Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và trình tự gen trnh psba của loài sao mặt quỷ (hopea mollissima c y wu, 1957) ở việt nam

Ở Việt Nam, các loài cây họ Dầu hiện chỉ còn gặp trong các khu bảo tồn đã được quy hoạch vì trong những năm qua, do chiến tranh tàn phá, khai thác quá mức mà diện tích rừng nói chung và

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) đã tạo nên một họ thực vật độc đáo và nổi tiếng của vùng nhiệt đới Hiện nay, gỗ các loài cây họ Dầu đang chiếm phần lớn trên thị trường gỗ thế giới nên rõ ràng chúng đang đóng một vai trò quan trọng đối với nhiều nước, nhất là các nước châu Á đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á Ngoài việc cung cấp gỗ, các loài cây họ Dầu còn đem lại nhiều loại sản phẩm có giá trị khác phục vụ đời sống con người như tinh dầu thơm, nhựa mủ, mỡ bơ, camphor, tannin …

Các chi lớn nhất trong họ Dầu là Shorea (khoảng 250 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatical (65 loài) [11] Ở Việt Nam, họ Dầu

có 6 chi (Anisoptera, Hopea, Parashorea, Vatica, Dipterocarpus, Shorea),

hầu hết là loài bản địa và đặc hữu Do giá trị thương mại và nhu cầu của người dân địa phương, các loài cây họ Dầu bị khai thác quá mức [4] Ở Việt Nam, các loài cây họ Dầu hiện chỉ còn gặp trong các khu bảo tồn đã được quy hoạch vì trong những năm qua, do chiến tranh tàn phá, khai thác quá mức mà diện tích rừng nói chung và rừng hỗn giao cây họ Dầu nói riêng đã bị suy giảm nghiêm trọng Theo viện Điều tra quy hoạch rừng (1995), ở thời điểm năm 1959, diện tích các loài rừng có cây họ Dầu ở Đông Nam Bộ chiếm 49% diện tích toàn vùng, đến năm 1968 giảm xuống 36%, năm 1982 giảm còn 18% và năm 1992 chỉ còn 8% [10] Xét ở quy mô quốc gia, tài nguyên cây họ Dầu nói chung và tài nguyên di truyền cuả từng loài cây họ Dầu nói riêng đã

bị suy kiệt mạnh Hiện tại, trong số hơn 40 loài thuộc họ Dầu có ở Việt Nam thì 33 loài đang bị đe doạ ở mức độ toàn cầu

Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) là loài phân bố hẹp, chỉ

có ở Việt Nam và Trung Quốc, do gỗ chắc bền, có nhiều giá trị sử dụng nên

gỗ Sao mặt quỷ bị khai thác quá mức, hiện đang đứng trước nguy cơ bị đe doạ tuyệt chủng cao, theo sách đỏ Việt Nam 2007, Táu Mặt Quỷ được xếp ở cấp

độ sẽ nguy cấp Vu A1c, d [2]

Để bổ sung thông tin về di truyền cho cở sở dữ liệu các loài thực vật quý hiếm của Việt Nam và góp phần nâng cao chất lượng của công tác bảo tồn loài, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái và

giải mã trình tự gen trnH-psbA của loài Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima

C.Y.Wu, 1957) thu tại Khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang

ết quả của đề tài sẽ góp phần bổ sung vào tài liệu về phân loại thực vật

ở Việt Nam, cung cấp thông tin về đặc điểm sinh học và trình tự gen

trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam, phân biệt với Sao hòn gai (Hopea chinensis Hand- azz) c ng như trong công

tác nghiên cứu các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam

3.2 n ti n:

Ứng dụng vào sản xuất lâm nghiệp, sinh thái và tài nguyên sinh vật

4 Đ ểm mới c đề tài:

Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về trình tự gen trnH-psbA của loài

Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam c ng như trên

thế giới

Đã ôn bố 1 bài báo khoa học tại: “Hội nghị sinh viên nghiên cứu

khoa học các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ VI”

Bố cục c a khóa luận gồm: 29 trang, 15 ảnh, 4 bảng được chia thành

các phần chính như sau: ở đầu (3 trang), chương 1 (Tổng quan tài liệu: 3 trang), chương 2 (Đối tượng, phạm vi, thời gian và phương pháp nghiên cứu:

8 trang), chương 3 ( ết quả nghiên cứu: 14 trang), kết luận và kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (21 tài liệu), phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về en (Vùn đệm) trnH-psbA

Vùng đệm trnH-psbA nằm trong hệ gen lục lạp Vùng này có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài

đã được nghiên cứu) ức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0.00% - 0.08% [14] Trình tự trnH-psbA c ng đã được công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật Hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản (liverwort)

Hình 1.1 Cấu trúc của hệ gen lục lạp và vị trí của gen trnH-psbA trên hệ

gen lục lạp [21]

1.2 Lƣợc sử nghiên cứu

1.2.1 Trên thế giới

Loài Sao mặt quỷ được tác giả người Trung Quốc Wu Cheng Yi công

bố (dựa vào mẫu vật thu được của P.Y ao thu ngày 7 tháng 4 năm 1954, trên núi Pingbian ở độ cao 800m, thuộc tỉnh Vân Nam, Trung Quốc) năm

1957 [20] với tên khoa học là Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957 và xếp trong

họ Dầu (Dipterocarpaceae) Sau này, có một số công trình nghiên cứu đề cập

đến đặc điểm sinh học của họ Dầu nói chung và chi Hopea, như: Ashton

(1982) [12]; Li Hsiwen-editor (1990) [15] cung cấp các thông tin về đặc điểm

hình thái, phân bố, sinh học và sinh thái loài Hopea mollissima C Y Wu,

1957 ở Trung Quốc (sau này Xi-wen Li, Jie Li & Peter S Ashton (2007) [19]

c ng đề cập đến trong công trình Thực vật chí Trung Quốc được dịch ra tiếng

Anh); Ashton, P (1998) [13] c ng đã đề cập đến loài Hopea mollissima C Y

Wu, 1957 trong danh lục đỏ thế giới,…

1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các công trình đề cập đến chi Hopea và loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) chủ yếu là các công trình phân loại hay giá

trị tài nguyên, như: Nguyễn Tiến Bân (1997) [1] giới thiệu họ Dầu

(Dipterocarpaceae) và chi Hopea; Phạm Hoàng Hộ (1999) [8] cung cấp các thông tin để nhận biết loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở

Việt Nam; Nguyễn im Đào (2003) [6] đã chỉnh lý về danh pháp, cung cấp các thông tin về phân bố, sinh thái và giá trị tài nguyên loài Sao mặt quỷ

(Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam; Nguyễn Tiến Bân & nnk

(2007) [2] cung cấp các thông tin về hình thái, phân loại và đánh giá hiện trạng bảo tồn loài này trong Sách đỏ Việt Nam,…

Như vậy có thể thấy rằng, công trình “Nghiên cứu một số đặ đ ểm

sinh học và n en nH-psbA c a loài ặ ỷ (Hopea

mollissima C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam” là công trình đầu tiên ở Việt Nam

nghiên cứu trình tự gen trnH-psbA của loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima

C.Y.Wu, 1957) ở Việt Nam c ng như trên thế giới

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đố ượng nghiên cứu

Mẫu lá và vỏ cây loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957)

được thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam

2.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 7 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012

2.4 P ƣơn p áp n ên ứu

2.4.1 P ƣơn p áp phân loại bằng hình thái học

Chúng tôi sử dụng mẫu tiêu bản thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe

Rỗ, tỉnh Bắc Giang kết hợp với các mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng tiêu bản thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (HN) Các mẫu tiêu bản

sử dụng trong nghiên cứu gồm các mẫu có số hiệu: 1171,3179, 5454 - phòng tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Các mẫu lá, cành, cuống, hoa được quan sát và soi dưới kính hiển vi điện tử (với độ phóng đại 40X10, 4X10) tại phòng thực hành thực vật - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.4.2 P ƣơn p áp đọc trình t gen

Để xác định trình tự gen trnH-psbA, chúng tôi sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR theo nguyên lý của Sanger et al, 1977 [16], thực hiện trên máy đọc trình tự ABI 3100

2.4.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Tách chiết Thiết kế mồi

PCR

Giải trình tự

Hình 2.2 Sơ đồ các bước thí nghiệm

2.4.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN là đại phân tử có kích thước lớn, nằm trong nhân tế bào do đó muốn thu được ADN ta phải dùng cả tác nhân cơ học và tác nhân hóa học Phương pháp tách cơ bản gồm ba bước: Phá huỷ màng tế bào và màng nhân;

họ Dầu

Đọc kết quả trình tự gen Mẫu vỏ cây

Sao mặt quỷ

loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các prôtêin; thu ADN bằng tủa cồn

Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số được tách chiết theo CTAB của Xavier, 2000 [18] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam

Quy trình tách được thực hiện theo các bước sau:

- Nghiền 00mg mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ thành bột mịn, chuyển vào ống epp ml

- Bổ sung 00l đệm rửa (Tris-HCL 100mM, EDTA 5mM, Sodium metabisulfit 0,5, pH: 8.0, H2O…) vào ống epp ml, trộn đều tạo thành dịch đồng nhất Li tâm 000 v/p trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi

- Bổ sung 600l đệm tách chiết (NaCl 1,5M , Tris-HCl 100mM, EDTA 20mM, CTAB 3, PVP 2%), đảo nhẹ tạo thành hỗn hợp đồng nhất ủ trong 60 phút ở 65oC (đảo đều sau mỗi 10 phút)

- Sau khi để nguội khoảng 5 phút, để loại bỏ các thành phần khác không mong muốn như các poly-saccarit ta bổ sung thêm 00l chloroform: isoamylacohol (:), đảo đều tạo thành dịch Ly tâm 000 v/p trong 0 phút

- Làm khô ADN Hoà tan ADN trong 00l nước khử ion

- Loại bỏ ARN bằng 2µl Rnase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 1 giờ

- Mẫu ADN được bảo quản ở - 200C

- ADN tổng số sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose 1%

2.4.2.3 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose

Điện di ADN trên gel Agarose là phương pháp được sử dụng trong cả phân tích định tính và định lượng mẫu ADN ADN là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, nên trong môi trường có điện trường các phân tử ADN có kích thước khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau

Gel Agarose là loại gel thông dụng và phổ biến nhất, thao tác đơn giản, thường được sử dụng để phân tích những đoạn có kích thước khoảng 0,5-

0kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang [7]

Để gel khô, khi gel đã khô, rút lược ra

Dùng pipet hút 7µl mẫu Mẫu được mix đều với 1µl màu nhuộm điện

di (brommophenol blue + glycerol) (loading dye) trên giấy parafin trước khi đưa vào các giếng trên bản gel Việc cho màu nhuộm điện di vào giúp ta nhận biết mẫu và làm mẫu nặng hơn tránh bị nổi khi cho vào bể điện di

Đưa bản gel vào bể điện di và chạy trong khoảng 0 phút ở 100v, 30A Soi gel đưới đèn UV Các phân tử ADN bắt màu với EB trong gel agarose sẽ hiện sẽ hiện lên với các vạch màu đỏ cam dưới đèn UV

Nồng độ ADN được xác định dựa vào độ sáng của băng ADN so với độ sáng của băng ADN chuẩn Độ gọn của băng ADN sẽ cho biết độ nguyên vẹn của ADN đã tách chiết được

2.4.2.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR)

do ary ullis phát minh ra năm 1985 Phương pháp PCR dựa vào đặc tính của enzym ADN polymerase có khả năng xúc tác tổng hợp mạch ADN mới trên mạch khuôn, với sự có mặt của mồi (mồi xuôi và mồi ngược)

- Cách tiến hành:

Nhân bản vùng gen psbA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi psbA

trnH-+ Mồi xuôi trn-H:

5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC

+Mồi ngược psbA:

5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C

Chu trình phản ứng PCR được chạy trong tổng thể tích 50µl gồm 32µl H2O, 5

µl đệm, 5 µl dNTP, 3 µl mồi xuôi F (30 pM), 3 µl mồi ngược R (30 pM), 1 µl ADN tổng số, 1 µl enzyme Taq-polymerase

Chương trình chạy PCR được tiến hành theo chu kỳ nhiệt: 2 phút ở

960C, 30 chu kỳ (30 giây 960C, 25 giây 560C, 40 giây 72 0C) và sau đó là 1 chu kỳ ở 72 0C trong 5 phút

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agrarose 1% và tinh sạch bằng Qiaquick gel extranction kit (Qiagen, Đức)

Phản ứng PCR được thực hiện với chu kỳ nhiệt như sau:

2.4.2.5 Phương pháp đọc trình tự nucleotide

Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain - determination method) là một phương pháp xác định trình tự ADN được Frederick Sanger phát triển vào năm 1977 [16]

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy là dựa vào hoạt động của enzyme ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN Enzym ADN polymerase xúc tác quá trình gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp ở vị trí 3’có chứa nhóm-OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm -OH

ở vị trí 3’ thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng của phương pháp là sử dụng các loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN một cách ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng mồi tổng hợp là đoạn ADN mạch đơn có kích thước khoảng 20 nucleotit

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp với mồi psbA, sử dụng Bigdye terminator cycler và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer

2.4.3 P ƣơn p áp p ân số liệu

- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng

đã được các tác giả công bố trên ngân hàng gen (Genbank)

- Các trình tự ADN được so sánh, phân tích với các loài thuộc chi

Hopea và các loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Bảng 2.1) sử dụng các

phần mềm Clustalx.8.1.msw, phần mềm ega 5 được dùng để phân tích tiến hóa phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Parsimony (MP)

Bảng 2.1 Danh sách các trình tự sử dụng trong nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặ đ ểm loài Sao mặt quỷ ở Việt Nam

3.1.1 Đặ đ ểm hình thái

Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) là loài cây gỗ lớn

thường xanh , cao tới 40m, đường kính 40-80 hay hơn Gốc có bạnh khá lớn

Vỏ mầu nâu nhạt khi non, khi già nâu xẫm và bong thành các mảnh, để lại các vết sẹo hình tròn đồng tâm Cành non mảnh có lông dài hình sao Lá đơn hình trứng thuôn hay hình mác kích thước cỡ 13-18(-22) x 3,5-4,5(-8) cm (lá trung bình) hoặc dài 22 cm, rộng 8 cm (lá lớn); chóp nhọn, mép nguyên, gốc nhọn đến gần tròn; cả hai mặt lá đều có lông hình sao, mặt dưới rậm hơn, nhất là trên các gân (khi già lông ít dần); gân bên 8-14 đôi, nổi rõ ở mặt dưới; gân mạng nhiều và rõ Cuống lá dài 1 cm, có nhiều vết nứt ngang

Cụm hoa: Dạng cụm hoa chùy, mọc ở nách lá gần đỉnh cành hay cành

không mang lá Hoa nhỏ, thơm, hoa lưỡng tính, nhỏ, mẫu 5; đài hợp ở gốc, mặt ngoài có lông; cánh hoa rời, màu hồng; nhị 10; bộ nhụy gồm 3 lá noãn hợp thành bầu thượng, không có lông

Q ả: Quả hạch khô, hình cầu, đường kính 8-9 mm; đỉnh có 2 cánh phát

triển và 3 cánh nhỏ (do đài tạo thành); cánh quả phát triển có hình mác ngược,

cỡ 9-10 x 2,5-3,5 cm, có 10-14 đôi gân rõ

Tuy nhiên trong thực tế, việc nhận dạng ra loài cây này c ng gặp nhiều

khó khăn bởi Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) và Sao hòn gai (Hopea chinensis Hand - Mazz) là hai loài có rất nhiều đặc điểm giống nhau

Qua quá trình tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đã tìm ra được một số đặc điểm riêng biệt của Sao mặt quỷ Đây là những đặc điểm giúp chúng ta dễ dàng phân biệt được hai loài này trong tự nhiên và c ng là những thông tin quan trọng cho các nhà phân loại

Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung

Để giúp cho việc phân loại rõ ràng chúng tôi đưa ra bảng 3.1 chỉ ra những đặc điểm sai khác cơ bản và dễ nhận biết nhất giữa hai loài này

Bảng 3.1: Những đặc điểm sai khác cơ bản giữa

Sao mặt quỷ và Sao hòn gai

1

Thân (hình 3.1, 3.2)

- Vỏ già mầu nâu sẫm

- Vỏ bong tạo các sẹo trên thân hình tròn đồng tâm rất rõ

- Vỏ già mầu nâu nhạt

- Vỏ bong tạo các sẹo trên thân hình tròn không thật đồng tâm

2

Lá (quan sát dưới kính hiển vi)

Mặt trên (hình 3.3) Có lông hình sao Không có lông Mặt dưới

Hình 3.1 Thân cây và cuống lá Sao mặt quỷ

Hình 3.2 Thân cây và cuống lá Sao hòn gai (Ba Mùn-Quảng Ninh)