Đánh giá khả năng sáng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống lúa nhật bản

Những nghiên cứu chọn tạo các giống cây trồng mới để ứng dụng vào sản xuất là rất quan trọng và được nhiều quốc gia chú trọng đầu tư, phát triển.. Một trong các kỹ thuật được quan tâm ứn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH-KTNN

………

NGUYỄN THỊ HOA

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO

VÀ TÁI SINH CÂY Ở MỘT SỐ GIỐNG

LÚA NHẬT BẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền học

Người hướng dẫn:

TS LÊ XUÂN ĐẮC

HÀ NỘI - 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS

Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Như Toản đã có những đóng góp quý báu

trong quá trình tôi thực hiện đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những khiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và các bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Nguyễn Thị Hoa

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, những tư liệu được trích dẫn trong khóa luận này là trung thực

Kết quả nghiên cứu này không hề trùng lặp với bất kì công trình nghiên cứu nào được công bố trước đây

Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Người thực hiện

Nguyễn Thị Hoa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3

5 Ý nghĩa của đề tài 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về cây lúa 4

1.1.1 Nguồn gốc 4

1.1.2 Phân loại cây lúa 5

1.2 Các phương pháp chọn tạo giống lúa 6

1.2.1 Chọn tạo bằng phương pháp đột biến 6

1.2.2 Tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen 8

1.2.3 Tạo giống bằng phương pháp lai 11

1.2.4 Nhập nội giống thích nghi 12

1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 13

1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo (callus) 16

1.3.3 Hệ thống tái sinh trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 17

1.3.4 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật 19

1.4 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam 22

1.4.1 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới 22

1.4.2 Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam 24

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Tạo nguyên liệu vô trùng 26

2.2.2 Nuôi cấy tạo mô sẹo 26

2.2.3 Nhân mô sẹo 26

2.2.4 Tái sinh cây 27

2.2.5 Tạo cây hoàn chỉnh 27

2.2.6 Đưa cây ra trồng 27

2.3 Thu thập và xử lý số liệu 28

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Tạo nguyên liệu vô trùng 30

3.2 Tạo mô sẹo 31

3.2.1 Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo 31

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tạo mô sẹo 32

3.3 Nhân mô sẹo 34

3.4 Tái sinh cây 35

3.4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin tới khả năng tái sinh cây 35

3.4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tái sinh cây 37

3.5 Tạo cây hoàn chỉnh 38

3.6 Ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sống của cây 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

Kết luận 42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.2 Tỷ lệ mô sẹo trên môi trường 2,4D (2 mg/l) 31

Bảng 3.4 Đánh giá chất lượng mô sẹo trên môi trường nhân mô sẹo 34

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang Hình 3.1 Tạo giống mô sẹo NIP1 và NH3 trên môi trường 0,2mg/l

BAP

33 Hình 3.2 Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống trên các công thức môi

trường

33 Hình 3.3 Nhân mô sẹo giống NH2 trên môi trường có 0,5mg/l BAP 35

Hình 3.4 Tái sinh cây giống NIP1 (BAP 2mg/l và kinetin 0,3mg/l) 38

Hình 3.6 Cây lúa trồng trên giá thể nước sau 10 ngày 41

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

IAA Indol - 3- Axetic Axit

IBA 3 - Indol Butyric Axit

Kinetin 6 furfuryl-amino-purin

KTST Kích thích sinh trưởng

MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog

NAA α- Napthalen Axetic Axit

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Lúa là lương thực chính của các nước châu Á Nó đã đi vào văn hóa của nhiều dân tộc, do có khẩu vị và sở thích ăn loại cơm khác nhau Trong khi dân Đông và Đông Nam Á thích loại gạo hạt dài như Basmati, Jasmine thì các nước Đông Bắc Á lại thích loại gạo tròn Gạo tròn chỉ thích hợp trồng ở vùng ôn đới Những nước ăn gạo hạt tròn thường thuộc những nước phát triển và sản xuất không đủ, do đó họ sẵn sàng trả tiền cao để mua loại gạo này Điều này trong thời gian tới có thể sẽ thay đổi, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI gần đây đã chọn tạo được 2 giống lúa có dạng hạt gạo tròn nhiệt đới Japonica ở Philippines, đó là 2 giống NSIC Rc170 và IRRI 142 để gieo trồng trên diện rộng Các giống lúa này mang đầy kỳ vọng giúp nông dân Philippines đạt lợi nhuận cao hơn, và nhất là giúp người tiêu dùng có thể thưởng thức được gạo Nhật với giá rẻ, đồng thời cũng mở ra triển vọng mới đối với nông dân Việt Nam

Dù được mệnh danh là cường quốc xuất khẩu gạo lớn thứ hai thế giới, nhưng giá gạo xuất khẩu Việt Nam vẫn thường thấp hơn gạo cùng loại trên thị trường thế giới Một trong những nguyên nhân là chất lượng Hiện tại, do nhu cầu lúa gạo của thế giới tăng cao, nên nông dân bán gạo với giá cao hơn Tuy nhiên, giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam lại kém hẳn so với giá gạo của Thái Lan

Đầu tư cho giống lúa chất lượng cao đạt tiêu chuẩn xuất khẩu cũng được nhà nước đầu tư mạnh trong những năm qua, chất lượng gạo Việt Nam đã cải thiện nhiều so với trước Vào thời điểm năm 1990, gạo xuất khẩu của Việt Nam đa phần là loại gạo chất lượng thấp (35 đến 45% tấm) Hiện nay, tỷ lệ gạo 5 đến 10% tấm đã ở mức trên 50% Tuy nhiên tỷ lệ gạo chất lượng cao, gạo thơm cho những thị trường xuất khẩu cao cấp vẫn còn ít

Chương trình chọn tạo giống lúa Japonica (dạng lúa Nhật Bản) để thích nghi vùng nhiệt đới của IRRI bắt đầu năm 1991 với sự hợp tác của Hàn Quốc nhằm tạo ra giống lúa Japonica năng suất chất lượng cao Với điều kiện của nhiệt độ cao ở vùng nhiệt đới, hầu hết các giống lúa Japonica này đều bị lùn, bông nhỏ và trổ sớm vì chúng nhạy cảm với ngày ngắn cho năng suất rất thấp Các giống lúa Japonica đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất lượng Bên cạnh đó, các giống Japonica còn được sử dụng rộng rãi trong việc tăng tính chống chịu lạnh, kháng bệnh cháy lá, cháy bìa lá, khô vằn, dạng hình cây lúa, vàng (lão hóa) lá sớm, cải thiện hình dạng hạt gạo, độ dẻo, hóa hồ và các đặc tính khác

Những nghiên cứu chọn tạo các giống cây trồng mới để ứng dụng vào sản xuất là rất quan trọng và được nhiều quốc gia chú trọng đầu tư, phát triển Một trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn tạo giống lúa là sử dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nhân giống và phục tráng cây trồng, chọn tạo giống chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, chuyển gen có giá trị kinh tế vào cây trồng, kết hợp nuôi cấy mô và đột biến thực nghiệm…

Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống

lúa Nhật Bản”, nhằm phục vụ các nghiên cứu tiếp theo đối với các giống lúa

này

2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng hệ thống tạo mô sẹo, tái sinh cây trong ống nghiệm đối với một

số giống lúa Nhật Bản để phục vụ các nghiên cứu ứng dụng như đột biến mô

sẹo hay chuyển gen để chọn tạo giống lúa chất lượng cao

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định môi trường có khả năng tạo mô sẹo tốt nhất đối với các giống

nghiên cứu

- Xác định môi trường tối ưu để tái sinh chồi của mô sẹo

- Xác định môi trường ra rễ của cây tái sinh tốt nhất

- Xác định loại giá thể ra cây phù hợp nhất

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Trại thực nghiệm sinh học, Viện Công Nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: tháng 5/2011 - 4/2012

5 Ý nghĩa của đề tài

* Ý nghĩa của khoa học:

Đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nuôi cấy trong ống nghiệm đối với một số giống lúa Nhật Bản

