Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ escherichia coli

LỜI MỞ ĐẦU Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 Fibroblast Growth Factor-2 là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể như cân bằng nội

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST GROWTH FACTOR) 4

1.1.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2 Nhân tố tăng trưởng FGF-2 7

1.1.2.1 Cấu trúc của nhân tố tăng trưởng FGF-2 7

1.1.2.2 Hoạt tính sinh học của FGF-2 .12

1.1.2.3 Các hướng ứng dụng của FGF-2 13

1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 16

1.2.1 Giới thiệu chung 16

1.2.2 Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp 18

1.2.2.1 Biểu hiện ở tế bào chất 18

1.2.2.2 Biểu hiện ở chu chất 18

1.2.2.3 Tiết ra môi trường 19

1.2.3 Một số hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E coli 19

1.2.3.1 Hệ thống cảm ứng bởi IPTG 19

1.2.3.2 Hệ thống cảm ứng bởi L – arabinose 22

1.2.3.3 Hệ thống cảm ứng bởi muối 22

1.3.2 Sự thẩm tích 23

1.3.3 Sắc ký 23

1.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC) 25

1.3.3.2 Sắc ký ái lực (Affinitive chromatography, AC) 26

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 VẬT LIỆU 29

2.1.1 Thiết bị – Dụng cụ 29

2.1.2 Hóa chất và môi trường 30

2.1.2.1 Hóa chất 30

2.1.2.2 Môi trường 34

2.1.3 Vật liệu sinh học 34

2.1.3.1 Chủng vi sinh vật 34

2.1.3.2 Plasmid 34

2.1.3.3 Thang chuẩn 35

2.2 PHƯƠNG PHÁP 36

2.2.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 37

2.2.1.1 Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR 37

2.2.1.2 Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His 37

2.2.1.3 Xử lý gen fgf2 và plasmid vector pET-His bằng enzyme cắt hạn chế 39

2.2.1.4 Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2 39

2.2.1.5 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α 40

2.2.1.6 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 41

2.2.2 Cấu trúc chủng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 44

2.2.2.1 Thu nhận plasmid pET-fgf2 44

2.2.2.2 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) 44

2.2.2.3 Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 44

2.2.3.2 Thu mẫu và xử lý mẫu 45

2.2.4 Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan 45

2.2.4.1 Các bước chuẩn bị 45

2.2.4.2 Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 47

2.2.4.3 Đánh giá hiệu quả lên men 47

2.2.5 Tinh chế FGF-2 48

2.2.5.1 Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation 48

2.2.5.2 Tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin 49

2.2.6 Các phương pháp phân tích protein 50

2.2.6.1 Phương pháp điện di SDS-PAGE 50

2.2.6.2 Phương pháp nhuộm gel điện di 51

2.2.6.3 Kiểm tra bằng phương pháp lai Western Blot 51

2.2.6.4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 53

2.2.6.5 Định lượng FGF-2 bằng phần mềm xác định đậm độ Quantity One .54

KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN 56

3.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 57

3.1.1 Thu nhận gen fgf2 bằng phản ứng PCR 57

3.1.2 Thu nhận và xử lý plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI 58

3.1.3 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α 59

3.1.4 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 60

3.1.5 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp PCR và enzyme cắt giới hạn 61

3.1.6 Kiểm tra giải trình tự gen fgf2 63

3.2 Cấu trúc chủng E coli BL21(DE3) biểu hiện protein fgf-2 63

3.2.1 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) 63

pET-fgf2 65

3.4 Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF -2 tái tổ hợp dạng tan 67

3.4.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng 67

3.4.2 Khảo sát sự biểu hiện protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng 68

3.4.3 Khảo sát chu kì phá tế bào bằng áp suất cao 69

3.5 Tinh chế FGF-2 72

3.5.1 Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation 72

3.5.2 Tinh chế bằng sắc ký ái lực với heparin 73

KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 76

KẾT LUẬN 77

ĐỀ NGHỊ 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC 82

LỜI MỞ ĐẦU

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể như cân bằng nội mô, duy trì và tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xương bị tổn thương, kích thích hình thành tế bào bạch cầu và sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn

có, kích thích sự tăng trưởng của tế bào cơ mềm, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, chữa lành vết thương và sửa chữa mô…

Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2 đang được sử dụng như là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi người Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng làm đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng được các hãng mỹ phẩm tin tưởng và

bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học, việc

sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn bệnh như bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo lồi do phẫu thuật, chữa bệnh viêm nha chu…

Trước đây, sản phẩm FGF-2 thường được thu nhận bằng cách tách chiết từ các dòng tế bào động vật Việc sản xuất FGF-2 bằng phương pháp này đảm bảo về hoạt tính của sản phẩm nhưng sản lượng thấp và giá thành cao Nhằm khắc phục những nhược điểm trên, người ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất nhân tố FGF-2 Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ

E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào

động vật

Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu được nhập từ các công ty nước ngoài nên giá thành rất cao (1mg protein FGF-2 người được sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng 1260

USD, hãng ProSpec) gây khó khăn trong việc ứng dụng Do đó, việc sản xuất FGF-2 trong nước nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng với giá thành thấp cần được quan tâm đầu tư

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo dòng, biểu

hiện và tinh chế hFGF-2 (human fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp từ Escherichia coli” như là bước đầu để nghiên cứu, sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng dụng trong nước Tuy nhiên, một trong những hạn chế của việc sử dụng E coli làm tế

bào chủ là protein thường được tạo ra dưới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần phải trải qua quá trình gấp cuộn phức tạp, tốn kém Do vậy, luận văn này được thực hiện với

mục đích xây dựng quy trình sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E coli để

cảm ứng biểu hiện protein dạng tan trong tế bào chất Đây là hướng chiến lược hiệu quả và triển vọng cho phép sản xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản phẩm

Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn với những nội dung sau:

- Tạo dòng vi khuẩn E coli DH5α mang vector pET-fgf2

- Tạo dòng vi khuẩn E coli BL21(DE3) mang vector pET-fgf2 có khả năng biểu

hiện rhFGF-2 trong tế bào chất

- Tiến hành lên men và thu nhận được protein rhFGF-2 từ 1L dịch lên men, đánh giá hiệu quả lên men

- Tinh chế protein rhFGF-2 từ dịch lên men bằng sắc ký trao đồi ion và sắc kí ái lực; đánh giá độ tinh sạch và hiệu suất của quá trình tinh chế

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1 HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG (2004) Kỹ thuật lên men công nghiệp Khoa

Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trang 3-4, 9-20

2 NGUYỄN THỊ MỸ TRINH (2011) Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2 (Fibroblast growth factors-2) tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli Khoa Sinh

học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

3 TRẦN LINH THƯỚC, ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO (2010) Thực tập kỹ thuật thao tác trên gen Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc

gia Thành phố Hồ Chí Minh

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

4 A BIKFALVI, S KLEIN, G PINTUCCI ET AL., (1997) “Biological Roles of

Fibroblast Growth Factor-2,” Endocrine Reviews, vol 18, no 1, pp 26-45

5 A LOGAN, A BAIRD, (1996) "Fibroblast growth factors," Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, L Derek and B Carolyn, eds., pp 147-178: JAI

6 A BEENKEN, M MOHAMMADI (March 2009) The FGF family: biology,

pathophysiology and therapy, Nature Reviews Drug Discovery vol 8, 235-253

7 BAIRD, A., & KLAGSBRUN, M (1991) The Fibroblast growth factor family

New York, N.Y., New York Academy of Sciences

8 B ENSOLI, C SGADARI, G BARILLARI ET AL (2003), "Chapter 31 - The fibroblast growth factors," The Cytokine Handbook (Fourth Edition), W T Angus and

