Ngiên cứu sản xuất một số chế phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị hội chứng hô hấp trên lợn và gà

Năm 2003, K.M.Park và các cộng sự đã phân lập được hợp chất Kuwanon G từ rễ cây dâu tằm, các nghiên cứu cũng cho thấy hợp chấy này có thể kháng lại vi khuẩn Streptococcus vi khuẩn gây ra

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành dưới sự giúp đỡ tận tình của thầy (cô)

khoa Hóa học trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 cùng cán bộ Viện Hóa Sinh

Biển – Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam Với tất cả lòng biết

ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Bằng đã giao

cho em đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Phan Văn Kiệm cùng

các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc hóa học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo

em trong quá trình làm thực ngiệm để hoàn thành khóa luận này

Khóa luận này được hoàn thành với hỗ trợ của đề tài “ Nghiên cứu sản

xuất một số chế phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị hội chứng

hô hấp trên lợn và gà’’ do PGS.TS Lã Văn Kính, Viện Khoa học Kỹ thuật

Nông nghiệp miền Nam làm chủ nhiệm đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy (cô) khoa Hóa học trường Đại Học

Sư Phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ em trong thời gian học tập, tu dưỡng tại trường

Bản thân em đã cố gắng để hoàn thành khóa luận, nhưng cũng không

tránh khỏi những thiếu xót Vì vậy, em kính mong sự đóng góp ý kiến quý

báu của thầy (cô) và các bạn đọc để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn

Hà Nội, tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Morus alba 3

1.1.1 Mô tả 3

1.1.2 Phân bố và sinh thái 4

1.1.3 Công dụng 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Morus alba 5

1.2 Giới thiệu về lớp chất flavonoit 6

1.2.1 Giới thiệu chung 6

1.2.2 Các nhóm flavonoit 7

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 13

1.3.1 Chọn dung môi chiết 13

1.3.2 Quá trình chiết 16

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 17

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 17

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí 18

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí 18

1.5 Một số phương pháp hóa lí xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ 20 1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) 20

1.5.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) 21

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Mẫu thực vật 25

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 25

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 25

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 25

2.2.3 Sắc ký cột (CC) 25

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 25

2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 25

2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 26

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 26

2.3.4 Độ quay cực [] D 26

2.4 Dụng cụ và thiết bị 26

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 26

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 27

2.5 Hoá chất 27

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28

3.1 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất 28

3.1.1 Xử lý mẫu 28

3.1.2 Chiết tách và phân lập các hợp chất 28

3.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất 31

3.2.1.Hợp chất 1 - Sanggenon J 31

3.2.2 Hợp chất 2- Atalantoflavone 31

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 32

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 ( Sanggenon J ) 32

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ( Atalantoflavone ) 37

KẾT LUẬN 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

Sơ đồ 2 Sơ đồ phân lập phân đoạn cloroform từ lá dâu tằm 30

Hình 4.1.a Phổ proton 1H của hợp chất 1 32

Hình 4.1.b Phổ cacbon 13C của hợp chất 1 33

Hình 4.1.c Phổ 13C và DEPT của hợp chất 1 33

Hình 4.1.d Phổ 2 chiều HSQC của hợp chất 1 34

Hình 4.1.e Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 1 35

Hình 4.1.f Các tương tác HMBC chính (HC) của hợp chất 1 35

Hình 4.1.g Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 35

Hình 4.2.a Phổ proton 1H của hợp chất 2 38

Hình 4.2.b Phổ cacbon 13C của hợp chất 2 39

Hình 4.2.c Phổ cacbon 13C và DEPT của hợp chất 2 39

Hình 4.2.d Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 40

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

[]D Độ quay cực Specific Optical Rotation

13C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR

CC Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mass Spectrometry FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High

Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có bốn mùa rõ

rệt, có độ ẩm trên 80% và có lượng mưa lớn Đây chính là điều kiện thuận lợi

để các thảm thực vật phát triển Nước ta hiện có một hệ thống thảm thực vật

phong phú và đa dạng với khoảng 12000 loài, trong đó có khoảng 4000 loài

được nhân dân sử dụng làm thảo dược để phục vụ cho mục đích chữa bệnh [1]

