Phản ứng của đậu tương DT 2008 nảy mầm trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tỉ lệ nảy mầm của đậu tương Bảng 3.2: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng tươi Bảng 3.3: Ảnh hưởng của áp suất

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

***********

KIM THỊ DUYÊN

PHẢN ỨNG CỦA ĐẬU TƯƠNG DT 2008

NẢY MẦM TRONG ĐIỀU KIỆN

ÁP SUẤT THẨM THẤU KHÁC NHAU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học PGS TS NGUYỄN VĂN MÃ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính

trọng sâu sắc tới thầy giáo PGS TS Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn

và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Khoa Sinh – KTNN và Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện đề tài này

Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Kim Thị Duyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi đã thực hiện đề tài: “Phản ứng của đậu tương DT 2008 nảy mầm

trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau”

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực, không trùng lặp với các tác giả khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Kim Thị Duyên

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

atm : Atmosphere

ABA : Axit absisic

cDNA : Complementary DNA (DNA bổ sung)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tỉ lệ nảy mầm của đậu tương Bảng 3.2: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng tươi

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng khô

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng thân mầm Bảng 3.5: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng rễ mầm Bảng 3.6: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim proteaza Bảng 3.7: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim α - amilaza Bảng 3.8: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim lipaza

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hàm lượng axit amin prolin

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tỉ lệ nảy mầm của đậu tương Hình 3.2: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng tươi

Hình 3.3: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khối lượng khô

Hình 3.4: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng thân mầm Hình 3.5: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng rễ mầm

Hình 3.6: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim proteaza Hình 3.7: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim α - amilaza Hình 3.8: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ enzim lipaza

Hình 3.9: Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ axit amin prolin

MỤC LỤC

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 2

2.1 Mục tiêu 2

2.2 Nhiệm vụ 2

3 Ý nghĩa lí luận và thực tiễn 3

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Sự nảy mầm của hạt đậu tương 4

1.2 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu và sự thiếu nước đến đậu tương trong giai đoạn nảy mầm 6

1.3 Đặc điểm một số enzim và axit amin prolin trong hạt đậu tương nảy mầm 7

1.4 Tình hình nghiên cứu về ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu môi trường đối với thực vật nói chung và đậu tương nói riêng 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 12

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương và sự sinh trưởng mầm của đậu tương 18

3.2 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hoạt độ một số enzim và hàm lượng prolin của mầm đậu tương 24

KẾT LUẬN 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Trải qua suốt quá trình lịch sử, loài người đã sử dụng khoảng 3000 loài thực vật để làm lương thực và tối thiểu cũng tới 150 loài thực vật đã trở thành hàng hóa trong đó tập trung vào 30 loại cây trồng Những loài này được xem

là “bức tường ngăn cách” loài người với sự nghèo đói Trong đó không thể không kể đến đậu tương

Cây đậu tương (Glycine max L.Merrill) là loài cây thuộc họ Đậu (Fabaceae) Cây đậu tương có nguồn gốc Châu Á và được trồng cách đây

5000 năm Trong hạt đậu tương hàm lượng protein chiếm 40% đây là nguồn protein thực vật vô cùng quan trọng; hàm lượng lipit 12 – 25%, hàm lượng gluxit 10 - 15%; các muối khoáng Ca, Mg, Fe, P, K, Na, S; các loại vitamin

A, B, D, E, F; các enzim, sáp, nhựa Trong đậu tương có đủ các loại axit

amin cơ bản: xistin, metionin, lizin, tryptophan, valin … [6], [10]

Đậu tương là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành sản xuất công nghiệp nhất là công nghiệp thực phẩm phục vụ trực tiếp cho nhu cầu của con người Hạt đậu tương là sự kết hợp độc đáo các đặc tính làm cho chúng trở thành loại thực phẩm đa năng nhất trong các loại thực phẩm Sản phẩm hạt đậu tương được sử dụng trực tiếp dạng hạt thô hay dùng để chế biến thành các sản phẩm khác như: sữa đậu nành, bánh kẹo, đậu phụ Ngoài

ra, đậu tương còn được dùng trong sản xuất dược liệu với nhiều vị thuốc có giá trị ở nước ta

