Nghiên cứu nhân giống loài nưa krausei (amorphophallus krausei engl ) bằng phương pháp nuôi cấy mô

Theo các nghiên cứu mới đây của viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Việt Nam là nơi phân bố của một số loài Nưa có hàm lượng glucomannan tương đối cao, Nưa krausei Amorphophallus krau

ăn có thể phòng và chữa trị được những bệnh này

Cây Nưa (Amorphophallus spp.) được dùng làm thức ăn từ lâu đời ở

Trung Quốc và các nước Đông Nam Á Ở Trung Quốc và Nhật Bản, bột từ củ Nưa được chế biến thành nhiều loại thức ăn khác nhau như mì, miến, thạch, bánh, kẹo Hơn nữa, trong bột Nưa có chứa đường glucomannan với hàm lượng khá cao, giúp làm giảm mỡ máu, chống béo phì được chế biến thành các viên giảm béo là một loại thực phẩm chức năng phổ biến Ngoài ra, bột Nưa còn được sử dụng trong mỹ phẩm làm đẹp da

Theo các nghiên cứu mới đây của viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Việt Nam là nơi phân bố của một số loài Nưa có hàm lượng glucomannan

tương đối cao, Nưa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) là một trong số

đó Để phát triển nguồn nguyên liệu củ cây Nưa krausei thu glucomannan cho công nghiệp chế biến thực phẩm và thực phẩm chức năng thì vấn đề nhân giống cây Nưa krausei là rất cần thiết

Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng và phổ biến của công nghệ sinh học giúp nhân nhanh giống cây trồng và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm Xuất phát từ những lý

do trên tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống loài Nưa krausei

(Amorphophallus krausei Engl.) bằng phương pháp nuôi cấy mô” để phục

vụ sản xuất

2

Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình nhân giống loài Nưa krausei bằng phương pháp

nuôi cấy mô

Nội dung nghiên cứu

- Xác định điều kiện khử trùng hiệu quả

- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo mô sẹo và tái sinh cây trong ống nghiệm

- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo đa chồi và cây hoàn chỉnh

trong ống nghiệm

- Xác định giá thể thích hợp cho cây con nuôi cấy mô nuôi trồng ngoài tự

nhiên

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học: Kết quả đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy trong

ống nghiệm đối với nhân giống và bảo tồn loài Nưa krausei

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả đề tài góp phần nhân giống phục vụ trực tiếp cho

các ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược học

Điểm mới của đề tài

- Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về nhân giống loài Nưa krausei bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam

Bố cục của khoá luận: gồm 41 trang, 12 bảng, 16 hình ảnh được chia thành

các phần chính như sau: Mở đầu (2 trang), chương 1 (Tổng quan tài liệu: 15 trang), chương 2 (Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 8 trang), chương 3 (Kết quả và thảo luận: 14 trang), Kết luận và kiến nghị (1 trang), Tài liệu tham khảo: 42 tài liệu, phụ lục

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu chi Nưa trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Trên thế giới

Chi Nưa (Amorphophallus) là một chi lớn thuộc họ Ráy (Aracae) Trên

thế giới chi Nưa có khoảng 200 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới thuộc Châu Phi và Châu Á Hiện nay nhiều loài được nghiên cứu và triển khai trồng với diện tích lớn ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand, Ấn Độ, Thái Lan, In đô nê xi-a, v.v

Ở Trung Quốc, chỉ riêng tỉnh Vân Nam, hàng nghìn hecta đất đồi núi được sử dụng để trồng Nưa, ngoài ra Nưa còn được trồng ở Nam Ninh, Quảng Đông, Quảng Tây, Trùng Khánh Ở Nhật Bản, chỉ 2 vùng Jinnejo và Uedama, ngay từ những năm 70 của thế kỷ trước, hàng năm khoảng hơn 15 nghìn ha Nưa đã được trồng với sản lượng đạt tới hàng nghìn tấn Do tầm quan trọng của nguồn lợi từ củ Nưa, nên cây này đã được nhập trồng từ Nhật Bản vào New Zealand từ hàng chục năm trước [23]

Nưa là cây trồng có thể mang lại nguồn lợi kinh tế lớn, nên trong những năm qua đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũng như kỹ thuật canh tác cây Nưa

