Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease nội tạng tôm hùm xanh (panulirus homarus) nuôi tại vùng biển khánh hòa

Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ của enzyme protease nội tạng tôm hùm xanh khi ủ trong 1 giờ ...39 Hình 3.5..  Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm enzyme prot

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRỊNH THỊ KIM LIÊN

TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT

CỦA PROTEASE NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus)

NUÔI TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HOÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRỊNH THỊ KIM LIÊN

TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE

NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH (Panulirus homarus)

NUÔI TẠI VÙNG BIỂN KHÁNH HOÀ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt chương trình thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch và luận văn này, đầu tiên tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học sự kính trọng và cảm ơn sâu sắc nhất

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy Đỗ Văn Ninh và thầy Đỗ Lê Hữu Nam đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tụy và những lời khuyên quý giá trong suốt quá trình thực hiện

đề tài này

Cảm ơn PGS – TS Lại Văn Hùng – Trưởng Khoa Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nha Trang – Chủ nhiệm Đề tài, đã cung cấp tôm hùm để thu nhận enzyme nội tạng và hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài này

Trân trọng cảm ơn đến Ban lãnh đạo Thanh tra sở Nông nghiệp và PTNT Khánh Hòa đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành chương trình học cao học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Đỗ Thị Tuyến (Viện Sinh học nhiệt đới T.P Hồ Chí Minh) và chị Nguyễn Minh Nhật (Trung tâm Thí nghiệm – Thực hành, Đại học Nha Trang) đã giúp đỡ nhiệt tình cho tôi hoàn thành tốt đề tài

Chân thành cảm ơn sự động viên của các anh chị và các bạn trong lớp cao học Công nghệ sau thu hoạch khóa 2011

Cuối cùng tôi chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Khánh Hòa, tháng 11 năm 2014

Trịnh Thị Kim Liên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các nội dung nghiên cứu và kết quả trình bày trong luận văn

“Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease nội tạng Tôm hùm xanh (Panulirus

homarus) nuôi tại vùng biển Khánh Hoà” là trung thực và rõ ràng

Học viên

Trịnh Thị Kim Liên

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm sinh học của tôm hùm xanh 3

1.1.1 Phân loại và hình thái 3

1.1.2 Đặc điểm phân bố 4

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 5

1.1.4 Đặc điểm sinh sản 6

1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 6

1.1.6 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tôm hùm nuôi 7

1.1.6.1 Nhiệt độ nước 7

1.1.6.2 Độ mặn 7

1.1.6.3 Thức ăn 7

1.1.6.4 Chất lượng nước 8

1.1.6.5 Hàm lượng oxy hoà tan 8

1.2 Tình hình nghiên cứu dinh dưỡng của tôm hùm 8

1.3 Tình hình nghiên cứu thức ăn viên cho tôm hùm 8

1.3.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 8

1.3.2 Các công trình nghiên cứu ngoài nước 10

1.4 Các nghiên cứu về trong và ngoài nước về hệ enzyme protease của tôm hùm 12

1.5 Enzyme protease 14

1.5.1 Một số khái niệm cơ bản về enzyme 14

1.5.2 Bản chất cấu trúc của enzyme 14

1.5.3 Phân loại Protease 16

1.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của protease 17

1.5.5 Phương pháp phân tách và làm sạch enzyme 18

1.5.5.1 Phương pháp trích ly enzyme 18

1.5.5.2 Phương pháp làm sạch enzyme 19

1.5.5.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 20

1.5.6 Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS – PAGE 23

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Thời gian và địa điểm 25

2.2 Vật liệu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Sơ đồ quá trình nghiên cứu tổng quát 26

2.3.2 Tách chiết protease từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) 27

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm protease 27

2.3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease 27

2.3.3.2 Xác định độ bền nhiệt của protease tôm hùm xanh 28

2.3.3.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease 28

2.3.3.4 Xác định độ bền pH của protease tôm hùm xanh 30

2.3.3.5 Ảnh hưởng của ion kim loại hoá trị II đến hoạt độ của protease 31

2.3.4 Các phương pháp nghiên cứu đã áp dụng 31

2.3.4.1 Hàm lượng protein hòa tan xác định theo phương pháp Lowry 31

2.3.4.2 Xác định hoạt độ của protease từ nội tạng tôm hùm xanh theo phương pháp Anson 31

2.3.4.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel 31

2.3.4.4 Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 32

2.4 Thiết bị, hóa chất dùng trong nghiên cứu 32

2.4.1 Thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 32

2.4.2 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 33

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Thu nhận chế phẩm enzyme protease thô từ tôm hùm xanh 34

3.1.1 Quá trình chuẩn bị nguyên liệu và xử lý tôm hùm để thu nhận nội tạng 34

3.1.2 Kết quả xử lý nội tạng để thu dịch chiết enzyme nội tạng tôm hùm 34

3.1.3 Kết quả tủa protease bằng ethanol 96% để thu chế phẩm protease thô 34

3.1.4 Kết quả xác định hàm lượng protein trong chế phẩm protease thô nội tạng tôm hùm xanh 35

3.1.5 Kết quả xác định hoạt độ protease trong chế phẩm enzyme thô nội tạng tôm hùm xanh 36

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease 37

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease 37

3.2.2 Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease 38

3.2.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme protease 40

3.2.4 Khảo sát độ bền pH của enzyme protease 41

3.2.5 Xác định sự ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ enzyme protease 42

3.3 Tinh sạch chế phẩm protease thô bằng sắc ký lọc gel 44

3.4 Xác định trọng lượng phân tử của protease bằng điện di SDS – PAGE 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CL Carapace length: kích thước chiều dài phần giáp đầu ngực

EFA Các axít béo cần thiết

SGR Tốc độ tăng trưởng đặc trưng

AWG Tăng trưởng đạt theo tuần

DGC Hệ số tăng trưởng tương đối theo ngày

HĐR Hoạt độ riêng của protease

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 3.1 Kết quả xác định hàm lượng protein trong mẫu CPT 36Bảng 3.2 Kết quả xác định mM tyrosine theo phương pháp Anson 36Bảng 3.3 Lượng CPT, hàm lượng protein và hoạt độ protease của chế phẩm protease thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh 37Bảng 3.4 Bảng hoạt độ riêng, độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease 44Bảng 3.5 Kết quả xác định trọng lượng phân tử của protein trong mẫu CPT protease nội tạng tôm hùm xanh sau khi tinh sạch 47

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1.Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) 3

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái của tôm hùm 4

Hình 2.1 Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) dùng trong nghiên cứu 25

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình nghiên cứu tổng quát 26

Hình 2.3 Sơ đồ quá trình tách chiết thu chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) 27

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm protease thô 28

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của chế phẩm protease thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh 29

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt độ của 29

của chế phẩm protease thô .29

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền pH của chế phẩm protease thô 30

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đến hoạt độ của chế phẩm protease thô 30

Hình 3.1 Đường chuẩn Albumin 35

Hình 3.2 Đường chuẩn Tyrosin 36

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ của enzyme protease nội tạng tôm hùm xanh 38

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ của enzyme protease nội tạng tôm hùm xanh khi ủ trong 1 giờ 39

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease nội tạng tôm hùm xanh .40

Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt độ của enzyme protease 42

khi ủ trong 1 giờ .42

Hình 3.7 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đối với hoạt độ 43

của enzyme protease nội tạng tôm hùm xanh 43

Hình 3.8 Sắc ký đồ protein trong chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm hùm 44

Hình 3.9 Hình ảnh phổ điện di protein của chế phẩm protease nội tạng tôm hùm xanh sau khi tinh sạch bằng phương pháp điện di SDS - PAGE 45

MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tôm hùm xanh hay còn gọi là tôm hùm đá (Panulirus homarus) là những đối

tượng nuôi biển có tốc độ tăng trưởng trung bình, tuy nhiên chúng có giá trị kinh tế cao nên hiện đang được nghiên cứu và nuôi ở một số nước trên thế giới như: New Zealand, Việt Nam, Úc, Philippines (Smith et al., 2003; Tuan & Mao, 2004; William

et al., 2005) Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm bắt đầu từ năm 1992, đến nay nghề nuôi tôm hùm lồng đang phát triển mạnh, số lượng lồng tăng lên đáng kể, sản lượng tôm

hùm lồng đạt 1,3 nghìn tấn, tăng 22,7% (Tổng Cục Thống kê, 2011) Lượng lồng tôm

hùm nuôi ở Khánh Hòa chiếm 2/3 trong tổng số lượng lồng nuôi của cả nước, toàn tỉnh

có 23 tiểu vùng được phân theo địa giới hành chính của 04 vùng nuôi chính là Vạn Ninh, Ninh Hòa, Nha Trang và Cam Ranh, với 18.842 lồng nuôi sản lượng tôm hùm lồng đạt gần 1000 tấn/ năm (Chi cục Nuôi trồng thuỷ sản Khánh Hoà, 2013) Các loài

tôm hùm được nuôi chính là: Tôm hùm bông (Panulirus ornatus) và Tôm hùm xanh (Panulirus homarus)

Trong nghề nuôi tôm hùm ở Việt Nam, cá tạp, cua, ghẹ, sò nhỏ được xem là nguồn thức ăn chủ yếu Tuy nhiên việc sử dụng nguồn thức ăn này có những bất lợi như gây ô nhiễm môi trường, cạnh tranh nguồn cá tạp với các mục đích sử dụng khác: thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, gia cầm…, người nuôi không chủ động nguồn thức ăn nhất là vào mùa mưa bão (Tuan và cs, 2000)

Để khắc phục tình trạng trên, hướng nghiên cứu sản xuất thức ăn tổng hợp dạng viên cho nuôi tôm hùm lồng là rất cần thiết (Lê Anh Tuấn, 2005) Tuy vậy những thông tin về dinh dưỡng và nghiên cứu sử dụng thức ăn tổng hợp dạng viên cho tôm hùm hiện nay còn hạn chế Các công trình nghiên cứu về nhu cầu dinh dưỡng của tôm hùm nhằm phát triển thức ăn tổng hợp dạng viên cho tôm hùm để thay thế cho nguồn thức ăn là cá tạp đã được nghiên cứu nhưng chủ yếu tập trung vào đối tượng tôm hùm

bông (Panulirus ornatus) như: Smith và cs (2003, 2005), Mai Như Thuỷ (2006) Đối tượng tôm hùm xanh Panulirus homarus hiện được nuôi phổ biến ở Phú Yên, Khánh

Hòa, Ninh Thuận cũng đã có những nghiên cứu thử nghiệm sản xuất thức ăn tổng hợp viên Tuy nhiên thức ăn công nghiệp cho tôm hùm vẫn chưa được sản xuất và ứng dụng hiệu quả Do đó để sản xuất thức ăn công nghiệp đáp ứng nhu cầu sinh trưởng của tôm hùm cần nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng, nhất là nghiên cứu hệ enzyme tiêu

hoá của tôm hùm làm cơ sở khoa học xây dựng khẩu phần thức ăn và các giải pháp nâng cao chất lượng thức ăn công nghiệp cho tôm hùm

Hoạt động của hệ enzyme tiêu hóa tôm hùm liên quan chặt chẽ tới các thành phần dinh dưỡng trong thức ăn, phản ánh tập tính ăn, phổ thức ăn và khả năng sử dụng các nguồn thức ăn khác nhau Nghiên cứu thành phần, tính chất enzyme trong hệ tiêu hoá của tôm hùm để làm cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về nhu cầu dinh dưỡng của chúng là cần thiết Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tách chiết, tinh

sạch và tính chất của protease nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) nuôi tại

vùng biển Khánh Hoà”

MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Mục đích: Tách chiết, tinh sạch và bước đầu xác định một số tính chất của

protease nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm nuôi tại

vùng biển Cam Ranh, Khánh Hoà

 Nội dung nghiên cứu

 Tách chiết protease từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn

thương phẩm nuôi tại vùng biển Khánh Hòa

 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm enzyme protease thô được tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh

+ Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease

+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease

+ Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại hoá trị II đến hoạt độ của protease

 Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel

 Xác định trọng lượng phân tử của protease bằng điện di SDS – PAGE

Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Các số liệu nghiên cứu của đề tài bổ sung cho sự hiểu biết về hệ enzyme tiêu hoá

protein của tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Đề tài cung cấp cơ sở dữ liệu về một số tính chất của protease nội tạng tôm hùm

xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm cho các nghiên cứu trong tương lai

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học của tôm hùm xanh

1.1.1 Phân loại và hình thái

Theo hệ thống phân loại của George và Holthuis (1965), tôm hùm xanh (tôm hùm đá) có vị trí phân loại như sau:

Ngành chân đốt: Arthropoda

Lớp giáp xác : Crustacea

Bộ mười chân : Decapoda

Họ tôm hùm gai: Palinuridae

Hình 1.1.Tôm hùm xanh (Panulirus homarus)

(Nguồn: http://ropme.org/program7.html ) Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) còn gọi là tôm hùm đá có chân ngắn Toàn

thân có màu xanh lá cây nhạt Kích thước cơ thể không lớn, cá thể lớn nhất bắt gặp khoảng 1,5 kg, còn đa số khoảng 0,3 – 0,4 kg Đôi râu thứ hai dài khoảng 1,4 – 1,5 chiều dài cơ thể Năm đôi chân bò có những vòng ngang màu vàng nhạt Các đốt bụng

có rãnh ngang, mép trước của rãnh ngang có dạng lượn sóng thành những vòng nhỏ có nhiều lông mịn Hai cặp gai ở phiến gốc râu thứ nhất xếp cách đều nhau tạo thành hình vuông, giữa có nhiều gai nhỏ (Hình 1.1) (Nguyễn Trọng Nho và cs, 2006)

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái của tôm hùm

(Nguồn: http://animals.howstuffworks.com/marine-life/lobster-info1.html)

1.1.2 Đặc điểm phân bố

Phân bố của tôm hùm được quyết định bởi tính di truyền và quá trình thích nghi của loài với các điều kiện tự nhiên, môi trường ở từng vùng biển Chu kỳ sống của tôm hùm trải qua nhiều lần thay đổi môi trường sống khác nhau, nghĩa là mỗi giai đoạn sống của chúng gắn với một điều kiện sinh thái nhất định và tạo nên quần thể ấu trùng riêng biệt

Giai đoạn ấu trùng Phyllosoma sống trôi nổi như những sinh vật phù du trên biển

và đại dương vì thế khả năng phát tán là rất lớn do tác dụng của sóng, gió, dòng chảy,… Hầu như trong suốt thời kỳ này chúng luôn di chuyển và phụ thuộc hoàn toàn

vào điều kiện thủy văn môi trường biển khơi Sau khi ấu trùng Phyllosoma trải qua 12

- 15 lần lột xác biến thái chúng chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng Puerulus và bắt đầu đời sống định cư Ấu trùng Puerulus thường phân bố ở vùng gần dân cư, nguồn thức ăn khá phong phú Giai đoạn này ấu trùng Puerulus bơi chủ động hơn chúng

thích bám trên rong trên đá và các vật trong nước

Sau khoảng 4 lần lột xác và biến thái ấu trùng Puerulus chuyển sang giai đoạn tôm con (Juveline) Màu sắc hình thái giống với tôm trưởng thành Chúng sống trong

các vịnh, vũng, đầm,… ven biển

Tôm hùm khi đạt tới kích cỡ trưởng thành có xu hướng di chuyển ra khỏi các đầm, vũng, vịnh,… để đến những vùng rạn sâu hơn Nơi những điều kiện sinh thái phù hợp với sự sinh trưởng và sinh sản của loài

Ở Việt Nam, dọc bờ biển từ Quảng Bình, Quảng Trị đến Ninh Thuận, Bình Thuận có sự hình thành và phát triển của các kiểu dạng vũng, vịnh trên các đoạn bờ biển khác nhau, thích hợp cho quá trình sinh sống, nhập cư và di cư của tôm hùm con

từ biển khơi vào vịnh, rồi từ vịnh trở lại biển khơi Tuy nhiên khác với giai đoạn ấu trùng, tôm hùm con sống đáy ổn định hơn và thường tập trung ở những vùng rạn trong các vịnh, vũng, đầm với độ sâu phân bố dao động từ 0,5 – 5,0 m Tập tính sống bầy đàn thể hiện rất rõ Chúng thường nấp trong các khe, kẽ đá, hoặc bám chắc vào những hõm, lỗ nhỏ của đá ghềnh Vùng thềm lục địa miền Trung nước ta có nhiều đá ngầm,

đá nổi , rạn đá, rạn san hô,… là nơi cư trú rất thích hợp cho tôm hùm trưởng thành Trong suốt thời kì này, tôm hùm thường sống trong các vùng rạn ngầm và rạn ghềnh

có độ sâu từ 10 đến 50 m, thường là các vùng rạn ven bờ và các hải đảo, nền đáy là đá tảng, san hô và cát bùn (Mai Như Thủy, 2006)

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Sinh trưởng của tôm hùm được xác định bằng sự gia tăng về chiều dài giáp đầu ngực hoặc khối lượng cơ thể Chu kỳ lột xác thể hiện mức độ sinh trưởng cá thể của loài, khi lột xác khối lượng cơ thể tăng lên rõ rệt Có nhiều yếu tố tác động trực tiếp hay gián tiếp đến chu kỳ lột xác của tôm hùm bao gồm nhiệt độ nước, ánh sáng,… và các yếu tố nội tại của cơ thể bao gồm các hormone kích thích lột xác hay các hormone

ức chế lột xác Ba yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến chu kỳ lột xác của tôm hùm là thức

ăn, nhiệt độ nước và tính di truyền của loài, nhiều tác giả đã nhấn mạnh tầm quan trọng của thức ăn và việc quản lý chăm sóc là tác nhân làm tăng tần số lột xác đáng kể

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thúy (2004), trên tôm hùm bông (P ornatus), nhóm tôm con có kích thước 15 - 20 mm CL (chiều dài giáp đầu ngực), ở

nhiệt độ bình thường (26 - 27oC) thì thời gian giữa 2 lần lột xác là 8 - 12 ngày nhưng khi nhiệt độ tăng cao và ổn định (29 - 30oC) thời gian lột xác giảm xuống khoảng một nửa, khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 20 -24oC thời gian giữa 2 lần lột xác kéo dài gấp 1 – 1,2 lần Thành phần dinh dưỡng của thức ăn có ý nghĩa rất quan trọng đối với sinh trưởng của tôm con, thức ăn giàu các axít amin không thay thế và các axít béo không

no có tác dụng kích thích sinh trưởng tôm con rõ rệt Ngoài ra độ mặn cũng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của tôm độ mặn thích hợp cho sự phát triển của tôm hùm con là 25 - 35‰

Đối với tôm hùm, ở cùng một nhóm chiều dài CL thì chu trình lột xác giữa các loài không có sự sai khác nhau một cách đáng kể, nhưng các nhóm kích thước khác

nhau thì chu trình lột xác hoàn toàn khác nhau Ví dụ như với nhóm kích thước từ 8 -

13 mm (CL), thời gian giữa 2 lần lột xác khoảng 8 - 10 ngày, còn nhóm kích thước 63

- 68 mm (CL) thì chu kì lột xác khoảng 40 ngày ở cả 2 loài tôm hùm bông (P.ornatus)

và tôm hùm xanh (P homarus)

Qua mỗi lần lột xác thì tỉ lệ phần trăm khối lượng tăng, tỉ lệ chiều dài giáp đầu ngực của tôm giảm xuống, độ dài vỏ của cá thể tăng Nhìn chung thì tôm hùm có chu

kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp xác khác, do vậy tốc độ tăng tưởng của chúng tương đối chậm

1.1.4 Đặc điểm sinh sản

Tôm hùm thuộc giống Panulirus nói chung, con tôm đực luôn có kích thước lớn

hơn con tôm cái khi đạt đến giai đoạn thành thục sinh dục và cá thể đực có đôi chân bò dài hơn hẳn cá thể cái Quá trình cặp đôi giao vĩ chia làm 2 pha khá rõ rệt Pha trước giao vĩ kéo dài khoảng 5 - 13 giờ và pha giao vĩ kéo dài khoảng 3 - 12 giờ, tuy nhiên thời gian giao vĩ hoàn toàn khoảng 1 - 2 phút Sau khi giao vĩ xong, buồng trứng tiếp tục phát triển, con cái có xu hướng chuyển đến những vùng có rạn đá sâu, nhiều hang hóc để đẻ trứng Khi tôm hùm đẻ, trứng thụ tinh bám dính các nhánh trong chân bụng thứ nhất đến thứ tư của tôm mẹ, ở đây trứng phát triển qua các giai đoạn phôi khác nhau cho đến khi nở ra ấu trùng Từ lúc trứng nở đến giai đoạn “tôm trắng” kéo dài

khoảng 10 - 12 tháng Tôm hùm xanh loài (P homarus) sinh sản tập trung vào tháng 4

và tháng 5 hàng năm (Nguyễn Thị Bích Thúy, 2004)

1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Nguyễn Trọng Nho và cs (2006) cho rằng nguồn cung cấp năng lượng duy nhất cho tôm hùm sinh trưởng và phát triển là các loại thức ăn Song tùy theo loài và các giai đoạn phát triển mà phổ thức ăn của chúng thay đổi khác nhau Ngoài tự nhiên tôm hùm thường kiếm mồi vào ban đêm, thích mồi sống, ăn cả mồi chết, ngay cả thịt gia súc, gia cầm chết Nghiên cứu về phổ thức ăn của tôm hùm cho thấy, đây là loài thuộc nhóm giáp xác ăn thịt nhưng ít đi kiếm ăn, trong dạ dày của chúng có tới 65 loài sinh vật làm thức ăn, chiếm ưu thế là động vật thân mềm một mảnh vỏ và hai mảnh vỏ Tuy nhiên, khả năng đồng hóa thức ăn của tôm hùm tương đối thấp

Trong các thí nghiệm, tôm hùm con được cho ăn động vật thân mềm hai mảnh vỏ sinh trưởng nhanh hơn tôm hùm chỉ có ăn cá Nếu thiếu thức ăn hoặc thức ăn thiếu canxi, chúng thường ăn thịt lẫn nhau, nhất là khi tôm lột xác Vì vậy, trong thức ăn cho tôm hùm nên có một lượng tôm, cua (khoảng 30%) Các nghiên cứu gần đây nhận

thấy: tôm hùm được nuôi thành đàn thì tôm ăn mồi nhiều hơn khi nuôi riêng lẻ, khi có chỗ ẩn nấp, tôm hùm con ăn nhiều hơn, sinh trưởng nhanh hơn Sự ăn mồi của tôm hùm cũng thay đổi theo chu kỳ lột xác Trước lột xác khoảng 2 ngày và sau lột xác 2 ngày, chúng hầu như ngừng ăn Sau thời gian nhịn đói, tôm ăn rất nhiều trong 4 - 5 ngày tiếp theo, sau đó chúng giảm ăn dần và trở lại mức bình thường

1.1.6 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tôm hùm nuôi

1.1.6.1 Nhiệt độ nước

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng, quyết định sự phân của các giống

tôm hùm trong họ Palinuridae Hầu hết các loài thuộc giống Panulirus sống ở vùng

biển ấm, nhiệt độ dao động từ 20 - 300C, trung bình khoảng 250C

Ở vùng biển miền Trung Việt Nam, theo những số liệu điều tra cho thấy, nhiệt độ nước vùng phân bố tôm hùm bông nhỏ ngoài tự nhiên dao động từ 24 - 310C; còn ở tôm hùm trưởng thành dao động từ 26 - 290C vào mùa hè và khoảng 22 - 270C vào mùa đông Khi nhiệt độ nước thay đổi đột ngột, chẳng hạn như tăng 3 - 50C thì hầu như tôm hùm con bị chết, khi giảm nhiệt độ nước xuống 50C làm cho pha lột xác của tôm chậm lại và dừng lại hoàn toàn (Võ Văn Nha, 2008)

1.1.6.3 Thức ăn

Trong nuôi tôm hùm thương phẩm thức ăn chiếm tới 50 - 70% giá thành sản xuất Thức ăn phải đảm bảo giá trị dinh dưỡng và được tôm chấp nhận Để bảo đảm cho sự phát triển bền vững của nghề nuôi tôm hùm thì thức ăn phải đáp ứng được các yêu cầu về dinh dưỡng, tính sẵn có, giá rẻ, dễ bảo quản Yêu cầu của người nuôi lúc này là tìm ra loại thức ăn, chế độ cho ăn phù hợp giúp tôm tăng trưởng nhanh, hệ số thức ăn thấp và ít tác động tiêu cực đến môi trường

tổng số khi nuôi loài tôm hùm Jasus edwardsii nuôi trong hệ thống tuần hoàn nước

nên nhỏ hơn 0,5 mg/L, NH3-N không nên vượt quá 0,1 mg/l, NO2 - N bằng hoặc nhỏ hơn 1 mg/l, NO3 - N nhỏ hơn 100 mg/l, pH 7,8 – 8,2 (Hoàng Thị Thanh, 2008)

1.1.6.5 Hàm lượng oxy hoà tan

Hàm lượng oxy hoà tan rất quan trọng đối với thuỷ sinh vật nói chung và tôm hùm nói riêng Lượng oxy tôm tiêu thụ phụ thuộc vào giới tính của tôm, khối lượng cơ thể, giai đoạn lột xác, hoạt động bắt mồi, nhiệt độ nước và độ mặn, khi độ mặn và nhiệt độ nước cao thì hàm lượng oxy hoà tan thấp, các loại thức ăn dễ phân rã, thức ăn thừa cũng làm tăng nhu cầu oxy hoá sinh học, tỷ lệ tiêu thụ oxy ban đêm cao hơn ban ngày Hàm lượng oxy hòa tan trong nước vùng nuôi tôm hùm lồng trong khoảng 6,2 – 7,2 (mg/l) (Võ Văn Nha, 2008)

1.2 Tình hình nghiên cứu dinh dưỡng của tôm hùm [15]

Cho đến nay, nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về nhu cầu dinh dưỡng của tôm và giáp xác đã được công bố Những nghiên cứu này tập trung vào nhu cầu dinh dưỡng như nhu cầu protein, axít amin, lipit, axít béo, vitamin, lecithin, astaxanthin, khoáng, Thực tế cho thấy nhu cầu này khác nhau cho từng loài, từng giai đoạn phát triển và tùy thuộc vào môi trường sống Các thông tin đó là cơ sở quan trọng cho việc xác định các mức độ tối ưu về dinh dưỡng trong thành phần thức ăn cho từng loài giáp xác nói chung và tôm hùm nói riêng nhằm xây dựng và hoàn thiện thức

ăn tổng hợp dạng viên để thay thế cho nguồn thức ăn là cá tạp

1.3 Tình hình nghiên cứu thức ăn viên cho tôm hùm

1.3.1 Các công trình nghiên cứu trong nước

Năm 2004, Đinh Tấn Thiện đã thử nghiệm nuôi tôm hùm bông (Panulirus ornatus) giai đoạn giống bằng thức ăn cho tôm sú (P Monodon) và nhận thấy kết quả

sau 75 ngày nuôi, tôm hùm chết hoàn toàn Như vậy thức ăn tổng hợp cho tôm sú không thích hợp cho việc nuôi tôm hùm Tác giả cũng cho rằng ương tôm hùm con

bằng thức ăn gồm giáp xác và thân mềm đạt tỉ lệ sống ổn định với tỉ lệ 96,66%, cao hơn với được ăn các loại thức ăn khác

Năm 2006, Mai Như Thủy nghiên cứu thức ăn cho tôm hùm bông (Panulirus ornatus) giai đoạn 10 – 20 g, tại Khánh Hòa Kết quả thí nghiệm đối với 3 mức protein

thí nghiệm (45, 50, 55%) tốc độ tăng trưởng riêng của tôm thí nghiệm ở nghiệm thức 50% protein (8% lipid) đạt cao nhất (1,48%/ ngày) và thấp nhất là nghiệm thức 55% protein (12% lipid) (1,07%/ ngày) Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05)

Năm 2006, Lại Văn Hùng, những nghiên cứu bước đầu đã cho thấy hoàn toàn có

thể nuôi tôm hùm bông (Panulirus ornatus) bằng thức ăn viên Tuy vậy, loại thức ăn

mà tác giả Lại Văn Hùng sử dụng chưa có thành phần dinh dưỡng tối ưu nên mặc dù tỷ

lệ sống đạt 100% nhưng tốc độ tăng trưởng chỉ đạt 60% so với tôm nuôi bằng thức ăn

là "cá tạp" Nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng thức ăn viên để nuôi tôm hùm nhưng cần có các nghiên cứu sâu hơn về thành phần thức ăn của tôm hùm từ đó sản xuất một loại thức ăn phù hợp cho quá trình sinh trưởng phát triển của tôm

Tháng 02/2008, Hoàng Thị Thanh, nghiên cứu thay thế bột cá bằng bã đậu nành

và xác định nhu cầu n-3 HUFA trong thức ăn viên cho tôm hùm bông (Panulirrus ornatus) giai đoạn giống trong điều kiện thí nghiệm Kết quả cho thấy mức thay thế 0 -

40% protein bột cá bằng bã đậu nành trong thức ăn tổng hợp dạng viên cho tôm hùm ảnh hưởng lên tốc độ sinh trưởng của tôm Tốc độ tăng trưởng tương đối (WG) thấp nhất ở mức thay thế 40% Hệ số FCR tăng từ 1,70 lên 2,91 khi tăng mức thay thế từ 0 lên 40% Tỉ lệ sống của tôm thấp hơn so với thức ăn tươi Các mức n-3 HUFA trong thức ăn ảnh hưởng lên hệ số sinh trưởng hàng ngày (DGC) của tôm Hệ số DGC (0,74 – 0,75%/ngày) ở các nghiệm thức có mức EPA và DHA từ 1,83 – 2,06% cao hơn so với các nghiệm thức có mức EPA và DHA từ 1,58 – 1,65% (DGC từ 0,59 – 0,60%)

Tỷ lệ sống từ 38,3 – 47,5%, hệ số FCR từ 1,54 – 2,06 và có xu hướng tăng khi mức EPA và DHA trong thức ăn giảm

Năm 2010, Lại Văn Hùng và cộng sự thực hiện các thí nghiệm kéo dài trong 8 tuần nhằm đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng protein và lipid trong thức ăn tổng hợp

đến sinh trưởng của tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn nuôi thương phẩm

Kết quả thí nghiệm cho thấy sự sai khác ý nghĩa về tốc độ tăng trưởng đặc trưng (SGR); tăng trưởng đạt theo tuần (AWG); hệ số tăng trưởng tương đối theo ngày (DGC) và tỷ lệ sống của tôm hùm xanh thí nghiệm khi cho ăn thức ăn có hàm lượng

protein và lipid khác nhau Kết quả phân tích cũng cho thấy thức ăn có hàm lượng protein 52% và lipid 11% là thích hợp nhất cho sự phát triển của tôm hùm xanh giai đoạn nuôi thương phẩm

Tác giả Lê Xuân Sơn cũng đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ DHA/ EPA trong thức ăn tổng hợp đến sự phát triển của tôm hùm xanh giai đoạn giống và giai đoạn nuôi thương phẩm Theo tác giả thì tỷ lệ DHA/EPA là 1,9 % /0,23 % (tính theo % của lipid) tương ứng với mức bổ sung Protein Selco 2,84% (chất làm giàu DHA, EPA) là thích hợp cho sự sinh trưởng của tôm hùm xanh giai đoạn giống Hàm lượng DHA 1,90 ÷ 2,10% và hàm lượng EPA 0,16 ÷ 0,20 % là thích hợp cho sinh trưởng của tôm hùm xanh thương phẩm Nếu thức ăn tổng hợp bổ sung tỷ lệ dầu mực/dầu đậu nành (3/0) tương ứng với tỉ lệ DHA/EPA: 2,25%/ 0,37% (tính theo % của lipid) là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tôm hùm xanh giống và (3/2) tương ứng với hàm lượng DHA/EPA: 1,81%/ 0,15% (tính theo % của lipid) là thích hợp cho sinh trưởng của tôm hùm xanh giai đoạn nuôi thương phẩm

1.3.2 Các công trình nghiên cứu ngoài nước

Từ năm 2000 trở lại đây, TS William Kevin và Roland Picher (CSIRO Marine Rerearch), Clive Jones (QDPI Northen Fisheries Center) và cơ quan nghiên cứu của

Úc đã phối hợp với Việt Nam để nghiên cứu về tôm hùm

Năm 2003, K.C William, D.M Smith và cs, những nghiên cứu về tôm hùm, đều thống nhất có thể nuôi tôm hùm bằng thức ăn tổng hợp nhưng tốc độ tăng trưởng và tỷ

lệ sống còn thấp và đề nghị tiếp tục nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng làm cơ sở sản xuất thức ăn viên nuôi tôm

Năm 2003, D.J Johnston và cs nghiên cứu xác định tác dụng của tỉ lệ carbonhydrat/ lipid và điều kiện dinh dưỡng lên sự sinh trưởng của tôm hùm đá miền

Nam Jasus edwardsii giai đoạn Juvenile Sau 84 ngày thực nghiệm trong hệ thống

tuần hoàn nước có nhiệt độ 180C với các tỉ lệ khác nhau của carbohydrat/ lipid (17:1, 5:1, 2:1, 0,8:1) Kết quả cho thấy sự phát triển của tôm ở tỉ lệ 2:1 (27% carbohydrate and 13.5% lipid) là tốt nhất với (4,9 g/ 84 ngày); sau đó là 0,8:1 (4,18 g/ 84 ngày); 5:1 (3,46 g/ 84 ngày); 17:1 (2,36 g/ 84 ngày)

Năm 2004, D Smith, K.C William và cs nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng protein và lipid khác nhau trong thức ăn cho tôm hùm bông Các tác giả trên đã cho thấy thức ăn với các hàm lượng lipid 6% và 10% ứng với các hàm lượng protein: 30%, 35%, 40%, 45%, 50% và 60% thì tốc độ tăng trưởng của tôm hùm có tương

quan thuận với hàm lượng protein trong thức ăn

Năm 2004, nghiên cứu của J.A Esterhuizen về thức ăn cho tôm hùm đá Jasus lalandii giai đoạn hậu ấu trùng pueruli và giai đoạn giống juvenile Trong các thức ăn

được thử nghiệm cho thấy tốc độ sinh trưởng của tôm hùm khi ăn thức ăn vẹm và cho

ăn luân phiên vẹm và thức ăn tổng hợp của tôm thì không khác nhau, tuy nhiên, nếu cho ăn thức tổng hợp thì tốc độ phát triển kém hơn so với hai nghiệm thức trên Tôm cho ăn thức ăn là vẹm thì tỉ lệ sống cao nhất J.A Esterhuizen cho rằng sự mất cân đối các axít béo có thể là nguyên nhân chính làm cho tốc độ phát triển và tỉ lệ sống của tôm hùm thấp khi chỉ ăn thức ăn tổng hợp của tôm

Smith và cs (2005) thử nghiệm các mức protein từ 33 - 61% làm thức ăn cho tôm

hùm bông (Panulirus ornatus) thấy rằng, tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống cao hơn so

với cho tôm ăn bằng vẹm xanh và càng tăng mức protein trong thức ăn thì tốc độ tăng trưởng của tôm càng tăng, tuy nhiên tỷ lệ sống cao và ổn định (79 - 84%) lại nằm ở các nghiệm thức có mức protein lần lượt là 40; 47 và 60%

Hoang D.H và cs, (2009) với đối tượng nghiên cứu là tôm hùm bông (Panulirus ornatus) nuôi tại vịnh Vân Phong (Khánh Hòa, Việt Nam) với thức ăn là cá tạp có và không bổ sung vẹm (Perna viridis) Nghiên cứu này đã chứng minh tôm hùm cho

thức ăn cá tạp có bổ sung vẹm thì tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng tốt hơn so với thức

ăn không có bổ sung vẹm Tác giả cho rằng điều này có liên quan đến các chất dinh dưỡng được bổ sung từ vẹm

Năm 2009, Kevin C Williams cho rằng, tôm hùm bông (P ornatus) giai đoạn

hậu ấu trùng (postlarvae) phát triển tốt khi cung cấp thức ăn tổng hợp có chứa hàm lượng protein tiêu hóa > 57% DM, lipid tổng số từ 10 - 11% DM (DM: hàm lượng

chất khô) Trong khi đó tôm hùm Panulirus cygnus và Jasus edwardsii có nhu cầu về

protein và lipid thấp hơn Tác giả cũng cho rằng, đến nay có rất ít nghiên cứu đề cập

về nhu cầu dinh dưỡng lipid cần thiết, đặc biệt là cholesterol, phospholipit và các axít béo cần thiết Điều này rất quan trọng trong việc làm giảm giá thành của thức ăn tổng hợp cho tôm hùm khi sử dụng các thành phần có nguồn gốc trên cạn thay thế cho các thành có nguồn gốc ở biển

Nhìn chung, trên thế giới cũng như ở Việt Nam mới chỉ bắt đầu nghiên cứu về thức ăn tôm hùm Các nghiên cứu của các tác giả tại Việt Nam còn khá đơn giản và chưa xác định được đầy đủ các nhu cầu dinh dưỡng của tôm hùm, đặc biệt thức ăn cho

tôm hùm xanh (Panulirus homarus) ở giai đoạn giống và nuôi thương phẩm Nên các

loại thức ăn tôm hùm sản xuất ở Việt Nam chưa đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của tôm

Do vậy việc “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của protease nội tạng tôm hùm xanh nuôi tại vùng biển Khánh Hoà” là cần thiết nhằm góp phần làm cơ sở cho sản xuất thức ăn công nghiệp nuôi tôm hùm

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hệ enzyme protease của tôm hùm

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào về enzyme hệ tiêu hoá của tôm hùm trong nước, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm khảo sát hệ protease trong tiêu hoá thức ăn của tôm hùm xanh để đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến hệ enzyme này, đồng thời ứng dụng để xây dựng khẩu phần dinh dưỡng hợp lý trong thức ăn tổng hợp viên cho tôm hùm lồng

Các tác giả nước ngoài cũng đã có nghiên cứu về enzyme protease nội tạng tôm hùm: F Galgani và F Nagayama (1987) đã tiến hành nghiên cứu hệ protease tiêu hoá

ở tôm hùm gai Nhật Bản Panulirus japonicus, cho thấy tuyến tiêu hoá của chúng hoạt

động ở pH tối ưu là 7,5 và nhiệt độ thích hợp là 60oC Ủ dịch chiết hệ tiêu hoá tôm hùm gai ở 37 oC và pH 4,0 làm cho chúng bị bất hoạt không thuận nghịch sau 24 giờ

Trypsin, collagenase, leucin aminopeptidase và cả carboxypeptidases a và b đều

được tìm thấy trong tuyến tiêu hoá của tôm hùm gai Nhật Bản Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự hoạt động của chymotrypsin Trọng lượng phân tử của trypsin và collagenase là 24.000 Da

Năm 1994, H Glass và J Stark cũng đã có những nghiên cứu về hoạt động tiêu

hoá protein ở tôm hùm Châu Âu Homarus gammarus, kết quả khi tiến hành thuỷ phân

casein với hai mẫu ly trích từ dạ dày và gan tuỵ của tôm hùm Châu Âu ở pH khác nhau thì pH tối ưu cho hoạt động phân giải này là pH 2,3 và 5,8, tương ứng với từng mẫu dịch chiết Hai nhà khoa học cũng xác định dịch chiết từ gan tuỵ chứa endoprotease endoproteases - elastase (EC 3.4.21.36), trypsin (EC 3.4.21.4), exoproteases - leucine

aminopeptidase (EC 3.4.11.1), carboxypeptidases a (EC 3.4.17.1) và carboxypeptidase

b (EC 3.4.17.2), không phát hiện thấy hoạt động của chymotrypsin (EC 3.4.21.1) Các protease axít (pH tối ưu là 2.3) không phân giải N-acetyl phenylalanyl di-iodotyrosine

(cơ chất đặc hiệu của pepsin) và cũng không hoạt động ở khi ức chế bởi chất kìm hãm đặc biệt của pepsin là pepstatin A

A Zotos và K.D.A Taylor (1995) đã được nghiên cứu hoạt động phân giải

protein ở tôm hùm Na Uy (Nephrops norvegicus) với quy trình ly trích cải tiến và tinh

sạch từng phần thu được 3 band protease (gọi là band I, II và III) từ đầu tôm hùm Na

Uy bằng cách phối hợp kết tủa acetone rồi dùng sắc ký cột DEAE – Sepharose CL-6B Tác giả sử dụng casein làm cơ chất, kết quả nghiên cứu cho thấy protease III có hoạt

độ tốt nhất ở pH 8,2, trong khi protease I và II có hoạt độ ở vùng pH quá rộng Protease III thể hiện đặc tính như một protease kiềm Zn – Serine bị ức chế mạnh hoạt

độ bởi PMSF, chất ức chế trypsin đậu nành, Co2+, Mn2+ và 1-10 phenanthroline Protease I bị ức chế mạnh bởi p-benzoquinone, iodo-acetamide, kim loại nặng (Ag+,

Cu2+) và 1-10 phenanthroline và vì vậy nên có tính chất như là protease Zn-thiol Protease II cũng bị kiềm hãm hoạt bởi các chất ức chế như protease I (nhưng phạm vi

ít hơn) và cũng mang đặc tính như một protease thiol Trọng lượng phân tử được xác định là 22,5, 45 và 45,5 kDa đối với protease I, II và III, lần lượt

M.V Laycock và cs (1989) đã tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính của hệ

proteinase cysteine tiêu hoá của tôm hùm Mỹ (Homarus americanus) Tác giả sử dụng

kết hợp sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và lọc gel để tinh sạch hệ enzyme này Proteinase cysteine chiếm tới 80% hoạt động phân giải protein trong khoang của gan tuỵ Các ion kim loại nặng Hg, Cu và Ag là chất ức chế hoạt động mạnh nhất Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ của proteinase tôm hùm với cơ chất là

benzyloxycarbonlalanine p-nitrophenyl ester cũng đã được nghiên cứu, kết quả cho

thấy giá trị kcat./ Km

Celis - Guerrero và đồng sự (2004) đã ước lượng hệ enzyme chịu trách nhiệm

tiêu hoá protein trong thức ăn và xác định đặc tính của chúng ở tôm hùm đỏ (Panulirus interruptus) Những thành phần tương tự như proteases đã được tìm thấy trong dịch dạ

dày, tuyến gan tuỵ và dịch ruột Sử dụng cơ chất đặc biệt và chất ức chế, chúng tôi đã xác định được một vài isotrypsin và isochymotrypsin bằng sắc ký lọc gel Hoạt độ protease được nhận thấy ở pH = 3 và giảm khi sử dụng chất ức chế pepstatin A

Năm 2008, E Perera, F.J Moyano và cs đã xác đính đặc tính của hệ enzyme tiêu

hoá chính ở tôm hùm gai Panulirus argus bằng cách sử dụng kết hợp các phương pháp

hoá sinh và điện di SDS – PAGE Kết quả hoạt độ của protease và amylase được tìm thấy ở dịch vị trong khi esterase và lipase hoạt động mạnh hơn ở tuyến ruột Một enzyme hoạt độ giống trypsin hoạt động mạnh ở cả hai nơi này Tác giả cũng sử dụng các chất ức chế protease thường thấy đối với protease serin và metalloprotease để thử nghiệm Kết quả là serine protease được chứng thực bằng điện di là có một số enzyme giống như isotrypsin (17 - 21 kDa) và một vài enzyme thì giống với isochymotrypsin (23 – 38 kDa) Amylase (38 – 47 kDa) đã xác định ở điện di và một dải phức tạp

isoenzymes esterases không đặc hiệu đã được tìm thấy ở tuyến tiêu hoá Nghiên cứu

này cũng là cơ sở sinh hoá cho tập tính ăn uống của Panulirus argus Sự phân bố và

đặc tính của hệ enzyme cung cấp một số hiểu biết về sự tiêu hoá thức ăn và là cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về sinh lý tiêu hoá của tôm hùm gai

Ponnuswamy Vijayaraghavan và cs (2011) đã ly trích hệ cysteine proteinase từ

gan tuỵ của tôm hùm Ấn Độ Panulirus homarus Các enzyme này được tinh sạch bằng

cách dùng ammonium sulphate làm tác nhân kết tủa, kết hợp với sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel Enzyme này hoạt động rất mạnh ở pH 8,0 và nhiệt độ ủ tối ưu đã được tìm thấy là 600C Nó là một cysteine protease, cả β-Mercaptoethanol và dithiothritol đều ảnh hưởng đến hoạt độ của protease này Nghiên cứu được tiến hành để đánh giá trọng lượng phân tử của của protease biểu hiện Bốn protease được phân tách thành các band trên gel điện di SDS-PAGE từ 27 đến 45,5 kDa Band protease I và II (27 kDa, 29,5 kDa) thuộc nhóm cysteine và các band protein này bị xoá sạch khi thực hiện zymograpy trên gel đó với β-Mercaptoethanol và dithiothritol

1.5 Enzyme protease

1.5.1 Một số khái niệm cơ bản về enzyme [1,2]

Hầu hết các phản ứng hóa sinh học xảy ra trong hệ thống sống đều do enzyme xúc tác Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống cũng như xảy ra ở ngoài tế bào Mặt khác enzyme còn có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm, hàng nghìn lần so với các chất vô cơ thông thường Quan trọng hơn nữa là enzyme có khả năng xúc tác cho những phản ứng hóa học xảy ra trong những điều kiện nhiệt độ bình thường của cơ thể, ở pH môi trường gần pH sinh lý Trong khi các chất vô cơ không có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học thì enzyme có khả năng xúc tác đặc hiệu cao đối với kiểu phản ứng cũng như đối với cơ chất mà nó tác dụng

Ví dụ: axít clohydric có khả năng xúc tác thủy phân liên kết peptit có trong protein cũng như liên kết glycosit trong tinh bột Còn protease là enzyme chỉ thủy phân liên kết peptit trong protein mà không thủy phân liên kết glycosit trong tinh bột, còn amylase lại chỉ có khả năng thủy phân liên kết glycosit của tinh bột mà không thuỷ phân được liên kết peptit của protein Do những ưu điểm trên mà ngày nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme càng có ý nghĩa về mặt lý thuyết cũng như thực tiễn

1.5.2 Bản chất cấu trúc của enzyme [1,2]

Enzyme là các protein có hoạt độ sinh học, do vậy chúng có đầy đủ tính chất của

một protein Về khối lượng phân tử: enzyme là những protein có khối lượng phân tử lớn, đa số enzyme có khối lượng phân tử từ 6.000 ÷ 1.000.000 Da do vậy enzyme không thể đi qua được màng bán thấm

Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng và khi tan trong nước thì tạo thành dung dịch keo giống như dung dịch của protein, enzyme không tan trong dung môi phân cực

Enzyme bị kết tủa bởi các yếu tố gây kết tủa protein Các yếu tố vật lý và hóa học làm kết tủa protein thì cũng làm kết tủa enzyme Enzyme cũng bị mất hoạt độ khi bị tác động bởi các yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, axít hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng… Enzyme được cấu tạo bởi các L - acid amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit Các kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme cũng bị thủy phân dưới tác dụng của các peptit - hydrolase, axít hoặc kiềm Khi enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L- acid amin, trong một số trường hợp ngoại lệ ngoài axít amin còn nhận được các chất khác

Enzyme có hai loại: enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần

Enzyme một thành phần thì trong thành phần của nó chỉ có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân Enzyme hai thành phần gồm có: phần protein và phần phi protein Phần protein gọi là apoenzyme, phần phi protein gọi là coenzyme Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều chứa protein nhưng chuỗi polypeptit trong phân tử enzyme có thể thay đổi tùy từng enzyme Đến nay người ta đã xác định được rằng phần lớn enzyme trong tế bào đều có cấu trúc bậc bốn bao gồm nhiều tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có thể liên kết với nhau bằng liên kết hydro, liên kết cộng hóa trị hoặc một số liên kết khác, tùy mức độ liên kết mà hình thành nên các đồng phân của enzyme gọi là isoenzyme Trung tâm hoạt động của enzyme là một phần nhỏ trong cấu trúc của enzyme có nhiệm vụ liên kết với cơ chất và chuyển hóa cơ chất Có những enzyme có một trung tâm hoạt động nhưng cũng có enzyme có hai hay nhiều trung tâm hoạt động Ví dụ: alcol-dehydrogenase của gan động vật có hai trung hoạt động, còn alcol-dehyrogenase của nấm men có tới bốn trung tâm hoạt động Các trung tâm hoạt động có thể giống nhau, nhưng cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chức năng

Đối với enzyme một thành phần trung tâm hoạt động của nó là sự phối hợp giữa các nhóm chức nằm ở mạch bên của axít amin có trong thành phần của nó Các nhóm chức thường gặp là: nhóm sulfihydryl (-SH-) của Cysteine; nhóm hydroxyl (-OH-) của

Serine, Threonine, Tyrosine; nhóm cacboxyl (-COOH) của Aspartic acid, Glutamic acid; nhóm amin (-NH2-) của Lysine; vòng imidazol của Histidine; nhóm guanilic của Arginine Đối với enzyme hai thành phần trung tâm hoạt động của nó ngoài các nhóm chức của axít amin người ta còn gặp các nhóm chức của các thành phần phi protein chẳng hạn như các nhóm chức của phần coenzyme (thường chứa các vitamin hoặc các ion kim loại)

1.5.3 Phân loại Protease [1]

Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L-acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton Và chúng thường tác động lên các liên kết ester đơn giản

 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng Các proteinase serine này thường hoạt động ở vùng

pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng Các enzyme thuộc nhóm này như: trypsin

có thể thủy phân liên kết peptit chứa nhóm (-CO-) của axít amin kiềm (Lysine, Arginine), chymotrypsin xúc tác thủy phân liên kết peptit chứa nhóm (-CO-) của axít amin có vòng thơm, … Chúng bị ức chế mạnh dưới tác dụng của DFP và một số protein đặc hiệu khác như các antitrypsin có ở hạt đậu tương

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động xúc tác của enzyme, vì nó có khả năng phản ứng cao,tham gia nhiều biến đổi hóa học như axít

hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa,… Vai trò của nhóm thiol trong phân tử enzyme thể hiện

ở nhiều mặt khác nhau như tạo thành phức trung gian enzyme – cơ chất, kết hợp giữa

cơ chất và cofactor… Các proteinase cystein thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng, chúng chỉ hoạt động khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động không bị bao vây Do đó các chất như cystein, axít ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này Một số ion kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy ngân và các chất khác như iodoacetamid có tác dụng

ức chế proteinase cystein, còn các chất oxy hóa như: iốt, H2O2, EDTA,… có khả năng gắn với ion kim loại nên thường làm tăng độ bền của nhóm enzyme này Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của Aspartic acid hoặc Glutamic acid hay cũng có thể là nhóm (-COOH) đầu C của chuỗi polypeptit Các proteinase aspartic bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các axít amin có vòng thơm hoặc axít amin kỵ nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân

+ Metallo proteinase: là những proteinase trong trung tâm hoạt động chúng có các ion kim loại Các proteinase kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc axít amin chứa nhóm (-NH -) của liên kết peptit, chúng có thể tác dụng lên liên kết peptit chứa nhóm (- NH -) của các axít amin

kỵ nước có kích thước lớn hoặc liên kết peptit được tạo thành từ các axít amin có phân

tử lượng thấp Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường bị giảm mạnh hoạt độ dưới tác dụng của EDTA

 Dựa vào pH hoạt động: Theo Haard, các protease lại có thể chia làm hai nhóm chính là các enzyme acid, enzyme kiềm và trung tính (Nguyễn Lệ Hà, 2011)

1.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của protease [1]

Trong quá trình thủy phân thịt cá bằng protease có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân như:

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Khi tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng đến hoạt

độ của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt độ cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40

÷ 50oC và ở nhiệt độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị mất hoạt độ Như vậy nhiệt độ

70oC gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme nếu nhiệt độ tăng 10oC thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng 1,5 ÷ 2 lần Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH cơ chất

Ảnh hưởng của pH: Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH Mỗi

enzyme chỉ hoạt động trong một vùng pH nhất định gọi là pH tối ưu pH tối ưu của đa

số enzyme nằm trong vùng trung tính, axít yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động trong vùng axít hay kiềm

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất, sẽ tạo

thành phức trung gian enzyme và cơ chất, phức này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng

Ảnh hưởng của nồng độ muối: Muối ăn phân ly thành Na+ và Cl- , nồng độ muối thấp lớp vỏ hydrate của phân tử protein cũng chưa bị biến đổi, chưa gây biến tính protein Mặc khác, các ion này cũng liên kết với các phần mang điện trong phân tử enzyme, làm tăng điện tích của các trung tâm hoạt động này Kết quả những biến đổi trên làm tăng cường sự tương tác giữa phân tử enzyme và phân tử protein, làm thay đổi chiều hướng và sự phân bố electron trong phân tử protein, điểm tương tác tại các liên kết trong phân tử protein dễ bị cắt đứt hơn trước Do muối ăn có tính phân ly mạnh nên khi nồng độ cao, các ion đã liên kết mạnh với các phân tử nước, tạo áp suất thẩm thấu lớn, kéo các phân tử nước khỏi liên kết với phân tử protein, làm cấu trúc không gian bậc cao của phân tử mất đi, phân tử protein duỗi ra, bị biến tính, kết tủa, làm hoạt độ enzyme giảm và protein của cơ chất cũng bị biến tính, khó bị thủy phân

1.5.5 Phương pháp phân tách và làm sạch enzyme

1.5.5.1 Phương pháp trích ly enzyme [7,11]

Enzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong

tế bào Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp Các

phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ tế bào như: Phương pháp

cơ học Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa… Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm Phương pháp hóa học như dùng các loại dung môi: butylic, acetone, glycerol, ethylacetate Quá trình trích ly enzyme từ nội tạng tôm chịu tác động của các yếu tố: tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease: tỷ lệ dung môi với mẫu: mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau Ngoài protein enzyme còn có các thành phần phi enzyme khác đặc biệt là hàm lượng lipid nhiều, ảnh hưởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly được những protein - protease ra ngoài mô nhiều hơn Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết protease động vật rất dễ biến tính hay giảm hoạt độ khi tăng nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích hợp enzyme hoạt động mạnh thủy phân protein lẫn nhau Thường nhiệt độ ly trích protease từ mô động vật ở nhiệt độ không quá 5oC Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt độ protease mạnh

và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme trong quá trình ly trích, có những protease acid thì cần phải trích ly ở pH acid thì thu protein của enzyme đó cao hơn, còn protease kiềm thì ngược lại

1.5.5.2 Phương pháp làm sạch enzyme [7,11]

Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp sau:

Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50 - 70oC và pH ≤ 5 Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần protein không phải là enzyme mà ta mong muốn

Phương pháp kết tủa phân đoạn

Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thường sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme Bằng cách này, người

ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ như ethanol, acetone để kết tủa protein

Phương pháp hấp thu chọn lọc

Có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi như hydrocyapatite Phương pháp này có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp Để tránh làm biến tính enzyme, thường thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC Sau khi hấp thụ ta lại tiến hành chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp

Phương pháp sắc ký

Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước và tác nhân trao đổi ion, có thể áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) để làm sạch enzyme Thường sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion sau:

+ Nhựa trao đổi ion

+ Dẫn suất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose

diethylamino-ethyl-Dựa vào đặc tính phân cực của protein :

+ Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)

+ Sắc ký giấy

+ Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography)

+ Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC) Dựa vào kính thước protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)

(Fructionation range): Thí dụ sephadex G-50 có phạm vi tách từ 1.500 – 30.000 Da

Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô hút nước Thí dụ G-50 có độ ngậm nước là 5,0 ÷ 0,3 g Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao quanh hạt Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột

Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 g gel khô hấp thu khi trương nở trong nước G-50 có thể tích nền 9 - 11 ml/ g gel khô Hạt gel (gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ Kích thước hạt xác định bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo m Hạt có kích thước lớn (50 - 100 mesh, 100 - 300 µm cho

tố độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 - 40 µm) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt Thường người ta chọn hạt gel có kích thước 100 - 200 mesh Thể tích trống (void volume): Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột Xác định nhờ chất màu blue dextran có trọng lượng phân tử 2.000.000 Da Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột

Đặc tính hóa học của gel: Có 4 loại gel thường được sử dụng

+ Dextran: Có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia (Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Sephadex Giới hạn tách của gel dextran 600.000 Da Tuy nhiên nếu dextran được bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’-methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng

+ Gel polyacrylamide: Tạo bởi quá trình đồng polymer hoá của acrylamide và methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel – P là tên thương mại)

N,N’-+ Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose

và anhydrogalactose Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên thương mại là Bio-gel A + Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho phép

có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để

mesh (10 - 40 m) hay 200 - 400 mesh (20 - 80 m) Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài

b Chuẩn bị gel và bảo quản

Gel dextran và acrylamide thương mại ở dạng bột không ngậm nước do vậy phải cho chúng ngậm nước (cho nở) trước khi sử dụng Quá trình này thường khoảng 3-4 giờ ở 20oC đối với loại gel có liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm) Có thể rút ngắn thời gian nở trong nước ở nhiệt độ cao (có thể đun) Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thương mại ở dạng ngậm nước, do vậy không cần cho nở Trước khi nhồi gel mới vào cột phải loại

bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nước) trong khoảng 1-2 giờ Sau đó bổ sung chất bảo quản sodium aride (0,02%)

Dựng cột và chuẩn bị mẫu

a Dựng cột lọc gel

Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm có tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100 Để tách nhóm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 5-10 Đối với gel dextran

và polyacrylamide sử dụng đệm có pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH 10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo không làm mất hoạt độ của chất cần tách

b Chuẩn bị mẫu

Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10 - 25% tổng thể tích cột Để phân tích chỉ được phép đưa một lượng mẫu đưa một lượng mẫu nhỏ vào cột 1 - 5% tổng thể tích cột ( là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi)

Tốc độ dòng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự

do Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ , nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm2mặt cắt ngang (15 - 25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm2 (5-10 ml/h) Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén Thông thường là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngược

từ dưới lên

Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel

a Ưu điểm

Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt

Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37oC hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm

Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối

b Nhược điểm

Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài)

Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu

1.5.6 Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS – PAGE [11]

Sau khi thực hiện các bước ly trích và tinh sạch enzyme bước kế tiếp kiểm tra lại

độ tinh sạch protein dựa vào kỹ thuật điện di Kỹ thuật điện di có thể cho ta xác định được trọng lượng phân tử protein mong muốn

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein Trong

kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT) Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân

tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết Để đưa các protein

trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel) Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): duỗi thẳng các phân tử protein trong mẫu có cấu trúc bậc cao về dạng cấu trúc bậc 1 và các protein này được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu

Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và

vị trí Kỹ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000 – 200.000 Da Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Da thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5% Ngoài

kỹ thuật SDS - PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo liên kết (cross- linked) giữa các protein với nhau Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focussing gel electrophoresis)

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

- Địa điểm: Trung tâm Thí nghiệm – Thực hành, Đại học Nha Trang; Phòng sắc ký,

Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh

- Thời gian: đề tài tiến hành từ tháng 2/2013 đến 02/2014

2.2 Vật liệu

Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) giai đoạn thương phẩm (loại 150 – 200

g/con) được nuôi lồng bè tại vùng biển Cam Ranh, Khánh Hoà; tôm được bắt sống và đưa về phòng thí nghiệm để thu hồi nội tạng và chiết rút enzyme protease

Hình 2.1 Tôm hùm xanh (Panulirus homarus) dùng trong nghiên cứu

(Hình ảnh do học viên tự chụp trong quá trình thực hiện đề tài)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ quá trình nghiên cứu tổng quát

Từ đặc điểm của nguyên liệu và mục đích, nội dung nghiên cứu, chúng tôi xây dựng sơ đồ quá trình tiến hành nghiên cứu như sau (Hình 2.2):

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình nghiên cứu tổng quát

Đệm phosphate

(0,1 M, pH 8,0)

Ly tâm

Xác định trọng lượng nội tạng

Loại bỏ cặn rắn không tan và mỡ

Dịch chiết nội tạng

Kết tủa Ethanol 96%

Ly tâm

Loại bỏ dịch trong

Chế phẩm enzyme protease thô (CPT)

Xác định trọng lượng phân tử protein enzyme bằng phương pháp điện di SDS - PAGE

- Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm protease thô:

+ pH + Nhiệt độ + Ion kim loại hoá trị II

Cấp đông nhanh

CPT và bảo quản

trong tủ đông -20oC

2.3.2 Tách chiết protease từ nội tạng tôm hùm xanh (Panulirus homarus)

Quá trình tách chiết thu chế phẩm enzyme protease thô từ nội tạng tôm hùm xanh được tham khảo từ các nghiên cứu của Ponnuswamy Vijayaraghavan (2011) và Nguyễn Lệ Hà (2011), các bước tiến hành được trình bày trong sơ đồ ở hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ quá trình tách chiết thu chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm

hùm xanh (Panulirus homarus)

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của chế phẩm protease thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh (Ponnuswamy Vijayaraghavan, 2011)

2.3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm protease thô được nghiên cứu bằng cách xác định hoạt độ của protease ở những nhiệt độ khác nhau:10, 20, 30, 40,

50, 60 và 70oC với cơ chất là casein 1% pH 8,0 trong 10 phút theo phương pháp Anson cải tiến (Phụ lục 3) Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày trong hình 2.4

Nội tạng tôm hùm xanh

Khuấy hỗn hợp trên bằng máy

Tủa dịch chiết bằng ethanol 96%

Ly tâm thu chế phẩm enzyme

protease thô (CPT) Bảo quản trong tủ đông -20o

C

để sử trong các thí nghiệm

Xác định khối lượng, hàm lượng protein và hoạt độ của chế phẩm protease thô Loại bỏ cặn rắn

không tan và mỡ

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ

của chế phẩm protease thô

2.3.3.2 Xác định độ bền nhiệt của protease tôm hùm xanh

Xác định độ bền nhiệt của protease bằng cách ủ chế phẩm enzyme thô này trong Phosphate buffer (0,1 M, pH 8,0), ở các nhiệt độ khác nhau từ 10 đến 70oC trong một giờ Sau khi xử lý nhiệt độ, thì tiến hành xác định hoạt độ của protease theo phương pháp Anson và so sánh với hoạt tính của protease đã xác định ở điều kiện chuẩn (pH 8,0, thời gian phản ứng là 10 phút) Chúng tôi bố trí thí nghiệm theo sơ đồ ở hình 2.5

2.3.3.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease

Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease được xác định bằng cách ủ hỗn hợp phản ứng (protease và casein 1%) ở các giá trị pH khác nhau từ 2,0 đến 10,0, theo một hệ thống buffer 0,1 M là: Britton - Robinson buffer (pH 2,0 – 4,0), succinate buffer (pH 5,0 – 6,0); phosphate buffer (pH 7,0); Tris-HCl buffer (pH 8,0) và Glycine

- NaOH buffer (pH 9,0 – 10,0) Sơ đồ bố trí thí nghiệm như trong hình 2.6

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của chế phẩm protease

thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt độ của

của chế phẩm protease thô

8 2

Kết luận về ảnh hưởng của

pH đến hoạt độ của protease

Kết luận về ảnh hưởng của nhiệt

độ đến hoạt độ của protease

Ủ với cơ chất casein 1% trong

10 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

(pH 8,0, 37oC)

2.3.3.4 Xác định độ bền pH của protease tôm hùm xanh

Sử dụng chế phẩm protease thô ủ ở các giá trị pH khác nhau từ 2,0 đến 10,0 ở

37oC trong 1 giờ, sau đó xác định hoạt độ của protease theo phương pháp Anson để xác định độ bền pH của protease Các bước tiến hành thí nghiệm được thể hiện trong

sơ đồ ở hình 2.7

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền pH của chế phẩm protease thô

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II

đến hoạt độ của chế phẩm protease thô

Chế phẩm protease thô từ nội tạng

tôm hùm xanh

Ủ với các ion kim loại hóa trị II khác nhau (5mM) và cơ chất casein 1% (37oC, pH 7,0)

2.3.3.5 Ảnh hưởng của ion kim loại hoá trị II đến hoạt độ của protease

Để xác định ảnh hưởng của các ion kim loại II đến hoạt độ của enzyme, mẫu dịch chiết sẽ được ủ với các ion (5 mM): Ca2+, Mg2+, Hg2+, Zn2+ và Cu2+ trong 30 phút ở

37oC Hoạt độ của enzyme sau khi ủ với ion kim loại cũng sẽ được xác định bằng phương pháp Anson Sơ đồ bố trí thí nghiệm này được trình bày trong hình 2.8

2.3.4 Các phương pháp nghiên cứu đã áp dụng

2.3.4.1 Hàm lượng protein hòa tan xác định theo phương pháp Lowry [1,30]

Phương pháp dựa trên phản ứng biuret là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ 2 liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím hoặc tím đỏ tùy thuộc vào số lượng liên kết peptide nhiều hay ít và phản ứng với thuốc thử foline để tạo thành sản phẩm có màu đặc trưng Sản phẩm này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng

750 nm, dùng máy so màu để xác định cường độ màu trong các mẫu và so sánh với dung dịch protein chuẩn để xác định nồng độ của mẫu protein mà chúng ta quan tâm Các bước tiến hành xác định hàm lượng protein hòa tan trong mẫu enzyme protease thô theo phương pháp Lowry được trình bày ở Phụ lục 2

2.3.4.2 Xác định hoạt độ của protease từ nội tạng tôm hùm xanh theo phương pháp Anson [1]

Dùng protein “casein” làm cơ chất xúc tác định hoạt độ phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào hình chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme Các bước tiến hành phương pháp này được trình bày ở Phụ lục 3

2.3.4.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Chế phẩm enzyme protease thô thu được từ nội tạng tôm hùm xanh được tinh sạch trên sắc ký lọc gel dạng cột áp suất thấp Bio- Rad [11,17]

Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử có kích thước

đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ Các bước tiến hành phương pháp sắc ký lọc gel cột áp suất thấp được trình bày ở phụ lục 4