Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc m4v có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi

Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V .... Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh cell

LỜI CẢM ƠN

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Phương Phú Công, người đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Vi sinh vật học và toàn thể các thầy cô khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đây Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Dung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, các kết quả thu được trong khoá luận là trung thực, chưa từng được công

bố trong bất kì công trình khoa học nào

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Dung

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm

nông nghiệp phổ biến 7 Bảng 3.1 Khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V trên các

nguồn cơ chất khác nhau 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông

nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh

cellulase 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase 33 Bảng 3.6 Hàm lượng đường tổng số của các mẫu cơ chất trước và

sau khi lên men 35 Bảng 3.7 Hàm lượng protein của các mẫu cơ chất trước và sau khi

lên men 37 Bảng 3.8 Kết quả phân tích hoạt tính cellulase từ các mẫu sau khi

lên men (UI/g) 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức hoá học của cellulose 4 Hình 1.2 Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase 8 Hình 3.1 Hoạt tính của chủng M4V trên nguồn cơ chất vỏ trấu, vỏ lạc

và lõi ngô 27 Hình 3.2 Hoạt tính của chủng M4V ở tỉ lệ phối trộn 4:4:2 và 4:3:3 29 Hình 3.3 Hoạt tính của chủng M4V ở thời gian lần lượt là 36 giờ và

48 giờ 31 Hình 3.4 Hoạt tính của chủng M4V ở 320C và 440C 32 Hình 3.5 Hoạt tính của chủng M4V ở nguồn nitơ pepton và NaNO3 33

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Cs : Cộng sự

CMC : Cacboxyl methyl cellulose CMC – ase : Cacboxylmethylcellulase

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 2

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung của đề tài 2

4 Ý nghĩa của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cellulose và sự phân bố cellulose trong thực vật 4

1.1.1 Cellulose 4

1.1.2 Sự phân bố cellulose trong thực vật 6

1.2 Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase 8

1.2.1 Hệ thống cellulase 8

1.2.2 Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase 8

1.3 Ứng dụng của cellulase 9

1.3.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm 9

1.3.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 10

1.3.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 10

1.3.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 11

1.3.5 Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 12

1.3.6 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 12

1.4 Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose 13

1.4.1 Vi khuẩn 13

1.4.2 Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces) 14

1.4.3 Nấm sợi 14

1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật 14

1.5.2 Nguồn dinh dưỡng 15

1.5.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 15

1.5.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 15

1.5.3 Điều kiện nuôi cấy 16

1.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 16

1.5.3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm 16

1.5.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật 18

2.1.1.Chủng vi sinh vật 18

2.1.2 Nguyên liệu 18

2.1.3 Hóa chất – thiết bị 18

2.1.4 Môi trường 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp vi sinh 20

2.2.1.1 Thu thập mẫu 20

2.2.1.2 Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản 20

2.2.1.3 Hoạt hoá vi sinh vật 20

2.2.2 Phương pháp hoá sinh 21

2.2.2.1 Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính 21

2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase 22

2.2.2.3 Phương pháp xác định protein tổng số 24

2.2.2.4 Phương pháp xác định lượng đường tổng số 25

2.2.3 Phương pháp xử lí số liệu 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 27

3.1 Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng M4V trên các phế phụ phẩm nông nghiệp 27

3.2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh

cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V 29

3.2.1 Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V 29

3.2.2 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V 31

3.2.2.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase 31

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase 32

3.2.2.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase 33

3.3 Nâng cao chất lượng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua sử dụng chủng nấm mốc M4V để ứng dụng trong chăn nuôi 35

3.3.1 Kiểm tra hàm lượng đường tổng số của môi trường trước và sau khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V 35

3.3.2 Kiểm tra hàm lượng protein của môi trường trước và sau khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V 37

3.3.3 Phân tích hoạt tính cellulase của các mẫu nghiên cứu 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong thời gian gần đây chăn nuôi đang gặp phải những khó khăn với

hàng loạt các vấn đề nổi lên như: nhiều dịch bệnh như cúm gia cầm tái phát

và giá thức ăn chăn nuôi cao,… Chính vì vậy, ngành chăn nuôi nước ta đang đứng trước một thách thức mới là làm thế nào để có một nền nông nghiệp bền vững và ổn định trong thời kì kinh tế hội nhập, phát triển nhanh, luôn đổi mới

và nhiều cạnh tranh này

Mặt khác, một nền nông nghiệp phát triển như ở Việt Nam thì vấn đề được đặt ra là đầu ra cho các phế phụ phẩm trong nông nghiệp sau thu hoạch như rơm rạ, vỏ trấu, vỏ lạc…Nguồn phế phụ phẩm trong nông nghiệp thải ra trong quá trình sản xuất và chế biến nông sản của nước ta ước tính khoảng trên 50 triệu tấn mỗi năm Lượng phế thải lớn này là những hợp chất hữu cơ giàu cacbon và các chất khoáng đa vi lượng Đây là nguồn nguyên liệu có giá trị cao cho sản xuất các dạng chế phẩm sinh học cũng như phân hữu cơ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp đặc biệt là trong lĩnh vực chăn nuôi Do vậy, cần phải có những phương pháp, những nghiên cứu khả thi và hiệu quả

để tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp dồi dào này [26]

Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose, chúng được tổng hợp chủ yếu nhờ vi sinh vật trong đó nấm mốc có

hoạt tính phân giải cellulose cao hơn cả như Aspegillus, Mucor,

Tricoderma…Cellulase là một phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng

dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Cellulase được sử dụng với 2 mục đích chính : Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải các phế thải của công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc và vào trong công nghệ môi trường ; Thủy phân cellulase tạo cơ chất lên men để thu sản

phẩm cuối cùng khác nhau Cellulase đã, đang và sẽ ngày càng được sử dụng nhiều hơn để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi [12]

Từ rất lâu trước, con người cũng đã biết đến sự tồn tại của các chủng nấm mốc và đã biết ứng dụng chúng vào nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp…Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong chăn nuôi như : Chu Thanh Bình và Cs (2012) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bãi thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách

sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho bò;

Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn và ứng dụng một số chủng vi sinh vật

có khả năng lên men xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi… và đã thu được kết quả cho nhiều triển vọng

Xuất phát từ những yều cầu cấp thiết như trên tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi”

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong việc

phân giải cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục

vụ chăn nuôi

3 Nội dung của đề tài

3.1 Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp

3.2 Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ sung vào thức ăn làm tăng năng suất vật nuôi

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa lý luận

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp 4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành nông nghiệp Việt Nam để phục vụ chăn nuôi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose và sự phân bố cellulose trong thực vật

1.1.1 Cellulose

Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1) Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011

tấn cellulose (trong gỗ,cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%) [27]

Hình 1.1 Công thức hoá học của cellulose

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Waals Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hoá chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose không liên kết chặt với nhau nên dễ bị tấn công [27]

Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo dài và định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Ao

và xếp xen kẽ với vùng vô định hình [27]

Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng khớp khoảng 1000 Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thuỷ phân Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa tính chất kết tinh càng cao Trong vùng vô định hình, các liên kết β – glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân

tử monomer sắp xếp tạo ra sự thay đổi 180o

cho toàn mạch Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thuỷ phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hoá trị (β – glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro[27]

Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1→4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm - OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm - OH của chúng Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hơn hay còn gọi đó là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose [27]

Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thuỷ phân Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hoá được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà hoạt động của hệ

thống tiêu hoá Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn [24]

1.1.2 Sự phân bố cellulose trong thực vật

Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn Sinh khối thực vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn Khối lượng cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng nhỏ Cùng với cellulose, hemicellulose và lignin phối hợp với nhau tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hoá học và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật Các hợp chất này thường đi cùng với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose (Bảng 1.1) [27]

Bảng 1.1 Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm

nông nghiệp phổ biến

Nguồn lignocellulose Cellulose

(%)

Hemicellulose (%)

Lignin (%)

Giấy thải từ bột giấy hoá học 60-70 10-20 5-10

1.2 Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase

 β – glucosidase hoặc β – glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [28]

1.2.2 Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase

 Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và α- D glucan một cách ngẫu nhiên Sản phẩm của quá trình

phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose

 Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi

cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose

 Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose

thành glucose [28]

1.3 Ứng dụng của cellulase

1.3.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm

Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của ngành trồng trọt và nông nghiệp Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hoá Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật [31]

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng

nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên Một số nước đã dùng cellulase để xử lí các loại rau quả cải bắp, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn

xử lí cả chè và các loại tảo biển,… [25]

Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase thành tế bào của hạt đại mạch bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase đã làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật

đem thuỷ phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao [25]

1.3.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hoá học, gỗ được xử lí với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hoá chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin [32]

Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy [12]

1.3.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm

Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền Các loại quả sau khi tách vỏ, bỏ hạt được dịch nhuyễn Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn thì việc bổ sung endoglucanase là rất quan trọng Enzyme này là

sẽ phá huỷ hoàn toàn màng tế bào Trong quá trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hoá bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase

đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia [15]

Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia [15]

Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được

áp dụng Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử

lí bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng trích li dịch quả Trong khâu bóc vỏ, cellulase gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng

thời cản trở cho việc bóc vỏ Khi sử dụng chế phẩm A niger có tên thương

mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao Trong quá trình trích li dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hoà tan trong tế bào ra ngoài tế bào Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích li cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [9]

1.3.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Trong giai đoạn đường hoá của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thuỷ phân tinh bột Tuy nhiên, bổ sung một

số enzyme phá huỷ thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5% [27]

1.3.5 Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vi sinh

Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lí rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả Enzyme này có khả năng thuỷ phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác [27]

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để chứ rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất

Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lí nguồn nước thải do các nhà máy giấy tạo ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [33]

1.3.6 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng ở thức ăn ở mức cao nhất Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi Các enzyme này cùng với các enzyme

có sẵn trong đường tiêu hoá sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn, giúp cho con vật tiêu hoá được tốt hơn [3]

Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho gia súc Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase,

bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ hấp thu tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau [3]

Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hoá của chúng chưa hoàn chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6÷14% Thí nghiệm trên lợn 1-3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8÷40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn từ 10÷18% [3]

Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu, bò Quá trình tiêu hoá thức ăn trong dạ cỏ của trâu, bò được gắn liền với hoạt động của enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đấy Vì vậy bổ sung vào thức ăn những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hoá là điều rất cần thiết Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase,… đều thu được kết quả tốt, kết quả tăng trọng của trâu, bò có thể đạt đến 12÷17% và thậm chí còn có thể cao hơn Trên thế giới, người ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme tiêu hoá từ đầu những năm 1990 Hiện nay, hàng năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme, chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất [14], [15]

Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ ràng làm tăng tỉ lệ tiêu hoá cho vật nuôi và giảm chi phí Tuy nhiên, hiện nay

ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải được nhập khẩu với giá thành cao nên nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề vô cùng cần thiết

1.4 Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose

1.4.1 Vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens var cellulose – Acetobacter xylinum

Cellulomonos phân giải mạnh cellulose bã mía

Cytophaga Sporocytophaga myxococcoides

Cellvibrio gilvus, cellvibrio fulvus [7]

1.4.2 Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces)

Actimimyces coelicolor; Act sulfureus

Act cellulosae; Act diastaticus

Act hydroscopicus; Act themofuscus

Act bovis; Act flavochromogenes, Thermonosporacurvala [7]

1.4.3 Nấm sợi

Đối tượng chủ yếu trong các nghiên cứu về cellulase hiện nay thường là nấm (nấm mốc và nấm quả thể) Rất nhiều loài nấm đã tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao trong đó đáng kể là một số chủng loại sau:

Asp flavus; Asp niger; Asp oryzae; Asp terreus;

Asp amstelodamy; Asp fumigates

Chaetomium globosu …

Mucor pusillus

Penicillium notatum, Pen variabite; Pen pusillum…

Tricoderma koningi; Trlignorum Tr viride

cả [8]

Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như

về lượng enzyme do chúng sản sinh ra Vì vậy, trong công tác nghiên cứu cần

phải tiến hành tìm kiếm các chủng, giống có hoạt lực enzyme cao bằng cách

phân lập từ các điều kiện và lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối thích với các

cơ chất cảm ứng cũng như cần nâng cao hoạt lực bằng cách đột biến [8]

1.5.2 Nguồn dinh dưỡng

Các yếu tố trong thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt

động sống và sự tạo thành enzyme của vi sinh vật Trong môi trường nuôi cấy

vi sinh vật cần phải đảm bảo có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các

thành phần dinh dưỡng hợp lí, phù hợp với từng nhu cầu vi sinh vật cụ thể

[10]

1.5.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp

enzyme Đối với nấm sợi A fumigatus và các loại nấm mốc ưa nhiệt, nguồn

cacbon thích hợp nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc Môi trường cám bã và

củ cải đường là môi trường thích hợp nhất với T reesei [10]

Bã mía là nguồn cellulose tự nhiên tốt cho quá trình sinh tổng hợp

cellulase của A niger, A elipticus và A fumigatus, T reesi kết hợp với

A phoenicis, Penicilium sp, A terreus…còn lõi ngô, vỏ cà phê, xơ cọ dừa lại

là nguồn cellulose thích hợp cho các chủng vi sinh vật khác [10]

1.5.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu

trúc cũng như enzyme Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh

vật có thể là nitơ vô cơ hoặc hữu cơ Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để

đảm bảo được hiệu suất tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế [13]

Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh

cellulase là muối nitrat Đối với các giống của bộ nấm bông

(Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4 Nói chung các muối

amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì môi trường các muối này làm cho môi trường axit hoá Điều này không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme mà còn làm mất hoạt tính sau khi tạo thành [13]

Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hoá, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật Tác dụng kích thích của hợp chất này do sự có mặt của các axit amin, các nhân tố khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác [13]

Ngoài nitơ và cacbon thì những nguyên tố khoáng như Fe, Mn, Bo, Mo, Cu,… cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật Các nguyên tố khoáng Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme ở nhiều chủng [13]

1.5.3 Điều kiện nuôi cấy

1.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 25÷400C Nhiệt độ dưới 250C hoặc trên 400C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme [11], [12]

1.5.3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm

Trong quá trình lên men bề mặt, độ ẩm 60-70% là độ ẩm tương đối thích hợp với các chủng nấm mốc khi nuôi cấy trên các khay Nếu để độ ẩm quá thấp 50% môi trường sẽ khô nhanh, sinh bào tử mạnh đồng thời giảm sinh enzyme Hơn nữa, độ ẩm môi trường ảnh hưởng đến độ thoáng khí khi lên men bề mặt không có đảo trộn [10]

1.5.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme Theo

Lương Đức Phẩm khi lên men bề mặt chủng mốc Asp awamori để sản xuất

enzyme nhiều nhất vào thời điểm khoảng 36-40 giờ [13] Đối với nấm mốc

Aspergillus tạo thành enzyme cao nhất lúc bắt đầu sinh bào tử, sau khi sinh

bào tử lượng enzyme tiết ra ít thậm chí giảm đi rất nhiều [7]