Hiroshi Kurihama (1979) đã đưa ra các định hướng và kinh nghiệm trong trồng trọt Nưa konjac trên đất bằng và đất dốc tại 2 tỉnh Jinnejo và Uedama ở Nhật Bản, cũng như các yếu tố về nhiệt độ, đất, sâu bệnh và thời

4

Liu & cs (1998) khi nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển của một số loài Nưa ở Trung Quốc đã chỉ ra các điều kiện sinh thái của Nưa Theo nhóm nghiên cứu, Nưa không phải là cây đòi hỏi nhiều nước, có khả năng chịu hạn tốt nhưng không chịu được ngập úng Về nhiệt độ, Nưa là cây ưa ấm, có khả năng chịu biến thiên nhiệt độ từ 5 - 43o

C, nhiệt độ tối thích là 20 - 25oC, khi nhiệt độ xuống dưới 0oC và lên trên 48oC cây sẽ chết sau 5 ngày Nghiên cứu này cũng đưa ra một số mức nhiệt tối thích cho sự phát triển của củ và rễ, khả năng lai của một số loài Nưa và thu được nhiều kết quả khả quan Cũng theo nghiên cứu cho biết Nhật Bản và Trung Quốc là hai nước có lịch sử trồng và

sử dụng bột Nưa (bột konjac) như loại thực phẩm truyền thống từ hàng nghìn năm trở về trước Dựa trên những nghiên cứu rộng rãi về an toàn thực phẩm,

Bộ Y tế Trung Quốc cho phép đưa bột Nưa vào trong những thực phẩm quản

lý thông thường từ năm 1998 Ở Mỹ người ta chấp nhận bột Nưa như thực phẩm bổ sung (năm 1997), và cũng cho phép sử dụng bột Nưa như nhân tố làm đặc, tạo màng, chất chuyển thể sữa và chất ổn định trong các thực phẩm Ngày nay Nhật Bản, Trung Quốc và một số nước đã sử dụng bột Nưa làm nguyên liệu trong công nghệ dược phẩm, sản xuất thực phẩm chức năng, hỗ trợ nhiều bệnh như đái tháo đường, hạ cholesterol máu, điều trị táo bón, hỗ trợ giảm cân [29]

Long Chu Lin (1998) đã có công trình nghiên cứu thực vật dân tộc học của các loài Nưa, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng người dân Trung Quốc đã sử dụng Nưa làm thức ăn từ 3000 - 4000 năm trước, nhiều kiến thức về kỹ thuật trồng cây Nưa theo lối cổ truyền cũng được đề cập Theo nghiên cứu này, hạt của một số loài Nưa khó nảy mầm ở ngoài tự nhiên, tuy nhiên nó lại nảy mầm

dễ dàng sau khi qua đường tiêu hóa của một số loài chim Theo cách nảy mầm nhân tạo, quả Nưa chín sau khi rửa sạch vỏ và cơm quả, trộn lẫn với cát ẩm ở

tỉ lệ 1:4 rồi cất vào chỗ tối hoặc phủ bằng lớp đất dày thì dễ dàng nảy mầm [30]

5

Theo Santosa và cs (2002) Nưa chuông là cây lương thực quan trọng ở Java trong những năm 1940 - 1950, sau một thời gian ít được sử dụng, hiện nay Nưa đã trở thành loài có triển vọng kinh tế lớn, sự có mặt của loài cây này tại các vườn nhà ở Java ngày càng nhiều Trong các nghiên cứu về sinh trưởng và ứng dụng của Nưa chuông từ 2003 đến 2008 của nhóm tác giả cho biết chu kỳ tăng tưởng của Nưa chuông là khác nhau ở một số nước Nam Á như: ở Tây nam Trung Quốc, bắc Mianma, bắc Thái Lan chu kì tăng trưởng bắt đầu từ tháng 5, kết thúc vào tháng 10, trong khi đó ở In đô nê xi-a lại bắt đầu từ tháng 11 và kết thúc vào tháng 5, giai đoạn tăng trưởng kéo dài 160-

180 ngày ở tất cả các khu vực [37]

Liu (2004) đã đề cập khá kỹ về nguồn gốc, phân bố của chi Nưa, phân loại học, hình thái học, chu trình sinh trưởng và phát triển, sinh thái, sự chuyển hóa của glucomannan, trồng trọt, nhân giống và chế biến cũng như bảo quản sau thu hoạch… của các loài Nưa Theo Liu trên thế giới đã biết khoảng 173 loài Nưa, trong đó có trên 20 loài được phát triển thương mại ở Trung Quốc, Nhật Bản, Malaisia, Ấn Độ và In đô nê xi-a, hàng năm thế giới sản xuất khoảng 30 nghìn tấn bột konjac Sản lượng củ Nưa tươi có thể đạt tới