T L Michael, eds., pp 747-XVII, London: Academic Press

9 CHOI, J., & LEE, S (2004) Secretory and extracellular production of recombinant

proteins using Escherichia coli Applied Microbiology and Biotechnology 64, 625-635

10 C KINSLAND, (2010) "9.19 - Bacterial Protein Overexpression Systems and

Strategies," Comprehensive Natural Products II, M Editors-in-Chief: Lew and L Hung-Wen, eds., pp 695-721, Oxford: Elsevier

11 C RYAN, S ALEXANDER, R GREGORY, ET AL (2011), Cloning and Expression of Human Recombinant FGF-2 Isoforms

12 E F F JOSEPH SAMBROOK, TOM MANIATIS, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual

13 ELISSAVET KARDAMI, KAREN A DETILLIEUX, SARAH K JIMENEZ, PETERA CATTINP (2006) Fibroblast Growth factor-2 As a therapeutic agent

against heart disease Myocardial ischemia, Basic Science for the Cardiologist

16 G HANNIG, S C MAKRIDES, “Strategies for optimizing heterologous protein

expression in Escherichia coli,” Trends in biotechnology, vol 16, no 2, pp 54-60,

1998

17 I DELRIEU, (2000) “The high molecular weight isoforms of basic fibroblast growth factor (FGF-2): an insight into an intracrine mechanism,” FEBS Letters, vol

468, no 1, pp 6-10

18 J P COOKE, R BHATNAGAR, A SZUBA ET AL., (2000) “Fibroblast growth

factor as therapy for critical limb ischemia: a case report,” Vascular Medicine, vol 4,

no 2, pp 89-91

19 L MACFARLANE, P R MURPHY, (2011) “FGF2 (fibroblast growth factor 2

(basic)),” Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, pp

169-182

20 L MACFARLANE, Y GU, A G CASSON ET AL., (2010) “Regulation of Fibroblast Growth Factor-2 by an Endogenous Antisense RNA and by Argonaute-2,”

Molecular Endocrinology, vol 24, no 4, pp 800-812

21 MAI OKADA-BAN, JEAN PAUL THIERY, JACQUELINE JOUANNEAU

(2000) Molecules in focus Fibroblast growth factor-2 The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 32, 263 – 267

22 MAKRIDES, S C (1996) Strategies for Achieving High-Level Expression of

Genes in Escherichia coli Microbiological reviews 60, 512-538

23 M OKADA-BAN, J P THIERY, AND J JOUANNEAU, (2000) “Fibroblast

growth factor-2,” The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol

32, no 3, pp 263-267

24 NOVAGEN (2003) pET System Manual, 10th edition

25 PADERA, R F (2000) Cell signaling by fibroblast growth factor 2: investigations into interactions between fibroblast growth factor 2, fibroblast growth factor receptor

1 and heparin-like glycosaminoglycans Thesis (M.D with honors), Harvard

University, MIT Division of Health Sciences and Technology

26 POLNASZEK N, KWABI-ADDO B, PETERSON LE, OZEN M, GREENBERG

NM, ORTEGA S, BASILICO C, & ITTMANN M (2003) Fibroblast growth factor 2 promotes tumor progression in an autochthonous mouse model of prostate cancer

Cancer Research.63, 5754-60

27 Quantity One User Guide for Version 4, Windows and Macintosh Bio-Rad

Technical Service Department

28 ROSENBERG, I M (2004) Protein analysis and purification benchtop techniques Boston, Birkhäuser

29 RUEL M, LAHAM RJ, PARKER JA, POST MJ, WARE JA, SIMONS M, & SELLKE FW (2002) Long-term effects of surgical angiogenic therapy with fibroblast

growth factor 2 protein The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 124,

28-34

30 SØRENSEN HP, & MORTENSEN KK (2005) Advanced genetic strategies for

recombinant protein expression in Escherichia coli Journal of Biotechnology 115,

113-28

31 TERPE K, IBA GmbH (2002) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production:from molecular and biochemical fundamentals to

commercial systems Appl Microbiol Biotechnol 2006 Sep;72(2):211-22

32 VENKATARAMAN, G R., RAHUL; SASISEKHARAN, V.; SASISEKHARAN,

RAM (1970) Molecular characteristics of fibroblast growth factor–fibroblast growth factor receptor–heparin-like glycosaminoglycan complex The National Academy of

Sciences

33 WANG, D I K (2000) The effects of fibroblast growth factor 2 on the early stages on in vitro endothelial wound repair Ottawa, National Library of Canada

34 Y.-R YUN, J E WON, E JEON ET AL., (2010) “Fibroblast Growth Factors:

Biology, Function, and Application for Tissue Regeneration,” Journal of Tissue Engineering, vol 1, no 1

TÀI LIỆU TỪ INTERNET

35 http://www.molecularstation.com/sds-page-gel-electrophoresis/

36 http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/bradford.html

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST GROWTH FACTOR)

1.1.1 Giới thiệu chung

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF được Armelin tìm thấy trong dịch chiết tuyến yên vào năm 1973 Năm 1974, Gospodarowicz công bố nghiên cứu tìm thấy nhân tố tăng trưởng này trong dịch chiết não bò Nghiên cứu này cũng tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học và kết luận protein được tìm thấy có tác dụng làm tăng sinh các nguyên bào sợi Sau đó, Gospodarowicz tinh chế phân đoạn dịch chiết được tìm thấy ở pH acid và basic Thí nghiệm đã cô lập được hai dạng FGF khác nhau tương ứng với mỗi phân đoạn pH Nhân tố tăng trưởng thu nhận được ở pH acid được gọi là FGF-1 còn nhân tố tăng trưởng thu nhận ở pH bazơ được gọi là FGF-2 Hai loại protein có độ tương đồng cao về trình tự amino acid Hiện nay, trên 20 thành viên của

họ nhân tố tăng trưởng FGF đã được tìm thấy và nghiên cứu về cấu trúc, hoạt tính… để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau [5, 8]

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF) được tìm thấy ở rất nhiều loài, từ giun tròn đến con người Ở động vật có xương sống, trên 20 thành viên của họ nhân tố tăng trưởng FGF đã được tìm thấy với khối lượng phân tử từ 17 đến 34 kDa Có 18 loại nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF1–FGF10 and FGF16–FGF23) được phân vào sáu họ nhỏ dựa vào sự tương đồng trình tự cũng như sự phát sinh giống loài: FGF1

và FGF2; FGF3, FGF7, FGF10, FGF22; FGF4, FGF5 và FGF6; FGF8, FGF17và FGF18; FGF9, FGF16 và FGF20; FGF19, FGF21 và FGF23 Những nhân tố FGFs không được xếp vào họ nào (FGF11-FGF14) có sự tương đồng trình tự cao với họ FGF nhưng không gắn được lên thụ thể của FGF và vì thế không được coi là thành viên của

họ FGF (như FGF15 tìm thấy ở chuột là dạng tương đồng với FGF19 ở người) FGF hầu hết là những nhân tố cận tiết (paracrine), có vai trò trong sự hình thành mô và các

cơ quan ở những giai đoạn phát triển của phôi (năm phân họ FGF đầu tiên đều nằm trong nhóm này) Ngược lại, phân họ cuối cùng gồm FGF19, FGF21, FGF23 có vai trò

như những nhân tố nội tiết (endocrine), có vai trò điều hòa sự cân bằng acid mật, cholesterol, glucose, vitamin D và phosphate trong cơ thể [6]

