Nghiên cứu quy trình tẩy rửa và bảo quản màng BC tạo ra từ vi khuẩn acetobacter

Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp v

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, đối với các quốc gia trên thế giới công nghệ sinh học không còn là một ngành mới mẻ mà nó đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo trong sự phát triển khoa học kĩ thuật và công nghệ Là một bộ phận của công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang ngày càng phát triển mạnh mẽ

và ngày càng có những ứng dụng thiết thực vào cuộc sống Bằng việc ứng dụng các quá trình lên men vi sinh vật đã tạo ra chế phẩm Một trong các chủng vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ lên men vi sinh

là vi khuẩn Acetobacter

Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng

trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch,

màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn Acetobacter

xylinum – gọi là màng BC

Màng BC do vi khuẩn sản xuất ra có bản chất là cellulose cũng giống như cellulose của thực vật nhưng có một số tính chất ưu việt hơn như: độ dẻo dai, độ bền cơ học, khả năng polymer hóa cao… nên có rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm (sản xuất thạch dừa, màng để bảo quản thực phẩm…); y học (sản xuất màng trị bỏng…); mỹ phẩm (sản xuất màng làm mặt nạ…); bảo vệ môi trường (màng để bảo quản thực phẩm…); công nghiệp (sản xuất giấy chất lượng cao…)

Màng BC mới chỉ được quan tâm gần đây và mới bước đầu thu được kết quả Việc tẩy rửa và bảo quản màng như thế nào để có những đặc tính (pH, độ bền cơ học, độ dẻo dai, khả năng thấm hút, khả năng kháng khuẩn ) phù hợp với ứng dụng trị bỏng trên thỏ đang là hướng nghiên cứu được nhiều tác giả quan tâm

Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn, tìm ra được phương pháp tẩy rửa

màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum để đạt được những đặc tính cơ

bản và phương pháp bảo quản màng trong một thời gian nhất định không làm thay đổi tính chất có được của màng thử nghiệm ứng dụng trị bỏng trên thỏ, trên cơ sở kế thừa những kết quả của nhiều tác giả mà tôi quyết định

chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình tẩy rửa và bảo quản màng BC tạo ra từ

vi khuẩn Acetobacter”

2 Mục tiêu của đề tài

Lựa chọn phương pháp tẩy rửa màng từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

BHN2 thích hợp ứng dụng trị bỏng trên thỏ

Bước đầu khảo sát phương pháp bảo quản màng

3 Nội dung tiến hành

- Tạo màng BC từ chủng vi khuẩn Accetobacter xylinum BHN2

- Xử lý màng bằng 4 mô hình

- Khảo sát khả năng thấm hút nước, nghệ, thuốc kháng sinh của màng sau khi xử lý

- Bảo quản màng bằng túi hút chân không

4 Ý nghĩa của đề tài

Đề xuất ra quy trình tẩy rửa màng và bảo quản màng BC ứng dụng trị bỏng trên thỏ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Acetobacter Acetobacter xylinum

: k

-

: 1: v

H2O

Acetobacter aceti Acetobacter xylium Acetobacter meroxydan trên

Acetobacter ascendans Acetobacter ransens Acetobacter lovaniens cao

4 Peroxydans Acetobacter peroxydans

Acetobacter paradoxum

1.1.3 Vi khuẩn Acetobacter

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae,

phân bố rộng rãi trong tự nhiên Có thể phân lập được các giống vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, giấm, rượu, bia,

hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và

mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa đáng kể

* Đặc điểm hình thái của Acetobacter

Vi khuẩn Acetobacter bắt màu Gram âm (Gr - ) Thông thường

Acetobacter có dạng hình que, kích thước thay đổi tùy theo loài (0,3 - 0,6 ×

1 - 8 µm), có thể di động (có tiêm mao hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiêm mao), hiếu khí bắt buộc, chịu được độ acid cao, tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi, có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng Tùy điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi

trường nuôi cấy…), các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra hình thái khác

biệt (kéo dài hoặc phình to ra)

Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter có hình

dạng tròn, đều, đường kính trung bình khoảng 1 - 2 mm Trên môi trường

lỏng, vi khuẩn Acetobacter tập trung phát triển trên bề mặt môi trường, tạo

thành lớp màng mỏng, trong suốt, có độ dày khác nhau

Khả năng tạo váng thay đổi tùy theo loài:

Acetobacter xylinum tạo thành váng hemicellulose khá dày và chắc Acetobacter orleanse váng mỏng nhưng chắc

Acetobacter pasteurianum váng khô và nhăn nheo

Acetobacter suboxydans váng mỏng dễ tan dã

Acetobacter curvum sinh ra acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo

váng không chắc chắn [1]

* Đặc điểm sinh trưởng

Vi khuẩn phát triển trong phạm vi nhiệt độ 12 - 35ºC, pH = 3,0 - 6,5; hiếu khí tuyệt đối

Vi khuẩn Acetobacter có khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau

để sinh trưởng và phát triển Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng

hóa muối amôn, có khả năng phân giải pepton

Acetobacter đòi hỏi phải có một số vitamin nhất định như acid

pantothenic và các chất khoáng như K, Mg, Ca, Fe, S, P… ở dạng muối vô

cơ và hợp chất hữu cơ Do có bia, dịch thủy phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng tốt cho sự phát triển của vi khuẩn

Acetobacter Tính chất đặc trưng của của Acetobacter là oxy hóa rượu thành

acid acetic Ngoài khả năng lên men tạo acid acetic, một số loài Acetobacter

còn tổng hợp được vitamin B1, B2, oxy hóa propanol thành acid propionic, oxy hóa sorbit thành đường sorbose dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hóa glycerin thành dioxyaceton, oxy hóa glucose thành acid gluconic [18]

1.2 Vị trí và đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylium

1.2.1 Vị trí

Acetobacter xylinum là tên gọi chính thức theo hệ thống danh pháp

quốc tế 1990

Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Acetobacter

xylinum thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ

Pseudomonadales, lớp Schizommycetes Việc phân loại vi khuẩn còn nhiều

tranh cãi, có một số tác giả coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của

Acetobacter acetic [16]

1.2.2 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylium

* Đặc điểm hình thái

Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di

động hay không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi

Khuẩn lạc của Acetobacter xylinum có kích thước (đường kính khuẩn

lạc đạt 1 – 2 mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [17]

* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

+ Đặc điểm sinh lý:

Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350

C, pH = 4

- 6 Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu

Acetobacter xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ

sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [5]

+ Đặc điểm sinh hoá [1]

Năm 1950, Fasteur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer… Theo quan điểm này

Acetobacter xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,

bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng dưới đây:

Bảng 1.2 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Acetobacter

xylinum theo Frateur (1950)

3 Sinh trưởng trên

4

Chuyển hoá glycerol thành

6 Kiểm tra khả năng

7 Kiểm tra khả năng

tổng hợp cellulose Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam +

1.2.3 Sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylium

* Cấu trúc cellulose

Các kỹ thuật hiện đại đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của cellulose vi khuẩn Các kỹ thuật phổ Rama, phân tích phổ hồng ngoại phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (hình 1.1) [16]

Cellulose thực vật Bacterial cellulose

Hình 1.1: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn và độ của cellulose vi khuẩn gần bằng với độ chịu lực của nhôm Khi đem so sánh đường kính của cellulose vi khuẩn và cellulose nhân tạo cho thấy: kích thước của cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn kích thước của sợi tổng hợp hóa học có đường kính nhỏ

nhất BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết ß - 1,4 glucan [12]

Các sợi mới sinh ra của BC kết hợp lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril) có chiều dài khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên Các sợi sơ cấp kết hợp thành vi sợi (microfibril) Các sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng thành dải (ribbon)

Cấu trúc của BC phụ chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy Ở điều kiện nuôi cấy chính, vi khuẩn tổng hợp những màng celluose trên bề mặt nuôi cấy, tại danh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxi Các màng

BC được gọi là S - BC trên môi trường nuôi cấy tĩnh (S - BC: static BC) Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song như không có tổ chức, có vai trò chống đỡ cho

quần thể tế bào Acetobacter xylinum

* Tính chất của cellulose

Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối… lên tính chất của BC

Sản phẩm của của cellulose vi khuẩn có một số tính chất như sau:

- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao

- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể chỉnh độ xốp

- Do khả năng S - BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm vải không cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy

- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy

- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose

- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn ligin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Vì vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn nguyên liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai [14]

* Quá trình tổng hợp cellulose của màng bacteria cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylium

- Vi khuẩn Acetobacter xylinum khi nuôi cấy trên môi trường dịch

lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh tạo nên một lớp màng trên bề mặt dung dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi khuẩn

Acetobacter xylinum – gọi là màng BC

- Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [7]

- Các enzym tham gia quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn bao gồm:

Glc-1-P: glucose-1- phosphate GK: glucokinase

FBP: fructose-1,6-biphosphate phosphatase

G6PDH: glucose-6- phosphate dehydrogenase

- Quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau, được thực hiện bởi sự tham gia của một hệ các enzym [15]

Hình 1.2: Sơ đồ con đường tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter

xylinum Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzym glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6- phosphate Enzym phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua phản ứng isomer hóa Glucose-1-phosphate nhờ enzym UDP-glucose pyrophospholyase chuyển hóa thành UDP-glucose Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là

cellulosesynthase Enzym này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP

Một số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng sử dụng

đường fructose hiệu quả hơn Hệ thống enzym phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose-1-phosphate Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-bi-phosphate nhờ enzym fructose-1-phosphatekinase Enzym phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose [17]

Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết 1,4-glucan Trong

đó, các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van đec van Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi [14]

1.3 Ứng dụng của màng BC

1.3.1 Ứng dụng của màng BC trong một số lĩnh vực

Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh,

độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường,

bề dày của vi sợi dưới 100 nm, bị phân hủy sinh học có tính tương thích sinh học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng Màng BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực như:

Thực phẩm: BC được dùng làm món tráng miệng (thạch dừa, kem ít

calori, đồ ăn nhanh, kẹo), chất nhũ hóa trong nước ép trái cây và những thức uống khác, màng bao thực phẩm… [13]

Y học: điều trị tổn thương da trong ghép mô, cơ quan nội tạng, tác

nhân vận chuyển thuốc (qua đường miệng và da), da nhân tạo

Mỹ phẩm: kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất tăng

độ dày và bền cho nước làm bóng móng tay… [7]

Bảo vệ môi trường: làm chất hấp thu cho các vật liệu loại bỏ chất độc

hại (làm sạch nước thải), thu hồi dầu và khoáng sản

Công nghiệp: vật liệu làm quần áo và giày dép, màng dung chuyển

đổi âm thanh, làm các loại giấy đặc biệt như giấy dùng trong lưu trữ tài liệu, giấy có thời gian sử dụng lâu dài, trong vẽ, in, chất dính và chất xơ trên trang

vẽ như giấy làm phủ bề mặt láng trong công nghiệp in

1.3.2 Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng

Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày Ngoài tổn thương da, bỏng còn gây rối loạn nội tạng, để di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh [11]

Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Đối với vết thương nông, điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng làm giảm đau ngăn chặn các chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho quá trình tái tạo phục hồi Đối với trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử, tạo điều kiện tốt cho hình thành mô hạt và biểu mô hóa thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật Màng BC tổng hợp từ

Acetobacter xylinum có những đặc tính làm màng sinh học trị bỏng, màng

băng vết thương, điều trị tổn thương da Trong ghép mô, cơ quan nội tạng

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Acetobacter xylium BHN2

được cung cấp từ phòng thí nghiệm vi sinh - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2 Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (Nhật)

Cân (Precisa XT 320 M – Thụy Sĩ)

Máy li tâm Sorvall ( Mỹ)

Máy đo màu UV - vis (Nhật)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump

Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)

Tủ lạnh

Máy hút chân không Ammera R V100

Buồng cấy vô trùng, kính hiển vi quang học, hộp nồng, ống nghiệm, bình tam giác,lamen, đèn cồn… và một số dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

2.3 Hóa chất - môi trường

2.3.1 Hóa chất

- Nguồn Cacbon: Glucose, Acid acetic

- Nguồn Nitơ:, Pepton, (NH4)2SO4.

- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH

- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men

- Thuốc thử: dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol

- Thuốc nhuộm: tím gentian, Fucshin, Lugol

- Ngoài ra còn sử dụng : các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết quả

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp vi sinh

* Phương pháp đếm khuẩn lạc [3]

Phương pháp đến khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Đây là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào trong mẫu, độ nhậy cao, định lượng vi sinh vật ở nồng độ thấp, nhưng khả năng sai số lớn cần phải lặp lại nhiều lần trên một độ pha loãng

Lấy 1 ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 300C trong 5 ngày đếm

số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

N : Tổng số CFU trong 1 ml mẫu ban đầu

Ai: Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giảm CaCO3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10 - n

Vi : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập

10 - n : Là độ pha loãng của mẫu phân lập

* Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram [3]

Vai trò: Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều

loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iot

Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đem nhuộm tiêu

bản theo Phương pháp Gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus CH - 2 với độ phóng đại 1000 lần

* Bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng [3] [4]

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và xác định sơ bộ là vi khuẩn axetic cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 3 ngày

ở tủ ấm 28 - 30oC Sau đó giữ trong tủ lạnh 4oC cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần

* Phương pháp hoạt hóa giống

Giống trong ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem

sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hóa sử dụng môi trường tiêu chẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 8 phút Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghêng vào

và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ

* Phương pháp lên men tạo màng

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1210

C trong 8 phút để tránh phân rã đường Sau đó khử khuẩn ở đèn tím trong 15

phút Bổ sung vào môi trường 5% giống hoạt hóa

Nuôi ở điều kiện tĩnh trong 7 – 10 ngày

+ Đối với nước: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng ngâm vào nước trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng trong thời gian trên

+ Đối với nghệ: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng ngâm vào nước trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng trong thời gian trên

+ Đối với thuốc kháng sinh: sau khi sấy khô, cân màng chúng tôi đem màng ngâm vào dung dịch thuốc kháng sinh (thuốc kháng sinh hòa tan trong nước) trong (2h, 6h, 12h) rồi lại đem cân khối lượng của màng trong thời gian trên

* Khảo sát khả năng ngăn cản vi khuẩn của màng [9]

Khảo sát khả năng ngăn cản vi khuẩn của màng BC và so sánh với vải gạc vô trùng đang lưu hành trên thị trường Đặt các hộp lồng có chứa môi trường dinh dưỡng và được

nghiệm trong 24 giờ Đưa vào tủ ấm 370C và quan sát trong những ngày tiếp theo

2.4.3 Kiểm tra độ pH

Kiểm tra bằng cách so màu bằng giấy chỉ thị

Dùng giấy chỉ thị đặt một đầu lên màng sau khi xử lý, khi đó giấy chỉ thị sẽ hình thành màu Ta so màu của giấy chỉ thị với bảng màu để đọc độ

pH

2.4.4 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả [6] [10]

Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại

thí nghiệm

1

i i

Mô hình 1

+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần

+ Đun sôi với nước trong 30 phút

Mô hình 2

+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần

+ Đun sôi với nước trong 30 phút

+ Trung hòa với NaOH 0,1N ở nhiệt độ phòng trong 12h

+ Rửa lại bằng nước 3 lần

Mô hình 3

+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần

+ Đun sôi với NaOH 0,5% trong 30 phút

+ Rửa lại bằng nước 3 lần

Mô hình 4

+ Rửa màng BC bằng nước nhiều lần

+ Đun sôi với NaOH 0,5% trong 30 phút

+ Trung hòa với acid citrid 5% ngâm với NaOH 0,5N trong 12h

+ Ngâm với NaOH 0,5N trong 12h

+ Trung hòa với acid citrid 5%

2.4.6 Phương pháp bảo quản màng

Sử dụng máy hút chân không để bảo quản màng sau khi đã xử lý

Màng sau khi được xử lý chúng tôi đem sấy khô ở 400

và bảo quản màng bằng túi hút chân không bằng cách sử dụng máy hút chân không hút hết không khí bên trong túi đựng màng

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặc điểm của chủng Acetobacter xylinum BHN2

3.1.1 Hình thái và kích thước tế bào

Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần,

chúng tôi nhận thấy chủng Acetobacter xylinum BHN2 có dạng hình que, là

vi khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 1,5 - 2,5µm Tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn

Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram của Acetobacter xylinum BHN2

3.1.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa

Vi sinh vật khi phát triển trên môi trường đặc sẽ hình thành các khuẩn

lạc đặc trưng, khuẩn lạc của Acetobacter xylinum BHN2 có dạng tròn, trắng,

đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng và cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất Sau

4 ngày nuôi cấy, kích thước trung bình của khuẩn lạc 1 - 2 mm (hình 3.3)