TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN và TINH CHẾ HFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ ESCHERICHIA COLI 2

Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR Gene fgf-2 được thu nhận với lượng lớn nhờ phản ứng PCR plasmid pIDT-fgf2 với cặp mồi đặc hiệu của gene nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào pla

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Thiết bị – Dụng cụ

- Bộ pipetman 10, 20, 100, 1000, 5000 μl, các loại đầu tip tương ứng

- Các loại eppendof 0,2ml, 1,5ml

- Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri

- Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nước cất

- Bộ chuyển màng lai (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech)

- Bộ điện di ngang DNA (HORIZON ®58, Life Technology™, Mỹ) và hộp đèn soi

UV (Hoefer, Mỹ)

- Bộ điện di protein (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech) và bộ nguồn (Amersham Biosciences)

- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ)

- Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)

- Cột tinh chế Hitrap SP FF 5ml, Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare)

- Hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302 và các thiết bị phụ trợ như: máy nén khí, hệ thống nước giải nhiệt…

- Hệ thống tinh chế AKTA (GE Healthcare)

- Máy chụp hình gel (Amersham Biosciences)

- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop

- Máy điều nhiệt theo chu kỳ Eppendorf Mastercycler Personal

- Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuantpro (Amersham Biosciences) dùng cho DNA, RNA và protein

- Máy đo pH (ORION, Anh)

- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh)

- Máy lắc nước Grant GLS400 (Cambridge, Anh) và thiết bị làm lạnh đi kèm

- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Nhật)

- Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh)

- Máy phá tế bào Model M-110EH-30 Microfluidizer Processor và hệ thống làm lạnh đi kèm

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)

- Phần mềm Quantity One (Biorad)

- Taq polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức)

- Buffer Taq polymerase 10X (Fermentas, Đức)

- Pfu DNA polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức)

- Buffer Pfu DNA polymerase 10X(Fermentas, Đức)

b) Dung dịch tách plasmid bằng phương pháp SDS- kiềm

- Dung dịch I: Tris-HCl 25mM; EDTA 10mM; glucose 50mM, pH 8

- Dung dịch II: NaOH 0,2N; SDS 1% (pha trước khi dùng)

- Dung dịch III: CH3COOK 3M, pH 4,8

- Chloroform

- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM; EDTA 1M, pH 8,0

- Ethanol 70% và ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20oC)

- Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC)

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)

- Sodium acetate 3M (pH 4,8)

c) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt và nối

- Enzyme BamHI, NdeI (Fermentas, Đức)

- Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức)

- Buffer ligation 10X (Fermentas, Đức)

- T4 DNA ligase (Fermentas, Đức)

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)

- Hóa chất dùng cho tinh chế DNA

- Bộ kit tinh chế EZ-10 spin column (Biobasic)

e) Hóa chất dùng cho biến nạp DNA plasmid vào E coli

- Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng

- Dung dịch MgCl2 20mM, CaCl2 80mM vô trùng (giữ ở 4oC)

- Dung dịch glycerol 80% vô trùng

f) Hóa chất dùng cho điện di DNA trên gel agarose

- Agarose (Biobasic)

- Dung dịch chạy điện di TAE 50X: Tris acetate 40mM, EDTA 0,1M (pH 8,0)

- Dung dịch nạp mẫu DNA: 0,05% xylene cyanol, 0,09% bromophenol blue; 60% glycerol và 60mM EDTA

- Ethidium bromide 10 mg/ml

g) Hoá chất dùng cho điện di SDS - PAGE

- Dung dịch điện di 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3): Tris 15,1g, SDS 5g, glycine

- Tris - HCl 1,5M pH 8,8 (giữ ở 4oC)

- Tris - HCl 0,5M pH 6,8 (giữ ở 4oC)

- SDS 10%

- 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 4oC)

- Ammonium persulphate (APS) (giữ ở 4oC)

- TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ ở 4oC)

