Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng tới khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc m151 bằng phương pháp lên men rắn

Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151 .... Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến khả năng sinh cellulose của

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

ĐINH THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI

TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA CHỦNG NẤM MỐC M151 BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

TS Phương Phú Công

Hà Nội, 2012

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phương Phú Công đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện để em thực hiện và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Đinh Thị Kim Nhung và các thầy cô trong tổ bộ môn Vi sinh vật học, cùng toàn thể thầy cô trong khoa Sinh - KTNN, Ban giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng em xin cảm ơn sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè trong suốt quá trình làm đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày…tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Đinh Thị Thu Hương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với kết quả của các tác giả khác

Hà Nội, ngày…tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Đinh Thị Thu Hương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

5 Điểm mới của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cellulose 4

1.2 Cơ chế phân giải cellulose 6

1.3 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 8

1.3.1 Nấm sợi 8

1.3.2 Vi khuẩn 8

1.3.3 Xạ khuẩn 9

1.4 Hệ thống cellulase 9

1.5 Ứng dụng của cellulase 10

1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật 14

1.6.1 Giống vi sinh vật 14

1.6.2 Nguồn dinh dưỡng 14

1.6.3 Điều kiện nuôi cấy 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Môi trường 17

2.1.3 Hóa chất – thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp vi sinh 19

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 20

2.2.2.1 Nuôi cấy chủng để thử hoạt tính 20

2.2.2.2 Xác định hoạt tính bằng phương pháp cấy chấm điểm 20

2.2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983) 20

2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính Cellulase 21 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose 22

3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng M151 24

3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên 24

3.2.2 Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả

năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151 26

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase 28

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 29

3.2.5 Ảnh hưởng của độ ẩm 30

3.2.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu

Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose (D-d) cm

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhau đến khả năng sinh

cellulose của chủng mốc M151

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm đến khả năng sinh

cellulase của chủng nẩm mốc M151

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh cellulase

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase

HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc lập thể của cellulose

Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose

Hình 3.1 Khả năng sinh cellulase của các chủng được nghiên cứu

Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng nấm mốc M151

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh

cellulase của chủng M151

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nguồn cellulose phối trộn đến khả năng sinh

cellulase của chủng M151

Hình 3.5 Khả năng sinh cellulase ở các tỷ lệ phối trộn cellulose tự nhiên

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase của chủng

M151

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của

chủng M151

Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh cellulase của chủng M151

Hình 3.9 Khả năng sinh cellulase của chủng M151 ở các mức độ ẩm

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase của chủng

M151

Hình 3.11 Khả năng sinh cellulase của chủng M151 trên các nguồn nitơ

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trên thế giới ngày nay, đặc biệt là ở những nước công nghiệp phát triển, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày càng trở nên mạnh mẽ Theo thống kê gần đây, hầu hết enzyme công nghiệp đều có nguồn gốc từ vi sinh vật Qui mô sản xuất, mức độ và hiệu quả ứng dụng tùy thuộc trình độ sản xuất công nghiệp ở mỗi nước Tuy nhiên, đa số các chế phẩm enzyme hiện hữu được ứng dụng nhiều nhất trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, y tế, nghiên cứu khoa học và bảo vệ môi trường Trong đó nghiên cứu sản xuất và ứng dụng cellulase đang được quan tâm một cách đặc biệt bởi cellulose là nguồn nguyên liệu dồi dào trên trái đất

Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Trong hiện tại và tương lai, người ta sử dụng

cellulase cho hai mục đích chính: Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế

thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc và công nghệ môi truờng; thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để

thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau

Đặc biệt trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức cao nhất Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào khẩu phần ăn của vật nuôi Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn giúp cho vật nuôi tiêu hóa được tốt hơn [14]

Từ lâu, con người cũng đã biết đến các chủng nấm mốc và ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp Tuy nhiên cũng chưa

có nhiều nghiên cứu tập trung vào các chủng nấm mốc phân giải cellulose,

nguyên nhân có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật ưu thế hơn so với nấm mốc về khả năng sinh celllulase Nhưng nếu xét về khả năng sử dụng nguồn cacbon, nguồn nitơ, khả năng chống chịu pH…thì nấm mốc tỏ ra ưu thế hơn so với các nhóm vi sinh vật khác [4] Hàng năm, hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường hàng trăm tấn phế thải, hiện đã và đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón thì đó là một nguồn lợi lớn Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc [1], theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên

men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger

sản phẩm dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò…và kết quả cho nhiều triển vọng [5]