30 - 35 tấn/ha nhưng chỉ khoảng 2,5 tấn glucomannan được chiết xuất từ số lượng củ này [28]

Douglas và cs (2005) đã có công trình nghiên cứu về kỹ thuật trồng Nưa konjac ở New Zealand và đã thu được nhiều kết quả về trọng lượng, chất lượng củ Nưa khi trồng dưới tán rừng và trồng trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời [22]

Theo Zhang và Liu (2006) Nưa phát triển theo mùa, chúng thường rụng

lá vào mùa đông hay mùa khô, thời gian ngủ sinh lý của Nưa kéo dài từ 60 -

80 ngày và không thể có bất kỳ tác nhân nào có thể phá vỡ trạng thái ngủ để hình thành chồi trong giai đoạn này Sau khi ngủ, cây bắt đầu nảy mầm, lá

6

phát triển mạnh để hình thành củ mới, lúc này củ mẹ hết chất dinh dưỡng và chết đi Trong tự nhiên, Nưa cần ít nhất 3 năm để để phát triển đủ lớn và có thể ra hoa Do đó, Nưa được đánh giá là cây sinh trưởng chậm và cho năng suất thấp [40]

Kết quả nghiên cứu của Nedunchezhiyan và cs (2006) đã giới thiệu khá

cụ thể về các bước nhân giống từ củ, làm đất, tỷ lệ phân bón, mật độ trồng, tưới nước, thu hoạch, cũng như bảo quản củ Nưa chuông ở Ấn Độ Theo các tác giả, Nưa chuông hoàn toàn có thể nhân giống được bằng cách cắt củ ra thành từng phần khoảng 100gram trọng lượng Ở Ấn Độ, Nưa chuông có tên gọi là Elephant foot yam, được biết đến như là một trong những rau củ giàu chất dinh dưỡng và là cây trồng lâu đời ở Tây Bengat, Andhra Pradesh, Tamil Nadu, Bihar… năng suất của Nưa chuông khoảng 30 - 35 tấn/ha [33], [35] Nedunchezhiyan và cs (2012) đã có công trình nghiên cứu về sự phát sinh chồi của Nưa chuông, ảnh hưởng của các loại giá thể, kích thước củ giống và ảnh hưởng của các chất như thiourea, gibberellic acid, kali nitrat đến quá trình hình thành chồi Nưa chuông [34]

Theo Melinda Chua và cs (2010), ở Trung Quốc, Nưa được trồng xen canh với ngô và kê cũng đạt năng xuất khá cao [31]

Zhang và cs (2010) đã công bố kết quả nghiên cứu nhân giống so le

giữa 2 loài Nưa là: A.bulbifer và A muelleri nhằm tìm ra loài Nưa thích hợp cho vùng Nam Á Sau khi nghiên cứu và so sánh với Nưa konjac (A konjac), nhóm nghiên cứu đã kết luận loài A muelleri có khả năng thích ứng tốt với

khí hậu Nam Á, cho hàm lượng glucomannan cao (>70%) có thể phát triển trồng ở bắc Mianma và Lào Nghiên cứu đã giải thích tại sao ở Nam Á người

ta sử dụng củ mà không sử dụng hạt Nưa làm vật liệu nhân giống Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện khí hậu của khu vực rất thuận lợi cho sự phát triển của các loài cỏ dại, cây từ hạt thường không đủ sức cạnh tranh Hơn nữa,

được nghiên cứu ở một số loài như: A konjac, A muelleri, A.bulbifer, A paeoniifolius Các loài Nưa khác còn ít được biết đến trong đó có Nưa

krausei

1.1.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, chi Nưa có khoảng 25 loài phân bố từ Bắc vào Nam nhưng hầu hết tập trung ở các tỉnh miền núi, một số tỉnh duyên hải và hải đảo Một số loài đã được các dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không chỉ làm thực phẩm mà còn là nguồn dược liệu tự nhiên quý giá Người dân thường trồng Nưa lấy củ làm lương thực, thân và cành lá dùng chăn nuôi, cuống lá (bèn hay chột) Nưa dùng nấu canh hoặc muối dưa ăn Củ được dùng làm thuốc trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa trị đờm tích trong phổi, trúng phong bất tỉnh, cấm khẩu, chứng đau nhức, đầy bụng, tức ngực, ăn uống không tiêu, sốt rét, trục thai chết [14], [42]

Tài liệu về Nưa ở Việt Nam chủ yếu là các công trình về phân loại chi Nưa Các loài Nưa đầu tiên ở Việt Nam được Gagnepain tổng hợp và mô tả trong bộ sách Thực vật chí Đại cương Đông dương (1942) với 5 loài Đó là

Nưa chuông (A campanulatus Bl = A paeoniifolius Nicolson), Nưa rex (A rex Prain = A paeoniifolius Nicolson), Nưa đứt đoạn (A interruptus Engl.), Nưa rivieri (A rivieri Dur = A konjac K Koch) và Nưa Bắc Bộ (A tonkinensis Engl.) [24]

Phạm Hoàng Hộ (1993) đã thống kê và mô tả 7 loài, từ năm 1994 -

2000, nhiều loài Nưa mới đã được một số nhà thực vật mô tả từ các mẫu thu

hệ thực vật Việt Nam, làm cho số loài của chi này lên tới 25 loài Trong đó, 4

loài Nưa phổ biến nhất là: Nưa chuông (A paeoniifolius), Nưa bắc bộ (A tonkinensis), Nưa đầu nhăn (A corrugatus) và Nưa vân nam (A yunnanensis)

[4], [5], [6]

Gần đây nguồn glucomannan từ củ của một số loài Nưa ở nước ta đã được biết tới Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đang tiến hành nghiên cứu theo hướng này, theo báo cáo khoa học về sinh thái và tài nguyên sinh vật tại hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4 đã công bố 3 loài Nưa có triển vọng trong công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam là: Nưa đầu nhăn

(A corrugatus), Nưa vân nam (A yunnanensis) và Nưa krausei (A krausei)

[7] Hiện nay các loài này đang được tiếp tục nghiên cứu Đối với Nưa krausei, các thông tin về thành phần hóa học, đặc tính sinh trưởng và phát triển, trồng trọt, nhân giống và chế biến chưa được tài liệu trong nước nào đề cập

1.2 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh giống cây trồng

1.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật

- Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào

thực vật Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng (totipotency),

nghĩa là mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể và

có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

9

Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng từ đầu

rễ của một cây hoà thảo trong 12 ngày Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào được chứng minh bằng thực nghiệm Từ đó đến nay, rất nhiều công trình nghiên cứu đã tạo được cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối

mô hay một phần của cơ quan Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật [17], [19]

- Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào

Biệt hoá (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó

Các tế bào dùng trong môi trường nuôi cấy đều đã biệt hoá về cấu trúc

và chức năng Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản phân hoá

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa

Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản phân hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau Những tế bào càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó xảy ra quá trình phản phân hoá và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh ở động vật Người ta đã chứng minh rằng: các tế bào

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào phân chia Tế bào chuyên

hóa Phản phân hóa tế

bào

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào, người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật chính là auxin và cytokinin Tỷ lệ hàm lượng của hai nhóm chất kích thích sinh trưởng này của mô nuôi cấy khác nhau tuỳ từng mục đích nghiên cứu (phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo) [8]

1.2.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch

sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng còn hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trưởng hầu như chưa được khám phá Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công [18]

Đến nay đã có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng đã được xây dựng

và thử nghiệm có kết quả Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm các thành

11

phần chính sau:

- Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô

tế bào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng là: nhóm đa lượng và nhóm vi lượng

+ Các nguyên tố khoáng đa lượng

Là các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng nên thành tế bào Môi trường nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi Môi trường nhiều kali giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh

+ Các nguyên tố vi lượng

Nguyên tố vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ dưới 30ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp Hàm lượng các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và các đối tượng nuôi cấy [9]

- Nguồn cacbon

Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp cacbon Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Trong phần lớn các môi trường nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu là saccharose và glucose Ở một số mô thì có thể dùng mantose, fructose và galactose

12

- Vitamin

Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) vẫn có

khả năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng Vì vậy, phải bổ sung thêm các vitamin cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các co-enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào Các vitamin thường đươc sử dụng như: B1(Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Panthotenic), B5 (Nicotinic acid) với nồng độ phổ biến là 0,5 - 1mg/l Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào thực vật [9]

