BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TÁCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS Adult stem cell Tế bào mầm trưởng thành D`MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Môi trường D`MEM dpc day postcoitum Ngày sau giao phối Ebs Embryonic bodys T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM

KHOA SINH HỌC

*****  *****

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TÁCH

VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT

MÃ SỐ : CS.2004.23.64

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

TS Dương Thị Bạch Tuyết

Thành Phố Hồ Chí Minh - 12/2005

ThS.Nguyễn Đăng Quân CN.Phạm Văn Phúc

(ĐHKHTN Tp HCM) CN.Lê Phan Quốc

CN.Trương Văn Trí (ĐHSP Tp.HCM)

ThS.Phan Kim Ngọc

Cộng tác viên:

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AS Adult stem cell Tế bào mầm trưởng thành D`MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Môi trường D`MEM dpc day postcoitum Ngày sau giao phối Ebs Embryonic bodys Thể phôi

EC Embryonic carcinoma Tế bào khối u

EGC Embryonic germ cell Tế bào mầm phôi

ES Embryonic stem cell Tế bào gốc phôi

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò FGF Fibroblast growth factor Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi

GC Germ cell Tế bào mầm

ICM Inner mass cell Khối tế bào bên trong LIF Leukimia inhibitory factor Nhân tố ức chế bạch cầu MEF Mouse embryonic fibroblast Tế bào fibroblast phôi chuột MHC Major Histocompatibitity complex Phức hợp tương hợp mô PGC Primordial germ cell Tế bào mầm sinh dục sơ khai

LỜI MỞ ĐẦU

Thế kỷ 21 - với sự bùng nổ của thành tựu Công Nghệ Sinh học đã đem lại nguồn lợi to lớn cho cuộc sống nhân loại Con người không ngừng tìm kiếm những hướng nghiên cứu mới trong Sinh học Phân tử và Sinh học tế bào Đặc biệt là việc nghiên cứu tế bào gốc (Stem cell) nhằm tận dụng nguồn giá trị vô tận của loại tế bào này trong công tác chữa bệnh nhất là bệnh nan y

“Tế bào gốc” đã trở thành một khái niệm không còn xa lạ trong lĩnh vực Sinh học do những đặc tính ưu việt của nó Tuy nhiên Công nghệ tế bào gốc (Stem cell biotech) cũng đã trở thành nỗi băn khoăn cho nhân loại khi nó được nghiên cứu và thao tác trên chính con người

Nhiều quốc gia trên thế giới đã cho phép tiến hành các thao tác trên tế bào gốc phôi người (Human embryo) và cũng có nhiều nước cấm, trong đó có Việt Nam Vấn đề này còn đang có nhiều tranh cãi và hiển nhiên sẽ còn bị hạn chế cho đến khi tìm ra các phương pháp kiểm soát chặt chẽ

Trong các đối tượng nghiên cứu phổ biến hiện nay, chuột nhắt trắng có lẽ là khá quen thuộc trong phòng thí nghiệm vì những đặc tính thuận lợi của nó: kích thước nhỏ, vòng đời ngắn, đặc điểm sinh lý gần với người …

Việc thu nhận tế bào gốc từ phôi chuột đã được thực hiện từ rất lâu trên thế giới và đã đạt được nhiều thành tựu Tuy nhiên, lĩnh vực nghiên cứu này còn rất hạn chế

ở Việt Nam

Để bắt đầu tiếp cận với đối tượng nghiên cứu mới này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột

Mặc dù bước đầu đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng chắc chắn rằng còn nhiều điều chưa hoàn thiện Rất mong sự quan tâm và góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này để đề tài được hoàn thiện hơn

Chân thành cảm ơn

TP HCM, tháng 12/2005

Thay mặt nhóm tác giả

Dương Thị Bạch Tuyết

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TẾ BÀO GỐC

1.1 Khái niệm

Tế bào gốc là một loại tế bào chưa chuyên hoá, có khả năng phân chia vô hạn trong các tổ chức sống, có nguồn gốc từ phôi, bào thai hay mô cơ thể trưởng thành Dưới điều kiện thích hợp hay có tín hiệu kích thích, tế bào gốc sẽ phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên hoá tạo thành các cơ quan hay tổ chức của cơ thể [1][2]

1.2 Đặc điểm

 Có khả năng phân chia vô hạn

 Cấu trúc di truyền (Bộ NST lưỡng bội) trong các tế bào vẫn duy trì và ổn định với mỗi loài

 Có thể biệt hoá thành các loại tế bào chuyên hoá khác nhau thu từ 3 lớp mầm nguyên thủy

 Có khả năng nhân dòng tế bào.[1][2]

1.3 Phân loại

Gồm 2 nhóm chính : [7][9]

 Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ES)

 Tế bào gốc phôi – ES

 Tế bào mầm phôi (Embryonic Germ Cell – EGC)

 Tế bào gốc trưởng thành (Adult Stem Cell – AS)

1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu

Các tế bào gốc phôi (ES _ Embryo stem cell, ) lần đầu tiên được cô lập vào những năm 1980 bởi nhiều nhóm nghiên cứu làm việc độc lập Những nhà nghiên cứu này đã nhận ra đặc tính biệt hóa đa hướng của tế bào ES để cho ra các loại tế bào của cả ba lớp mầm sơ khởi

Gossler và cộng sự đã miêu tả khả năng và lợi điểm của việc dùng tế bào ES để tạo ra được các động vật chuyển gene Thomas và Capechi đã báo cáo về khả năng biến đổi bộ gene của các tế bào ES bằng tái tổ hợp tương đồng

Smithies và các đồng nghiệp sau đó đã chứng minh rằng các tế bào ES được biến đổi gen khi vào Blastocyst, có thể truyền lại những biến đổi di truyền này qua các dòng tế bào

Ngày nay các biến đổi di truyền trên bộ gene chuột bằng kỹ thuật tế bào ES là một cách tiếp cận quan trọng để tìm hiểu chức năng của các tế bào động vật hữu

nhũ in vivo Các nghiên cứu về các tế bào ES của các động vật hữu nhũ: chuột đồng,

chuột, chồn, heo và bò đã được công bố; tuy nhiên, chỉ có tế bào ES chuột là thành công trong việc truyền lại các biến đổi di truyền từ tế bào ES thông qua dòng tế bào mầm sinh dục

Gần đây, các quan tâm về các tế bào gốc đã tăng mạnh nhờ những báo cáo về cô lập tế bào ES ở người và linh trưởng

Các công trình tạo phôi lai giữa người và thỏ, biến tế bào gốc thành trứng và tinh trùng, thu tế bào mầm mà không làm chết phôi … đã thu được nhiều kết quả khả quan trong hai thập kỷ qua

Đặc biệt, vào tháng 5/2004 A Melton và cộng sự đã biệt hoá 17 loại tế bào khác nhau từ ES thu nhận từ khối tế bào bên trong của blastocyst ở người

Các nhà khoa học Hàn quốc đã tỏ ra vượt trội và đã có các công trình có tính tiên phong trong lĩnh vực thu nhận tế bào gốc phôi người

Tính đến nay, trên thế giới, ít nhất đã có 4 ngân hàng tế bào gốc ra đời và đi vào hoạt động (Hàn quốc, Anh, Mỹ, Trung quốc)

Hình 1.1 : a) Blastocyst b) phôi người giai đoạn 8 tế bào

Riêng ở Việt Nam, việc nghiên cứu tế bào gốc chỉ mới đang trong giai đoạn khởi đầu và được tập trung chủ yếu tại hai trung tâm lớn (Đại học Khoa học Tự nhiên Hà nội và Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM) Mặc dầu vậy, các phòng Thí nghiệm công nghệ cao của hai Trường nói trên cũng đã đạt được một số thành tựu làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về tế bào gốc Chẳng hạn như xây dựng

các quy trình thu nhận nguồn phôi in vitro, in vivo từ động vật làm nguyên liệu cho

khai thác tế bào gốc, cấy ghép da thu được từ nuôi cấy tế bào để điều trị các ca bỏng, ghép tế bào gốc CD34+ máu ngoại vi để để điều trị bệnh lý ác tính, thu tế bào gốc sinh máu từ tuỷ xương, cuống rốn … [7][9]

2 TẾ BÀO GỐC PHÔI

2.1 Khái niệm và đặc điểm

Tế bào gốc phôi được định nghĩa bởi nguồn gốc của nó, chúng có nguồn gốc từ dạng blastocyst của phôi Blastocyst là một dạng phát triển tất yếu của phôi trước khi bám vào thành tử cung Ở giai đoạn này, phôi chuột gồm lớp tế bào ngoài (ngoại phôi bì), khoang phôi và khối tế bào bên trong

Tế bào gốc tăng nhanh về số lượng và biệt hóa chức năng thành các cơ quan trưởng thành Nếu tách tế bào gốc ra khỏi phôi và chuyển chúng vào một cơ quan khác hay cơ thể trưởng thành, chúng có thể hòa nhập, tiếp tục phân chia và thể hiện khả năng chuyên biệt theo cơ quan đó

Tương tự, nếu các tế bào này được cô lập invitro, tạo dòng (colony) và tác động

biệt hóa, chúng sẽ có khả năng biến đổi hình thái và đặc điểm sinh lý để cho các dạng tế bào khác trong phòng thí nghiệm.[1][2]

Hầu hết những tế bào trong cơ thể đều có nguồn gốc từ sự tự sao chép tế bào gốc Do đó, các nhà khoa học nhận thấy cần phải phát triển đặc điểm đặc biệt này để giúp tế bào gốc biệt hóa tốt hơn Austin Smith đã xác định các đặc điểm cụ thể của tế bào gốc phôi như sau:

 Chuyển hóa từ lớp tế bào bên trong hay nội phôi bì của blastocyst

 Tồn tại và duy trì ổn định bộ nhiễm sắc thể ở dạng lưỡng bội

 Có thể phát triển thành các loại tế bào khác nhau và xuất phát từ 3 lớp mầm riêng biệt của phôi (nội bì, trung bì và ngoại bì)

 Có khả năng hợp thành một thể thống nhất trong tất cả các mô thai trong suốt thời kỳ phát triển

 Có khả năng nhân dòng tế bào và phát triển thành tế bào trứng và tinh trùng

 Biểu hiện nhân tố sao chép Octo-4, làm hoạt hóa hay kìm hãm một gene đích và duy trì sự phát triển nhanh của tế bào gốc phôi không biệt hóa

 Có thể tiếp tục phát triển và tự đổi mới chính nó

 Dòng các tế bào gốc phôi đơn bào có thể phát triển thành dòng tế bào thuần hay dòng tế bào có nguồn gốc như nhau

 Trong tổng hợp DNA, khác với tế bào sinh dưỡng, tế bào gốc phôi không đòi hỏi các tác nhân kích thích bên ngoài khi bắt đầu sao chép DNA

 Ở mỗi tế bào sinh dưỡng của động vật hữu nhũ cái, một trong hai nhiễm xắc thể X trở nên bất hoạt hoàn toàn , nhưng sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X không xuất hiện ở tế bào ES.[1][2][7][9]

Hình 1.2: Sơ đồ biệt hóa các tế bào từ túi phôi ở người

2.2 Nguồn gốc của tế bào gốc phôi

Phôi động vật có vú khi phát triển thì từng đám tế bào trong đám đại phôi bào chìm xuống, trước khi phôi bám vào thành tử cung Đây là các tế bào đa năng, có nghĩa là chúng có khả năng phát triển thành các tế bào của 3 lớp mầm sơ cấp

Các tế bào đa năng này được hình thành từ khối tế bào bên trong của phôi ở giai đọan túi phôi, sau đó một số trong chúng di chuyển ra phía ngoài để tạo ngoại phôi

Tế bào mầm sinh dục (gọi tắt tế bào mầm – Germ Cell ) là những tế bào gốc đa

năng có thể phân chia liên tục vừa tự làm mới vừa biệt hóa tạo thành các giao tử (tinh trùng, trứng) từ đó tạo ra cơ thể mới.[5]

3.2 Sự hình thành và tồn tại của các tế bào mầm

Trong quá trình phát triển của phôi, hợp tử sau khi được tạo thành, qua những lần phân chia đầu tiên các tế bào con được sinh ra Những tế bào này sẽ phát triển theo các hướng khác nhau với cấu trúc và chức năng riêng biệt

Một trong những hướng biệt hóa là hướng hình thành nên các tế bào mầm sơ khai (tế bào mầm sinh dục sơ khai – Primordial Germ Cell – PGC ) Nguyên nhân tạo ra hướng biệt hóa là vì trong tế bào chất của hợp tử chứa nhiều nhân tố ‘‘quyết định’’ (determint factor), các nhân tố này lại phân bố không đồng đều Do đó, khi hợp tử phân cắt thì mỗi tế bào con sẽ nhận được một phần tế bào chất có chứa các nhân tố ‘‘quyết định’’ có thành phần và hàm lượng không giống nhau

Những tế bào con nào nhận được nhân tố này sẽ biệt hóa theo hướng mà nhân tố quyết định quy định.[4][5]

Các tế bào mầm sinh dục xuất hiện từ giai đoạn khá sớm trong sự phát triển của phôi, đó là giai đoạn phôi vị hóa (phôi ba lá) Các tế bào ở rãnh sinh dục (PGC) là nền tảng cho dòng tế bào mầm sinh dục Thế hệ con cháu của chúng sẽ hình thành nên các giao tử ở động vật trưởng thành Các tế bào PGC giữ vai trò quan trọng trong sự sống sót của một loài

Ở động vật hữu nhũ nói chung và chuột nói riêng, PGC là một quần thể các tế bào di động Chúng được hình thành trong quá trình phát triển của phôi, sau đó di chuyển, khếch đại và định cư ở bộ phận sinh dục

Các tế bào mầm lần đầu tiên được xác định khi có một dấu hiệu yếu của những tế bào dương tính với phản ứng alkaline phosphatase tại rãnh sinh dục nguyên thủy vào ngày 7 dpc (day postcoitum) Số lượng tế bào mầm sinh dục nguyên thủy chừng

50 – 80 tế bào vào cuối giai đoạn phôi vị hóa (giai đoạn ba lá phôi)

Vào giai đoạn 8 – 8,5 dpc thì số lượng tế bào của chúng chừng 100 tế bào, định

vị tại lớp trong ruột sau và di chuyển lên lớp biểu mô ruột sau vào ngày 9 – 9,5 dpc, tại đây số lượng của chúng tăng lên chừng 350 tế bào Từ đây, chúng di chuyển theo hướng lưng dọc theo các niêm mạc ruột sau về phía cầu sinh dục phát triển (genital ridge) và định cư ở đây vào ngày 10,5 dpc, khi đó số lượng của chúng khoảng 1000 Bên trong bộ phận sinh dục, các tế bào mầm sinh dục tiếp tục phân chia và quần thể

tế bào đạt chừng 25000 tế bào vào ngày 13,5 dpc [5]

Cầu sinh dục (genital ridge) là tiền thân của cơ quan sinh dục sau này Các tế bào mầm tồn tại trong cầu sinh dục sẽ di chuyển về cơ quan sinh dục đang hình thành trong các giai đoạn phát triển của phôi

Ở giai đoạn 12.5 dpc, cầu sinh dục bám vào trung thận (mesonephros) hay còn gọi là thận thai (fetus kidney) Sau khi bỏ hết phần nội quan, cầu sinh dục và trung

thận nằm gần sát vào lưng Có thể quan sát bằng mắt thường hay qua kính lúp hoặc kính hiển vi soi nổi để thấy hai bộ phận này.

Kích thước của cầu sinh dục và trung thận chừng 1 – 2 mm tuỳ thuộc trọng lượng, kích thước phôi Khi chưa tách rời, cầu sinh dục và trung thận tạo thành hình lưỡi liềm Dưới kính hiển vi, lưỡi liềm có hai lớp: một lớp bên phía chiều cong bên trong có màu sáng hơn là cầu sinh dục, một lớp có màu sẫm hơn là trung thận

Hình 1.3: Sự định vị và tồn tại của tế bào mầm ở các giai đoạn phát triển của phôi (Phần màu đỏ là các tế bào mầm sinh dục)

Để nghiên cứu GC in vitro, người ta dựa vào sự định vị của chúng trong phôi theo tuổi mà thu nhận và nuôi cấy

Sau 12,5 dpc, các tế bào mầm sinh dục tập trung vào các cơ quan sinh dục Buồng trứng nằm cạnh thận trong khi đó tinh hoàn thì nằm ở vị trí gần bóng đái

Biểu đồ 1.1: Mối quan hệ giữa tuổi (dpc) và số lượng tế bào mầm sinh dục ở phôi

chuột Mus musculus var.Albino Theo Tam và Snow (1981) [ 5]

3.3 Xác định tế bào mầm

Hiện tại có ba phương pháp xác định tế bào mầm sinh dục dựa vào:

(1) Đặc điểm hình dạng,

(2) Kháng thể nhận diện kháng nguyên đặc trưng cho tế bào GC

(3) Sự biểu hiện của enzym Alkaline phosphatase

3.3.1 Đặc điểm hình dạng tế bào mầm

Các tế bào GC sau khi được rời ra từ các mảnh mô có thể phân biệt được chúng với các tế bào sinh dưỡng khác khi xem dưới kính hiển vi soi nổi hay cắt lớp Tế bào mầm sinh dục vừa mới thu nhận thì sẽ có hình tròn, bề mặt láng và phản chiếu ánh

sáng Chúng có đường kính từ 18 - 20 μm nên lớn hơn hầu hết các tế bào sinh dưỡng Chúng lăn tròn đều trên mặt đáy của giếng nuôi

Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các tế bào sinh dưỡng bám vào đáy bình trong khi đó các tế bào mầm sinh dục vẫn không bám vào đáy bình Tế bào GC hầu như không có màu do vậy có thể phân biệt với những tế bào hồng cầu không nhân, không bám và có cùng kích thước với tế bào GC bởi các tế bào hồng cầu có màu đỏ hồng nhạt

Sau một vài giờ nuôi cấy trên lớp tế bào đơn (lớp feeder, thường là fibroblast), chúng sẽ dính vào lớp tế bào bên dưới và thay đổi hình dạng – hình dạng của chúng có vẻ như hình của fibroblast Khi đó, chúng ta không thể nào xác định được chúng qua hình dạng mà để xác định chúng phải thông qua kháng thể hay alkaline phosphatase

3.3.2 Xác định dựa vào kháng thể

Các tế bào mầm sinh dục thể hiện một số kháng nguyên bề mặt chuyên biệt (Donovan và cộng sự, 1986) Các kháng nguyên này sẽ kết hợp được với kháng thể TG-1 và SSEA-1 Sự hiện diện của các kháng nguyên này là một phương tiện đáng tin cậy cho việc xác định tế bào GC sống trong nuôi cấy

Tuy nhiên, thật cẩn thận rằng các phản ứng kháng thể không hoàn toàn đặc hiệu cho tế bào GC Một số kháng thể đa dòng được biết phản ứng chuyên biệt với tế bào GC nhưng cũng đồng thời phản ứng với các kiểu tế bào khác [5]

3.3.3 Xác định dựa vào Alkaline phosphatase

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các tế bào GC thể hiện sự hoạt động mạnh của Alkaline phosphatase Hoạt tính của Alkaline phosphatase đầu tiên được xác định vào ngày thứ 7 dpc và tiếp tục biểu hiện cho đến cuối đời sống của phôi.[5]

Mặc dù trong phôi cũng có những tế bào khác cũng dương tính với alkaline phosphatase nhưng sự hiện diện của tế bào dương tính với alkaline phosphatase thu

nhận từ mẫu mô sinh dục (như cầu sinh dục) là không thể nhầm lẫn được bởi vì

không có kiểu tế bào nào biểu hiện đặc tính này

Tế bào mầm thu nhận từ cầu sinh dục được xác định bằng phương nhuộm

Alkaline phosphatase Trạng thái chưa biệt hoá của tế bào mầm có thể được nhận

biết nhờ mức độ biểu hiện cao của enzym Alkaline Phosphatase Enzym này hoạt

động tối ưu trong môi trường pH kiềm, do vậy gọi là Alkaline phosphatase (Alkaline

nghĩa là kiềm) Trong tế bào, Alkaline phosphatase giữ vai trò rất quan trọng trong

việc phân giải các nhóm phosphate của các phân tử nucleotide, protein và akaloide

Ở tế bào gốc và tế bào mầm trong một khoảng thời gian nhất định trong thời gian

phát triển của phôi thì enzym này hoạt động mạnh Sự biểu hiện mạnh của enzym

này hầu như ít xảy ra ở các tế bào đã biệt hoá Do vậy, sự biểu hiện mạnh của

enzym này là một dấu hiệu để xác định tế bào gốc và tế bào mầm.[5][9]

Cơ chế phản ứng

Đầu tiên, Naphthol AS-BI phosphaste sẽ bị cắt đi gốc Phosphate thành Naphthol

AS-BI Sau đó, Naphthol AS-BI sẽ phản ứng trở lại với Fast Blue BB Salt và tạo ra

sản phẩm có màu xanh bám trên bề mặt tế bào Màu xanh này có thể quan sát dưới

kính hiển vi

Naphthol AS-BI phosphaste Naphthol AS-BI APase

Naphthol AS-BI + Fast Blue BB Salt Blue Pigment (Sắc tố màu xanh)

4 NGUỒN GỐC THU NHẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN TẾ BÀO

GỐC ĐA NĂNG

Hầu hết các nhà khoa học sử dụng tế bào gốc đa năng (pluripotent stem cell hay

leuripotent stem cell) để chỉ những tế bào gốc thu nhận từ túi phôi Từ pluri có

nguồn gốc từ tiếng Hy lạp là plures nghĩa là nhiều Do vậy, những tế bào gốc đa

năng có thể biệt hóa thành bất kì tế bào nào trừ các tế bào thu nhận từ màng phôi

Đây là một đặc tính được quan sát trong điều kiện in vivo và cả trong điều kiện in

vitro.[5]

Các tế bào gốc đa năng có thể được thu nhận từ ba nguồn gốc:

 Các tế bào gốc phôi (ES) thu nhận từ phôi giai đoạn blastocyst

 Các tế bào mầm sinh dục (GC) thu nhận từ phôi thai (chuột từ giai đoạn 8,5 – 12,5 dpc, người 5 – 7 tuần tuổi)

 Các tế bào khối u chứa nhiều loại tế bào khác nhau của các lớp mầm

Hình 1.4 : Nguồn thu nhận các tế bào gốc đa năng

Do trong quá trình phát triển của phôi, tính từ lúc sau khi thụ tinh (Do) thì các sự kiện tiếp theo xảy ra theo một thời gian có thể dự đoán trước Nhờ đó mà người ta có thể thực hiện các kỹ thuật vi thao tác để thu nhận một hỗn hợp tế bào chứa các tế bào gốc phôi ES, tế bào mầm EG ở các giai đoạn phôi khác nhau từ các phôi thụ

tinh tự nhiên in vivo hoặc từ các phôi thụ tinh in vitro bằng cách theo dõi thời gian

phát triển của phôi.[9]

Từ hỗn hợp tế bào thu nhận được người ta tiến hành các phương pháp nuôi cấy khác nhau để từ đó cấy chuyền, phân lập bằng nhiều phương pháp và cuối cùng thu nhận được các dòng tế bào gốc đa năng

Thường thì các nhà khoa học sử dụng các kỹ thuật công nghệ cao để phân lập các tế bào gốc đa năng như việc sử dụng công cụ FACS (Fluorescen Activated Cell Sorting) để phân loại các tế bào gốc rất hiếm từ hàng triệu tế bào khác Với kỹ thuật này, dịch huyền phù các tế bào được gắn với đuôi huỳnh quang (nghĩa là chỉ gắn lên các marker bề mặt của tế bào gốc các tag huỳnh quang thích hợp), sau đó được chuyển đến một dụng cụ tạo ra sức ép xuyên qua miệng hẹp - rất hẹp đến nỗi các tế bào phải xuyên qua từng cái một tại một thời điểm Nhờ vào việc thoát khỏi miệng, các tế bào sau đó chuyển qua, từng cái một, xuyên qua một nguồn ánh sáng, thường là laser, và sau đó xuyên qua một trường điện từ Các tế bào huỳnh quang tích điện âm, trong khi các tế bào không huỳnh quang tích điện dương, sự khác điện tích cho phép các tế bào gốc được tách ra khỏi các tế bào khác