Sử dụng cây cỏ để làm thuốc luôn gắn liền với lịch sử tồn tại và phát

triển của xã hội loài người Từ xa xưa, cha ông ta đã biết sử dụng thực vật để

nuôi sống bản thân đồng thời cũng dùng để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe

cho chính mình Hầu hết các loài cây thuốc đều có chứa các hoạt chất sinh

học, vì tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc chủ yếu là do các hợp chất tự

nhiên đặc biệt là các hợp chất trao đổi thứ cấp Việc sử dụng các hợp chất

thiên nhiên và sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên đang là mối quan tâm

của các nhà khoa học đa ngành cũng như cộng đồng bởiưu điểm của chúng là

độc tính thấp, ít tác dụng phụ, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so

với các dược phẩm tổng hợp

Họ dâu tằm (Moracae) là một họ lớn chứa từ 40-60 chi và khoảng

1000-1500 loài thực vật phân bố rộng rãi ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới

nhưng ít phổ biến ở các vùng ôn đới Ở Việt Nam, họ Moraceae hiện biết có

khoảng trên 10 chi với gần 140 loài được phân bố rộng rãi khắp nước, bao

gồm cả cây trồng và cây mọc dại, nhiều loài có giá trị kinh tế cao

Cây dâu tằm ( Morus alba), thuộc họ dâu tằm ( Moracae) là cây được

sử dụng để chữa bệnh từ rất lâu, lá dâu dùng để chữa cảm mạo, hạ huyết

áp,làm lành vết thương; vỏ và rễ dâu chữa chứng ho lâu ngày, sốt cao, băng

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận

tốt nghiệp là:

“Nghiên cứu phân lập các flavonoit từ lá dâu tằm (Morus alba)’’

Nhiệm vụ của đề tài là:

1 Thu mẫu từ lá cây dâu tằm (Morus alba), xử lý mẫu, tạo dịch chiết;

2 Phân lập các hợp chất flavonoit thu được từ dịch chiết lá cây dâu tằm

(Morus alba)

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây dâu tằm (Morus alba)

1.1.1 Mô tả

Tên khác: Tang, Dâu cang, Dâu ta

Tên khoa học: Morus alba

Họ: Dâu tằm (Moracae )

Chi: Morus

Tên nước ngoài: White mulberry (Anh )

Dâu tằm là loại cây gỗ nhỏ, cao khoảng 2-3m.Thông thường cây dâu

sống từ 8-12 năm, nếu đất tốt và chăm sóc tốt thì tuổi thọ tới 50 năm và có thể

cao tới 15-20m Thân cành nhiều nhựa, không gai, trên thân cành có nhiều

mầm, mầm đỉnh, mầm nách Lá mọc so le, nguyên hoặc chia 3 thùy Trên các

cây già, lá dài 8-15cm, có hình tim ở gốc lá,

nhọn ở chóp lá và có các khứa răng cưa ở mép

lá từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ rệt Hoa đơn

tính, hoa đực mọc thành bông, có 4 lá đài, có

4 nhị Hoa cái cũng mọc thành bông hoặc

hình khối cầu, có 4 lá đài Quả bé bao bọc các

đài, mọng nước thành 1 quả phức Quả có

màu từ trắng đến hồng đối với cây nuôi trồng

, nhưng màu quả tự nhiên của loài này khi

mọc hoang là màu tím sẫm Rễ ăn sâu và rộng

2-3m Phân bố nhiều ở tầng đất 10-30m và

rộng theo tán cây

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Nguyên sản ở Trung Quốc, được trồng rộng rãi ở các nước Châu Á

Ở Việt Nam, đã được trồng từ lâu đời khi người ta biết nuôi tằm Cây

được trồng nhiều ở các tỉnh Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh

Cây dâu ưa đất phù sa, bãi bồi, đất ẩm xốp và khí trời ấm áp

1.1.3 Công dụng

Lá dâu (Tang diệp) có vị đắng, tính bình, có tác dụng tán phong, thanh

nhiệt, lương huyết chữa cảm mạo,hạ huyết áp, làm sáng mắt, chữa chứng mồ

hôi trộm ở trẻ con, chứng thổ huyết, làm lành vết thương

Vỏ rễ dâu (Tang bạch bì) đã cạo sạch lớp vỏ ngoài, phơi hay sấy khô,

có vị ngọt hơi đắng, tính mát,có tác dụng thanh phế nhiệt, lợi thủy, hạ suyễn,

tiêu sưng, chứng ho lâu ngày, sốt cao, băng huyết

Cành dâu non (Tang chi) đã phơi hay sấy khô có vị đắng nhạt, tính

bình, có tác dụng trừ phong, lợi các khớp, thông kinh lạc, tiêu viêm, hạ nhiệt,

giảm đau

Quả dâu (Tang thầm) có vị ngọt, chua, tính mát, có tác dụng bổ gan, trị

tiểu đường, lao hạch

1.1.4 Thành phần hóa học [13]

Lá cây dâu tằm chứa các thành phần bay hơi như tinh dầu (0,0035%),

các thành phần không bay hơi gồm protein, carbohydrat, flavonoid, coumarin,

vitamin… Các flavonoid: rutin, quercetin, moracetin

(quercetin-3-triglucosid), quercitrin (quercetin 3- rhamnosid), isoquercitrin (quercetin-3-

glucosid) Các dẫn chất coumarin: umbeliferon, scopoletin, scopolin Các

vitamin B, C, D, caroten Các sterol: β-sitosterol, campesterol, β-sitosterol

glycosid, β- ecdyson và inokosterol Các acid hữu cơ: oxalic, malic, tartric,

citric, fumaric, palmitic và ester ethyl palmitat

Vỏ rễ cây dâu tằm chứa mulberin, cyclomulberin, mulberochomen,,

cyclomulberochromen, mulberanol, oxydihydromorusin (morusinol), kuwanon,

mulberofuran, albanol, albafuran, albafuran B, C Ngoài ra, vỏ rễ còn chứa

p-tocopherol, umberiferon, socopoletin, ethyl 2,4 - dihydrobenzoat,

5,7-dihydroxychoromon, morin (3,5,7,2’,4’- pentahydroxyfalavon) dihydromorin,

dihydrokaemferol, acid betulenic, 2,4,4’,6-tetrahydroxybenzophenol (R=H),

macrulin (2,3’,4,4’,6-pentahydroxybenzophenol (R=OH), sitosterol, resinotanol

1.1.5 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây dâu tằm (Morus alba)

Các nghiên cứu gần đây cho thấy một số hợp chất phân lập từ rễ cây

dâu tằm có nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất flavonoid

Năm 1986, Hirakura đã cô lập được hợp chất Mulberrosid từ rễ cây dâu

tằm và đã thử nghiệm thành công hoạt tính kháng virus Herpes simplex-l

(HSV-l: một loại virus gây viêm não)[10]

Các công trình nghiên cứu của một số tác giả Nhật Bản (1994) [11],

Trung Quốc (1996)[12] đã chứng minh polyphenol chứa trong lá dâu có nhiều

tác dụng quý và có thể ứng dụng trong sinh học như: làm hạ glucose máu,

chống oxy hóa, hạn chế rối loạn lipit máu

Năm 2003, K.M.Park và các cộng sự đã phân lập được hợp chất

Kuwanon G từ rễ cây dâu tằm, các nghiên cứu cũng cho thấy hợp chấy này có

thể kháng lại vi khuẩn Streptococcus (vi khuẩn gây ra nhiễm trùng) và các

loại vi khuẩn Cariogenic như S mutans (loại khuẩn này chuyên bám trên bề

mặt răng và tạo cao răng)……

Khi dùng cloroform để chiết các hợp chất hữu cơ từ rễ cây dâu tằm, các

nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện dung dịch thu được có tác dụng bổ trợ

cho trực khuẩn Bacillus subtilis phát triển mạnh, trực khuẩn này sinh nhiều

chiết có thể kháng được vi khuẩn Staphylococcus aureus (một nhóm vi khuẩn

sống trên da tay, chân của con người Hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm cấp

tính do Staphylococcus aureus gây ra) và Escherichia colia (vi khuẩn này là

nguyên nhân gây tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu như viêm thận,

nhiễm trùng huyết,…)[12]