- Các chất kích thích sinh trưởng

Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết

quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi

cấy Nó ảnh hưởng đến sự phân hóa, phản phân hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hóa các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì

vậy, để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành nghiên cứu

cụ thể để tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3 nhóm chất kích thích sinh trưởng là auxin, cytokinin và gibberelin

+ Auxin

Auxin (Aux) là hormone thực vật được phát hiện đầu tiên Qua nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học, người ta nhận ra rằng Aux là hormone thực vật quan trọng đối với toàn bộ giới thực vật Aux dạng tự nhiên gồm có β-Indolacetic Acid (IAA), Phenylacetic Acid, β- Indolyacetonitril Acid Ngoài

ra có các dạng Aux được tổng hợp bằng con đường nhân tạo, đáp ứng nhu cầu của con người trong lĩnh vực trồng trọt và nghiên cứu như: β-Indolbutiric Acid (IBA), α-Naphtylacetic Acid (α-NAA), 2,4 Diclorophenoxiacetic Acid (2,4D)…[ 12], [16]

13

Aux là nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Aux kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng kết hợp với cytokinin Sự áp dụng loại và nồng độ Aux trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng và phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng Aux nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa Aux ngoại sinh và Aux nội sinh [12], [16]

Aux kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to dẫn đến tăng kích thước của các cơ quan như tăng diện tích lá, phình to của quả, củ, tăng đường kính và chiều dài của cành, thân, rễ, tạo quả không hạt, kìm hãm sự rụng lá, hoa quả [11]

Aux điều khiển tính hướng của cây như hướng sáng, hướng đất Do sự phân bố không đều của Aux ở hai phía của cơ quan, dẫn đến sự sinh trưởng không đều của tế bào trong một cơ quan, gây ra tính hướng [11], [12], [16]

Ở cấp độ tế bào, Aux còn ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất, các quá trình sinh lý của cây trồng như: quang hợp, hô hấp, trao đổi nước hay khoáng, tăng khả năng thẩm thấu của tế bào, tăng quá trình trao đổi acid nucleic, protein…[11]

Quan trọng nhất là Aux kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất định trên cành chiết, cành giâm và trên mô nuôi cấy Vì vậy, trong kỹ thuật nhân giống vô tính, việc sử dụng Aux để kích thích ra rễ là cực kỳ quan trọng

và bắt buộc [12], [16]

+ Cytokinin

Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp là kinetin, BAP Kinetin là một dẫn xuất của bazo nito adenine được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất

14

nucleic acid BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phôi sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào Ngoài ra, các chất này có tác dụng lên qua trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và tăng cường hoạt tính của nhiều loại enzyme Cơ chế tác động của cytokinin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA Tác động phối hợp giữa auxin và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog (1963) cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao phù hợp cho sự hình thành rễ và thấp thì thích hợp cho sự phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo Miller và Skoog (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong phân bào và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được hình thành bởi rễ và hạt đang phát triển [11]

+ Gibberellin

Gibberellin là nhóm hormone thực vật thứ hai được phát hiện sau auxin bởi nhà nghiên cứu người Nhật Kurosawa (1920) từ việc nghiên cứu bệnh của

cây mạ do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra, đây là chứng bệnh rất phổ biến

trong nghề trồng lúa ở các nước phương Đông thời bấy giờ, khi nghiên cứu cơ chế gây bệnh ông đã tách được hàng loạt các chất là sản phẩm tự nhiên của

nấm G Fujikuroi cũng như từ thực vật bậc cao gọi là gibberellin A Hiện nay,

người ta đã phát hiện được trên 50 loại gibberellin và ký hiệu A1, A2, …,A52 hoặc GA1, GA2, …, GA5,…, trong đó GA3 (gibberellic acid) có hoạt tính mạnh nhất [12], [16]

Gibberellin (GA) được tổng hợp trong phôi và các cơ quan đang sinh trưởng khác như lá non, rễ non, quả non… GA được vận chuyển không phân

GA ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng các đột biến lùn Các nghiên cứu

về trao đổi chất di truyền của GA khẳng định rằng các đột biến lùn của một số thực vật như ngô, đậu Hà lan (chiều cao của cây chỉ bằng 20% chiều cao của cây bình thường) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu những gen chịu trác nhiệm tổng hợp các enzyme của một số phản ứng trên con đường tổng hợp GA mà cây không thể hình thành được GA dù là một lượng rất nhỏ Với những đột biến này thì việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho cây sinh trưởng bình thường [12], [16]

- Các chất phụ gia hữu cơ

Các chất phụ gia hữu cơ được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, dịch chiết khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men Trong thành phần của nước dừa chứa các acid amin, acid hữu cơ, đường, Myo-inositol và các chất có hoạt tính auxin, các gluoxit của cytokinin Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được

sử dụng do trong thành phần của chúng có chứa một số loại vitamin và các chất kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cây nuôi cấy

- Chất giá thể (thạch - Agar)

Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường nuôi cấy, hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng

16

Khi nồng độ agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dưỡng cũng như sự hấp thụ của mô gặp khó khăn Đa số nuôi cấy phôi được thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào từng loại cây mà

sử dụng cho phù hợp Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng, việc sử dụng agar được tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion

Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết Tuy nhiên, các chất nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất

là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60oC trong 24 giờ [17]

Giá trị pH môi trường

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy, đối với từng môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu Nuôi cấy mô sẹo (callus) của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá trị từ 6,0 - 6,5 Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5 - 6,5

Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,0 - 6,0 Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar đồng thời hoạt hóa các enzyme hydrolase, dẫn tới kìm hãm sự sinh trưởng, kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy [9]

1.2.2.2 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt tới sự phân chia tế bào

và quá trình trao đổi chất trong các mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hưởng đến hoạt động của auxin do đó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây nuôi cấy mô Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định trong khoảng 25 - 270

C

17

Ánh sáng: có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô

nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng

Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy nhiều loại mô Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ [9],[17]

1.3.3 Những tồn tại của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và phương hướng giải quyết

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có

thể sai khác với cây mẹ ban đầu di hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được những đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Một nghiên

cứu cho thấy khi nhân giống dứa in vitro nếu cấy chuyển quá 5 lần sẽ xuất

hiện biến dị soma Tỷ lệ biến dị tăng dần khi cấy chuyển trên 5 lần và có thể

đạt 5% Các dạng biến dị của cây dứa nuôi cấy in vitro thường có biểu hiện

hình thái: bạch tạng, lá sọc, sinh trưởng kém, chậm ra quả [2], [8]

Để hạn chế sự xuất hiện các biến dị không mong muốn, người ta thường chọn con đường nhân nhanh qua phát triển chồi nách, nếu kích thước đoạn chồi đem nhân nhanh càng dài thì khả năng biến dị càng thấp và nhanh chóng cho chồi non Tránh cấy chuyển nhiều lần để hạn chế nguy cơ biến dị Trong trường hợp tái sinh cây nhất thiết phải thông qua mô sẹo nên sử dụng

mô sẹo ít ngày tuổi, mô sẹo càng ít ngày tuổi thì khả năng phân chia càng mạnh và nguy cơ biến dị càng thấp [18]

- Tạo các độc tố: Khi nuôi cấy ở một số loài cây thường thấy hiện

tượng mô hoá màu nâu hoặc đen thường gặp nhất ở cây thân gỗ Hiện tượng này là do mô già chứa nhiều tanin, hydroxyphenol các chất này phát tán ra môi trường và ức chế sinh trưởng, phát triển của mô Để hạn chế hiện tượng

18

hoá màu nâu, hoá màu đen, người ta thường bổ sung vào môi trường than hoạt tính, polyvinyl, pyrolidon hoặc ngâm mô trước khi cấy vào axit ascorbic, axit citric [2], [8], [18]

- Sự nhiễm khuẩn: Mặc dù trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy mẫu

thường được khử trùng bằng các loại hoá chất để loại bỏ và tiêu diệt các loại nấm, vi khuẩn nhưng khi nuôi cấy mẫu vẫn có thể bị một số loại nấm mốc,

vi khuẩn xâm nhập vào mô làm ảnh hưởng đến quá trình phân chia Để khắc phục hiện tượng nhiễm khuẩn chúng ta có thể sử dụng một số loại hoá chất kháng sinh để tiêu diệt vi sinh vật, tuy nhiên vẫn cần lưu ý về nồng độ kháng sinh để không ảnh hưởng đến mẫu [8]

19

Chương 2 VẬT LIỆU, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 270C và chế độ chiếu sáng 12h/24h với cường độ chiếu sáng 2000lux, pH môi trường nuôi cấy 5,8

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thực vật dân tộc - Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật; Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 05/2012 đến tháng 05/2013

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei

- Thu thập, nghiên cứu và kế thừa các tài liệu về phân loại và hình thái học

20

- Quan sát, ghi chép các đặc điểm của mẫu tươi và cây trồng tại trại thực nghiệm sinh học – Viện công nghệ sinh học

- So sánh với các tài liệu phân loại và hình thái học trước đây

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong điều kiện thí nghiệm

Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.3.2.1 Thu thập mẫu

- Mẫu hạt: Thu hoạch hạt Nưa giai đoạn bắt đầu chín, chọn hạt của cây

khỏe mạnh và sạch bệnh Rửa sạch hạt, phơi khô, gói kín bảo quản trong tủ mát để sử dụng dần

Hạt Nưa

Khử trùng hạt

Tạo cây con nuôi in vitro

Tạo cây hoàn chỉnh Tái sinh cây

Trồng cây in vitro trong bầu

21

2.3.2.2 Khử trùng mẫu, tạo cây con nuôi in vitro

Hạt Nưa có thể khử trùng bằng hai phương pháp: khử trùng bằng dung dịch javen 70% hoặc bằng dung dịch HgCl2 0,1% [3]

Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường MS Sau 40 ngày chồi

non phát sinh trong ống nghiệm, các chồi non này được sử dụng làm nguyên

liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.2.3 Tái sinh cây Nưa krausei thông qua mô sẹo

Thí nghiệm 1: Cảm ứng tạo mô sẹo từ mảnh lá, cuống lá, bẹ lá, củ và

22

Tỷ lệ tạo mô sẹo =

Số mẫu tạo mô sẹo

× 100%

Tổng số mẫu nuôi cấy + Màu sắc mô sẹo

+ Tính chất mô sẹo

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4D và BAP đến

khả năng hình thành mô sẹo của củ Nưa krausei

Mảnh củ Nưa krausei vô trùng kích thước 0,3cm × 0,3cm vô trùng được cấy vào môi trường AMORC (1-4), với thành phần môi trường là:

MS + 30 g/l đường saccharose + 8g/l agar + 2,4D + BAP

Nồng độ 2,4D và BAP thay đổi theo bảng sau:

Bảng 2.1 Nồng độ 2,4D và BAP trong công thức môi trường tạo mô sẹo

Sau 30 ngày nuôi cấy đánh giá khả năng tạo mô sẹo

Thí nghiệm 3: Tái sinh cây từ mô sẹo

Mô sẹo tạo ra được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây AMORR (1-4) gồm:

MS + 30g/l đường saccharose + 8g/l agar + NAA + BAP

Trong đó, nồng độ NAA và BAP thay đổi như bảng sau:

2.3.2.4 Tạo đa chồi

Nhân đa chồi là một bước quan trọng trong quá trình nhân nhanh giống cây trồng Mục đích của giai đoạn này là tạo ra cây giống sạch với số lượng lớn, chồi phát triển khoẻ mạnh tạo cơ sở cho việc tạo cây hoàn chỉnh để trồng

ra vườn ươm Trong nhân đa chồi, môi trường nuôi cấy thường được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin hoặc tổ hợp giữa auxin

và cytokinin [9] Tuy nhiên, mỗi loài thực vật lại thích hợp với một loại và nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau Trong thí nghiệm này tôi thử nghiệm với BAP ở các nồng độ khác nhau

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng

tạo đa chồi Nưa krausei

+ Hệ số nhân chồi =

Tổng số chồi

× 100%

Tổng số mẫu đem nhân

2.3.2.5 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra ngoài trồng tự nhiên Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bên ngoài Các chất kích thích sinh trưởng có tác dụng tạo đa chồi được loại bỏ và thay vào đó là chất kích thích sinh trưởng tạo rễ như NAA, IBA, IAA [1], [3]

Các chồi có kích thước 3 - 4 cm, tách riêng từng chồi, cấy chuyển sang môi trường tạo rễ: MS + 30g/l đường saccharose + 8g/l agar + NAA trong đó nồng độ NAA thay đổi như bảng 2.4

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ

Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây Nưa krausei