Nghiên cứu sự đa hình di truyền của các dòng hoa cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống đoá trắng

Để nâng cao chất lượng của các giống cây trồng và phát triển các giống cúc mới, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự đa hình di truyền của các dòng hoa cúc được tạo ra bằng phương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA: SINH - KTNN

-*** -

KIỀU THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA CÁC DÒNG HOA CÚC ĐƯỢC TẠO RA BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GÂY ĐỘT BIẾN

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh- KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ để tôi hoàn thành bản khoá luận này

Trong quá trình hoàn thành bản khoá luận này, tôi không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được sự góp ý kiến của các thầy cô để bản khoá luận được đầy đủ hơn

Tôi xin chân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Kiều Thị Mai Hương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khoá luận được hoàn thành là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, những số liệu trong luận văn là trung thực, không sao chép, không trùng lặp với các kết quả nghiên cứu trước

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Sinh viên

Kiều Thị Mai Hương

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tên đầy đủ

1 bp Base pair (cặp bazơ nitơ)

2 CTAB Cetyl trimethylammonium

3 dNTP Deoxynucleotide Triphosphate

4 EDTA Ethylen Diamine Tetr Acetic acid

5 Gy Gray

6 Kb kilobase

7 DNA Deoxyribonucleic acid

8 EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic acid

9 EtBr Ethidium Bromide

10 mRNA Messenger Ribonucleic acid

12 PCR Polymerase Chain Reaction

12 PVP Polyvinyl pyrrolidone

13 SDS Sodium Dodecyl Sulphate

14 TBE Tris – boric acid – EDTA

15 TE Tris – EDTA

MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài……… 1

2 Mục đích yêu cầu của đề tài……… 2

3 Nội dung nghiên cứu……….2

Phần 2: Nội dung Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………3

1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cúc………3

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại và đặc điểm của cây hoa cúc……… 3

1.1.2 Giá trị sử dụng của cây hoa cúc……….…………5

1.1.3 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới……… 6

1.1.4 Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam…….……….6

1.2 Khái quát về nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng……….……….8

1.2.1 Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng…… ….8

1.2.2 Cơ sở di truyền của đột biến……….……… 8

1.2.3 Các tác nhân gây đột biến……… ……… 9

1.2.4 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái… 12 1.2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng……… 13

1.2.3.1 Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng… 13

1.2.3.2 Các chỉ thị dựa trên PCR 14

1.2.3.3 Kỹ thuật RAPD 17

1.2.3.4 Một số nghiên cứu ứng dụng của PCR – RAPD 18

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu………20

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 20

2.1.2.1 Dụng cụ dùng trong mô tả hình thái 20

2.1.2.2 Các hoá chất sinh học phân tử cần thiết 20

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22

2.1.4 Thời gian nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp mô tả hình thái……….23

2.2.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR- RAPD………23

2.2.2.1 Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB………… 23

2.2.2.2 Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24

2.2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose……… 25

2.2.2.4 Tính hệ số đồng dạng di truyền theo công thức của Nei và Li…… 26

2.2.2.5 Phân tích và xử lý số liệu 26

Chương III: KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức hình thái 27

3.2 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng cúc đột biến ưu tú ở mức phân tử bằng kĩ thuật PCR-RADP 33

3.2.1 Kết quả tách chiết ADN 33

3.2.2 Kết quả phản ứng PCR – RAPD 34

Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

1 Kết luận 41

2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

sống và tâm hồn con người Thế giới của các loài hoa là vô cùng phong phú

và đa dạng, chúng giúp cho cuộc sống của chúng ta đẹp hơn, sinh động hơn,

vì vậy hoa mang lại những giá trị kinh tế và tinh thần mà thiên nhiên ưu ái cho loài người Theo báo cáo MNS (market New Sevice) của trung tâm thương mại quốc tế, tính đến tháng 9 năm 2008 tổng kim ngạch sản xuất hoa cây cảnh trên thế giới đạt 411,5 triệu EUR, tăng 5% so với năm trước Châu

Á có 134.000 ha trồng hoa chiếm 60% diện tích trồng hoa thế giới nhưng diện tích trồng hoa thương mại nhỏ (chiếm 20% thị trường hoa thế giới) Phong trào trồng hoa ở Việt Nam trong những năm gần đây đã được chú ý phát triển, diện tích hoa tăng nhanh Hơn nữa điều kiện khí hậu và đất đai đa dạng đã tạo

điều kiện để trồng nhiều loại hoa, trong đó có hoa cúc Chrysanthemum sp (họ Asteraceae) là một trong những loài hoa cắt cành phổ biến nhất và được

thương mại hoá nhiều thứ hai trên thị trường chỉ sau hoa hồng

Hoa cúc đã được trồng phổ biến ở Việt Nam từ rất lâu Trải qua nhiều năm, cùng với các kỹ thuật lai ghép, các phương pháp trồng hoa mới, chất lượng và chủng loại hoa cúc ở Việt Nam đã được cải thiện rất nhiều Cho đến nay có khoảng trên 70 giống hoa cúc được trồng với mục đích cắt cành tại Việt nam [13] Người Việt cũng trồng hoa cúc và coi như nó là một trong những cây “tứ quý” (tùng, trúc, cúc, mai) tượng trưng cho bốn mùa Hoa cúc xuất hiện ở khắp các nơi như vườn hoa, công viên, trong phòng khách, bàn làm việc, trong các cuộc thăm viếng,… Hoa cúc cũng mang lại giá trị trong y dược học Không những thế hoa cúc còn đem lại những lợi nhuận kinh tế đáng kể cho người nông dân Hiện nay diện tích trồng hoa cây cảnh của nước

hoa cây cảnh trên cả nước Tuy nhiên, ở nước ta việc sản xuất hoa cúc còn gặp rất nhiều hạn chế Các giống hoa cúc có giá trị thương mại ở Việt Nam chủ yếu là các giống được nhập nội

Để nâng cao chất lượng của các giống cây trồng và phát triển các giống

cúc mới, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự đa hình di truyền của

các dòng hoa cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến giống đóa trắng”

2 Mục đích yêu cầu của đề tài

Đánh giá đa hình di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các dòng cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến

Xác định được một số chỉ thị đặc trưng, để nhận dạng một số dòng cúc

có triển vọng, để phục vụ công tác chọn, tạo, nhân giống và đăng kí bản quyền

3 Nội dung nghiên cứu

Phân tích và đánh giá đa dạng các đặc điểm hình thái, đa dạng di truyền

ở mức phân tử của các dòng cúc bằng kỹ thuật PCR-RAPD

Chọn lọc các dòng cúc đột biến ưu tú

Phân tích và đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái của các dòng cúc sau chiếu xạ

* Ý nghĩa của đề tài

Dựa vào sự đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các dòng cúc được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ gây đột biến làm cơ sở để chọn tạo ra các dòng cúc ưu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới

Kết quả của đề tài có ý nghĩa lớn trong việc xây dựng quy trình chọn tạo giống mới

Chương I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cúc

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại và đặc điểm của cây hoa cúc

Nguồn gốc: Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum, được định nghĩa từ Chrysos (vàng) và themum (hoa) bởi Linne năm 1973 Hoa cúc

có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước Châu Âu Theo Zenhua, Shouhe, hoa cúc được trồng ở Trung Quốc cách đây 3.000 năm, có nguồn gốc từ một số loài hoang dại, trải qua quá trình trồng trọt, lai tạo và chọn lọc từ những biến dị để trở thành những giống cúc ngày nay [15]

Ở Nhật Bản, cây hoa cúc được du nhập từ Trung Quốc sang, nó được đánh giá rất cao và được mệnh danh là “ Hoàng thất quốc hoa” Năm 1889 Edsmit đã bắt đầu lai tạo thành công nhiều loại cúc và ông đặt tên cho hơn

100 giống cúc của các thế hệ sau đó, một số khác ngày nay vẫn còn duy trì và được trồng đến ngày nay [15]

Theo hệ thống phân loại thực vật cây hoa cúc thuộc lớp hai lá mầm

(Diccotyledoneae), phân lớp hoa cúc (Asterydae), bộ cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceace), phân họ hoa cúc (Asteroidea) và chi hoa cúc (Chrysanthenmum) [5]

Theo nghiên cứu của Langton (1987) [10] cho biết trên thế giới có hơn 7.000 giống cúc đã được đưa vào sử dụng với chủng loại và màu sắc đa dạng

Họ cúc trên thế giới được xếp trong 2 phân họ, 13 tông Ở Việt Nam có

2 phân họ và 12 tông nhưng hiện tại chia làm 17 tông Họ cúc (Asteraceae) có

khoảng 1.550 chi với 23.000 loài, phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới, chủ yếu sử dụng để làm hoa

Ở Việt Nam: việc phân loại cúc chưa thống nhất, nhưng hiện nay cách phân loại phổ biến:

Dựa vào hình dạng hoa để phân biệt cúc đơn hay cúc kép

Cúc đơn: thường là dạng hoa nhỏ đường kính hoa từ 2-5 cm, chỉ có hàng cánh ở vòng ngoài cùng, còn vòng trong là cánh hoa rất nhỏ thường được gọi là cồi hoa

sít nhau, có loại cánh dài cong, có loại cánh ngắn [6]

Dựa theo cấu tạo của cánh hoa:

Cúc đơn: chỉ để lại 1 bông hoa chính Thường hoa to như giống CN93, CN98, …

Cúc cành (chùm): Cây hoa có nhiều cành, nhiều hoa nhỏ trên 1 gốc, như các giống cúc chi và cúc cành Hà Lan

Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc: cây hoa cúc thuộc dạng thân thảo, có nhiều đốt, giòn, có khả năng phân cành mạnh, cây dạng đứng hoặc dạng bò

Rễ: rễ cây hoa cúc thuộc loại rễ chùm, phát triển theo chiều ngang

Khối lượng bộ rễ lớn do sinh nhiều rễ phụ và lông hút, nên khả năng hút nước

và dinh dưỡng mạnh Có 2 loại rễ: rễ mầm và rễ thứ sinh, những rễ thứ sinh mọc ra từ các mắt đốt thân

Thân: thân cây hoa cúc thuộc loại thân thảo, có phân đốt, phân nhánh

mạnh, thân có thể đứng hay bò, đốt giòn dễ gãy, càng lớn càng cứng Những giống nhập nội thân thường to mập và thẳng, những giống cổ truyền thân nhỏ hơn, mảnh và cong Cây cao hay thấp, đốt dài hay ngắn, sự phân cành mạnh hay yếu tùy thuộc vào từng giống Chiều cao cây hoa cúc ở Việt Nam biến động từ 30 – 80 cm, ở điều kiện ngày dài cây cúc có thể cao đến 1,5 – 2m

Lá: lá cúc xẻ thùy có răng cưa to, sâu, thường là lá đơn mọc so le nhau,

mặt dưới lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng lưới Từ mỗi nách lá thường phát sinh một mầm nhánh Phiến lá có thể to hay nhỏ, dày hay mỏng, màu sắc xanh đậm, xanh vàng hay xanh nhạt còn phụ thuộc vào từng giống

Hoa: hoa lưỡng tính hoặc đơn tính có nhiều màu sắc khác nhau (trắng

đỏ, tím vàng, xanh) Đường kính hoa từ 1,5 – 12cm Hoa cúc chính là gồm nhiều hoa nhỏ hợp lại trên một cuống hoa hình thành hoa đầu trạng, mỗi cánh hoa là một bông hoa Tràng hoa dính vào bầu như hình cái ống, trên ống đó phát sinh cánh hoa Cánh hoa nằm ở phía ngoài thường có màu đậm hơn cánh phía trong hoa và xếp thành nhiều tầng Độ xếp sít của cánh hoa lỏng hay chặt tùy thuộc vào từng giống Hình dạng của cánh hoa: cong, thẳng, dài, ngắn, cuộn lại Hoa cúc có từ 4 – 5 nhị đực dính vào nhau bao quanh vòi nhụy Vòi nhụy mảnh hình chẻ đôi

Quả: quả cây hoa cúc là loại quả bế khô, hình trụ hơi dẹt, chỉ chứa 1

hạt mỏng và lép, trong hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ Các giống cúc thông thường có bộ nhiễm sắc thể là phức hợp lục bội với số lượng nhiễm sắc thể trung bình là 54 [14]

1.1.2 Giá trị sử dụng của cây hoa cúc

Cúc (Chrysanthemum sp) là một trong những loại hoa được trồng từ

lâu đời và quan trọng nhất trên thế giới Hiện nay, hoa cúc được trồng phổ biến khắp nơi, cúc có mặt ở các vườn hoa công viên, trong phòng khách, trong các lễ hội,… Ngoài giá trị làm cảnh, cây hoa cúc có nhiều giá trị sử dụng khác như: làm thuốc, làm các loại thức uống, làm thực phẩm, con người

đã và đang từng bước nghiên cứu nhằm khai thác tốt nhất các giá trị của cây hoa cúc để phục vụ cho các nhu cầu của cuộc sống

1.1.3 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới

Ở Bắc Mỹ, Tây Âu và Nhật Bản hoa cúc đang đứng ở vị trí thương mại thứ hai sau cây hoa hồng Quốc gia sản xuất hoa cúc dẫn đầu là Hà Lan với diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa tươi Columbia là nơi sản xuất hoa của Mỹ chiếm ưu thế nhất với hoa hồng, cẩm chướng trong

đó hoa cúc đứng đầu về sản lượng Ecuardor là nước chiếm vị trí thứ nhì Cả

2 nước đều là nơi có khí hậu đặc biệt tốt cho sự phát triển của hoa và cả 2 cũng đều tạo ra cho mình những phân đoạn sản phẩm phổ biến nhất Những loại hoa có sản lượng đứng đầu của Ecuardor bao gồm hoa hồng, cúc tây, cây phi yến và các loại hoa hỗn hơp khác [14]

Ở Châu Á, Nhật Bản cũng đang là nước dẫn đầu về xuất khẩu hoa cúc, mỗi năm Nhật Bản sản xuất được khoảng 200 triệu cành phục vụ cho tiêu dùng nội địa và xuất khẩu Ngoài ra cũng phải kể đến Thái Lan, hoa cúc được trồng quanh năm với sản lượng là 50.841.500 cành/ năm Ở Trung Quốc, theo hiệp hội sản xuất hoa sản lượng hoa cúc năm 2007 đạt hơn 35 triệu bông Diện tích trồng hoa cúc phát triển ở Quảng Đông, Thượng Hải, và Bắc Kinh bao gồm các giống ra hoa vào mùa hè, mùa thu, đông sớm và xuân muộn, màu được ưa chuộng nhất là màu vàng, kế đến là màu trắng, đỏ [14]

1.1.4 Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam

Từ xa xưa, chơi cúc đã là một thú chơi tao nhã của các bậc học sỹ và các gia đình giàu có của Việt Nam Trải qua nhiều năm, cùng với các kỹ thuật lai ghép, các phương pháp trồng hoa mới, chất lượng và chủng loại hoa cúc ở Việt Nam đã được cải thiện rất nhiều Cho đến nay có khoảng trên 70 giống hoa cúc được trồng với mục đích cắt cành tại Việt nam diện tích hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa và cây cảnh ở nước ta Hoa cúc được trồng quanh năm và xuất hiện khắp nơi trên đất nước ta, tập trung chủ yếu ở

Đà Lạt, Hải Phòng , Sa Pa, thành phố Hồ Chí Minh trong đó Đà Lạt là lý

tưởng với khí hậu ôn hòa thuận lợi cho cây hoa cúc phát triển Tại các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc diện tích trồng hoa cúc đã có 14,5 ha với sản lượng 5 triệu cành/ năm [14]

Hiện nay vấn đề quan tâm không chỉ là đảm bảo mục tiêu về diện tích trồng hoa, mà còn là chất lượng và hiệu quả bền vững, cần phải đa dạng hóa các loại hoa phục vụ nhu cầu trong nước, mặt khác phải chú trọng các loại hoa chất lượng cao phục vụ xuất khẩu

Các nhà khoa học đã xác định cần chú trọng công tác nhập nội, chọn tạo và nhân nhanh các giống hoa chất lượng cao, nhất là hoa cúc, hoa hồng, hoa lay ơn, hoa đồng tiền, hoa hồng môn, hoa phăng, hoa phong lan và hoa ly; đồng thời tăng cường tiếp nhận, chuyển giao các công nghệ, tiến bộ kỹ thuật trong trồng, chăm sóc, thu hoạch và phân phối hoa để tăng hiệu quả, giá trị sản phẩm, trong đó vấn đề giống, kỹ thuật canh tác là yếu tố quan trọng cần được quan tâm, đầu tư thích đáng

Công tác xây dựng cơ sở hạ tầng phục vụ sản xuất hoa, trong đó có việc thiết kế đồng ruộng theo quy hoạch, hoàn chỉnh hệ thống tưới - tiêu, hệ thống nhà lưới, nhà kính và các kỹ thuật đóng gói, bảo quản, vận chuyển, nhất là vận chuyển từ nơi sản xuất đến các sân bay đối với hoa xuất khẩu,

Cần phải rà soát các hoạt động thị trường hoa trong hệ thống quốc gia

về tiếp thị và phân phối sản phẩm hoa Xây dựng kế hoạch hành động về quản

lý sản phẩm nhằm đảm bảo dòng lưu chuyển sản phẩm nhanh từ nhà sản xuất đến người tiêu thụ Đặc biệt, các cơ chế chính sách khuyến khích các cơ sở trồng hoa quy mô lớn, chất lượng cao theo quy hoạch và với hệ thống lưu thông sản phẩm hoa, sự phối hợp chặt chẽ giữa các cấp, ngành chức năng cũng được đề cập như những yếu tố không thể thiếu trong giải pháp phát triển hoa trong giai đoạn tới

1.2 Khái quát về nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng

1.2.2 Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Chọn tạo giống cây trồng là một ngành khoa học cải tiến di truyền của thực vật nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người, có nhiều phương pháp chọn tạo giống cây trồng như: chọn lọc, lai giống, tạo đột biến, gây đa

bộ thể, áp dụng thành tựu của công nghệ sinh học

Trong tiến hóa: tính chất có lợi hay có hại của một đột biến gen chỉ là tương đối (có trường hợp này thì có lợi, có trường hợp khác có hại) Có trường hợp ở trạng thái dị hợp lại làm tăng sức sống, sức chống chịu của cơ thể đối với một số bệnh Ví dụ: người mang gen đột biến gây huyết cầu đỏ hình lưỡi liềm ở trạng thái dị hợp, có khả năng đề kháng với bệnh sốt rét Tuy tính chất ngẫu nhiên, cá biệt, không xác định và thường ở trạng thái lặn nhưng đột biến gen vẫn được xem là nguồn nguyên liệu sơ cấp chủ yếu cho quá trình chọn lọc tự nhiên, vì vậy chúng có vai trò trong tiến hóa Đột biến là cơ sở hình thành các giống vật nuôi và cây trồng mới [15]

Trong chọn giống: một vài đột biến có lợi dùng làm cơ sở là nguồn nguyên liệu quan trọng cho tạo giống vật nuôi và cây trồng Đột biến tự phát

là những đột biến xảy ra một cách ngẫu nhiên trong tự nhiên, thường xảy ra với tần số thấp và không phải lúc nào đột biến tự nhiên cũng có ý nghĩa cho con người, vậy chúng ít có ý nghĩa trong tiến hóa và chọn giống [15]

1.2.2 Cơ sở di truyền của đột biến

Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các đời sau

Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định hướng ở cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên Đa số là đột biến gen lặn và có hại, một số ít có lợi và có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống

Những cá thể mang đột biến đã biểu hiện trên kiểu hình của cơ thể gọi

Đột biến nhiễm sắc thể là sự biến đổi về cấu trúc hoặc số lượng nhiễm sắc thể (đột biến về cấu trúc nhiễm sắc thể như: mất đoạn, thêm đoạn, đảo đoạn hay chuyển đoạn) Đột biến số lượng nhiễm sắc thể (thể dị bội, đa bội) [15]

1.2.3 Các tác nhân gây đột biến

Các tác nhân gây đột biến đột biến có thể xảy ra ở mọi cơ quan, mọi thời kỳ sinh trưởng của cây trồng, theo nhiều hướng khác nhau và mức độ tần

số cũng khác nhau, đột biến có thể xảy ra bất cứ lúc nào do những thay đổi nội tại trong cấu trúc vật chất di truyền, do môi trường thay đổi đột ngột cũng như những tác động vật lý, hóa học của con người

Đột biến thường có hại: gây dị dạng, gây chết,…, nhưng cũng xuất hiện dạng có lợi như: năng suất cao, chống chịu tốt với điều kiện môi trường , xuất hiện các tính trạng mới, khắc phục các nhược điểm của giống vật liệu khởi đầu

Các tác nhân được sử dụng trong tạo đột biến nhân tạo: tác nhân vật lý

và tác nhân hóa học

+ Tác nhân hóa học:

Số lượng các chất hóa học gây đột biến là rất nhiều và số lượng các chất như vậy được phát hiệ n ngày càng nhiều Tuy nhiên trong thực tiễn công tác chọn tạo giống đột biến ở cây trồng chỉ một số í t được sử dụng và tỏ ra hữu ích; hầu hết trong số đó thuộc về nhóm alkyl hóa, như là: ethyl methane sulhonate (EMS), diethyl sulfate (DES), ethyleimine (EI), ethyl nitroso urethane (ENU), dimethyl sunfat (DMS), ethyl nitroso urea (ENH), methyl nitroso urea (MNH) Đây là nhóm quan trọng nhất của các tác nhân hóa học được sử dụng cho quá trình gây đột biến các chủng nông nghiệp Chúng có một hoặc nhiều nhóm alkyl linh động vốn có thể được chuyển sang cho các phân tử khác Chúng phản ứng với ADN bằng cách alkyl hóa nhóm phosphate cũng như các base puri ne và pyrimidine , do vậy nên cực kỳ cẩn thận trong việc sử dụng chúng vì hầu hết là chất gây ung thư tiềm năng, chẳng hạn như: EI, EMS, MNH

Nhóm chất oxy hóa khử như: HNO3, H2O2, aldehyde và một số muối kim loại nặng xâm nhập vào làm thay đổi nhóm NH2 trong nucleotide, trong protein và tế bào

Nhóm chất kháng sinh (antibiotics) như là azaserine, mitomycin C, streptonigrin và actinomycin D đã được nhận thấy là có tính chất làm đứt gẫy nhiễm sắc thể

Azide: Azide là một tác nhân gây đột biến hiệ u quả trong những điều kiện xử lý nào đó Nó cho phép nhận được các thể đột biến với tần suất cao Phần lớn các đột biến ghi nhậ n được là các đột biến gen , bên cạnh đó còn có các hiệu ứng làm thay đổi cầu trúc nhiễm sắc thể

Trước đây và ngay cả đến nay , người ta còn dùng Conchicine để gây ra hiện tượng đa bội là vì khi thấm vào mô đang phân bào, Conchicine cản trở

sự hình thành thoi vô sắc, làm cho nhiễm sắc thể không phân li

+ Tác nhân vật lý:

Các tác nhân vật lý có thể tác độ ng làm thay đổi cấu trúc ADN, nhiễm sắc thể một cách hiệu quả so với các nhân tố hóa học là điều đã được chứng minh thông qua lịch s ử chọn tao giống đột biến Các tác nhân vật lý ấy bao gồm:

Việc gây sốc nhiệt : sự tăng hoặc giảm nhiệt độ môi trường một cách đột ngột có khả năng gây đột biến là vì nó làm cho tế bào không khởi động kịp các cơ chế đáp ứng, gây chấn thương trong bộ máy di truyền hoặc làm tổn thương thoi vô sắc, gây rối loạn sự phân bào Sốc nhiệt thường gây đột biến

số lượng nhiễm sắc thể

Các tác động gây bức xạ ion hóa các cặ p base nitrogen trong chuỗi ADN xảy ra trong quá trình sinh tổng hợp ADN có khả năng gây ra các đột biến Trong trường hợp này , chúng làm nảy sinh sự tồn tại của các cặp base nitrogen bất thường và hình thành nên các thay đỗi hỗn biến trong cấu trúc các cặp base Hệ quả của việc này là trìn h tự các base trong chuỗi ADN được sinh tổng hợp mới bị sai lệch, một thay đổi rời rạc có khả năng duy trì , di truyền được có thể được hình thành

Có một số các loại bức xạ và nguồn bức xạ đã được các nhà chọn giống

sử dụng Ngoài tia cực tím (ultraviolet), một vài kiểu bức xạ ion hóa như tia

X, tia Gamma , các tiểu phần beta và alpha , proton và neutron thông thường

có khả năng hình thành nên sự phát năng lượng rời rạc được gọi là sự ion hóa khi chúng xuyên qua vật chất Tia X cũng như tia Gamma hay ánh sáng cực tím là các bức xạ điện từ phát ra lượng tử (với bước sóng 10 0.001nm đối với Tia X và tia Gamma , khác với ánh sáng cực tím khoảng 2.000 – 3.000nm)

Trong việc sản sinh ra các đột biến , máy phát tia X với bước só ng ngắn có khả năng xuyên thấu cao là thích hợp hơn bước sóng dài

Tia Gamma: có bước sóng ngắn hơn và do vậy có mức năng lượng photon cao hơn tia X Khác với tia X , tia Gamma thường được tạo ra từ các đồng vị phóng xạ

Tia cực tím (UV) có khả năng xuyên thấu vật chất rất giới hạn , vì thế chúng chỉ được sử dụng một cách hạn chế để xử lý các vật liệu có kích thước nhỏ như bào từ, hạt phấn, các tế bào hạt và mô nuôi cấy

Các tiểu phần be ta: Các tiểu phần beta hình thành từ nguồn đồng vị Phosphorus 32 (32P) hoặc Sulfur 35 (35S) gây hiệu ứng lên các mô tương tự như tia X và tia Gamma , tuy nhiên khả năng xuyên thấu của các tiểu phần beta là thấp hơn

Tia Neutron: chùm tia neutron chậm và chùm neutron nhanh từ việc phân hủy hạt nhân nguyên tử Uranium trong các lò phản ứng hạt nhân cũng

có thể được sử dụng để chiếu xạ gây đột biến vật liệu thực vật

Tia điện tử (electron beam ): hình thành từ máy gi a tốc hạt điện tử , phương pháp này bị hạn chế và cấm sử dụng trong việc chiếu xạ tạo đột biến

để đảm bảo tính an toàn cho nhà chọn giống

Chùm tia ion (Ion beam): có thể gây ra sự thay đổi lớn về cấu trúc nhiễm sắc thể và AND [8], [15]

1.2.4 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái

Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền thống được nhà phân loại học đầu tiên là Larmark sử dụng Phương pháp này bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ thể là:

Đặc điểm của hoa: màu sắc, số lượng hoa trên bông, số lượng bông trên thân, cách sắp xếp của cánh hoa, kích thước, mùi hương của hoa, thời gian ra

Đặc điểm của lá: màu sắc, số lượng của lá trung bình của một cây, chiều dài và chiều rộng của lá, hình dáng của lá, cấu tạo lá

Đặc điểm của bộ rễ: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thước (chiều dài

và đường kính)

Đặc điểm của thân: màu sắc, cấu tạo, hình dáng, kích thước (chiều dài

và đường kính) [3]

1.2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

1.2.3.1 Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Chỉ thị phân tử được coi là những đoạn ADN đã được tìm thấy ở các vùng đặc hiệu trên bộ gen và được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Ứng dụng chỉ thị phân tử để xác định nguồn gốc cũng như phân loại giống cây trồng được thực hiện từ những năm 1990 do William & cs Chỉ thị phân

tử được coi là những đoạn DNA đã được tìm thấy ở các vùng đặc hiệu trên bộ gen và được di truyền theo các quy luật từ thế hệ này sang thế hệ khác Sự phát triển và sử dụng các loại chỉ thị phân tử để phát hiện và khám phá sự đa hình của ADN, lập bản đồ di truyền và nghiên cứu sự liên kết của các tính trạng là một trong những tiến bộ nhất trong lĩnh vực di truyền phân tử Có rất nhiều loại chỉ thị phân tử như: đa hình các đoạn độ dài giới hạn (RFLP), đa hình khuếch đại ngẫu nhiên ADN (RAPD), đa hình khuyếch đại đoạn dài (AFLP), lặp trình tự đơn giản giữa các phân tử (SSRs), vùng đặc trưng trính

tự (SCARs), điểm trình tự đầu (STSs), các trình tự đa hình khuếch đại đã phân cắt (CAPs), phương pháp vi vệ tinh hay lặp trình tự đơn giản (SSRs), đầu trình tự đã biểu hiện (ETSs), đa hình nucleotide đơn (SNPs) và công nghệ mảng đa dạng (DArT) được sử dụng trong các nghiên cứu phát hiện và đánh giá sự đa hình ở mức độ phân tử của ADN Tuy nhiên tùy thuộc vào mục đích của từng nghiên cứu để có thể lựa chọn một trong số các chỉ thị phân tử

* Nguyên lý chung của phương pháp

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90 - 95°C, cao hơn nhiệt độ biến

tính (Tm) của khuôn, làm đứt các liên kết hydro của phân tử ADN, hai mạch phân tử ADN tách rời nhau Đoạn khuôn ADN có các đoạn dài gồm nhiều nucleotid giống nhau, hoặc tỉ lệ G - C càng cao, có nhiệt độ biến tính cao hơn

Do vậy cần căn cứ đặc điểm của ADN khuôn để lựa nhiệt độ biến tính phù hợp Giai đoạn này kéo dài 1 - 2 phút

Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55 - 56°C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn ADN khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff Giai đoạn này khoảng 30 - 60 giây

Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70 - 72°C thích hợp với điều kiện hoạt động của enzym ADN polymerase Enzym ADN polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào cuối đoạn mồi, các mồi đƣợc kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn, tạo nên các mạch đơn ADN mới, giai

đoạn này gọi là giai đoạn polymer hoá Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài chục phút, tuỳ thuộc vào kích thước của đoạn ADN Thông thường với thời gian 2 phút, tổng hợp được những đoạn ADN kích thước dưới 2 kb

Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu

kỳ trước lại được làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân Một phản ứng PCR thường thực hiện 20 - 40 chu kỳ,

từ mỗi đoạn ADN khuôn có thể tạo nên 220

- 240 bản sao ADN Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzym ADN polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi dNTP, enzym để bảo đảm phản ứng PCR có kết quả tốt nhất [7]

* Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR

ADN khuôn: đoạn khuôn ADN tinh sạch là một yếu tố quan trọng, đảm

bảo kết quả phản ứng PCR tạo được các sản phẩm PCR chính xác Kích thước đoạn khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất PCR có thể khuyếch đại được ADN từ những mẫu sinh học đang bị phân huỷ như: vết máu, vết

tinh dịch để lâu ngày, tóc và xương của người chết,

Các nucleotid tự do (dNTP): cần thiết cho phản ứng PCR bao gồm:

dATP, dTTP, dGTP và dCTP Trong mỗi phản ứng PCR cần chú ý tỉ lệ G - C trong đoạn khuôn để xác định hàm lượng mỗi đoạn ADN phù hợp Nồng độ dNTP mỗi loại, thường sử dụng trong các phản ứng PCR khoảng 50 – 200

M Khi hàm lượng các loại dNTP tự do quá ít, tạo sản phẩm PCR không đủ

để phát hiện, ngược lại nồng độ dNTP tự do quá cao thì phản ứng PCR khó thực hiện Do đó, tuỳ theo kích thước đoạn gen và số chu kỳ PCR thực hiện

để tính toán nồng độ dNTP thích hợp

Mồi: là các đoạn oligonucleotid ngắn khoảng 14 - 35 nucleotid, có vai

một đoạn ADN bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi thích hợp Một cặp mồi trong PCR gồm mồi xuôi F (Foward) và mồi ngược R (Revert) Mồi có vai trò tạo các nhóm 3’ OH tự do, cần thiết cho phản ứng polymer hoá Mồi xuôi phải có trình tự tương đồng với trình tự của mạch ADN mang mã di truyền, mồi ngược bắt cặp với mạch ADN mang mã di truyền ở đầu 3’ của

mạch

Emzym ADN polymerase: là yếu tố quan trọng, có vai trò quyết định

hiệu quả của phản ứng PCR Mỗi loại enzym ADN polymerase có đặc tính và vai trò khác nhau trong phản ứng PCR, sử dụng các loại enzym ADN

polymerase khác nhau thu được sản phẩm PCR có tính đặc hiệu khác nhau

Hàm lượng enzym ADN polymerase cũng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR Do đó, trong các phản ứng PCR, tuỳ theo mục đích cụ thể của các nghiên

cứu để lựa chọn loại enzym với hàm lượng thích hợp

Dung dịch đệm cho PCR: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng PCR Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt động của enzym ADN polymerase như: MgCl2, KCl, Tris, Trong dung dịch đệm, ion

Mg2+ là thành phần có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng PCR, do

Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn

Thiết bị thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi các chu

kỳ tuần hoàn nhiệt, do vậy có thể thực hiện phản ứng PCR trong các thiết bị chuyên dụng là các máy PCR Ngoài ra, phản ứng PCR có thể thực hiện trong các bể ổn nhiệt, có bộ đếm giờ với dụng cụ thông dụng trong phòng thí

nghiệm [7]

* Các ứng dụng chủ yếu của PCR

Sử dụng PCR trong tách dòng gen, xây dựng ngân hàng gen, lập các loại bản đồ gen và giải trình tự gen, bộ gen

PCR được ứng dụng trong các nghiên cứu chuẩn đoán sớm các bệnh nhiễm virus, vi khuẩn và các đột biến gây rối loại di truyền

PCR được sử dụng trong tạo đột biến in vitro, và trong một số kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra các giống vật nuôi, cây trồng và vi sinh vật mới

PCR có vai trò quan trọng trong nghiên cứu nguồn gốc các loài sinh vật

và trong phân loại phân tử

Ưu điểm của phương pháp này là: chỉ cần một lượng nhỏ ADN và có thể không cần đến mẫu dò gắn phóng xạ, có khả năng khuyếch đại trình tự ADN từ các mô đã được bảo quản, có thể ứng dụng cho nhiều loại chỉ thị di truyền, có khả năng chọn lọc nhiều gen trong cùng một thời điểm và trong thời gian ngắn Phương pháp này có thể áp dụng được ở tất cả các phòng thí nghiệm quy mô nhỏ và có thể tiết kiệm được chi phí [7]

1.2.3.3 Kỹ thuật RAPD

RADP hay còn gọi là đa hình khuyếch đại ngẫu nhiên ADN là kỹ thuật

sử dụng cùng một số cặp mồi ngẫu nhiên nhất định (thường sử dụng từ 10 - 40 cặp mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADN đặc trưng của các mẫu nghiên cứu Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR nhân được các đoạn khác biệt nhau Mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligonucleotid gồm khoảng 8 - 20 nucleotid đặc trưng với mỗi loài sinh vật [7]

* Các bước thực hiện

Tách chiết và tinh sạch ADN bộ gen của các mẫu nghiên cứu, và thực hiện phản ứng PCR nhân các đoạn ADN với các cặp mồi đã lựa chọn (trong cùng điều kiện giống nhau)

Xác định tính hệ số đồng dạng di truyền hoặc mức độ khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu bằng các phần mềm phân tích sinh học thông dụng, hoặc tính theo các biểu thức khác nhau bởi các nghiên cứu của các nhà khoa học

Có thể tính hệ số đồng dạng di truyền theo biểu thức của Nei & Li (1979) [7]

1.2.3.4 Một số nghiên cứu ứng dụng của PCR - RAPD

RAPD được ứng dụng cho nhiều nghiên cứu về hệ gen thực vật như được dùng để định vị các gen kháng bệnh và kháng côn trùng, phối hợp với

kỹ thuật RFLP lập bảng đồ gen lúa, định vị gen kháng bệnh ruồi gall midge

trên nhiễm sắc thể số 4 ở lúa RAPD còn được dùng phổ biến để nghiên cứu tính đa dạng di truyền ở các loại thực vật RAPD được ứng dụng khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê được lai tạo từ các loại bố

mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau Kết quả cho phép chọn lọc được các dòng lai gần và lai xa có đặc tính quý để làm nguyên liệu cho việc lai tạo giống cà phê mới, như trong công trình nghiên cứu của Orozco - Castillo và cộng sự, năm 1994 Năm 1995, Schell và cộng sự đã sử dụng RAPD để nghiên cứu 25 giống xoài khác nhau với 80 mồi 10 bp Kết quả cho phép phát hiện ra các đoạn ADN đặc trưng cho mỗi loài, phân loại và xác định di truyền của các loài này RAPD đánh giá mối quan hệ di truyền của 10 giống đu đủ, phản ứng PCR với một đoạn 10 bp có trật tự ngẫu nhiên RAPD cũng được nghiên cứu ứng dụng tính đa dạng ở các loài thực vật khác nhau như ở cần tây, ở hành, cỏ linh lăng, bạch dương và táo,… RAPD cũng được sử dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở một số giống lan công nghiệp ở Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan

Ưu điểm của kỹ thuật này là: không cần biết trình tự nucleotit của đoạn DNA khuôn, quy trình tiến hành tương đối nhanh, dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm nhỏ Các chỉ thị RADP thường được sử dụng để phân tích