Công cụ này còn được dùng để phân lập tế bào gốc dựa vào sự khác nhau về độ lớn tế bào, hình dạng bề mặt, độ trong suốt, độ đậm đặc NST, các marker bề mặt, marker bên trong của tế bào …

Hình 1.5: Phương pháp phân loại tế bào có hoạt tính phát huỳnh quang FACS

5 ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC

Tế bào ES đã mở ra rất nhiều ứng dụng Vấn đề được xem là nóng bỏng nhất là sử dụng tính đa thế của tế bào này trong liệu pháp cấy ghép – nghĩa là thay thế hoặc phục hồi mô đã bị phá hủy, bị thương hoặc bệnh tật Các bệnh có thể sử dụng tế bào ES để điều trị gồm: Parkinson, tiểu đường , chấn xương cột sống , sự suy thoái tế bào, loạn dưỡng cơ, tim và tạo xương Tuy nhiên, tùy theo mục đích điều trị cho mỗi loại bệnh mà tế bào ES phải được điều khiển để biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt trước khi cấy ghép Các nghiên cứu này đang được tiến hành, tuy nhiên số lượng phòng thí nghiệm ES người thì rất ít

Như vậy, việc sử dụng tế bào ES vẫn còn là tiềm năng và cần tính thực nghiệm cao Thuận lợi khác của tế bào ES là nó có khả năng tăng sinh vô hạn trong ống nghiệm, do vậy nó có nhiều triển vọng để phát triển thành nhiều dạng tế bào thông qua sự điều khiển biệt hóa, sau đó được cấy ghép để thay thế hoặc phục hồi các cơ quan bị tổn thương Các tế bào ES thuận lợi cho việc cấy ghép nếu chúng không bị hệ thống miễn dịch của cơ thể thải loại

Tế bào gốc phôi người có thể được dùng để nghiên cứu các bất thường trong sự phát triển của phôi người: khuyết tật bẩm sinh, quái thai và nhất là sẩy thai… Việc nghiên cứu tế bào ES người có thể được xác định bởi các nguyên nhân ở mức độ phân tử và mức độ tế bào

Tế bào ES cũng có thể được dùng để thăm dò tác động của nhiễm sắc thể bất thường trong sự phát triển của phôi sớm Điều này bao gồm khả năng kiểm soát sự phát triển của các mô ung thư giai đọan sớm Tế bào gốc phôi còn dùng để kiểm tra các loại thuốc trị bệnh mới, sàng lọc các độc tố tiềm ẩn

Cuối cùng tế bào ES người có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp mới cho kỹ thuật di truyền như tái tổ hợp tương đồng.[5][9]

Hình 1.6 : Chiến lược ghép tế bào gốc

Hình 1.7: Chiến lược dùng tế bào gốc trong liệu pháp gene

Đối với tế bào mầm ( cũng là tế bào gốc đa năng và là nguồn gốc cho các tế bào sinh dục) thì ngoài ứng dụng của một tế bào gốc đa năng thì tế bào mầm được sử dụng vào những mục đích chuyên biệt như :

 Điều trị bệnh vô sinh bằng cách nuôi mô sinh dục để thu nhận tế bào mầm và cho biệt hoá thành tế bào sinh dục hoàn chỉnh để có thể tham gia thụ tinh

 Nuôi cấy biệt hóa tế bào mầm còn có ý nghĩa trong bảo tồn giống Những loài động vật quý hiếm sau khi bị chết có thể thu nhận tế bào cơ quan sinh dục để trữ lạnh Sau đó, những tế bào này có thể biệt hóa và cho thụ tinh để sinh con Điều này có ý nghĩa lớn nếu con vật chưa trưởng thành

 Sử dụng tế bào mầm sinh dục làm mô hình cho việc kiểm nghiệm các chất gây vô sinh

PHẦN 2

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) : từ hai đến ba tháng tuổi, cân nặng

từ 20 – 30g, có sức sống khỏe mạnh, sạch bệnh, do Viện Pasteur TP.HCM cung cấp (chuột đực và cái đều trưởng thành về sinh dục),

Hình 2.1: Chuột nuôi trong chuồng

2.1.2 Dụng cụ – thiết bị

- Tấm lót cao su

- Ghim cố định chuột

- Kéo thẳng và kéo cong

- Kẹp thẳng và kẹp cong

- Becher (200ml,100ml)

 Dụng cụ tách và thu nhận tế bào

- Ống tiêm 1ml, 5ml

- Đầu kim tiêm 26G

- Màng lọc tế bào Cell Strainer 70μm

- Đĩa Petri nhựa (đường kính 35 x10 mm)

- Hệ thống kính vi thao tác

- Kính hiển vi đảo ngược

- Kính hiển vi quang học

- Máy vi tính

- Máy đo pH

- Cân phân tích

- Hệ thống chụp ảnh

- Tủ lạnh mát

- Tủ lạnh – 20oC

- Tủ ấm CO2

2.1.3.Hóa chất

2.1.3.1.Hóa chất kích thích rụng trứng và thụ tinh

+ PMSG (Prenant Mare’s Serum Gonadotropin 1000 IU)

 Dạng bột

 Bảo quản 2 – 7oC, tránh ánh sáng

 Công dụng: kích thích nang trứng phát triển

 Pha PMSG 100IU/ml: cân một lượng PMSG tương đương 100IU hòa vào

1ml dung dịch NaCl 0,9%

 Tiêm với liều 0,1ml/ chuột (tương đương với nồng độ 10IU/ chuột)

+ Humagon: 75IU FSH/75IU LH

 Dạng bột

 Bảo quản 25 oC, tránh ánh sáng

 Công dụng: kích thích nang trứng phát triển

 Pha dung dịch Humagon: cân một lượng 75IU hòa vào 0,75 ml dung dịch

NaCl 0,9%

 Tiêm với liều 0,1ml/chuột (tương đương với nồng độ 10IU/chuột)

+ Prenyl: Human Chorionic Gonadotropin 1500IU (Organon, Hà Lan)

 Dạng bột

 Bảo quản: 2 - 15 oC, tránh ánh sáng

 Công dụng: kích thích trứng chín và rụng

 Pha Prenyl: cân một lượng 150IU hòa vào 1,5 ml dung dịch NaCl 0,9%

 Tiêm với liều 0,1ml/ chuột (tương đương với nồng độ 10IU/ chuột)

2.1.3.2 Môi trường giải phẫu

PBS (Phosphate Buffer Saline)

Cân hỗn hợp muối như sau :

8g NaCl + 0.2g KCl + 0.2g KH2PO4 + 2.285g Na2HPO4.12H2O

Sau đó cho nước cất 2 lần vào cho đủ 1000 ml Đem hấp khử trùng

2.1.3.3 Dung dịch Trypsin/EDTA 0,25%

Cách pha:

 Cân 0,25g trypsin hòa vào 98ml PBS , bổ sung 2ml EDTA 1%

 Lọc vô trùng bằng phin lọc 0,22μm

2.1.3.4 Môi trường nuôi phôi

D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), bổ sung 10% huyết thanh

thai bò (FBS – Fetal Bovin Serum)

Cách pha:

 Cân 2g bột D’MEM và 0,74g NaHCO3 ,hòa vào 150ml nước cất 2 lần

 Chỉnh pH từ 7,4 đến 7,5 bằng dung dịch HCl 1M Sau đó bổ sung nước cất

cho đủ 200ml

 Bổ sung 10% huyết thanh

 Lọc bằng phin lọc 0,22μm

 Giữ lạnh ở -4 oC

2.1.3.5 Hóa chất nhuộm Alkaline phosphatse

 Naphthol AS-BI (Sigma) - C18H15BrNO6P

 Fast Blue BB Salt (Sigma) - 2C17H18ClN3O3 · ZnCl2

Hai dung dịch Fast Blue BB Salt và Naphthol AS-BI phosphate phải giữ riêng

tại nhiệt độ – 20 C Khi sử dụng trộn lại dung dịch trên và dùng liền, không sử dụng

nếu dung dịch trộn quá 30 phút

2.1.3.6 Dung dịch Collagenase 1 mg/ml

- 100 mg bột Collagenase II (Sigma)

- Dung dịch PBS vừa đủ 100 ml

Lọc vô trùng bằng màng lọc minipore 0,2 μm (Mini Start) Giữ lạnh ở – 4 o C

2.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

2.2.1 Phương pháp gây động dục chuột cái và cho thụ tinh tự nhiên

2.2.1.1 Ổn định điều kiện sống của chuột

 Chuột nhắt được ổn định điều kiện sống tại phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật khoảng 3 – 5 ngày trước khi gây động dục

 Chuột đực và chuột cái được nuôi riêng trong chuồng nhựa, mỗi chuồng 4 – 5 con

 Chuột được nuôi theo chu kỳ sáng tối Thức ăn cho chuột gồm: thóc, cám viên, lúa mầm, nước uống lấy từ nguồn nước uống dân dụng

2.2.1.2 Tiến hành gây động dục và thụ tinh tự nhiên

 Tiêm PMSG hoặc Humagon cho chuột cái tại xoang bụng với liều lượng 10IU/ con

 Để chuột ổn định 48 giờ

 Tiêm HCG cho chuột tại xoang bụng với liều 10IU/con Thả chuột đực vào chuồng theo tỉ lệ 1 đực: 2 cái

 Kiểm tra nốt nhầy âm đạo

 Theo dõi quá trình giao phối chuột, sau 4 ngày bắt chuột đực ra khỏi chuồng

 9 ngày sau khi cách ly chuột đực, xác định chuột cái mang thai để giải phẩu thu phôi

2.2.1.3 Phương pháp tiêm thuốc

 Bắt chuột bằng cách nắm đuôi

 Dùng ngón tay cái và ngón trỏ của tay trái nắm lấy vùng da gần cổ và ngón tay út kẹp gốc đuôi chuột vào lòng bàn tay trái

 Tiêm 0,1ml hormone vào xoang bụng bằng ống tiêm 1ml

 Các lưu ý khi thực hiện thao tác tiêm thuốc:

 Không để chuột có thể quay đầu và cắn vào tay người chích

 Tránh tiêm vào cơ hoành hay bàng quang

 Thuốc sau khi tiêm không bị chảy ra ngoài

 Chỗ tiêm không bị chảy máu

 Lớp da không bị phồng lên

 Trước và sau khi tiêm phải sát trùng vị trí tiêm

Hình 2.2: Thao tác tiêm thuốc

2.2.2 Phương pháp thu phôi:

 Giết chuột bằng cách kéo dãn dây sống

 Nhúng toàn bộ cơ thể chuột vào cồn

 Đặt chuột nằm ngửa và sát trùng bằng cồn 70o

 Mổ bụng chuột để lộ nội quan

 Dùng kẹp và kéo tháo ruột ra ngoài, định vị 2 nhánh tử cung

 Dùng kẹp gắp tử cung lên và loại bỏ mở bám bên ngoài tử cung

 Cắt lấy toàn bộ tử cung có chứa phôi cho vào đĩa Petri nhựa có chứa sẵn môi trường PBS

 Chuyển tử cung chứa phôi lần lượt sang 2 đĩa Petri môi trường PBS khác để rửa sạch máu

 Dùng kẹp và kéo loại bỏ sạch phần mỡ còn lại dính ngoài tử cung

 Cắt dọc tử cung để lộ phôi ra ngoài và chuyển các phôi sang một đĩa Petri khác chứa PBS Lúc này phôi vẫn còn trong noãn hoàng

 Dùng 2 kim 26G để giữ xé rách một phần bao noãn hoàng quanh phôi Thao tác nhẹ nhàng và cẩn thận tránh để phôi bị kim đâm thủng

 Dùng kẹp ấn mạnh bên phần bao noãn hoàng không bị rách để đẩy phôi ra ngoài

 Chuyển phôi vừa thu được sang đĩa Petri PBS mới

 Sử dụng hệ thống vi thao tác, quan sát và cắt phôi làm đôi tại vị trí nách chi trước Loại bỏ phần đầu của phôi, chuyển phần sau của phôi sang đĩa Petri PBS khác

Hình 2.3 : Qui trình thu nhận phôi chuột

(a) Chuột sau khi giết bằng ete, (b) Vị trí mổ chuột (c) Phôi chuột, (d) Chùm phôi trong tử cung

 Chú ý: Lúc chuyển phôi qua các môi trường vì phôi nhỏ nên có thể dùng

micropipette để hút chuyển phôi qua lại, cần thao tác cẩn thận tránh vỡ phôi

2.2.3 Phương pháp thu nhận cầu sinh dục

 Cắt bỏ tử cung

 Cắt lấy màng ối của phôi, tách phôi và nhau ra

 Cắt rời nhau thai và phôi chuột ra ngoài

 Đặt phôi chuột lên một lờ giấy thấm Dùng kéo cắt một nửa thân chuột tại

vị trí dưới cánh tay

 Dùng kéo nhỏ cắt một đường dọc theo giữa bụng và tách hết ruột và gan ra ngoài bằng kim mũi cong

 Chuyển phần phôi chuột còn lại vào đĩa Petri nhựa chứa môi trường PBS và đặt mảnh phôi sao cho lưng chuột nằm xuống dưới

 Cầu sinh dục nằm phía dưới của nội tạng, bám vào trung thận (thận thai – sau này phát triển thành thận) Cả trung thận và cầu sinh dục đều bám vào mặt trong của lưng chuột

 Chuyển cầu sinh dục qua môi trường mới, tách thể trung thận ra khỏi cầu sinh dục bằng hai mũi kim 1ml dưới kính lúp hay kính hiển vi đảo ngược

 Rửa cầu sinh dục trong PBS

Trong quá trình tiến hành để tế bào thu nhận ít bị ảnh hưởng sức sống, thường xuyên nhỏ vài giọt dung dịch PBS lên trên phôi

Hình 2.4: Phôi chuột

Hình 2.5 : Phôi chuột 12,5 ngày sau khi tách tử cung

Hình 2.6 : Phôi chuột ( ) và nhau thai ( )

Hình 2.7: Phôi chuột sau khi cắt nhau thai

Hình 2.8: Vị trí cắt phôi để tách gan Gan chuột, Vị trí cắt, Dao cắt

Hình 2.9: Phôi sau khi cắt phần đầu