Đề tài của tôi tập trung vào nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151, ứng dụng trong việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M151 tuyển chọn được

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose 3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh cellulase của chủng M151

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Ý nghĩa lí luận: nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm

sinh lí, sinh hóa chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose

Ý nghĩa thực tiễn: mong rằng các chủng được lựa chọn sẽ có triển vọng

ứng dụng trong việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc

5 Điểm mới của đề tài

Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc tuyển chọn được trên các tỷ lệ phối trộn phế phụ phẩm nông nghiệp (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) lần lượt là 4:3:3, 4:4:2, 6:2:2, 6:3:1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết mắt xích

β-D-glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong

đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật Tổng lượng của chúng chiếm tới 50% tổng số hydratcacbon trên trái đất

Về cấu trúc hóa học, cellulose là một polymer mạch thẳng do các gluco-pyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4glucozid Các đơn phân glucose trong cellulose có cấu hình dạng ghế, quay 1 góc 1800 so với phân tử trước nó Các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang [23]

D-Hình 1.1 Cấu trúc lập thể của cellulose

Về cấu trúc không gian, cellulose có cấu trúc dạng sợi song song dài khoảng 5µm với đường kính 3nm Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và liên kết Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đường kính 10-

40 nm gọi là vi sợi (microfibrin) Các sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen của cellulose, cellulose dạng mixen gồm có 2 vùng

Vùng kết tinh (crystalline): có cấu trúc trật tự cao gồm các sợi chặt chẽ, ngăn cản sự hấp thụ nước ít chịu tác động phân giải Vùng này chiếm 3/4 cấu trúc cellulose

Vùng vô định hình (amorphous regions): có cấu trúc kém chặt chẽ nên kém bền vững, do vùng có thể hấp thụ nước và trương lên

Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose

Cellulose tự nhiên không tan trong nước, axit, hay kiềm loãng và nhiều dung môi hữu cơ khác Chỉ có axit hay kiềm nóng mới có tác dụng phân giải cellulose Trong tự nhiên có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme thủy phân được cellulose như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc…

Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn Sinh khối thực vật cả Trái Đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn Khối lượng cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng rất nhỏ Dưới đây là bảng thông kê cho thấy hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu

Bảng 1.1 Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu

Nguyên liệu Cellulose Nguyên liệu Cellulose

Trong các phế liệu cellulose thường có mặt ở các dạng sau:

Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi ngô, cây ngô, cỏ …

Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn… Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…

Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…

1.2 Cơ chế phân giải cellulose

* Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải vào năm 1952

như sau:

C 1 C x Cellobiase

Theo tác giả này thì enzyme C1 tương ứng với exoglucanase, Cx tương ứng với endoglucanase Quá trình thủy phân cellulose tự nhiên được thực hiện dưới tác động của một phức hệ cellulase như sau

Enzyme C1 là một enzyme không đặc hiệu Dưới tác dụng của enzyme này các cellulose tự nhiên (rơm rạ, cỏ, bông…) bị trương lên và biến dạng thành chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn, chuẩn bị cho tác dụng của enzyme tiếp theo Để xác định hoạt tính của enzyme C1 người ta thường sử dụng các loại cellulose tự nhiên nhất là sợi bông thấm nước

Cellulose tự

nhiên

Cellulose hoạt động

Đường hòa tan

Glucose

Enzyme Cx thủy phân cellulose hoạt động thành các đường hòa tan

cellodextrin và cellobiose Để xác định hoạt tính của enzyme Cx người ta

thường sử dụng CMC hay HEC (hydroxyethyl cellulose) làm cơ chất

Cellobiase thủy phân cellobiose để tạo ra glucose

* Erichson và cs 1973 lại có quan điểm khác thể hiện trên một sơ đồ phức tạp

hơn nhiều về quá trình thủy phân cellulose

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973

Đầu tiên endoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt

cellulose, cắt đứt các liên kết β-1,4glucozid để tạo ra các đầu mạch tự do

Tiếp đó, dưới tác dụng của exoglucanase từ phía cực kín (phía không có tính

khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của

exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose Cuối cùng β-1,4-glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose thành glucose