* Ý nghĩa của thực tiễn sản xuất:

Các kết quả nghiên cứu của đề tài này có thể phục vụ các nghiên cứu ứng dụng như đột biến mô sẹo hay chuyển gen trên các giống lúa này để chọn tạo

giống lúa chất lượng cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc

Cây lúa trồng Oryza sativa L (2n= 24) là loại thân thảo sống hàng năm

Thời gian sinh trưởng của các giống dài ngắn khác nhau và nằm trong khoảng

60 - 250 ngày Về nguồn gốc cây lúa có nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra nhiều ý kiến khác nhau

+ Theo Candalle (1886) cây lúa có nguồn gốc từ Ấn Độ

+ Theo Roselevicz (1931) cây lúa có nguồn gốc từ Đông Nam Á, đặc biệt Ấn

Độ và Đông Dương

Tuy có nhiều ý kiến khác nhau về nguồn gốc cây lúa nhưng cho đến nay các nhà khoa học đã thống nhất là cât lúa có nguồn gốc ở Đông Nam Á và Nam Trung Hoa

Việc xác định nguồn gốc cây lúa ở Đông Nam Á dựa vào các cơ sở sau đây:

+ Đây là vùng trồng lúa có diện tích tập trung và lớn trên thế giới

+ Tổ tiên của các loài loài lúa trồng hiện nay là lúa dại vẫn còn tìm thấy ở nhiều nước trong khu vực này

+ Theo các tài liệu lịch sử, các di tích lịch sử khảo cổ học đã cho thấy cây lúa được trồng ở khu vực này từ rất sớm khoảng 4000 - 5000 năm trước

1.1.2 Phân loại cây lúa

Theo hệ thống phân loại học thực vật thì cây lúa trồng có vị trí phân loại như sau:

- Giới (Re grum): Plante - Thực vật

- Ngành (Divisio): Angios permes - Thực vật có hoa

- Lớp (Classic): Mono cotyledones - Một lá mầm

- Bộ (Ordines): Poales (Graminasles) - Hòa thảo có hoa

- Họ (Familia): Pcacoe (Graminac) - Hòa thảo

- Họ phụ (Pryzoideae): Hòa thảo ưa nước

- Chi (Genus): Oryza - Lúa

- Loài (Species): Oryza Sativa - Lúa trồng

Việc phân loại Oryza Sativa L có nhiều quan điểm khác nhau:

- Theo Kato (1931) chia Oryza Sativa L thành hai loại là:

+ Oryza Sativa Sub Sp Japonica Kato (loài phụ Nhật Bản)

+ Oryza Sativa Sub Sp Indica Kato (loài phụ Ấn Độ)

- Loài Oryza Sativa L được chia làm 3 loài phụ:

+ Loài phụ Indica được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Việt

Nam, Ấn Độ, Mianma, Philippin…) Loài phụ Indica có đặc điểm hạt dài,

thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ ánh sáng

+ Javanica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung Quốc, Nhật Bản,

Triều Tiên…), có những đặc điểm như chịu rét cao, nhưng ít chịu sâu bệnh

+ Japonica là loại hình trung gian giữa Indica và Javanica nhưng gần với Indica hơn Javanica có đặc điểm hạt dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ

được trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia (Mai Thọ Trung,1990; Khush, 1997) [10] [14]

Ngoài ra còn một số cách phân loại khác tùy theo tiêu chí đặt ra như:

- Dựa vào hình thái hạt lúa: lúa hạt tròn; lúa hạt dài…

- Dựa vào thành phần dinh dưỡng: lúa nếp; lúa tẻ…

- Dựa vào thời gian sinh trưởng: lúa ngắn ngày; lúa dài ngày…

- Dựa vào mùa vụ gieo trồng có: lúa chiêm xuân; lúa mùa; lúa hè thu…

1.2 Các phương pháp chọn tạo giống lúa

1.2.1 Chọn tạo bằng phương pháp đột biến

Từ lâu, gây đột biến thực nghiệm để làm vật liệu khởi đầu cho chọn giống đã được coi là một trong những kỹ thuật ứng dụng cao trong nông nghiệp Phương pháp này được biết đến vào năm 1925 khi Natxon và Philippôp phát hiện rằng tia Roentgen có khả năng gây ra biến dị di truyền ở nấm Đến năm 1926 - 1928, với các nghiên cứu của Muller trên ruồi dấm, Stadler trên lúa mạch di truyền học phóng xạ đã trở thành nền tảng cho sự ra đời ngành chọn giống đột biến phóng xạ Năm 1946, Auerbach và Robson phát hiện vài hợp chất có thể gây đột biến, sau đó, ngày càng nhiều hóa chất được tìm thấy có khả năng làm tăng tần số đột biến Nhưng đến nay, phương pháp sử dụng hóa chất gây đột biến bị hạn chế vì độc hại và có nguy cơ gây ung thư cao

Ở Việt Nam, lĩnh vực này đã được Giáo sư Lương Đình Của khởi xướng

từ những năm 1960 Nhưng mãi đến năm 1980, hướng nghiên cứu này mới được phát triển một cách tương đối có hệ thống và định hướng do Phan Phải

và cộng sự tiến hành Sau đó, một loạt nghiên cứu của các tác giả như: Trần Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Trần Đình Long, Mai Quang Vinh, Đỗ Hữu Ất, Lâm Quang Dụ, Nguyễn Văn Bích, Nguyễn Quang Xu, Lê Văn Nhạ, trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như: lúa, ngô, đậu, lạc, táo, cà chua, hoa

cúc đã tạo ra nhiều dòng đột biến có giá trị, được chọn lọc và phát triển trực tiếp thành các giống quốc gia hoặc các dòng có triển vọng phục vụ cho công tác lai tạo giống mới

Việc chọn lọc dòng/giống nào để xử lý đột biến phụ thuộc vào tính trạng cần cải tiến Các bức xạ bức xạ ion hoá mật độ cao chủ yếu gây ra những biến đổi nhiễm sắc thể (sắp xếp lại, mất đoạn ), trong khi bức xạ ion hoá mật độ thưa (tia X, tia gamma) và bức xạ không ion hóa (tia tử ngoại) gây ra nhiều đột biến điểm hơn Các tác nhân hoá học đa dạng hơn nhiều về chủng loại so với tác nhân lý học Các tác nhân như ethyl methane sulphonate (EMS) và các hợp chất siêu đột biến nitrozo urê (nitrozoethyl urê) gây ra tần số đột biến cao

ở nhiều loại cây trồng

Thời gian chiếu phụ thuộc vào công suất của nguồn và liều lượng cần xử

lý Công suất nhỏ thì thời gian xử lý dài và ngược lại

Độ ẩm của hạt có ý nghĩa quyết định đối với tác động đột biến của tia bức xạ vì nó ảnh hưởng trực tiếp tới trạng thái sinh lý của hạt Phơi khô cũng như tăng thủy phần của hạt đều làm tăng tác động của tia bức xạ Ngoài ra, nhiệt độ và ôxy của hạt và của không khí cũng ảnh hưởng tới kết quả xử lý Với tia bức xạ, có thể xử lý nhanh (từ vài phút đến vài giờ) hoặc xử lý lâu dài trong trường gamma (từ nhiều tuần trở lên với cường độ thấp), nhưng

cũng có thể xử lý gián đoạn bằng cách ngắt quãng một khoảng thời gian nhất định

b Xử lý bằng hoá chất

Xử lý các chất hoá học thường diễn ra trong dung dịch

Vì tác nhân đột biến hoá học rất độc và có thể gây ung thư nên phải thực hiện các biện pháp bảo hộ nghiêm ngặt

Hạt (cây con, các bộ phân sinh dưỡng) được ngâm hoặc nhúng vào dung dịch trong một thời gian nhất định

Thông thường để đạt hiệu quả cao và có thể lặp lại kết quả, xử lý tác nhân hoá học được tiến hành theo nhiều bước: Làm trương hạt trong nước, xử

lý, rửa sạch, phơi khô hạt

Khi xử lý tác nhân hoá học, tác động của tác nhân đột biến cũng bị ảnh hưởng bởi trạng thái sinh lý của các bộ phận xử lý

