảm không đáng kể, còn 322 kDa, tuy nhiên khi tăng thời gian xử lý lên

10 phút, KLPTTB giảm xuống rõ rệt còn 234 kDa Như vậy việc chitosan xử lý bằng lò vi sóng đã có hiệu quả khi thu được chitosan có khối lượng phân tử thấp hơn, và theo nhiều nghiên cứu chitosan có khối lượng phân tử khác nhau sẽ ảnh hưởng rất lớn đến kích thước hạt nano chitosan tạo ra Để khẳng định khối lượng phân tử của chitosan ảnh hưởng đến kích thước hạt nano tạo thành, chitosan không

xử lý và chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 10 phút được sử dụng để làm nguyên liệu tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp liên kết ion như đã mô tả ở phần phương pháp 2.2.1.1.Các hạt nano chitosan tạo thành được đo kích thước và phân

bố hạt bằng máy Zetasizer Ver 6.20 Kết quả trên hình 3.1 và 3.2

C5: chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 5 phút C10: chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w / 10 phút

Kết quả nhận được cho thấy việc xử lý chitosan bằng lò vi sóng có thể giúp tạo ra được các hạt có kích thước nhỏ hơn nhiều so với mẫu chitosan không được

xử lý Trong cùng điều kiện phản ứng, các hạt nano chitosan từ CS xử lý bằng vi sóng có kích thước 971nm, trong khi đó các hạt nano chitosan từ CS không xử lý có kích thước 1254nm

Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu của các tác giả khác về ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến kích thước hạt nano chitosan được tạo

ra Thông thường, phân tử lượng của chitosan càng lớn thì kích thước hạt nano chitosan tạo thành càng lớn Nhóm của Hu [6] sử dụng chitosan có phân tử lượng lần lượt là 50, 100, 150 và 300 kDa, có cùng độ deacetyl hóa là 90% để điều chế hạt nano chitosan tripolyphosphate ở nồng độ chitosan là 1,5 mg/ml, tỷ lệ CS/TPP là 6:1, pH là 4,5 Khi phân tử lượng chitosan tăng từ 50kDa đến 150kDa, kích thước hạt không thay đổi đáng kể Khi phân tử lượng chitosan tăng từ 150kDa đến 300kDa, kích thước hạt tăng nhanh từ 173,3nm đến 309,7nm

Tương tự, nhóm của Gan [28] sử dụng chitosan có phân tử lượng thấp, trung

Hình 3.1: Sự phân bố kích thước hạt nano

chitosan với chitosan được xử lý bằng lò

vi sóng 600w/ 10 phút

Hình 3.2: Sự phân bố kích thước hạt nano chitosan với chitosan không xử lý