1.3 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose

1.3.1 Nấm sợi

Theo Carle-Urioste và cs cơ chế cảm ứng của cellulose đến sinh tổng

hợp cellulase ở nấm sợi T.reesei dựa trên sự có mặt một lượng nhỏ cellulase

sẵn có trong nấm

Các kết quả của Hrmova và cs cho thấy rằng các disaccarit trong tự nhiên cấu tạo bởi glucose và xylose, có vai trò quan trọng trong điều hòa sinh

tổng hợp cellulase của nấm sợi Aspergillus niger Chất cảm ứng tốt nhất là

beta-D-glucopyranosyl D-Xylose (Glcbeta 1-2Xyl), Sophorose và beta-D- glucopyranosyl D-Xylose (Xylbeta 1-2Xyl) hoặc các đồng phân của chúng cũng là những chất cảm ứng tốt Loewenberg và cs khi nghiên cứu

2-O-cellulase của nấm sợi Trichoderma cũng có kết luận rằng: chỉ một lượng nhỏ

sophorose cũng gây lên sự tổng hợp cellulase Bổ sung nhiều lần với một lượng nhỏ sophorose sẽ tốt hơn là một lần với lượng lớn

Các chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose thường thuộc các

chi: Aspergillus, Alternaria, Chaetomium, Coprinus, Myrothecium,

Penicillium, Rhizopus, Trichoderma…

1.3.2 Vi khuẩn

Vi khuẩn cũng có khả năng phân giải cellulose nhưng không mạnh bằng nấm sợi do lượng enzyme tiết ra môi trường ít hơn và thành phần enzyme cũng không đầy đủ Khác với các loại cellulase từ nấm mốc, phần lớn các cellulase từ vi khuẩn đều là các enzyme gắn kết với tế bào sinh chúng chứ không phải là enzyme ngoại bào Quá trình phân giải của các enzyme này sẽ làm bào mòn bề mặt cả sợi cellulose

Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thường thuộc các

chi sau: Angiococus, Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Cellvibrio,

Cellulomonas,…

1.3.3 Xạ khuẩn

Các chi xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh như:

Streptosporagium,…

1.4 Hệ thống cellulase

Hệ thống enzyme thủy phân cellulose gồm có 3 loại enzym chủ yếu: endoglucanase(1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase,EC.3.2.1.4), exoglucanase

(1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91), β-glucosidase (EC.3.2.1.21)

Endoglucanase EC.3.2.1.4: hay là glucannohydrolase hoặc Carboxymethylcellulase (viết tắt là CMCase) Đôi khi người ta có thể gọi enzyme này bằng tên khác là endo-1,4-β-D-glucanase; β-1,4-glucanase; cellulase A,…Enzyme này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong mạch cellulose một cách tùy tiện và giải phóng cellulodextrin, cellobiose, ngoài ra còn cắt đứt các liên kết β-D-glucan của các loại ngũ cốc CMCase phân giải mạnh mẽ các cellulose hòa tan nhất là dạng

1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4-cellulose vô định hình nhưng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh

Exoglucanase EC.3.2.1.91: hay là 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, (viết tắt là CBH) các tên khác như exo-cellobiohydrolase, exoglucanase, cellulase Cl, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase Enzyme này xúc tác tách liên tiếp các phân tử cellobiose từ đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose Ngày nay nó được coi là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi

nó có khả năng phân cắt cellulose ở cả vùng kết tinh Hoạt tính enzyme này rất mạnh khi tác động lên vùng vô định hình Bởi vậy, khi kết hợp endoglucanase với exoglucanase hoạt tính phân giải cellulose tăng rõ rệt

β-glucosidase EC.3.2.1.21: Tên thường gọi là β-D-glucosidase, tên hệ thống là β-D-glucosid glucohydrolase Đây là loại enzyme đặc hiệu, có khả năng thủy phân cellobiose hay các cellooligosacarit hòa tan trong nước giải

phóng glucose Enzyme này có hoạt tính cực đại trên cellobiose và có hoạt tính giảm dần theo chiều dài của chuỗi cellulodextrin [25]

1.5 Ứng dụng của cellulase

*Với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm cellulase thường dùng để

Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc

Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích ly dịch quả từ thịt nghiền, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn

Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển…[24]

Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa Các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia [16]

Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, khi sử dụng chế phẩm

A.niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase

cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao Trong quá trình trích ly dịch quả, cellulose và pectin cản trở

sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [12]

Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vở thành tế bào Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao

*Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng Ở công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [16]

*Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột Tuy nhiên, bổ sung một

số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5% [16]

*Trong công nghệ xử lý rác thái và sản xuất phân bón vi sinh

Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả

Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải Đặng Minh Hằng (1999) phân lập được 2 chủng nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh và đã tối ưu hóa được điều kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase, 192 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã được phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm mục, gỗ mục trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh chiếm 42% [11]

Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [17]

* Ứng dụng của cellulase trong chăn nuôi

Trong chăn nuôi, để nâng cao năng suất vật nuôi thì nâng cao hiệu suất

sử dụng các chất dinh dưỡng có trong thức ăn tới mức cao nhất được coi là giải pháp tốt nhất Để giải quyết vấn đề này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào khẩu phần thức ăn của vật nuôi Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn

Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng rẽ chế phẩm enzyme này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase, protease, xylanase tạo ra một dạng chế phẩm enzyme hỗn hợp (multienzym) Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ hấp thụ các nguồn thức ăn tốt hơn

Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6 – 14% Thí nghiệm trên lợn 1 – 3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8 – 40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn từ 10 – 18% [3]

Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò Quá trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò được gắn liền với hoạt động enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đây Vì vậy, bổ sung vào thức ăn những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hóa là điều rất cần thiết Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase… đều thu được kết quả tốt Kết quả tăng trọng cuả trâu bò có thể đạt tới 12 – 17%, có khi còn cao hơn [15], [16] Trên thế giới người ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme tiêu hóa từ đầu những năm 1990 Hiện nay, hàng năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme, chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức

ăn chăn nuôi như: GS.Nguyễn Lân Dũng, 1991 đã lên men xốp sắn với

Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho lợn, gà, bò…,

kết quả thấy có nhiều triển vọng [5] Chu Thị Thanh Bình và cs, 2002 đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm thức ăn gia súc…[1] Gần đây, đã có nghiên cứu về sự ảnh hưởng của enzyme thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease, cellulase, xylanase…) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa Kết quả cho thấy khi trong thức ăn có bổ sung chế phẩm phytase hoặc tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 13,3% và 32% Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm này thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 50%

Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ ràng làm tăng hiệu quả tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí Tuy nhiên, hiện

nay ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao nên việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề rất cần thiết

1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật

1.6.1 Giống vi sinh vật

Các vi sinh vật khác nhau thì có khả năng sinh enzyme khác nhau, ngay

cả những chủng cùng giống, cùng loài cũng có thể rất khác nhau về lượng enzyme do chúng sản sinh ra Vì vậy trong công tác nghiên cứu cần phải tiến hành tìm kiếm các chủng, giống có hoạt lực sinh enzyme cao bằng cách phân lập từ các điều kiện tự nhiên và lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối thích với các cơ chất cảm ứng cũng như cần nâng cao hoạt lực bằng cách đột biến [8]

1.6.2 Nguồn dinh dưỡng

Các yếu tố trong thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống và sự tạo thành enzyme của vi sinh vật Trong môi trường nuôi cấy

vi sinh vật cần phải đảm bảo có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỷ lệ các chất dinh dưỡng hợp lí, phù hợp với nhu cầu của từng vi sinh vật cụ thể

* Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzyme

Đối với nấm sợi A.fumigatus và các loại nấm mốc ưa nhiệt, nguồn

cacbon thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc Môi trường cám và bã

củ cải đường là môi trường thích hợp nhất đối với T.reesei [10]

Trichoderma lignorum và Tr.koningi nuôi trên môi trường có nguồn

cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme là cao nhất Kết quả cũng tương tự

như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi ngô, bã củ cải Đối với Stachybotrit atra nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng

hợp cellulase là tinh bột (1%) [13]

* Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu trúc cũng như các enzyme Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ Việc lựa chọn nguồn nitơ là rất cần

để đảm bảo được hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế

Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh

cellulase là muối nitrat Đối với các giống của bộ nấm bông(Hyphomycetales)

nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4 Nói chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp,

vì trong môi trường các muối này làm cho môi trường axit hóa Điều này không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme mà còn làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase

Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lí của từng chủng giống Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật, nhưng với cao ngô khả năng sinh tổng hợp C1- cellulase và Cx- cellulase cao hơn so với nấm men

Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành Cx – enzyme, còn cao ngô kích thích C1-enzyme và Cx-enzyme Tác dụng kích thích của hợp chất này là do sự có mặt của các axit amin, các nguyên tố khoáng và các nhân

tố sinh trưởng khác

Ngoài nitơ và cacbon thì các nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, Bo, Mo, Cu…) có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Các nguyên tố Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme ở nhiều chủng [13]