Phần lớn các gen fgf nằm rải rác trên toàn bộ gen Ở người, 22 gen fgf và vị trí

của chúng (trừ FGF-16) đã được xác định Nhiều gen của protein FGF được nhóm lại trên cùng một nhiễm sắc thể, ví dụ như FGF-3, FGF-4 và FGF-19 có gen nằm ở nhiễm sắc thể số 11, cánh dài, cách nhau lần lượt là 40 và 10kb Điều này cho thấy các gen

mã hóa cho họ protein FGF được tạo nên bởi cơ chế nhân đôi, chuyển vị gen và nhiễm sắc thể trong quá trình tiến hóa [8, 18]

Họ nhân tố tăng trưởng FGF không những tương đồng cao về trình tự amino acid (13-71%) mà cấu trúc gen của chúng cũng được bảo tồn cao giữa các loài động vật có xương sống Các protein thuộc họ nhân tố tăng trưởng này có ái lực cao với heparan sulfate proteoglycan Sự tương tác với heparan sulfate giúp hoạt hóa một trong bốn loại receptor của FGF trên bề mặt tế bào [7, 17]

Hình 1.1 Sơ đồ các thành phần trong chuỗi polypeptide của FGF [8]

Tất cả các FGF đều có những peptide tín hiệu Tuy nhiên, FGF9, 16 và 20 được tiết thông qua mạng lưới nội chất và bộ máy golgi; còn FGF1 và FGF2 được tiết theo những con đường riêng biệt độc lập nhau Các họ FGFs có một vùng lõi tương đồng bao gồm 120 – 130 amino acids xếp trật tự tạo thành 12 phiến β không song song (β1-β12) nối với nhau bằng những đầu carboxyl và amino Vị trí gắn của Heparan sulphate glucosaminoglycan (HSGAG) gọi là các HBS nằm ở bên trong lõi FGF bao gồm một vòng nối β1-β2 và phần cầu nối giữa β10-β12 Đối với những FGFs cận tiết, những

nhân tố hình thành các HBS là các bề mặt tích điện dương và giáp nhau Ngược lại, các HBS của phân họ FGF19, 21 và 23 chứa một trình tự hình thành bởi vòng nối β1-β2 và phần cầu nối giữa β10-β12 làm hạn chế vùng HSGAG gắn lên lõi FGF, nên những phân họ này được tạo ra theo cơ chế nội tiết [6]

Họ nhân tố tăng trưởng FGF là một họ protein đa chức năng Trong quá trình phát triển phôi, FGF có nhiều vai trò trong điều hòa sự tăng sinh tế bào, di chuyển và biệt hóa Trong cơ thể trưởng thành, họ protein FGF là các yếu tố cân bằng nội môi Ngoài ra họ protein này còn có chức năng sửa chữa các mô, đáp ứng với các tổn thương Một nhóm nhỏ các protein thuộc họ FGF biểu hiện ở các mô trưởng thành có vai trò quan trọng trong dẫn truyền tín hiệu thần kinh trong hệ thần kinh trung ương và ngoại vi Tuy nhiên, khi biểu hiện bất thường, các nhân tố tăng trưởng này có thể gây

ung thư [5, 8]

Bảng 1.1 Các chức năng cơ bản của họ nhân tố FGF [34]

Chức năng Phân họ Tế bào đích

Tăng sinh tế bào FGF-1, FGF-2

FGF-4 FGF-7, FGF-10 FGF-18

Tế bào mỡ tiền thân

Tế bào biểu mô, tế bào nội mô, tế bào gốc thần kinh

Tế bào gốc lá phôi

Tế bào biểu mô

Tế bào tạo xương, tế bào sụn, hủy cốt bào

Sự di trú tế bào FGF-2

FGF-4 FGF7 FGF8

Tế bào thần kinh đệm, tế bào cơ

Tế bào cơ

Tế bào nội mô, tế bào sừng

Tế bào mào thần kinh

Sự biệt hóa tế bào FGF1, FGF2

FGF7

Tế bào thần kinh biểu mô

Tế bào sừng

1.1.2 Nhân tố tăng trưởng FGF-2

1.1.2.1 Cấu trúc của nhân tố tăng trưởng FGF-2

Hình 1.2 Cấu trúc gene mã hóa protein FGF-2[17]

Gen mã hóa FGF-2 người nằm trên vùng q26-27 của nhiễm sắc thể số 4 Gen dài khoảng 71kb gồm một vùng không dịch mã 5’UTR (Untranslated Region), 3 exon,

2 intron và vùng không dịch mã lớn 3’UTR (hình 1.2) Vùng không dịch mã 5’UTR và

3’UTR chứa các yếu tố điều hòa sự biểu hiện nhân tố tăng trưởng FGF-2, mật độ tế bào, các chất dẫn truyền thần kinh, con đường truyền tín hiện thứ cấp…[17, 20]

FGF20 Tế bào gốc khỉ

Sự hình thành mạch FGF1, FGF2 Tế bào biểu mô

Hình 1.3 Cấu trúc ba chiều của FGF-2[6]

FGF-2 có hình dạng gần giống với một hình chóp tam giác Mỗi mặt bên hợp thành bởi hai chuỗi β Ba mặt bên của hình chóp hình thành một khoang trống do sáu chuỗi β song song ngược chiều nhau tạo thành Phần đáy của hình chóp gồm thêm sáu chuỗi β Như vậy, toàn bộ phân tử FGF-2 được cấu tạo bởi 12 chuỗi β xếp song song

ngược chiều nhau (hình 1.3) FGF-2 được tìm thấy lần đầu tiên là dạng protein có 146

amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 16,5kDa được phân lập từ tuyến yên Khi cDNA của FGF-2 được tạo dòng, codon AUG được xác định như là codon mở đầu cho quá trình dịch mã cho protein gồm 155 amino acid Ngoài ra không còn tìm thấy bất cứ codon AUG nào khác ở thượng nguồn mRNA Vì vậy, codon AUG được cho là codon

mở đầu cho quá trình dịch mã Tuy nhiên, dựa vào trình tự cDNA tìm thấy trong não lợn, não chuột, gan, phôi người, tuyến tiền liệt và một số tế bào được nuôi cấy khác, người ta nhận thấy rằng phân tử FGF-2 trên thực tế có dài hơn hoặc ngắn hơn kích trước đây Các dạng có ngắn hơn được cho là kết quả của việc phân giải dạng 155 amino acid Các dạng dài hơn và có trọng lượng phân tử lớn hơn (196, 201, và 210

amino acid) đã được chứng minh thông quá việc phân tích phiên mã/dịch mã in vitro

Và kết quả cho thấy codon CUG ở đầu 5’ so với codon AUG (vị trí khởi đầu phiên mã dạng FGF-2 gồm 155 amino acid) được sử dụng làm codon mở đầu cho quá trình dịch

mã các dạng FGF-2 có trọng lượng phân tử lớn này [4, 5, 11]

Kết quả của quá trình dịch mã này sẽ tạo ra 5 dạng protein FGF-2 khác nhau với các trọng lượng phân tử và đặc điểm khác nhau Khi cDNA FGF-2 được biểu hiện trong tế bào, dạng mở đầu bằng codon AUG có trọng lượng phân tử thấp (LMW) là 18kDa Dạng còn lại được mở đầu bằng codon CUG có trọng lượng phân tử cao (HMW) lần lượt là 22; 22,5; 24; và 34kDa [23]

Hình 1.4 Các dạng FGF-2 được tạo thành [23]

Sự khác biệt về cấu trúc giữa FGF-2 có trọng lượng phân tử lớn với FGF-2 có trọng lượng 18kDa là sự kéo dài của đầu N Dạng trọng lượng phân tử lớn có chứa chín

trình tự lặp lại Gly-Arg (hình 1.4) Trong đó, ít nhất sáu arginines trong motif Glu-Arg

đã được methyl hóa Chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của những trình tự arginines đã được methyl hóa này nhưng nó có thể ảnh hưởng đến sự di chuyển hay ở lại trong nhân của FGF-2 khi vận chuyển qua màng nhân Điều này lý giải phần nào nguyên nhân FGF-2 trọng lượng phân tử thấp tồn tại chủ yếu trong tế bào chất và có vai trò tác động theo cơ chế cận tiết (paracrine) và tự tiết (autocrine) Trong khi đó, FGF-2 trọng lượng phân tử cao tồn tại trong nhân, trong các tiểu phần ribosom và có vai trò tác động theo cơ chế nội tiết (endocrine) [7, 19, 21]

Kết quả sắp gióng cột các trình tự amino acid của FGF-2 và FGF-1 cho thấy có

độ tương đồng cao về trình tự amino acid (53%), do đó, dạng gấp cuộn của hai phân tử

này cũng giống nhau Ngoài ra, các amino acid bảo tồn của họ protein FGF được tìm thấy trong vùng lõi của FGF-2 Điều này củng cố thêm dự đoán rằng các thành viên khác thuộc họ protein FGF sẽ có cấu trúc tương tự với FGF-2 [6, 21]

Các vị trí tích điện dương (Lys-138, Lys-134, Lys-128, Arg-129, Lys-144) trên protein FGF-2 được xác định là vị trí gắn heparin của protein FGF Vị trí gắn receptor của protein được tạo thành nhờ đoạn peptide 115-124 (chứa Tyr-123 and Trp-124) trên protein FGF-2 Trên cấu trúc không gian 3 chiều, phân tử FGF có hai gốc cysteine (Cys-78 và Cys-96) được lộ ra ngoài và hai gốc cysteine khác (Cys-34 và Cys -101) được quay vào phía bên trong lõi kị nước Do đó, bốn cysteine có thể tạo thành hai cầu nối diusulfide Tuy nhiên, khi phân tích cấu trúc tinh thể thì khoảng cách giữa hai cặp cysteine này quá xa để có thể hình thành cầu nối bội phân tử nhưng có khả năng hình thành cầu nối liên phân tử [7, 19]

Phân tử FGF-2 tích điện dương ở vị trí Lys (vị trí gắn với heparin), sinh ra năng lượng trong phân tử, làm cấu trúc của protein không ổn định Những phân tử tích điện

âm như heparin tương tác với những vị trí này, làm cho FGF-2 trở nên ổn định hơn, bảo vệ FGF-2 chống lại tác động của nhiệt độ, pH cũng như tác động của protease Do

đó, có thể kết luận rằng, những gốc sulfate trên heparin giúp ổn định hoạt tính của FGF-2 Hơn nữa, khi có những ion sulfate tồn tại trong dung dịch, nó cũng gắn vào các

vị trí lysine trên FGF và đóng vai trò giúp ổn định hoạt tính của protein này giống như heparin Tuy nhiên, cả ion sulfate và heparin đều không ngăn được việc hình thành cầu nối disulfide nội/ngoại phân tử của các cystein tự do trong protein Ngoài ra, cũng do

có khả năng tương tác đặc hiệu với heparin nên chất này thường được sử dụng để tinh chế FGF-2 bằng phương pháp sắc kí ái lực [25, 32]

Sự tương tác giữa heparin và FGF-2 còn làm các phân tử này gắn lại với nhau tạo các cấu trúc dimer và tetramer Cơ chế heparin đóng góp vào việc hoạt hóa các receptor của FGF-2 vẫn chưa được biết rõ Sự dimer hóa của FGF-2 là điều kiện cần thiết để FGF-2 gắn và hoạt hóa các receptor của chúng Heparin là một phân tử glycoaminoglycan được sulfate hóa Một đơn vị heparin disaccharide cơ bản của chuỗi

heparin bao gồm phân tử L-iduronic acid (Idu) và D-glucosamine (GlcN) nối với nhau

bởi cầu nối α(1-4) glycoside (hình 1.5) Một đơn vị heparin disaccharide có 3 nhóm

sulfate, một nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl của Idu và hai nhóm sulfate còn lại liên kết với nhóm 2-amino và 6-hydroxyl của GlcN Heparin có dạng chuỗi xoắn quay về bên phải trong đó các đơn vị cấu tạo nên chuỗi heparin lệch nhau một góc 180o[25, 32]

Hình 1.5 Đơn vị heparin saccharide của chuỗi heparin [32]

Các nghiên cứu cho thấy, chuỗi bên của nhóm các amino acid Asn-27, Arg-120, Lys-125 tạo thành cầu nối hydrogen với nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl của chuỗi heparin [25]

Ngoài tác dụng tương tác với FGF-2 để tạo cấu trúc dimer và tetramer giúp FGF-2 có thể gắn với receptor của nó với ái lực cao hơn, heparin còn bảo vệ nhân tố

tăng trưởng FGF-2 khỏi sự bất hoạt do nhiệt hoặc acid và sự phân giải protein (hình 1.6) [25]

FGF-2 có điểm đẳng điện pI = 9,6 Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy FGF-2 bền ở pH 7 [25] Với giá trị pI cực đoan như vậy nên việc tinh chế FGF-2 bằng sắc kí trao đổi ion dễ dàng hơn so với các protein có pI gần pH trung tính

Hình 1.6 Cấu trúc dimer dạng cis (a), dimer dạng trans (b) và tetramer (c)

của FGF (hình tròn)và chuỗi heparin [25]

1.1.2.2 Hoạt tính sinh học của FGF-2

FGF-2 là một nhân tố tăng trưởng đa chức năng, nó có vai trò trong sự tăng sinh, di chuyển và biệt hóa tế bào FGF-2 kích thích tăng sinh nguyên bào sợi, nguyên bào cơ, nguyên bào xương, tế bào thần kinh, tế bào nội mô, tế bào sừng… Trong phôi sớm, FGF-2 có vai trò biệt hóa các mô ngoại phôi bì thành các mô trung phôi, duy trì tính đa năng của tế bào FGF-2 cũng có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành mạch máu nhờ khả năng tăng sinh các tế bào nội mô mạch máu, chữa lành vết thương

và sửa chữa mô FGF-2 là một chất kích thích phân bào mạnh trên nhiều loại tế bào có nguồn gốc từ trung phôi bì và thần kinh ngoại bì Ở cấp độ hệ cơ quan, FGF-2 cũng

đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển các hệ cơ quan khác nhau (bảng 1.2)

FGF-2 kích thích các nguyên bào sợi tăng sinh tạo mô hạt lấp đầy khoảng trống do vết thương gây ra trong quá trình làm lành vết thương FGF-2 tiết ra bởi những tế bào nội

mô lót bên trong thành mạch tác động theo cơ chế autocrine kích thích tế bào nội mô thành mạch phân bào, tổ chức các tế bào mới tạo thành theo cấu trúc dạng hình ống và đóng vai trò là chất hóa hướng động giúp hình thành mạch máu mới [4, 11, 34]

Gần đây, đã tìm thấy nhiều chất kích thích tế bào nội mô phân bào với khối lượng phân tử 13-18kDa, có ái lực cao với heparin và điểm đẳng điện basic Những chất kích thích phân bào đó bao gồm nhân tố tăng trưởng tế bào hình sao, nhân tố tăng trưởng gắn β heparin và các nhân tố tăng trưởng từ tế bào máu, sụn, võng mạc, đại thực bào, vùng dưới đồi… đều là các dạng của FGF-2, chỉ khác nhau ở đầu N Quá

trình xử lý nhân tố tăng trưởng FGF-2 ở các mô khác nhau với các dạng protease đặc trưng cho từng mô đã tạo nên nhiều dạng FGF-2 như đã liệt kê ở trên Tuy chức năng

của FGF-2 trong môi trường invivo vẫn chưa được biết rõ nhưng những tính chất của FGF-2 trong điều kiện nghiên cứu in vitro cho thấy FGF-2 có vai trò quan trọng trong

hình thành mạch máu mới, làm lành vết thương và có khả năng gây ung thư nếu biểu hiện bất thường [26, 29, 33]

Bảng 1.2 Chức năng của FGF-2 ở các hệ cơ quan khác nhau [4]

1.1.2.3 Các hướng ứng dụng của FGF-2

a) Trong nghiên cứu

- Vai trò của FGF-2 trong việc nuôi tế bào gốc phôi người

Cơ quan Chức năng

Não Duy trì và biệt hóa tế bào thần kinh

Mạch máu Hình thành mạch, tăng sinh tế bào cơ trơn

Hạn chế xơ vựa động mạch và điều hòa huyết áp

Phổi Phân nhánh hình thái, ngăn ngừa xơ hóa

Xương Chữa lành xương tổn thương, hình thành sụn

Quá trình tạo máu Kích thích tạo bạch cầu hạt, tăng tế bào nhân khổng lồ,

duy trì tế bào gốc Chống lại quá trình apoptosis

Hệ sinh sản Tạo tinh trùng

Mắt Duy trì tế bào tiếp nhận ánh sáng và truyền tín hiệu

Hình thành tế bào sừng Sửa chữa mô

Khi nuôi tế bào gốc phôi người, cần bổ sung các nhân tố tăng trưởng như FGF-2,

activin A, TGFβ1, Wnt1, Wnt3… vào môi trường nuôi để ức chế sự biệt hóa tế bào

Trong tất cả các cách nuôi tế bào gốc phôi, FGF-2 là thành phần không thể thiếu trong môi trường

Ngoài ra, FGF-2 còn được tạo ra bởi chính tế bào gốc phôi người FGF-2 tạo thành tác động trở lại lên tế bào bằng hai cách Nếu FGF-2 có trình tự tín hiệu giúp điều hòa sự biểu hiện của các gen liên quan đến kiểu hình sơ khai của tế bào Cơ chế tác động của dạng FGF-2 này đang được tiếp tục nghiên cứu Đối với các FGF-2 không gắn thêm các trình tự tín hiệu sẽ được tiết ra ngoài tế bào và tương tác với các thụ thể giúp tế bào gốc phôi người tăng sinh trong tình trạng không biệt hóa

Hiện nay, cách nuôi tế bào gốc phôi trên môi trường xác định trong đó có bổ sung các nhân tố tăng trưởng được ưu tiên sử dụng hơn khi nuôi tế bào dùng cho các ứng dụng trong y học vì tránh được nguy cơ nhiễm chéo mầm bệnh từ lớp tế bào đồng nuôi cấy Các nghiên cứu cho thấy việc kết hợp giữa FGF-2 với các nhân tố tăng trưởng khác noggin, activin A… giúp duy trì trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc phôi khi nuôi cấy tế bào gốc phôi trong khoảng thời gian dài [4, 34]

Như vậy, trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc người được duy trì nhờ nhân tố tăng trưởng FGF-2 Cơ chế duy trì trạng thái không biệt hóa của FGF-2 trên tế bào gốc phôi người cần được nghiên cứu cụ thể để có thể tối ưu hóa quy trình nuôi loại tế bào

gốc này [4, 34]

b) Trong y học

- Ngăn ngừa hình thành sẹo lồi

Sự hình thành sẹo lồi được cho là do tình trạng tăng sinh quá mức của nguyên bào sợi cơ và mô đàn hồi của da tại lớp trung bì trong quá trình làm lành các tổn thương trên da hoặc do đường khâu của vết mổ Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng FGF-2 có khả năng ngăn ngừa sẹo hiệu quả do tác dụng ức chế quá trình chuyển nguyên bào sợi thành tế bào cơ trơn Ngoài ra, FGF-2 còn thúc đẩy quá trình lành vết thương, giảm khả năng tạo sẹo bằng cách điều chỉnh sự cân bằng chất nền

ngoại bào Do đó, FGF-2 được ứng dụng trong xử lý, ngăn ngừa sự hình thành sẹo lồi trên da do phẫu thuật [33, 34]

- Điều trị bỏng

Việc điều trị những tổn thương do bỏng gây ra gặp rất nhiều khó khăn so với những tổn thương khác Những vết thương do bỏng thường bị nhiễm trùng do vi khuẩn gây nên những biến chứng không mong muốn, nhất là ở trẻ em Để khắc phục những khó khăn này, việc điều trị những tổn thương do bỏng phải được tiến hành trong thời gian nhanh nhất để tránh nhiễm trùng gây ra những biến chứng khác Với mục đích đó, ngày nay FGF-2 được sử dụng để điều trị những tổn thương do bỏng gây ra FGF-2 đóng vai trò làm cho quá trình lành hóa vết thương ở da nhanh hơn bằng cách hoạt hóa các đại thực bào (macrophage), kích thích tăng sinh tế bào gốc trung mô giúp đẩy nhanh quá trình co rút đóng kín vết thương [33, 34]

- Điều trị bệnh nhân thiếu máu cục bộ

Trong y học, bệnh thiếu máu cục bộ được định nghĩa là hiện tượng hạn chế sự cung cấp máu đến các mô, gây ra tình trạng thiếu oxy và các chất dinh dưỡng cần thiết cho việc trao đổi chất của tế bào dẫn đến tế bào bị chết và hoại tử mô Thiếu máu cục

bộ thường xuất hiện trong các bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim, thiếu máu cục bộ não, thiếu máu cục bộ chi Tuy nhiên, bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim và chi dưới thường là phổ biển nhất và có tỷ lệ tử vọng cao nhất Nguyên nhân gây ra bệnh thiếu máu cục bộ thường là do gặp các vấn đề về mạch máu như xơ vữa động mạch, hạ huyết áp, chèn ép

từ bên ngoài bởi khối u… Bệnh thiếu máu cục bộ thường được điều trị bằng cách phẫu thuật Ví dụ như bệnh nhân thiếu máu cục bộ tim thường được điều trị bằng cách khai thông động mạch bị tắc nghẽn bằng một ống stent hoặc phẫu thuật mở đường lưu thông máu đến mô bị thiếu máu Tuy nhiên, cả hai cách đều có mặt hạn chế là gây nên những tổn thương, cho nên đó không phải là biện pháp điều trị phát huy hiệu quả lâu dài Để khắc phục hạn chế của những phương pháp trước đó, hiện nay người ta sử dụng nhân

tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 để điều trị chứng thiếu máu cục bộ tim Một khi

vào mô bị thiếu máu, FGF-2 kích thích sự tăng trưởng tế bào và thúc đẩy sự phát triển mạch máu mới từ mạch máu đã tồn tại trước đó [13, 18]

c) Trong mỹ phẩm

Các tính chất cơ học, bảo vệ, phục hồi của da suy giảm dần theo thời gian và tuổi tác Ngoài ra, các yếu tố gây stress của môi trường bên ngoài như ô nhiễm, tia tử ngoại… làm đẩy nhanh quá trình lão hóa của da Sự tác động của tuổi tác và môi trường dẫn đến làn da bị khô ráp, nhăn nheo cũng như thay đổi sắc tố Về mặt mô học, theo thời gian lượng collagen trong da sẽ suy giảm, da sẽ mất dần các nguyên bào sợi

và mạng lưới mạch máu Để ngăn ngừa ngừa hiện tượng đó, FGF-2 đã được chứng minh là có khả năng thúc đẩy sự phát triển của các nguyên bào sợi, hỗ trợ quá trình tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn ngừa và đẩy lùi tiến trình lão hóa của da [4, 34]

Nhờ có khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da mà hiện nay FGF-2 được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ mỹ phẩm Một số sản phẩm đã được thương mại chứa FGF-2 đã được đưa ra thị trường chăm sóc sắc đẹp và nhận được những phản hồi tích cực

1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli

1.2.1 Giới thiệu chung

Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành công ở vi khuẩn như hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng

dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học Hiện nay, Escherichia coli

là chủng chủ đang được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp do có

những ưu thế nổi bật về tốc độ tăng trưởng nhanh chóng, đạt được mật độ tế bào cao,

phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền, các đặc tính di truyền được hiểu biết rõ, sản lượng protein sản xuất cao (có thể lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng [22, 30]

Bảng 1.3 Các chủng E coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp[9]

Chủng Đặc điểm

AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất

BL21(DE3) Bất hoạt protease lon và ompT

Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như

AGG, AGA, CCC Bất hoạt protease lon và ompT

BLR Đột biến recA làm ổn định các vùng lặp

Bất hoạt protease lon và ompT

C41/ C43 Đột biến dành cho biểu hiện protein màng

JM 83 Tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất

Bất hoạt protease lon và ompT Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt

cho việc tạo liên kết disulfide ở tế bào chất

Protein tái tổ hợp được sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hướng: sản

xuất nội bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp trong nội bào là chiến lược được sử dụng phổ biến nhất Protein tái tổ hợp tạo ra

có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi), do đó khuyết điểm chủ yếu của chiến lược này là hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện vượt mức Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải được tái gấp cuộn để có hoạt tính Nhiều cải tiến đã được tiến hành như nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp, thay thế các

acid amin, sử dụng các chủng E coli khác nhau(bảng 1.3), đồng biểu hiện với

chaperone gấp cuộn, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở điều kiện

stress…[9]

Một khía cạnh khác cần được quan tâm là sản xuất các protein có cầu nối

disulfide trong tế bào chất của E coli Do tế bào chất của E coli là môi trường có tính

oxy hoá khử thấp, thiếu hệ thống protein DsbA và DsbB để hình thành cầu nối disulfide hay có cơ chế ngăn chặn sự hình thành cầu nối này nên protein mục tiêu có thể không có cầu nối disulfide hay có nhưng cấu hình sai Hướng giải quyết là đồng biểu hiện DsbA và DsbB giúp tăng khả năng hình thành cầu nối disulfide [9, 30]

1.2.2 Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp

1.2.2.1 Biểu hiện ở tế bào chất

Hầu hết protein được biểu hiện ở E coli đều được thiết kế biểu hiện ở tế bào chất của tế bào Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli gặp nhiều khó

khăn như protein thường được tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính sinh học gọi

là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E coli không có cơ chế thúc đẩy sự hình

thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế

bào chất của E coli vẫn là phương án được sử dụng phổ biến nhất do mức độ biểu

hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng đơn giản hơn Ngoài ra, hiện nay người ta cũng phát triển nhiều phương pháp nhằm cải thiện tính tan của protein trong tể bào chất như đồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử

dụng các chủng E.coli đột biến gen trx…[9, 30, 31]

1.2.2.2 Biểu hiện ở chu chất

Khoang chu chất của tế bào E coli là nơi có tính oxi hóa cao do có chứa các

enzyme xúc tác cho việc hình thành liên kết disulfide Tuy nhiên trong khoang chu chất lượng protein thường được biểu hiện với hiệu suất thấp Mặt khác, để protein có thể chuyển từ màng trong ra ngoài khoang chu chất là đoạn peptide tín hiệu Không phải

peptid tín hiệu nào cũng hoạt động tốt trong tế bào E coli Khi tăng sự tổng hợp

peptide tín hiệu sẽ làm giảm mức độ biểu hiện của protein để tránh tình trạng ùn tắc hệ thống vận chuyển qua màng, làm tăng sự tổng hợp protein đóng vai trò chuyển màng Bên cạnh đó khi biểu hiện ở chu chất, protein cũng có thể tồn tại ở dạng thể vùi [9, 30, 31]

Hình 1.7 Sự hình thành cầu nối disuldide trong chu chất ở E coli [9]

1.2.2.3 Tiết ra môi trường

E coli tiết rất ít (hầu như không có) protein ra ngoài môi trường nuôi cấy

Protein được định hướng tiết ra ngoài môi trường sẽ phải qua hai màng: màng trong và

màng ngoài của E coli Cơ chế chuyển qua màng là rất đặc hiệu Người ta cho rằng có

hai cách để định hướng protein được tiết ra ngoài môi trường đó là sử dụng con đường tiết sẵn thông qua việc sử dụng các đoạn peptide tín hiệu; cách thứ hai là sử dụng các yếu tố thẩm thấu ảnh hưởng tới việc tiết protein có lựa chọn nhưng lại hạn chế được tính thấm của màng ngoài Nhìn chung protein tạo ra bằng những phương pháp này là rất hiếm gặp [9, 30, 31]

1.2.3 Một số hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E coli

1.2.3.1 Hệ thống cảm ứng bởi IPTG

a Giới thiệu

Hệ thống cảm ứng operon lac bởi lactose đã được phát triển từ lâu nhưng lại có

một khuyết điểm lớn, lactose vừa là chất cảm ứng vừa là cơ chất cho -galactosidase nên lượng lactose sẽ bị hao hụt dẫn đến phải bổ sung trong quá trình cảm ứng Người

ta đã sử dụng các đồng đẳng của lactose để thay thế là IPTG

(Isopropyl-β-D-thio-galactoside) Do không phải là cơ chất của -galactosidase, nên IPTG vẫn được duy trì

trong quá trình điều hoà Như vậy, IPTG là phân tử có khả năng thay thế lactose trong

sự điều hoà operon lac

Hệ thống cảm ứng bằng IPTG hiện nay rất phổ biến trong sản xuất protein tái tổ hợp do chất cảm ứng IPTG ổn định, có nhiều loại chủng chủ cũng như hệ thống vector

được thiết kế thích hợp cho cảm ứng IPTG Chủng chủ E coli BL21(DE3) và hệ thống

vector pET là hệ thống biểu hiện được sử dụng phổ biến trong biểu hiện protein tái tổ hợp [3, 24, 31]

b Hệ thống vector pET

Các vector pET được xây dựng đầu tiên bởi Studier và cộng sự Những vector pET hiện nay được bổ sung thêm nhiều đặc tính mới giúp việc tạo dòng, phát hiện và tinh chế protein mục tiêu trở nên dễ dàng hơn Việc lựa chọn một loại vector pET phù hợp để biểu hiện protein mục tiêu phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong đó, ba yếu tố quan trọng cần xét đến là mục tiêu ứng dụng của protein đích, các đặc tính sinh học về protein này và chiến lược tạo dòng

Hệ thống vector pET thường được sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái

tổ hợp trong E coli Vector có vùng MCS chứa các enzyme cắt giới hạn giúp tạo dòng gen mục tiêu vào vector Vùng MCS được thiết kế nằm ở vùng hạ lưu của T7 promoter Khi tế bào chủ tạo ra enzyme T7 RNA polymerase và gắn vào T7 promoter gen mục

tiêu nằm ở vùng hạ lưu của promoter sẽ được phiên mã, dịch mã và tạo protein tái tổ hợp tương ứng

Vì T7 promoter chỉ gắn đặc hiệu với enzyme T7 RNA polymerase có nguồn gốc

từ thực khuẩn thể nên protein mục tiêu được điều hòa biểu hiện một cách hiệu quả Mặt

khác, T7 promoter là một promoter mạnh, T7 RNA polymerase có hoạt tính cao nên

protein mục tiêu được sản xuất rất hiệu quả Vài giờ sau cảm ứng, protein tái tổ hợp có thể chiếm đến hơn 50% tổng protein của tế bào sản xuất ra Hệ thống vector pET còn

có khả năng duy trì gen mục tiêu ở trạng thái không biểu hiện khi được tạo dòng vào tế

bào chủ không có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase Điều này giúp plasmid tồn tại

ổn định trong tế bào chủ do protein tái tổ hợp khi tạo ra có thể gây độc cho tế bào

Tuy nhiên, việc điều hòa biểu hiện T7 polymerase dựa vào promoter lac có hạn

chế là trong một số trường hợp không cảm ứng mà vẫn có sự biểu hiện rò rỉ Nếu gen cần biểu hiện có khả năng gây độc thì việc biểu hiện rò rỉ làm ảnh hưởng đến sức sống

của tế bào Để giải quyết vấn đề này, có thể đồng biểu hiện T7 lysozyme để phân hủy các T7 RNA polymerase được sản xuất với số lượng nhỏ khi chưa được cảm ứng Nhờ

vậy protein có khả năng gây độc đối với tế bào sẽ không được biểu hiện cho đến khi có chất cảm ứng trong môi trường Hướng giải quyết này sẽ tạo ra có một khoảng thời gian ức chế giữa thời điểm cảm ứng và biểu hiện cực đại của protein mục tiêu vì nồng

độ của polymerase phải tăng lên đủ lớn để vượt qua được sự ức chế của lysozyme [3,

24, 31]

c Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG

Ở hệ thống biểu hiện được cảm ứng bằng IPTG, chủng chủ được biến đổi di

truyền để có gen mã hóa cho T7 polymerase trong bộ gen Gen này được đặt dưới sự kiểm soát của lac promoter Ngoài ra, gen lacI cũng được chèn vào bộ gen để tạo lac repressor Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trường, lac repressor tạo thành gắn với lac operator làm promoter lac bị bất hoạt, gen mã hóa cho T7

polymerase không được biểu hiện

Hình 1.8 Cơ chế điều hòa của T7 promotor [24]

Vector pET được thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7 promoter

Gen mục tiêu sẽ được thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để được kiểm soát biểu

hiện bởi T7 promoter Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac operator và gen lacI

mã hóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện của T7 promoter

Khi có sự hiện diện của IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí allosteric, làm protein này thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator Nhờ đó lac promoter được hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 polymerase được biểu hiện tạo T7

polymerase IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm soát của

lac repressor Enzyme T7 polymerase tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter đã được hoạt hóa giúp biểu hiện gen mục tiêu đã được tạo dòng vào vector (hình 1.8) [3, 16, 24, 31]

1.2.3.2 Hệ thống cảm ứng bởi L - arabinose

Promoter được sử dụng là pBAD với nhân tố kích hoạt AraC Khi môi trường có arabinose thì có sự điều hoà dương, ngược lại khi chỉ có glucose thì sự biểu hiện của operon bị ức chế Protein AraC hoạt động ở dạng dimer gắn vào 3 vị trí của operon arabinose là O1, O2, và I Khi vắng mặt arabinose thì dimer AraC sẽ tiếp xúc với vị trí O2 nằm trong vùng gen araC, cách promoter araBAD khoảng 210 cặp base Phần kia của dimer sẽ tiếp xúc với vị trí O1 trong vùng promoter, do đó hình thành DNA dạng vòng Sự phiên mã của promoter AraBAD và araC sẽ bị ức chế bởi cấu hình vòng này Khi có mặt arabinose thì chính arabinose sẽ gắn vào dimer araC làm dimer này thay đổi cấu hình, lúc đó dimer không gắn vào vị trí O2 nữa mà gắn vào vị trí I, nhờ đó RNA polymerase bắt đầu hoạt động phiên mã

Đây là một hệ thống điều hoà mạnh, với chất cảm ứng không đắt tiền, trong quá trình lên men với hàm lượng cảm ứng 1% có thể đạt được sự biểu hiện tối ưu [31]

1.2.3.3 Hệ thống cảm ứng bởi muối

Cảm ứng bởi muối là phương pháp mới đơn giản, hiệu quả có thể áp dụng cho

sản xuất vượt mức protein tái tổ hợp Hệ thống sử dụng chủng chủ E coli GJ1158 được thiết kế có promoter proU được cảm ứng bởi NaCl Để tăng cường biểu hiện, hệ thống

cảm ứng muối có nhân tố phiên mã T7 RNA polymerase, do đó protein được biểu hiện

vượt mức với lượng lớn [31]

1.3 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP

Protein được tinh sạch dựa trên những đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng thu nhận được protein tinh sạch Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký [15]

1.3.1 Tủa bằng muối

Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out) Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein [15]

1.3.2 Sự thẩm tích

Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ Những phân tử có cấu trúc không gian nhất định lớn hơn đường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó, những phân

tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau [15]

1.3.3 Sắc ký

Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh

Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động

Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (Size Exclusion Chromagraphy), sắc ký trao đổi

ion dựa vào điện tích của phân tử (Ion Exchange Chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào

ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (Affinity Chromagraphy) và sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction chromatography, HIC) dựa vào mức độ kị nước của protein ở các nồng độ muối khác nhau

Xây dựng một quy trình tinh chế hiệu quả là một trong những yếu tố quyết định thành công của việc sản xuất protein Tùy theo yêu cầu về độ tinh sạch, sự cần thiết phải duy trì hoạt tính protein cũng như mức độ tạp trong nguồn mẫu ban đầu, các phương pháp được sử dụng để tinh chế và sự phối hợp giữa các phương pháp này sẽ khác nhau Thông thường, đối với một protein được sử dụng làm thuốc, quá trình tinh chế đầy đủ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn bắt giữ: Đây là bước cô lập nhanh protein mục tiêu khỏi vật liệu thô ban đầu Đồng thời, protein được cô đặc và chuyển qua dung dịch giúp duy trì hoạt tính protein Ở bước này, protein thường được phân tách theo nhóm bằng cách sử dụng sắc ký ái lực hoặc sắc ký trao đổi ion

- Giai đoạn tinh chế trung gian: giai đoạn này tập trung vào mục đích phân tách protein mục tiêu khỏi các thành phần tạp lớn như nucleic acid, endotoxin, virus và các protein khác Giai đoạn này không cần phải tiến hành nhanh do các thành phần tạp gây

ra sự phân hủy và thủy giải protein đã bị loại đi trong giai đoạn trước đó Tuy nhiên, các kỹ thuật tinh chế được sử dụng trong giai đoạn này cần phải có khả năng phân tách cao Do vậy, cần phải lựa chọn biện pháp dung ly protein hiệu quả, như sử dụng gradient nồng độ hoặc dung ly nhiều bước

- Giai đoạn tinh chế cuối: Mục đích của giai đoạn này là loại những thành phần tạp nồng độ thấp và điều chỉnh pH, nồng độ muối cũng như bổ sung các chất hỗ trợ để bảo quản protein Trong giai đoạn này cần phải sử dụng những kỹ thuật tinh chế có độ phân tách cao để đạt đến độ tinh sạch cần thiết

Đây là quy trình tinh chế protein đầy đủ, điều đó không có nghĩa là bất cứ protein nào cũng cần tinh chế theo quy trình ba bước này Ví dụ, giai đoạn bắt giữ và tinh chế trung gian có thể nhập lại thành một bước duy nhất, tương tự có thể nhập giai

đoạn trung gian và giai đoạn cuối lại với nhau Trong một số trường hợp, nếu nguồn mẫu ban đầu đã tinh sạch thì chỉ cần một tinh chế qua một bước cuối cùng Ngược lại, một số protein dùng làm thuốc cần bốn, năm bước tinh chế để đạt được yêu cần về độ tinh sạch và tính an toàn [15, 28]

1.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC)

Ra đời từ những năm 1960, IEC với khả năng phân tách và khả năng nạp mẫu cao là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để tinh sạch protein, peptid, nucleic acid và các phân tử sinh học tích điện khác Kỹ thuật này giúp phân tách những phân tử sinh học dựa vào sự khác nhau về đặc tính tích điện giữa chúng IEC phân tách các phân tử dựa vào điện tích bề mặt của nó Chất nền IEC là những hạt nhỏ chứa những nhóm tích điện dương (cation) và tích điện âm (anion) Phân tử protein được tạo thành từ những amino acid chứa nhóm acid và base yếu, do vậy điện tích của protein thay đổi theo sự thay đổi pH của dung dịch chứa chúng Giá trị pH mà tại đó protein không tích điện gọi là điểm đẳng điện (pI) Ở pH cao hơn điểm đẳng điện, protein tích điện âm và gắn vào chất nền của cột trao đổi anion Ở pH thấp hơn điểm đẳng điện, protein tích điện dương và gắn với chất nền của cột trao đổi cation Để bắt đầu quá trình tinh chế, cột trao đổi ion cần được cân bằng với buffer có lực ion và pH thích hợp cho phép protein mục tiêu có thể gắn vào chất nền sắc ký trong khi các phần tử tạp đi ra khỏi cột nhiều nhất có thể Trong phương pháp này, pha tĩnh

là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch dung ly bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích Trong một số

trường hợp đặc biệt, protein được dung ly bằng cách thay đổi pH của dung dịch [15, 28]

Hình 1.9 Minh họa sắc ký trao đổi ion [15]

1.3.3.2 Sắc ký ái lực (Affinitive chromatography, AC)

Sắc ký ái lực là phương pháp rất hiệu quả, được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh

sạch protein Kỹ thuật này dựa trên ái lực của protein với một số nhóm hóa học chuyên biệt Khi nạp hỗn hợp protein vào cột, protein có khả năng nhận biết một nhóm X hay dẫn xuất của nó được gắn trên cột bằng nối cộng hóa trị Sau đó cột được rửa để loại bỏ những protein không tạo được nối hoặc nối không đặc hiệu, cuối cùng là dung ly protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hoặc thay đổi điều kiện để làm

giảm lực liên kết (hình 1.10) Kỹ thuật này có thể được sử dụng trong pha bắt giữ hoặc

tinh chế trung gian AC có tính đặc hiệu protein nên đây là kỹ thuật tinh chế có độ phân

tách và hiệu suất cao

Trong kỹ thuật này, protein mục tiêu được gắn đặc hiệu và thuận nghịch với ligand tương ứng Ban đầu, mẫu được nạp vào dưới điều kiện cho phép sự gắn đặc hiệu xảy ra Những protein không gắn được với ligand thì bị rửa đi sau đó Cuối cùng,

protein mục tiêu được tách ra dưới điều kiện chuyên biệt bằng cách sử dụng chất gắn cạnh tranh, hoặc được tách ra dưới điều kiện không chuyên biệt bằng cách thay đổi pH hoặc lực ion Sau quá trình tinh chế bằng AC, protein thu được có độ tinh sạch cao và được cô đặc [15, 28]

Nhằm mục đích ứng dụng trong nuôi cấy tế bào, y học và mỹ phẩm, FGF-2 tái tổ hợp cần phải có độ tinh sạch tối thiểu là 95% Dựa vào đặc điểm của FGF-2 có pI=9,6,

có ái lực cao với heparin, bền ở pH 7 và dựa vào các tính chất của các phương pháp sắc

ký đã được nêu ở trên, trong luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi cation và sắc ký ái lực heparin nhằm thu nhận FGF-2 có độ tinh sạch đạt yêu cầu từ

pha tan của dịch đồng nhất tế bào E coli

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Thiết bị – Dụng cụ

- Bộ pipetman 10, 20, 100, 1000, 5000 μl, các loại đầu tip tương ứng

- Các loại eppendof 0,2ml, 1,5ml

- Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri

- Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nước cất

- Bộ chuyển màng lai (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech)

- Bộ điện di ngang DNA (HORIZON ®58, Life Technology™, Mỹ) và hộp đèn soi

UV (Hoefer, Mỹ)

- Bộ điện di protein (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech) và bộ nguồn (Amersham Biosciences)

- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ)

- Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)

- Cột tinh chế Hitrap SP FF 5ml, Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare)

- Hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302 và các thiết bị phụ trợ như: máy nén khí, hệ thống nước giải nhiệt…

- Hệ thống tinh chế AKTA (GE Healthcare)

- Máy chụp hình gel (Amersham Biosciences)

- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop

- Máy điều nhiệt theo chu kỳ Eppendorf Mastercycler Personal

- Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuantpro (Amersham Biosciences) dùng cho DNA, RNA và protein

- Máy đo pH (ORION, Anh)

- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh)

- Máy lắc nước Grant GLS400 (Cambridge, Anh) và thiết bị làm lạnh đi kèm

- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Nhật)

- Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh)

- Máy phá tế bào Model M-110EH-30 Microfluidizer Processor và hệ thống làm lạnh đi kèm

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)

- Phần mềm Quantity One (Biorad)

- Taq polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức)

- Buffer Taq polymerase 10X (Fermentas, Đức)

- Pfu DNA polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức)

- Buffer Pfu DNA polymerase 10X(Fermentas, Đức)

b) Dung dịch tách plasmid bằng phương pháp SDS- kiềm

- Dung dịch I: Tris-HCl 25mM; EDTA 10mM; glucose 50mM, pH 8

- Dung dịch II: NaOH 0,2N; SDS 1% (pha trước khi dùng)

- Dung dịch III: CH3COOK 3M, pH 4,8

- Chloroform

- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM; EDTA 1M, pH 8,0

- Ethanol 70% và ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20oC)

- Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC)

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)

- Sodium acetate 3M (pH 4,8)

c) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt và nối

- Enzyme BamHI, NdeI (Fermentas, Đức)

- Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức)

- Buffer ligation 10X (Fermentas, Đức)

- T4 DNA ligase (Fermentas, Đức)

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)

- Hóa chất dùng cho tinh chế DNA

- Bộ kit tinh chế EZ-10 spin column (Biobasic)

e) Hóa chất dùng cho biến nạp DNA plasmid vào E coli

- Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng

- Dung dịch MgCl2 20mM, CaCl2 80mM vô trùng (giữ ở 4oC)

- Dung dịch glycerol 80% vô trùng

f) Hóa chất dùng cho điện di DNA trên gel agarose

- Agarose (Biobasic)

- Dung dịch chạy điện di TAE 50X: Tris acetate 40mM, EDTA 0,1M (pH 8,0)

- Dung dịch nạp mẫu DNA: 0,05% xylene cyanol, 0,09% bromophenol blue; 60% glycerol và 60mM EDTA

- Ethidium bromide 10 mg/ml

g) Hoá chất dùng cho điện di SDS - PAGE

- Dung dịch điện di 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3): Tris 15,1g, SDS 5g, glycine 94g pha trong 1 lít nước

- Tris - HCl 1,5M pH 8,8 (giữ ở 4oC)

- Tris - HCl 0,5M pH 6,8 (giữ ở 4oC)

- SDS 10%

- 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 4oC)

- Ammonium persulphate (APS) (giữ ở 4oC)

- TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ ở 4oC)

Thành phần gel phân tích (15%) và gel gom được trình bày như bảng 2.1

Bảng 2.1 Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS-PAGE

Gel phân tách Gel gom Nước cất 2,52ml 1,3ml

+ Dung dịch cố định mẫu 1: Ethanol 50ml, acetic acid 5ml, nước cất 50ml

+ Dung dịch cố định mẫu 2: Methanol 50ml, nước cất 50ml

+ Natrithiosulfate 0,02%