Một trong những yếu tố ngoại cảnh gây ra sự thiếu hụt nước trong cây

là do sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối cao Việc tích lũy và duy trì hàm lượng cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sức cạnh tranh nước với môi trường nhiễm muối, chống lại hiện tượng hạn sinh lí là một dạng phản ứng thích nghi của thực vật [3]

Việc phát triển cây đậu tương là việc làm có ý nghĩa trên các mặt kinh tế, nhân văn, môi trường đồng thời là yếu tố đảm bảo an ninh lương thực và góp phần phát triển bền vững đất nước Để tăng năng suất đậu tương một trong các biện pháp là làm tăng khả năng chống chịu của chúng với ngoại cảnh bằng cải tiến kĩ thuật, chọn giống mới hoặc lựa chọn những nơi trồng có điều kiện ngoại cảnh thích hợp Vì vậy cần tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu phản ứng của đậu tương nảy mầm trong các điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau để tìm được giới hạn của đậu tương và điều kiện mà cây sinh trưởng tốt nhất Cây ở những giai đoạn khác nhau cũng có những phản ứng với sự thiếu nước khác nhau, đặc biệt giai đoạn nảy mầm rất mẫn cảm với sự thiếu nước Giai đoạn nảy mầm là thời điểm quan trọng trong chu trình sống của thực vật nói chung và của đậu tương nói riêng Những biến đổi của giai đoạn này sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây về sau, xuất

phát từ vấn đề này tôi nghiên cứu đề tài: “Phản ứng của đậu tương DT

2008 nảy mầm trong điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau”

2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

- Xác định hoạt độ của các enzim: proteaza, lipaza, α - amilaza; hàm lượng prolin trong mầm đậu tương ở các điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau

3 Ý nghĩa lí luận và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung nguồn tài liệu cho việc nghiên cứu khả năng chống chịu của đậu tương đối với các điều kiện môi trường bất lợi và áp dụng cho việc trồng đậu tương trên đất nhiễm mặn Trên cơ sở đó lựa chọn và định hướng gieo trồng trong những vùng sinh thái thích hợp

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Sự nảy mầm của hạt đậu tương

Khả năng nảy mầm của hạt giống là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tiêu chuẩn của một giống tốt Đối với các loại cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng, nảy mầm là giai đoạn khởi đầu của quá trình sinh trưởng, thời kì nảy mầm được tính từ khi gieo hạt đến khi xuất hiện mầm trên mặt đất Khi nảy mầm trong hạt xảy ra hàng loạt các quá trình biến đổi sinh lý, sinh hóa một cách phức tạp

Tỉ lệ nảy mầm cao hay thấp, thời gian nảy mầm nhanh hay chậm đều

có liên quan tới tốc độ sinh trưởng của giống và sự đồng đều của các giống cây trong quần thể Do vậy, giống nào có tỉ lệ nảy mầm cao, thời gian nảy mầm nhanh sẽ rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của cây sau này Những giống có tỉ lệ nảy mầm thấp sẽ không đảm bảo mật độ, thời gian nảy kéo dài sẽ làm cho cây sinh trưởng kém ngay từ đầu, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất Tỉ lệ và thời gian nảy mầm không chỉ do bản chất di truyền của giống mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm Đối với đậu tương ở nhiệt độ 27 – 28oC, hạt đậu tương nảy mầm thuận lợi hơn, tốc độ

nảy mầm cũng nhanh hơn

Đậu tương là một loại cây trồng rất đa dạng Để giám định giống đậu tương các nhà chọn tạo giống căn cứ vào đặc tính sinh vật học và nhiều đặc điểm về hình thái để phân loại các giống đậu tương khác nhau Dựa vào đặc điểm thực vật học, các nhà khoa học có thể xác định được khả năng chống chịu sâu bệnh, điều kiện ngoại cảnh bất lợi cho năng suất của các giống đậu tương

Quá trình nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt với tốc độ cao để chuẩn bị cho sự hình thành một cây non mới Đậu tương

thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm của đậu tương cũng gồm các pha như

sự nảy mầm của cây hai lá mầm Pha trương hạt: khi bắt đầu nảy mầm hạt hút nước rất mạnh làm trương hạt Pha hình thành và hoạt hóa enzim: trong

hạt có một lượng enzim nhất định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết Khi hạt hút nước enzim mới được giải phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh

Pha tích lũy chất dinh dưỡng: ngay trong những phút ngâm trong nước đầu

tiên độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt chu trình hexozomonophotphat tăng lên nhiều lần do vậy lượng ATP tích lũy nhiều Pha động viên các chất

dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc biệt cho cơ thể ở giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chúng thuộc 3 nhóm chất hữu cơ là:

gluxit, protein, lipit Trong quá trình này enzim α - amilaza tác động vào liên kết 1,4 - glucozit phân giải tinh bột trong các dextrin tham gia vào quá trình

hô hấp ở các dạng sacacrozo tích lũy ở các tế bào trụ phôi Protein được phân giải bởi enzim proteaza thành các amit Phần lớn các axit amin tạo thành được vận chuyển vào để tổng hợp các phân tử protein đặc trưng cho cơ thể [5]

Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nước nhờ cơ chế hút trương của hạt làm hạt trương lên Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ hạt bắt đầu tăng tính thủy hóa của keo nguyên sinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo dẫn đến biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất của hạt liên quan đến sự nảy mầm Đặc trưng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzim thủy phân phân hủy polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản dẫn đến sự thay đổi hoạt động thẩm thấu Các sản phẩm thủy phân này làm nguyên liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ ở phôi hạt, vừa làm tăng áp suất thẩm thấu trong hạt giúp cho quá trình hút nước vào hạt nhanh chóng

Sự tăng hoạt tính enzim dẫn đến sự biến đổi các chất dự trữ và mức độ hoạt hóa các enzim riêng biệt phụ thuộc vào tính chất đặc trưng và thành

phần hóa học của hạt Đối với đậu tương, hạt dự trữ chủ yếu là protein thì hoạt tính enzim proteaza tăng lên mạnh mẽ hơn các enzim khác

1.2 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng của thực vật

Nước là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm Nước tham gia vào quá trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hóa trong tế bào, là nguồn nguyên liệu của nhiều phản ứng Nước đảm bảo cho cây sinh trưởng và phát triển

Áp suất thẩm thấu là lực gây ra sự chuyển dịch của dung môi vào tế bào qua màng sinh chất Áp suất thẩm thấu không phụ thuộc vào bản chất của chất tan mà phụ thuộc vào nồng độ phân tử chất tan, nhiệt độ, sự phân li của dung dịch Áp suất thẩm thấu bao gồm áp suất thẩm thấu bên trong (áp suất thẩm thấu nội bào) và áp suất thẩm thấu bên ngoài (áp suất thẩm thấu môi trường)

Áp suất thẩm thấu bên trong: dịch tế bào có chứa hàm lượng lớn các

chất hữu cơ là sản phẩm của quá trình trao đổi chất Các chất này trong dịch

tế bào đã tạo nên áp suất thẩm thấu cao giúp cho quá trình xâm nhập của nước và trong tế bào bằng con đường thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu bên ngoài: chủ yếu do các muối của môi trường

gây nên Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng muối cao đặc biệt là NaCl, điều

đó hạn chế khả năng hút nước dẫn đến khó khăn trong việc hút chất dinh dưỡng của cây Nếu cây sinh trưởng trong môi trường không có muối thì nước sẽ dễ dàng thấm qua màng bán thấm để đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thẩm thấu của màng Đất bị nhiễm mặn sẽ gây nên hai tác hại đối với thực vật Tác hại thứ nhất gây ra hiện tượng hạn sinh lí, hàm lượng muối trong đất làm cho áp suất thẩm thấu môi trường lớn Nếu áp suất tế bào không thắng nổi áp suất của môi trường cây sẽ bị khô héo do tế bào không hút được nước Thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo chất nguyên sinh làm tăng sự già hóa của tế bào Tác hại thứ hai, liên quan đến

tính gây độc của các ion đối với thực vật Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lượng cao các ion, đặc biệt Na+ và Cl-, ngoài ra còn có các ion khác: SO42-, Li+, hàm lượng cao ion này đều gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Thực vật nói chung và đậu tương nói riêng sống trong điều kiện thiếu nước đều có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những biến đổi hình thái hoặc những phản ứng hóa sinh phù hợp

Sự thiếu nước ở thực vật chủ yếu do hạn hán và áp suất thẩm thấu môi trường gây nên Khi thiếu nước thường làm cho tế bào mất sức căng, đỉnh sinh trưởng bị héo và các quá trình sinh lí diễn ra không bình thường, hoạt động của enzim thủy phân thường diễn ra nhanh hơn là enzim tổng hợp dẫn đến tế bào mất chất dinh dưỡng, đồng thời cũng gây ảnh hưởng trầm trọng đến quá trình hô hấp Khi thiếu nước cường độ hô hấp tăng nhưng hiệu quả năng lượng bị giảm sút Thiếu nước gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây, cuối cùng ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất của chúng

Về khả năng chịu mặn của thực vật, trước hết phải nói đến cơ chế tích lũy và duy trì nồng độ cao các chất hòa tan trong tế bào nhằm đảm bảo sự cạnh tranh nước với môi trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn sinh lý Hàm lượng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống thường xuyên trên đất này phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na+, Cl- cao hơn nhiều thực vật vốn có khả năng chịu mặn, đồng thời phải có những thay đổi về hoạt động sinh lí như: hô hấp, quang hợp, thoát hơi nước của lá cho phù hợp với điều kiện thiếu nước của cây

1.3 Đặc điểm một số enzim và axit amin prolin trong hạt nảy mầm

1.3.1 Đặc điểm một số enzim

Trong hạt đậu tương đang nảy mầm diễn ra quá trình phân giải các chất hữu cơ cung cấp năng lượng và nguyên liệu cho cây sinh trưởng và phát

triển Enzim hoạt động chủ yếu trong giai đoạn này là enzim xúc tác cho các

phản ứng thủy phân như: proteaza, lipaza, α – amilaza …

Proteaza: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptit Khi hạt nảy mầm protein bắt đầu được phân giải thành axit amin dưới tác dụng enzim proteaza Các axit amin là nguồn nguyên liệu cho quá trình tổng hợp các chất đồng thời góp phần tăng áp suất thẩm thấu tế bào thực vật Proteaza tham gia trong nhiều hoạt động sống quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong y học

và nhiều ngành công ngiệp khác

Lipaza: xúc tác phản ứng thủy phân triaxilglixerol tạo thành các axit béo tự do và glixerol Lipaza xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết este trong phân tử chứ không cắt đứt cả 3 liên kết este cùng 1 lúc Axit béo và glixerol là nguyên liệu cho hô hấp giải phóng năng lượng và kiến tạo thành phần của tế bào

α - amilaza: phân giải liên kết 1,4 - glucozit ở giữa chuỗi mạch polisaccarit tạo các dextrin phân tử thấp Dưới tác dụng của enzim này dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị giảm độ nhớt mạnh Do đó để xác định hoạt độ của enzim α - amilaza người ta thường dựa vào sự biến đổi màu của iot khi cho tác dụng với enzim này [9]

1.3.2 Đặc điểm axit amin prolin

Sống trong điều kiện hạn do stress muối gây ra, thực vật có khả năng chịu hạn nhờ hai cơ chế : tránh mất nước và chịu mất nước Cơ chế tránh mất nước biểu hiện qua sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm sự mất nước hoặc việc tích lũy các chất hòa tan như protein, axit amin…để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào Cơ chế chịu mất nước thể hiện qua việc nhanh chóng sinh tổng hợp các chất để bảo vệ, điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào như ABA (axit absisic), axit amin prolin …

Prolin là axit amin ưa nước trong cơ thể thực vật, được tổng hợp từ glutamin bởi enzim cảm ứng stress P5CS Prolin là thành phần chủ yếu trong cấu trúc của nhóm các chất amoni bậc 4 và có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật Vì thế, việc nghiên cứu hàm lượng prolin trong quá trình sinh trưởng của hạt đậu tương khi nảy mầm

có thể giúp chúng ta tìm hiểu sâu hơn sự điều tiết quá trình trao đổi nước trong tế bào thực vật và khả năng của chúng chống lại sự thiếu hụt nước

Axit amin prolin được tổng hợp từ glutamin bởi enzim chìa khóa pyrolin - 5 - cacboxylate - synthetase (P5CS) Prolin hay α - pirolidin cacboxylic có công thức trong phân tử một mạch bên chính là một hydro - cacbua, một vòng pirolidin được tạo thành do sự kết hợp giữa nhóm amin bậc một và Cα Do đó, prolin có chứa nhóm amin bậc hai và được gọi là imino axit [9]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng prolin đóng vai trò là nhân tố chính bảo vệ màng tế bào, chống lại các tác động có hại của nồng độ muối cao, làm tăng thế năng thẩm thấu của tế bào Sự tập trung prolin để phản ứng lại stress muối diễn ra chủ yếu trong dịch bào Prolin cũng có thể có chức năng như protein thẩm thấu ưa nước và như một gốc hydroxyl Do đó, sự tích lũy prolin được coi là một phản ứng thích nghi thông thường của thực vật bậc cao trong điều kiện khô hạn Prolin được xem như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật và còn là chỉ số tốt của thực vật có khả năng chịu mặn [3]

1.4 Tình hình nghiên cứu về ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu môi trường đối với thực vật nói chung và đậu tương nói riêng

1.4.1 Trên thế giới

Trên thế giới với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, đã có nhiều công trình nghiên cứu về tính chống chịu của thực vật như các nghiên

cứu của các tác giả: Bates L.S (1973) [14], Bamet N.M, Naylor A.W (1996) [17], Goyal K, LJ Walton (2005) [19], Ingram J, D Bartel (1996) [21], Thomashow MI (1998) [27], Xiao B, Y Huang, N Tang (2007) [30], Zhao và cộng sự (2000) [31]… nghiên cứu về tính chịu hạn, chịu mặn và chịu lạnh ở lúa, lúa mì và thực vật nói chung

Đã có nhiều công trình nghiên ở nước ngoài trên các đối tượng thực vật và cây trồng khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển hóa prolin,….liên quan đến vai trò của prolin đối với tính chịu hạn của thực vật Trong dòng tế bào thuốc lá được nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428 mM NaCl, prolin chiếm 80 % axit amin tự do (Rhodes và Handa, 1989) [25] Người ta thừa nhận rằng có sự phân bố đồng đều prolin trong toàn bộ thể tích nước của nội bào, kết quả được xác định axit amin tại thời điểm này vượt

quá 129 mM Sự tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlis spicata trong điều kiện stress muối (xử lí ở nồng độ 200 mM NaCl) ước tính trên 230 mM

(Ketchum et al, 1991) [22] Cũng trên đối tượng cay thuốc lá, tác giả Kishor P.B.K và cộng sự (1995) [23] nghiên cứu cây thuốc lá được chuyển gen (gen liên quan đến sinh tổng hợp prolin – P5CS) trong điều kiện hạn nước, hạn muối Kết quả cho thấy hàm lượng prolin gấp khoảng từ 10 - 18 lần so với đối chứng Thực vật được chuyển gen (gen P5CS) cũng được nghiên cứu trên đối tượng là cây đậu tương (J.A.de Ronde; R.N Laurie ; T.Caetano; M.M Greyling; I.Kerepesi 2004) [16] Các tác giả tiến hành so sánh giữa dòng đậu tương chuyển gen P5CS và dòng đậu tương không được chuyển gen cho thấy: dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn

Về đậu tương có một số tác giả nghiên cứu như: Whitsitt và cộng sự (1997) [29] đã cho thấy lượng nước mất trên 60% thì đậu tương không thể phục hồi được Những nghiên cứu của Matra N, Cushman J, C (1994) [24]…

đã nhận thấy rằng cDNA (complementary DNA) của dehidrin từ lá đậu

tương mất nước bị phân lập, dehidrin là một trong những LEA với chức năng bảo vệ tế bào khi mất nước Sheila A.Blackman và cộng sự (1992) [26] đã nghiên cứu protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein) trong phôi mầm hạt đậu tương đang chín ở điều kiện bình thường và dưới áp suất thẩm thấu cao Kết quả nghiên cứu đã khẳng định HSP tăng lên trong quá trình hình thành hạt và giảm khi hạt nảy mầm HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm oligosacarit chưa được tổng hợp để hỗ trợ tế bào thực hiện chức năng

sự biến đổi của hoạt độ enzim proteaza, amilaza và hàm lượng prolin của cây đậu tương khi gặp hạn ở thời kì ra hoa (Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã) [12] … Các kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất

và chọn tạo được nghiều giống đậu tương mới có năng suất cao, phẩm chất tốt phù hợp với điều kiện khí hậu và canh tác của Việt Nam

Tại Trung tâm Nghiên cứu và thực nghiệm đậu đỗ, Viện Khoa học kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam, nhiều giống đậu tương nhập nội và giống địa phương đã được đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng bằng một số biện pháp hạt nảy mầm trong dung dịch đường sacarozo, phương pháp dùng nhiệt cao… Kết quả trên 1000 mẫu giống nhập nội đã phân lập được 185 mẫu có khả năng chịu hạn trồng vụ đông, 68 mẫu giống chịu hạn tổng hợp, 14 mẫu giống vừa chịu nóng chịu hạn tốt và có nhiều đặc tính kinh tế quan trọng khác [4]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây đậu tương thuộc giống DT 2008 do Viện

Di truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp

Theo PGS TS Mai Quang Vinh cho biết: DT 2008 là kết quả chọn tạo bằng phương pháp lai + đột biến phóng xạ từ năm 2002 của đề tài “Chọn tạo giống đậu tương đột biến chịu hạn” mà Viện Di truyền Nông nghiệp là cơ quan đại diện cho Việt Nam tham gia phối hợp trong khuôn khổ Diễn đàn Hợp tác Hạt nhân châu Á về chương trình Chọn giống đột biến phóng xạ Thời gian sinh trưởng 95 – 110 ngày Giống được trồng vụ xuân, hè thu và đông DT 2008 có nhiều ưu điểm vượt trội so với các giống khác: năng suất cao (18-35 tạ/ha, trong điều kiện khó khăn có thể cho năng suất cao gấp 1,5 -

2 lần các giống thông thường [13]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Gieo trên khay có giấy thấm, chia thành 2 phần:

Phần 1: Lô đối chứng (ĐC) cho hạt nảy mầm trong nước cất

Phần 2: Lô thí nghiệm (TN) cho hạt nảy mầm trong dung dịch muối NaCl với áp suất thẩm thấu 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 (atm) và đặt tên tương ứng là các mẫu thí nghiệm P1, P3, P5, P7, P9, P11, P13

Hạt nảy mầm trong dung dịch muối NaCl và trong nước cất phải thường xuyên bổ sung lượng nước hoặc lượng dung dịch muối với nồng độ tương ứng ở các lô như nhau

2.2.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

.100%

a N b



N: Khả năng nảy mầm của hạt; a: Số hạt nảy mầm trong lô TN;

b: Số hạt nảy mầm trong lô ĐC

* Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm

Chúng tôi tiến hành đo chiều dài thân mầm, rễ mầm vào các ngày 1, 3,

5, 7 và khối lượng tươi, khô vào ngày 1 và ngày 7 sau khi hạt nảy mầm

- Chiều dài thân, rễ mầm (mm/mầm): sử dụng thước chia đơn vị đến

mm để đo chiều dài của thân mầm, rễ mầm

- Khối lượng tươi của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, lau sạch và thấm khô sau đó cân khối lượng của mầm

- Khối lượng khô của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, lau sạch và thấm khô đem sấy khô ở 105oC đến khi khối lượng không đổi (3h)

2.2.2.2 Xác định các chỉ tiêu sinh hóa

* Hoạt độ của enzym proteaza (mg/g)

Lấy 2 bình nón (V = 100 ml) cho vào mỗi bình 2 g hạt đậu tương đã nảy mầm đã nghiền nát và 10 ml KH2PO4 0,1 N, lắc nhẹ để tạo môi trường

pH thích hợp với hoạt độ của proteaza có trong hạt đã nảy mầm Thêm vào bình 1 (bình đối chứng) 10 ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzim Cho vào mỗi bình 2 ml dung dịch protein 5%, đặt 2 bình trong tủ

ấm 37º C thời gian 1 giờ Sau đó, thêm vào bình 2: 10 ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzim, kết thúc quá trình thủy phân protein Dùng ống đong đo dung dịch mẫu (V) Lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích lọc, chuyển sang bình tương ứng với thí nghiệm (2) và bình đối chứng (1) Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc: 10 ml foocmaldehit và 5 giọt tymophtalein để làm chất chỉ thị màu Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2 N đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long là được

Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu được tính theo công thức:

* Hoạt độ enzym lipaza (Theo Nguyễn Văn Mùi) [10]

Cân 5 g hạt đậu tương nảy mầm đã nghiền nát, chuyển vào bình nón

100 ml, cho thêm 10 ml nước cất, lắc đều Cho thêm 1 ml dầu lạc làm cơ chất và 5ml dung dịch đệm axetat pH = 4,7 với vài giọt toluen Trộn đều hỗn hợp và cho vào tủ ấm 30oC trong 20 – 24 giờ Bình kiểm tra phải đun sôi dịch enzim 3 – 5 phút để làm mất hoạt động của enzim trước khi cho tiếp xúc với cơ chất Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25 ml cồn 96% và

15 – 24 ml ete Lắc đều, để lắng Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N với 0,5 ml chỉ thị tymolphtalein 1% Đối với dịch chiết nguyên liệu thực vật không có màu thì dùng chỉ thị phenolphtalein

Hoạt độ lipaza được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1 N trong 10 g hạt theo công thức:

* Hoạt độ enzym α- amilaza

Cho vào 2 bình nón 50 ml, mỗi bình 10 ml dung dịch tinh bột 1% và đặt vào máy ủ nhiệt ở 30oC, giữ 10 phút Thêm vào bình 2 (bình TN) 5 ml dịch chiết enzim Khuấy đều và giữ 10 phút Lấy từ mỗi bình hỗn hợp cho vào 2 bình khác có chứa 50 ml dung dịch iot Lắc đều Bình đối chứng có màu xanh, bình thí nghiệm có màu tím Đo độ hấp thụ ở bước sóng 656 nm Mật độ quang của bình đối chứng (OD1) là lượng tinh bột ban đầu Mật độ quang của bình thí nghiệm (OD2) là lượng tinh bột còn lại sau khi α -

amilaza thủy phân Sự khác nhau giữa mật độ quang của bình đối chứng và bình thí nghiệm là lượng tinh bột bị enzim thủy phân