Thành phần gel phân tích (15%) và gel gom được trình bày như bảng 2.1

Bảng 2.1 Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS-PAGE

+ Dung dịch cố định mẫu 1: Ethanol 50ml, acetic acid 5ml, nước cất 50ml

+ Dung dịch cố định mẫu 2: Methanol 50ml, nước cất 50ml

+ Natrithiosulfate 0,02%

+ AgNO3 0,2%

+ Developer: Na2CO3 10g, Formaldehyde 0,54ml, nước cất đủ 50ml

+ Stopper: Glycine 0,5g, nước cất đủ 100ml

h) Hoá chất lai Western-Blot

- Dung dịch Towbin: 3g Tris-HCl, 14,4g glycine, 1g SDS trong 800ml nước cất

Bổ sung 200ml methanol trước khi dùng

- Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline): Na2HPO4 80mM, NaH2PO4 20mM, NaCl 100mM, pH = 7,5

- Dung dịch PBST: 0,1% Tween 20 trong PBS

- Dung dịch khoá màng: 0,5g sữa gầy trong 10ml dung dịch PBST

- Dung dịch chứa kháng thể kháng FGF: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng thể kháng FGF-2 (10mg/ml) (Sigma)

- Dung dịch chứa kháng thể anti-Ig chuột-HRP: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Sigma)

- Dung dịch phát hiện (Amersham): detection 1: detection 2= 1:1

i) Hóa chất dùng cho tinh chế protein

- Buffer A (dung dịch cân bằng cột): Na2HPO4 0,1M, NaH2PO4 0,1M, EDTA 1mM,

- Ampicillin 100mg/ml (Biobasic) (giữ ở -30oC)

- IPTG (Isopropyl1-β-D-thiogalactoside) 1M (giữ ở -30oC)

- Các chất điều chỉnh pH trong quá trình lên men: NH4OH 15%, H3PO4 30%

- Chất phá bọt trong quá trình lên men: polyglycon

- Môi trường lên men:

+ Trace: ZnSO4.7H2O 0,288g/l; MnSO4.7H2O 0,142g/l; H3BO3 0,062g/l; NaMoO4.2H2O 0,048g/l; CoCl2.6H2O 0,048g/l; KI 0,083g/l; CaSO4.5H2O 0,125g/l;

H2SO4 0,25M 1ml/l

+ Môi trường lên men (pH = 7): glycerol 0,3%, trypton 0,5%; cao nấm men 0,5%;

KH2PO4 50mM; Na2HPO4 50mM; NH4Cl 0,5g/l; MgSO4 4mM; Na2SO4 5mM; glucose 0,5%; trace 1ml/l

2.1.3 Vật liệu sinh học

Tất cả các vật liệu sinh học được dùng trong đề tài này được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học phân tử - môi trường, trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TPHCM

2.1.3.1 Chủng vi sinh vật

Chủng E coli DH5 [F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -

, thi-1, gyrA96, relA1] dùng để dòng hóa

Chủng E coli BL21(DE3) (F+ ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm(DE3)) là chủng E

coli đột biến khiếm khuyết protease ompT và lon, dùng để biểu hiện

2.1.3.2 Plasmid

Plasmid do Bộ môn Công nghệ Sinh học phân tử - môi trường, trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TPHCM cung cấp

Plasmid pIDT-fgf2 chứa gene mã hóa protein FGF-2 với các vị trí cysteine đã

được biến đổi được gửi tổng hợp hoá học ở công ty IDTDNA, Hoa Kỳ

Plasmid pET-His có kích thước 4636bp, có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin

(amp r ), trình tự khởi đầu sao chép pBR322 ori, promoter T7 Đây là một promoter

mạnh giúp cho việc biểu hiện protein trong vi khuẩn Ngoài ra, trên vùng MCS còn có

vị trí cắt giới hạn duy nhất của hai enzyme BamHI và NdeI giúp gắn chèn đoạn gen

mong muốn vào vector Gen quan tâm có thể được dung hợp với đuôi His 6x tại đầu

N-terminal giúp cho việc tinh chế dễ dàng hơn

Hình 2.1 Plasmid pET-His

2.1.3.3 Thang chuẩn

Hình 2.2 Các thang chuẩn

A, thang 1 Kb (Fermentas); B, thang 1Kb plus (Fermentas);