1.2.2 Tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen đã và đang trở thành nhân tố quan trọng trong chương trình chọn tạo giống cây trồng Có thể chia nguyên lý chuyển gen làm hai cách: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp

a, Chuyển gen trực tiếp

- Chuyển gen bằng xung điện:

Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh Khi đặt tế bào trần (protoplast) trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời

hổng trên màng tế bào được hình thành tùy thuộc vào điện trường, làm cho ADN bên ngoài môi trường được truyền qua lỗ hổng vào tế bào Một số tế bào thực vật có thể tiếp thu ADN nhờ xung điện mà không cần xử lí trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì Zang và cs (1988) đã đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần sử dụng phương pháp xung điện Sau một năm Shimamoto và cs (1989) đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở giống lúa Japonica sử dụng phương pháp xung điện

- Chuyển gen bằng vi tiêm (Microinjection):

Người ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ ADN vào những tế bào nhất định, có thể là một tế bào nguyên vẹn Phương pháp này có ưu điểm là ADN đưa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được Phương pháp này cần có thiết bị có độ chính xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải chính xác

- Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (Pollen tube):

Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nảy mầm hình thành ống phấn Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào Phương pháp này khá thành công, đặc biệt trên cây lúa và cây bông

- Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombaroment biolistics):

Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và

cs (1991) và kỹ thuật này được cải tiển bởi Cao và cs (1992); Zi và cs (1993) Ngay lập tức, kỹ thuật được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển

được áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều giống Japonica (Christai và cs, 1988; Datta và cs, 1999) Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen

Đây là kỹ thuật tương đối hiện đại và có hiệu quả khi sử dụng thiết bị (súng bắn gen) tạo được áp lực sẽ đẩy viên đạn được làm bằng kim loại trơ (vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích thước vào khoảng 1μm, với vận tốc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ

Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phương pháp dùng súng bắn gen không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao Ở một vài trường hợp, tần suất chuyển gen bằng phương pháp này ngang với cây hai lá mầm

b, Chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen gián tiếp nhờ virus:

Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng được coi như một vectơ Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau:

+ Bộ gen có cấu trúc ADN

+ Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại

+ Phổ kí chủ rộng

+ Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào

Có hai loại vius đảm nhận được vai trò chuyển gen là: Cauliflow mosaic

virus (caMV) và Genini virus

- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium

1.2.3 Tạo giống bằng phương pháp lai

Lai giống là phương pháp cơ bản và đem lại hiệu quả cao, chủ động nên được sử dụng rộng rãi để tạo ra giống mới

Sử dụng phương pháp lai nhằm kết hợp kiểu gen giữa bố và mẹ làm xuất hiện những tổ hợp gen mới từ đó quyết định những tính trạng và những đặc điểm tốt của các giống cây trồng

Có các kiểu lai sau:

- Lai cùng loài (lai gần): là phép lai giữa các cá thể khác nhau thuộc cùng 1 loài (Bộ Nông Nghiệp & phát triển Nông Thôn, 2005) [4]

- Lai khác loài (lai xa): là hình thức lai giữa các dạng bố, mẹ thuộc hai loài khác nhau hoặc thuộc các chi, họ khác nhau nhằm tạo ra các biến dị mới có giá trị Tuy nhiên, phương pháp này gặp một số khó khăn nhất định nên ít được sử dụng

- Phương pháp tạo ưu thế lai:

+ Lai khác dòng đơn: tạo ra 2 dòng đơn tự thụ phấn qua 5 - 7 thế hệ, sau đó cho giao phấn với nhau

+ Lai khác dòng kép: cần có nhiều dạng khởi đầu tham gia để tạo ra một giống lai mới

Trong chọn tạo giống lúa hầu hết các nước đều sử dụng phương pháp lai phức tạp nhiều bậc

Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI (tại Manina, Philippines) dùng phương pháp lai các giống ngoại với giống địa phương có kết hợp đột biến theo phương pháp lai phức tạp Vì vậy đã tạo ra được những giống lúa tốt, nhiều giống lúa tốt được trồng ở Việt Nam như IR5, IR8, IR64…

- Lai thuận nghịch: tiến hành lai cả thuận và nghịch giữa các dòng tự thụ phấn

để thăm dò, tìm ra tổ hợp lai có giá trị kinh tế nhất

- Lai khác thứ tạo giống cây trồng mới: là phương pháp lai giữa hai hay nhiều thứ có nguồn gen khác nhau để tạo ra giống mới, thông thường đều có biểu hiện ưu thế lai

1.2.4 Nhập nội giống thích nghi

Việc nhập nội các vật liệu khởi đầu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chọn giống Nhập nội theo nghĩa rộng là đưa vật liệu (có thể là giống, dạng loài hoang dại họ hàng với cây trồng) vào môi trường mới mà trước đây chưa được gieo trồng Theo nghĩa hẹp, nhập nội là di chuyển vật liệu từ nước này sang nước khác Nếu vật liệu nhập nội thích hợp tốt với môi trường mới thì sau khi khảo nghiệm có thể được công nhận là giống đưa vào sản xuất mà không cần thay đổi gọi là nhập nội sơ cấp (sử dụng trực tiếp) Ngược lại, nếu vật liệu nhập nội mà không thích ứng mà phải qua chọn lọc hoặc sử dụng lai

để chuyển hay kết hợp gen có ích gọi là nhập nội thứ cấp (sử dụng gián tiếp) Những đặc tính quý của thực vật như tính chín sớm, tính chịu rét, chịu

thành trong những điều kiện nhất định Các giống địa phương mặc dù có nhiều đặc tính quý, thích nghi với điều kiện địa phương nhưng vẫn không thể nào thỏa mãn được yêu cầu ngày càng cao và đa dạng đối với giống cây trồng của nền nông nghiệp hiện đại Chính vì vậy, việc nhập nội giống cây trồng là một yêu cầu không thể thiếu đối với công tác chọn giống

Bằng phương pháp nhập nội trong nhiều thập kỷ qua Việt Nam đã đưa vào sản xuất nhiều giống cây trồng mới như: lúa IR8, IR22, CR203, IR64, IR17494, IR50404, Khang dân 18, nhiều giống lúa lai có nguồn gốc Trung Quốc

Mục đích của nhập nội giống cây trồng trong chọn tạo giống:

- Sử dụng những giống ưu việt đang được gieo trồng trên thế giới

- Nhập cây trồng mới và tiến hành chương trình chọn giống cây trồng đó

- Thu thập nguồn gen để sử dụng trong việc cải tiến cây trồng

1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn năng của

tế bào Có thể thấy sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác Đến nay đã có hàng trăm loài cây được nuôi cấy mô thành công với nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi

mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã được tạo ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) (Lê Trần Bình và cs, 1997; Đỗ Năng Vịnh, 2005) [1] [11]

1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật, khi gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant tissue culture) là kĩ thuật đưa một

mô, bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thể kiểm soát về: thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận sinh trưởng đó phát triển theo mục đích của người nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1998; Nguyễn Đức Thành, 2000)[12][8]

Mục đích chung của nuôi cấy mô - tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào,

mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu hướng về những ứng dụng thực tiễn như:

- Tạo được quần thể lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện tích nhỏ,

có điều kiện hóa lý có thể kiểm soát được

- Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được

- Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng

- Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học

Trong mấy thập kỷ qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh, mô sẹo… con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên và tạo ra hàng loạt

cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất ở quy mô lớn Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào đã duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng qúy hiếm hoặc loại bỏ được nhiều mầm bệnh (phục tráng giống) (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2007) [6]

Mặt khác sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp protoplast (tế bào trần) đã thực hiện được việc chuyển các gen mong muốn vào cây trồng… Bên cạnh đó sự ổn định và độc lập, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài

tự nhiên

Ngoài ra, nuôi cấy mô - tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…

Nuôi cấy mô - tế bào bao gồm:

- Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

- Nuôi cấy mô phân sinh

- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

- Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

- Nuôi cấy mô sẹo

Các bước nhân giống bằng nuôi cấy mô (microproparation):

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc chồi đỉnh chồi bên

- Tạo thể nhân giống in- vitro

- Nhân giống in vitro

- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

- Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Mô sẹo là khối mô thực vật gồm những tế bào chưa phân hoá, có khả năng

phân chia liên tục và có tính biến động di truyền cao Trong nuôi cấy in vitro,

mô sẹo được tạo ra bằng cách nuôi cấy các cơ quan của thực vật (lá, hoa, quả, thân ) trong môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kỳ, song việc cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng tái sinh cây và làm tăng tính biến động di truyền của mô Những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho quá trình chọn giống Nhiều tác giả đã thu được những giống cây trồng mới bằng con đường nuôi cấy mô sẹo (Lê Xuân Đắc, 2008; Jain, 1998; Rahman & cv, 1998; Đinh Thị Phòng, 2001) [3] [18] [17] [13]

Nguyên liệu để tạo mô sẹo là các phần non của cây hoặc hạt, được đưa vào môi trường nuôi cấy Trong qúa trình nuôi cấy tạo mô sẹo, mẫu thường phải để trong tối Tạo mô sẹo có thể coi là quá trình phản biệt hóa, đưa những mẫu đã biệt hóa trở về trạng thái ban đầu của phôi

- Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, chất tế bào loãng và không bào

Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường hợp:

- Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện được

- Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhân các chất có hoạt tính sinh học

- Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến thực nghiệm, chọn dòng tế bào

có khả năng chống chịu cao

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

1.3.3 Hệ thống tái sinh trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Việc biểu hiện tính toàn năng (totipotency) hay tái sinh cây nguyên vẹn

từ những tế bào soma là một trong những vấn đề chính của nuôi cấy mô Quá trình tái sinh là quá trình làm cho một tế bào trở thành cơ thể mới hoàn chỉnh Quá trình tái sinh được chia làm hai giai đoạn: Phản biệt hóa và tái biệt hóa

- Phản biệt hóa là giai đoạn đưa tế bào từ trạng thái đã biệt hóa trở lại trạng thái chưa biệt hóa Các tế bào đã biệt hóa là những tế bào có chức năng nhất

định và có cấu trúc phù hợp để hoàn thành chức năng ấy Quá trình phản biệt hóa biến tế bào đã biệt hóa thành những tế bào có hình thức giống như những tế bào ở đỉnh sinh trưởng, chúng có đặc điểm: tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ hoặc không có, nhân to, có kích thước lớn Những tế bào như vậy coi như đã được phản biệt hóa xong và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới

- Tái biệt hóa là giai đoạn tế bào đã phản biệt hóa phát triển than cây hoàn chỉnh và chỉ có các tế bào phôi mới có thể hình thành cơ thể mới (Halperin, 1964)

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào đã biệt hóa tham gia phân chia hình thành nên tế bào phôi và hai loại tế bào khác là tế bào trung gian và tế bào khổng lồ có không bào rất lớn Tế bào phôi có kích thước bé nhất khoảng 5μm, còn tế bào khổng lồ có kích thước từ 65 - 200 μm và rỗng, tế bào chất của chúng chỉ là những đường viền mỏng bọc theo bên trong thành tế bào Tế bào trung gian có kích thước lớn hơn tế bào phôi và nhỏ hơn tế bào khổng lồ Chỉ có tế bào phôi và tế bào trung gian là phân chia, các tế bào khổng lồ thì chết dần Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh chỉ có ở tế bào phôi, nhưng nếu trong quần thể không có các tế bào khổng lồ thì các tế bào phôi không thể phát sinh thành cơ thể mới được Chỉ những quần thể nuôi cấy có đủ các loại

tế bào khác nhau mới có khả năng tái sinh

Bên cạnh các loại tế bào, cách sắp xếp của của từng loại tế bào trong mô cũng rất quan trọng Các tế bào có khả năng tái sinh tốt nhất khi các tế bào phôi nằm đơn độc và rải rác giữa các tế bào khổng lồ