Năm 2013,TS.BS.Nguyễn Quang Trung là người đầu tiên ở Việt Nam

công bố nghiên cứu tác dụng của bột chiết lá dâu tằm dùng để điều trị giảm

đường huyết và điều hòa rối loạn lipid ở bệnh nhân đái tháo đường, giúp kéo

dài thời gian ổn định đường huyết

Các nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy cây dâu tằm có hoạt tính

kháng virus rất mạnh nhưng cho đến nay vẫn chưa có nhiều hợp chất được

phát hiện và phân lập Vì vậy mà cây dâu tằm vẫn đang là đối tượng quan tâm

của các nhà khoa học để tiếp tục tìm ra các hợp chất mới có khả năng trị bệnh

phục vụ cho cuộc sống con người

1.2 Giới thiệu về lớp chất flavonoit

1.2.1 Giới thiệu chung [2, 3, 5, 6, 7]

Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật, có cấu tạo gồm 2

vòng benzen A, B được nối với nhau bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon

C6 – C3 – C6

Flavonoit xuất hiện cách đây 280 triệu năm ở hai loại tảo, vòng

Sự tiến hoá của Flavonoid liên quan đến quá trình tiến hoá thực vật Từ

các loài có gỗ sơ khai đến các loài cây bụi đã phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi

quan trọng về mặt cấu trúc của Flavonoid:

- Sự biến mất Proantoxianidin trong lá

- Sự mất 3 nhóm OH ở vòng benzen

- Sự thay thế Flavonol (Quercetin) bởi Flavon (Luteonin)

Việc phân loại các flavonoit dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 (các

glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và antoxianiđrin màu

đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin

là các chất tan trong nước và thường nằm trong không bào)

Flavonoid là một nhóm hợp chất poliphenol, đa dạng về cấu trúc hoá học

và tác dụng sinh học Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt

trong các tế bào thực vật, là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B

được kết nối bởi 1 dị vòng C với khung các bon C6-C3-C6 Tại các vòng có đính

một hay nhiều nhóm hydroxy tự do hay đã thay thế một phần Vì vậy về bản chất

chúng là các poliphenol có tính axit Các poliphenol có thể phản ứng lẫn nhau

qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hay có thể liên kết

với các hợp chất khác trong cây như các Oza (dạng glycozit) hay protein

Các flavonoit là các dẫn xuất của 2–phenyl chromen (flavan)

3

5 6

7

8 9

Nhóm flavon và flavonol chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3 Công thức

cấu tạo của các hợp chất như sau:

OH RO

O

OH

Hình 1.4: Flavonol (3-hidroxi flavon)

Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các

nhóm hydroxi liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất

khác nhau

Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng

tự do mà thường dưới dạng glycozit

Các flavanon tồn tại ở dạng cân bằng hỗ biến với các chalcon, do vòng

dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcon

1.2.2.3 Flavanonol-3

Các flavanonol-3 còn gọi là flavanon-3-ol hay dihydroflavonol,

flavanonol có cấu trúc giống như flavanon chỉ khác nhóm thế hydroxi ở vị trí

Người ta đã biết đến khoảng 30 hợp chất thuộc nhóm này, phần lớn

chúng ở dạng aglycon, chỉ có vài chất ở dạng glycozit Flavanonol-3 có hai

nguyên tử cacbon bất đối là C2 và C3 nên chúng có tính quang hoạt Các hợp

chất flavanonol-3 thường gặp là aromadendrin, fustin và taxifolin

O

O

OH HO

Chalcon khác với các loại Flavonoid khác là nhóm chalcon gồm hai

vòng benzen A và B được nối với nhau bởi một mạch hở có 3 nguyên tử

cacbon, số thứ tự các nguyên tố được bắt đầu đánh từ vòng B

Hiện nay người ta biết đến khoảng 20 hợp chất chalcon, ngoài ra còn

thấy hợp chất dihydrochalcon Tuy vậy, giữa chalcon và dihydrochalcon hầu

như không có mối quan hệ khăng khít nào Chalcon có thể bị đồng phân hoá

thành flavanon khi đun nóng với axit clohydric (HCl)

1.2.2.5 Auron

Auron là hợp chất có vòng C là một dị vòng 5 cạnh Công thức cấu tạo

chung của nhóm auron như sau:

C

Hình 1.10: Auron

Auron có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng

Shinoda (phản ứng định tính flavonoid) Trong tự nhiên, các chalcon-glycozit

dễ bị oxy hóa thành auron-glycozit nên hai nhóm chất này tồn tại cạnh nhau

Các auron-glycozit hay xuất hiện trong họ Cúc

1.2.2.6 Antoxianidin

Antoxianidin thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong

nước Công thức chung như sau:

Màu sắc của antoxianidin thay đổi theo pH Trong dung dịch axit vô

cơ, antoxianidin cho muối oxoni có màu đỏ, còn trong môi trường kiềm

chúng tạo thành các anhydrobazơ với một nhóm quinoid màu xanh:

O

OH

OH HO

OH

Hình 1.12: Các dạng chuyển hoá của antoxianidin 1.2.2.7 Leucoantoxianidin (flavan – 3,4 – điol)

Leucoantoxianidin còn gọi là flavan-3,4- diol Các hợp chất này mới

chỉ tìm thấy ở dạng aglycon, chưa tìm thấy ở dạng glycozit

O

O

OH

Hình 1.13: Leucoantoxianidin 1.2.2.8 Catechin

Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol Do có hai trung tâm cacbon bất

đối nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang

Isoflavonoid bao gồm các dẫn xuất của 3- phenyl chroman, được chia

O

O

Hình 1.17: Isoflavon Hình 1.18: Isoflavanon

1.2.2.10 Rotenoid và neoflavonoid

Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc

cũng như sinh tổng hợp Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử

cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai Công thức như sau:

Hình 1.19: Rotenoid

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân

cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá

thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng

với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác

nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung

môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Độ hòa tan của các flavonoid phụ thuộc vào vị trí và số lượng nhóm

- OH và các nhóm thế khác của chúng Do số lượng và vị trí nhóm –OH giữa

- Flavonoid glycozit là các flavon và các flavonol có nhiều nhóm –OH,

các biflavon là các chất phân cực mạnh thì người ta dung các dung môi phân

cực như CH3OH, C2H5OH

- Aglycon, các flavon, flavonol có nhiều nhóm metoxy, ít nhóm –OH là

những chất có độ phân cực yếu Để chiết chúng, người ta dùng các dung môi

phân cực yếu như C6H6, CHCl3, CH3COOC2H5

Dung môi nếu lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và

chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này cần được chưng

cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Có một số chất dẻo thường lẫn

trong dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat và tri-n-butyl

axetylcitrar Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất

hoặc trong khâu bảo quản như trong các nút đậy bằng nhựa hoặc trong các

thùng chứa

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)

phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân

lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử

nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlorofrom, metyl

clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình

chiết sơ bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả…

Những tạp chất của chlorofom như CH2ClBr, CH2Cl2 có thể phản ứng

với vài hợp chất như các ancaloid tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác

Tương tự như vậy, sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có

thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất

khác Chlorofom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với

chất này cần thao tác cẩn thận và khéo léo ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt

nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofom

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hidrocacbon thế clo Các dung môi thuộc nhóm rượu được cho rằng sẽ thấm

tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được

lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của

chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol

hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân

cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị

hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính

tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm được tạo thành khi dùng methanol

trong suốt quá trình chiết [4] Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechonaetes

aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ

1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết

trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà

thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành

peroxit dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp

chất không có khả năng tạo cholesterol như các calotenoid Tiếp đến là axeton

cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit

Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình

phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit – bazơ có thể

tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp

cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷ của chất bởi dung môi và quá trình

tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không

quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.3.2 Qúa trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi

nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và

thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung

môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước

đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể

dùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương

pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ

thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những

chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách

khác nhau

Ví dụ:

- Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất

này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:

Đragendroff và tác nhân Mayer

- Các flavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết

chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và

sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde

có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với

anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể

biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung

môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao

Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp

chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ.[7, 8]

Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và

hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp

chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất

hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động

Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất

của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan ) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác

nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc

theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá

trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh

sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa

hai pha tĩnh và pha động ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự

phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch

(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử

đẳng nhiệt Langmuir:

1

n b C n

b C







n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b - hằng số

C - nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng

thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm

lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra

thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1 Sắc ký cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm

các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,

ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh

hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết

sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp

phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng

tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt

càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng

trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy

được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp

suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất

quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu

cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa

quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này

mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp

phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ

này thấp (từ 1/5 – 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ

số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong

khoảng 1/20-1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc

vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các

phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là

tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh,

thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột

với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp

vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất

hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột

đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung