Phân tích mối quan hệ di truyền của sâm lào (panax SP ) và sâm ngọc linh (panax vietnamensis HA et grushv ) với một số loài khác nhau trong chi panax

với một số loài Sâm khác trong chi Panax ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS.. SSR Simple Sequence Repeat trình tự các đoạn lặp đơn giản Hì

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -

LƯU THỊ NHƯ

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA

SÂM LÀO (PANAX SP.) VÀ SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) VỚI MỘT SỐ LOÀI KHÁC TRONG CHI PANAX

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình làm khóa luận, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp

đỡ của TS Nguyễn Thị Phương Trang và TS Hà Minh Tâm Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng Hệ thống học phân tử

và Di truyền bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu tại viện

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi còn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức, cá nhân trong và ngoài trường Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn: Ban chủ nhiêm khoa Sinh – KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Lưu Thị Như

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực, khách quan của khóa luận, tôi xin cam đoan:

Khóa luận “Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác trong chi Panax ” là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới

sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Phương Trang và TS Hà Minh Tâm Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Lưu Thị Như

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABI Applied Biosystems ABI 3100 DNA Sequencer (máy đọc trình

tự) ADN Acid Deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

(Đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại) ARN Acid Ribonucleic

Bp Base pair (cặp bazơ)

CI Cloroform-Isoamyalcohol

cpDNA Chloroplast Acid Deoxyribonucleic (genome lục lạp)

cpSSR Chloroplast-Simple Sequence Repeat (trình tự lặp lại đơn giản

trong genome lục lạp)

dH20 Nước khử ion

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphtate (các nucleotide tự do)

Genbank Ngân hàng gen quốc tế

ISSR Internal sinple sequence repeat (vùng giữa các đoạn trình tự lặp

lại đơn giản) ITS Internal Transcribed Spacer

Kb Kilobase

MEGA Phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử

NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc tế

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

rDNA ADN ribosome

RE Restriction Enzyme (enzyme giới hạn)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism DNA

SSR Simple Sequence Repeat (trình tự các đoạn lặp đơn giản)

Hình 6 So sánh trình tự vùng ITS-rDNA của Sâm lào và

Sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax

20

Hình 7 Hình ảnh các đỉnh (peak) của sản phẩm PCR trên

máy đọc trình tự ABI 3100

21

Hình 8 So sánh trình tự vùng ITS-rADN của Sâm lào và

Sâm ngọc linh với một số loài khác trong chi Panax

22

Hình 9 Mối quan hệ di truyền của loài Sâm lào (Panax sp.)

và Panax vietnamensis với một số loài khác trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự vùng ITS-

rDNA bằng phương pháp Maximum Parsimony

27

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài:

Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv 1985) được tìm thấy

ở Việt Nam và hiện đang được coi là loài đặc hữu hẹp, chỉ phân bố ở miền trung Việt Nam (vĩ độ 14015) ở độ cao trên 1800m so với mặt biển [18] Sâm ngọc linh được xác định là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen [16]

Nhiều công trình nghiên cứu về Sâm ngọc linh đã được triển khai, đặc biệt từ năm 1985, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, chủ yếu với các nhà khoa học Ba Lan và Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh có 52 hợp chất Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố Khi so sánh với các nhóm sâm trồng có giá trị

trên thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P quinquefolius) và Tam thất (P notoginseng) thì thành phần saponin của Sâm ngọc linh rất giống

với 3 loài trên nhưng hàm lượng lại cao hơn rất nhiều Điều này càng khẳng định Sâm ngọc linh là một loài độc đáo về thành phần hóa học [17], là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng cao

Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường cây thuốc xuất hiện một loại sâm (đặc điểm hình thái gần giống Sâm ngọc linh) có nguồn gốc từ Lào, được làm giả Sâm ngọc linh Do mẫu vật chúng tôi thu được mới chỉ là mẫu lá và củ nên chưa đủ cơ sở hình thái để chứng minh mối quan hệ của chúng với Sâm ngọc linh, vì vậy, để phân tích mối quan hệ di truyền của loài sâm này với

Sâm ngọc linh của Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu “Phân tích mối quan hệ di truyền của Sâm lào (Panax sp.) và Sâm ngọc linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) với một số loài Sâm khác trong chi Panax”

Điểm mới của đề tài

đề tài của tôi nghiên cứu hoàn toàn mới chưa được công bố trong công trình khoa học nào, đề tài được đăng trong hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa

học các trường sư phạm toàn quốc lần thứ VI

Mục đích của đề tài

Đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền của cây sâm có nguồn gốc từ Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen ITS, từ đó đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng với một số loài sâm khác trên thế

giới

Nội dung nghiên cứu

- Tách ADN tổng số của mẫu Sâm, nhân bản vùng gen ITS- rDNA

- Giải trình tự gen ITS – rDNA

- Phân tích số liệu: so sánh, phân tích các trình tự DNA của các mẫu thu được và so với Panax vietnamsis ở Quảng Nam, và các loài

trong chi Panax

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học:

Góp phần bổ sung vốn kiến thức về đa dạng thực vật ở cấp độ phân tử,

chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo về loài Sâm lào

Ý nghĩa thực tiễn:

Đánh giá sự sai khác về mặt di truyền giữa cây sâm có nguồn gốc từ Lào và Sâm ngọc linh của Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi Sâm (Panax)

Chi Nhâm sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Toàn bộ chi Sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var) [23] Sự phân bố của chi Panax L trên thế giới

cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2

loài P quinquefolius và (P trifoliatus) Vùng Đông Bắc Á (gồm viễn đông Nga, đông bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật Bản) có 2 loài P ginseng và P japonica Trung tâm phân bố của chi Panax L có thể từ vùng Tây

Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam) Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn toàn tự nhiên Hai

loài trồng là P notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và P pseudoginseng (không tìm

thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc

là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó) Đây có thể coi là trung

tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P notoginseng; P quinquefolius và P trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài Sâm ngọc linh (Panax Vietnamensis) ở miền

trung của Việt Nam, tại 140

15’ vĩ độ Bắc Chính vì vậy Sâm ngọc linh được coi

là loài đặc hữu hẹp của miền trung Việt Nam [6]

Các loài Nhâm sâm nói chung có tính hàn, ưa khí hậu ôn hoà, mát mẻ,

sợ rét, sợ ánh nắng mặt trời mạnh chiếu trực tiếp, không ưa mưa nhiều và nhiệt độ cao, sợ gió nóng Nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng là 20 - 280

C

Candolle, 1830, Seemann 1868 mô tả Panax có cụm hoa tán, hoa nhỏ có năm

cánh, bộ nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2

- 5 hạt Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tuỳ theo số năm sinh trưởng [20] Khái niệm này được chấp nhận bởi các công trình nghiên cứu sau này (Wen và Zimmer, 1999; Choi và Wen, 2000) [34, 39].

Hình 1: Sâm Việt Nam - Panax vietnamensis

5cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều Cụm hoa dài 25cm, gấp 1.5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang tán đơn độc Tán hoa chính đường kính 2.5 - 4, có 50 -

120 hoa Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4mm Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có hai ô, hai vòi (chiếm 20%) Quả khi chín màu đỏ, thường có một chấm đen ở trên đỉnh quả Quả một hạt hình thận, quả 2 hạt hình cầu hơi dẹt dài 7 - 10 mm rộng 4 - 6 mm [12, 15] (Hình 2)

Sinh thái:

Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt

độ ban ngày từ 20 - 25oC, ban đêm 15 - 18o

C, Sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm

Hình 2: Sâm ngọc linh (Chụp tại vườn Sâm Đăc-Tô, Nam Trà My,

tỉnh Quảng Nam)

1.2.2 Phân bố tự nhiên của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis)

Cho đến nay, Sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên Trung phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có (và quan trọng nhất) là núi Ngọc Linh Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam)

Theo Hà Thị Dụng, cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm 1970 cũng là Sâm ngọc linh [13]

Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của nó thì Sâm ngọc linh đã

có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang) Cả 2 khối núi này đều có độ cao trên 1.500m Điểm phát hiện có Sâm ngọc linh mọc tự nhiên đều vào khoảng 1.800 - 2.200m [6, 24]

1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị và thành phần hoá học của cây Sâm ngọc linh

a Tầm quan trọng và giá trị

Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài

của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như Nhâm sâm

(Panax ginseng); Giả Nhâm sâm (P pseudoginseng); Tây Dương Sâm (P quiquefolius); Tam thất (P notogiseng) và Sâm ngọc linh (P vietnamensis Ha et

Grushv.) Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu vết thương [20, 24]

Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên

cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia 12 loài thuộc chi Panax thuộc

2 nhóm chính:

- Nhóm 1 gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: Nhâm sâm

(Panax ginseng), Sâm mỹ (P quinquefolius) và Tam thất (P notoginseng), có

bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển và chứa các Saponin

có khung thuộc nhóm dammaran

- Nhóm 2 gồm các loài mọc hoang như P japonicas, P zingiberensis, P stipuleanatus với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển theo hướng nằm ngang,

chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [17]

Tuy nhiên, hàm lượng Saponin của Sâm ngọc linh so với các loài

Panax trồng trọt thuộc nhóm 1 lại cao hơn rất nhiều

Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy Sâm ngọc linh

có 52 hợp chất Saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố Khi so sánh với nhóm sâm

trồng có giá tri trên thế giới như Nhâm sâm (Panax ginseng), Sâm mỹ (P quinquefolius) và Tam thất (P notoginseng) thì thành phần saponin của Sâm

ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều

[16, 17]

b Thành phần hóa học

Từ năm 1974 - 1990 Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu

Nhâm sâm việt nam, so sánh với Nhâm sâm Triều Tiên (Panax ginseng), Nhâm sâm nhật bản (Panax japonicus) và Nhâm sâm hoa kỳ (Panax quinquefollium) [17] Kết quả có thể tóm tắt như sau:

Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng Chi tiết hơn nữa trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane (7.58%),

trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ saponin của axit oleanolic Điều này trái với quy luật chung là thông thường các cây nhâm sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit oleanolic và lượng nhóm saponin damarane [17]

Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được 1 lượng lớn

majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai

chất này đã chiếm 4.34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol

saponin cao nhất có trong các loài chi Panax Ocotillol saponin đã trở thành 1

hợp chất cần chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học cho các

cây Panax vì nó có thể ảnh hưởng đến một số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn

làm cho Sâm Việt Nam khác với Nhâm sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta

chưa tìm thấy ocotillol trong Nhâm sâm triều tiên Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh Nhâm sâm việt nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so với Nhâm sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26% trong nhâm sâm triều tiên [10]

Ngoài những saponin nói trên, trong Nhâm sâm việt nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [15]

1.2.4 Hiện trạng của loài Sâm ngọc linh ở Việt Nam

Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có khoảng 5 loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là Tam thất (P.notogineng) và Nhâm sâm (P.ginseng) [1] Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là Sâm Vũ Diệp (P.bipinnatifidus Seem.), Tam thất hoang (P.stipuleanatus Tsai et Feng)

và đặc biệt Sâm ngọc linh (P.vietnamensis Ha et Grushv.) là loài đặc hữu hẹp

của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), Huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên 1500m Tuy nhiên hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên, do tình trạng khai thác kiệt quệ trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng

tự nhiên bị thu hẹp Hiện tại Sâm ngọc linh đã được đưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo sách đỏ Việt Nam (2007), Sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN A1a, c, d, B1 + 2b, c, e [3] Hiện nay Sâm ngọc linh chỉ còn tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng khoảng

10 hecta [18]

1.3 Phương pháp phân loại học phân tử.

Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất trong việc xác định mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự ADN, bởi vật liệu di truyền là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và chế biến ADN chiết từ lá và củ đều mang cùng thông tin di truyền ADN chiết thì ổn định và có thể giữ ở -200C trong thời gian dài (khoảng 3 - 5 năm),

do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích Chỉ sử dụng một lượng

ít mẫu cũng có hiệu quả, đây là một thuận lợi trong việc phân tích mẫu có giới hạn [2, 9,21]

1.4 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử

1.4.1 Thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử

Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hóa, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích ADN Các chỉ thị AFLP (đa hình độ dài các đoạn ADN khuếch đại), RFLP (đa hình các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các ADN Khuếch đại ngẫu nhiên), SSR (trình tự các đoạn lặp đơn giản), cpSSR (trình tự lặp đơn giản), gen mã hóa 18S - RNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng các đoạn ADN hoặc các trình tự đặc trưng cho loài [23, 19] Với số lượng bản sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR với các cặp mồi thích hợp

Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (GenBank, 2007) đã lưu

dữ trên 70 triệu trình tự ADN với gần 90 tỷ nucleotit Đây là nguồn dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1)

số liệu về trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2)

số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, trong nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa cha mẹ và con cái …; (3) kết quả ADN cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý,…; (4) kết quả nghiên cứu ADN không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra

Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang

là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tình trạng

di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hóa của nhiều loài động thực vật

và vi sinh vật Các kết quả nghiên cứu ở mức độ ADN đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và phát triển Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước tiếp cận Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN có tính thống nhất cao mới được thực hiện tại Viện sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật cho một số loài động vật quý hiếm, còn với thực vật thì hầu như chưa có Hơn nữa trong thực tế, có nhiều loài tồn tại và phân bố biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen rất lớn mà chưa được nghiên cứu

Một số cơ sở nghiên cứu như Viện công nghệ sinh học, Viện sinh thái và Tài nguyên sinh, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,…đã thực hiện một số nghiên cứu về đa dạng

di truyền thực vật, trên các đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa lan…) [13, 14, 23] cây rừng (họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh, Giổi…) [8, 22] nhưng các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể phục vụ cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hóa và tái tạo nguồn gen

Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng

di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt được nhiều kết quả có giá trị Nhóm nghiên cứu của Nông Văn Hải đã thực hiện trên gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và giám định ADN một số loài lan Hài, đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng [14] Hay nhóm tác giả của đặng Tất Thế (2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bó sát quý hiếm của Việt Nam [27] Nguyễn Thúy Hạnh (2006) [13] Hay nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen cây vạn tuế của Việt Nam làm cơ sở cho công tác di truyền [22]

Tuy nhiên, nghiên cứu các ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp phần vào việc phân loại mẫu thực vật đang còn ít

1.4.2 Các bước trong phương pháp phân loại hiện đại

1.4.2.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Retion) được Karry Mullis và cộng

sự mô tả lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần lượng mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10-3μg) Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chuẩn đoán bệnh, trong di truyền quần thể và phân tích pháp lý [29]

Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc nhân bản số lượng lớn các đoạn ADN, có thể sử dụng PCR để tách dòng đặc hiệu,

giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích gen từ các tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hóa ở mức độ phân tử Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hành chục triệu năm [30].

1.4.2.2 Đọc trình tự nucleotide

Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp Dideoxy hay còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain - determination method) là một phương pháp xác định trình tự ADN được Fredermination Sanger phát triển vào năm 1975 [39]

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyme ADN - polymerase trong quá trình tổng hợp ADN Enzim ADN - polymerase xúc tác quá trình gắn các nucleotit vào mạch đơn ADN đang tổng hợp ở vị trí 3’có chứa nhóm-OH tự do, khi gặp nucleotit không có nhóm -OH

ở vị trí 3’thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng của phương pháp là sử dụng các loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN một các ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng mồi tổng hợp là đoạn ADN mạch đơn có kích thước khoảng 20 nucleotit

1.4.2.3 Phân tích mối quan hệ di truyền

Mỗi quan hệ di truyền của các loài được thể hiện bằng cây phát sinh chủng loại, đây là sơ đồ mô tả mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, được xây dựng dựa trên sự giống và khác nhau các đặc điểm vật chất di truyền hay cơ thể Trong các nghiên cứu phân tử là sự giống và khác nhau về cấu trúc ADN giữa các loài Các taxon được nối với nhau trên cây thể hiện mối quan hệ di truyền Trên cây có rễ mỗi nút bên trong cây đại diện cho một loài tổ tiên chung Giả định nút gần nhất với rễ là loài khởi điểm, các nút còn lại được tỏa

ra từ nút này được gọi là con cháu Mỗi một nút được gọi là đơn vị phân loại, các nút trong cây được gọi là các đơn vị phân loại giả thiết Độ dài của cành cây mô phỏng thời gian tiến hóa Cây không rễ là cây không có điểm khởi