C, thang phân tử lượng protein (Sigma)

2.2.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

2.2.1.1 Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR

Gene fgf-2 được thu nhận với lượng lớn nhờ phản ứng PCR plasmid pIDT-fgf2

với cặp mồi đặc hiệu của gene nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào plasmid

pET-His với chương trình được thiết kế như hình 2.4

Hình 2.4 Chương trình PCR thu nhận gen fgf2

DNA plasmid pIDT 1,0µl

Pfu DNA polymerase 1,0µl

Gen fgf2 thu nhận sau phản ứng PCR được tinh chế bằng bộ kít EZ-10 Spin

Column DNA Gel Extraction Kit

2.2.1.2 Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His

a) Nguyên tắc của phương pháp tách chiết bằng SDS-kiềm

Có thể tách chiết plasmid bằng nhiều phương pháp như dùng nhiệt độ cao, lithium, SDS kiềm… Trong đó, sử dụng SDS kiềm là cách tách chiết phổ biến nhất do thực hiện đơn giản nhưng cho hiệu quả tách chiết cao Phương pháp dựa trên sự hồi tính nhanh chóng của DNA plasmid so với DNA bộ gen Tế bào được xử lý lần lượt với dung dịch 1, 2 và 3 Dung dịch 1 chứa glucose tạo môi trường nhược trương giúp tế bào dễ vỡ và EDTA ức chế DNAse Màng tế bào bị phá vỡ bởi NaOH và SDS Dưới tác dụng của SDS trong dung dịch 2, protein của tế bào sẽ bị biến tính Sự hiện diện của kiềm ở nồng độ cao trong giai đoạn đầu của quá trình tách chiết làm DNA bộ gen

và DNA plasmid bị biến tính Việc trung hòa nhanh bằng dung dịch 3 có tác dụng làm phục hồi cấu trúc DNA Do kích thước của plasmid nhỏ hơn nên phục hồi dễ dàng và hiện diện trong phần dịch nổi sau ly tâm Trong khi đó DNA bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi và tạo phức hợp với các protein bị biến tính thành tủa trong dung dịch DNA plasmid được tủa dưới tác dụng của ethanol tuyệt đối và sau đó hòa tan lại trong dung dịch TE [12]

b) Các bước tiến hành

- Nuôi cấy dòng E coli mang plasmid pET-His trong 5ml môi trường LB có bổ

sung Ampicillin 100g/ml, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút qua đêm ở 37o

C

- Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút để thu sinh khối

- Bổ sung 100µl dung dịch I vào eppendorf 1,5ml chứa sinh khối, vortex thật kỹ

- Bổ sung 200µl dung dịch II, đảo nhẹ

- Bổ sung ngay 150µl dung dịch III, đảo nhẹ

- Ly tâm thu dịch nổi ở 10.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC

- Bổ sung vào dịch nổi 1,5µl RNase (1 mg/ml), ủ ở 37oC, 1 giờ

- Thêm 250µl phenol pH 8 và 250µl chloroform, đảo đều, ly tâm 10.000rpm, 5 phút, thu dịch nổi

- Tủa DNA plasmid bằng 1ml ethanol 99o lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút, 30 phút,

4oC

- Rửa tủa trong 500µl ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút, 5 phút, 4oC

- Thu tủa, phơi khô tự nhiên Bảo quản mẫu trong 30µl TE, -20oC Điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose 1%

2.2.1.3 Xử lý gen fgf2 và plasmid pET-His bằng enzyme cắt hạn chế

a) Xử lý gen fgf2 bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và NdeI

Thành phần phản ứng cắt:

Buffer Tango 10X 10µl

Enzyme BamHI (10u/µl) 1µl

Enzyme NdeI (10u/µl) 1µl

Enzyme NdeI (10u/µl) 1µl

Enzyme BamHI (10u/µl) 1µl

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC, 4 giờ Sản phẩm cắt được tinh chế bằng bộ

EZ-10 Spin Column PCR Products Purification Kit

2.2.1.4 Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2

Nhằm mục đích dòng hoá, gen mục tiêu được đưa vào vector thông qua phản ứng nối dưới hoạt động của enzyme T4 DNA ligase T4 DNA ligase có khả năng nối hai trình tự DNA thông qua việc hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 5’phosphate

và đầu 3’OH của hai đoạn DNA

Dưới tác dụng của T4 DNA ligase, gen fgf-2 được nối vào plasmid pET-His, plasmid tái tổ hợp được tạo thành gọi là pET-fgf2

Thành phần phản ứng nối như sau:

Buffer T4 DNA ligase 1,5l

T4 DNA ligase 1,0l Tổng thể tích 15,0l Phản ứng nối được tiến hành ở 11 o

C trong 4 giờ Sau đó hỗn hợp sản phẩm nối

được biến nạp vào tế bào E coli DH5α

2.2.1.5 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α

Phương pháp hóa biến nạp dựa trên sự xáo trộn của màng tế bào do ion Ca2+ gây

ra giúp DNA xâm nhập vào tế bào dễ dàng hơn Quá trình sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây kích thích sự chuyển plasmid vào bên trong tế bào Sau đó tế bào được nuôi lại trong môi trường LB giúp tế bào hồi phục

- Rửa sinh khối tế bào bằng dung dịch CaCl2-MgCl2 (20mM-80mM), vortex nhẹ,

ly tâm thu sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC

- Thêm 3ml CaCl2 100mM và 1ml glycerol 80%, trộn nhẹ đều và cất giữ tế bào ở

tủ âm

Tất cả các bước được thực hiện vô trùng

b) Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp

15µl hỗn hợp sản phẩm nối được trộn đều vào 100µl tế bào E coli DH5α khả nạp

trong eppendorf Rồi thực hiện sốc nhiệt theo qui trình sau:

- Để lạnh 4o

C trong 10 phút

- Giữ 42oC trong 90 giây

- Giữ lạnh 4oC trong 15 phút

Sau đó trải hỗn hợp này lên đĩa LB-Amp100, ủ 37o

C trong khoảng 16-18 giờ

Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E coli DH5α không được biến

nạp sản phẩm nối

2.2.1.6 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

a) Sàng lọc thể biến nạp trên môi trường kháng sinh

Sau khi ủ ở 37oC, kiểm tra kết quả biến nạp bằng cách quan sát sự phát triển của

vi khuẩn trên đĩa biến nạp và đĩa đối chứng Trên môi trường LB-Amp100, chỉ những

tế bào E coli DH5α nào thu nhận được plasmid pET-fgf2 (plasmid tái tổ hợp) hoặc

plasmid pET (plasmid tự nối) mới mọc được trên môi trường này Các tế bào này sẽ được thu nhận để kiểm tra trong các bước tiếp theo

b) Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc

Nguyên tắc: Phương pháp PCR khuẩn lạc cũng tương tự như phương pháp PCR

DNA thông thường Dưới tác dụng nhiệt độ cao màng tế bào sẽ bị phá vỡ DNA

plasmid được giải phóng ra ngoài và trở thành khuôn cho phản ứng PCR

Các bước thực hiện:

Lấy một ít sinh khối bằng tăm vô trùng từ khuẩn lạc mọc trên đĩa LB-Amp100 agar Huyền phù đầu tăm vào các eppendorf 0,2ml được đánh dấu sẵn

Thành phần phản ứng:

Chương trình chạy PCR được trình bày như hình 2.5

Hình 2.5 Chương trình PCR khuẩn lạc bằng mồi đặc hiệu

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Những khuẩn lạc cho vạch DNA có kích thước đúng như dự đoán sẽ được chọn lọc nuôi cấy và tách chiết plasmid, chuẩn bị cho các bước kiểm tra tiếp theo

c) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

Thu nhận plasmid của các khuẩn lạc cho kết quả dương tính với phản ứng PCR theo phương pháp SDS-kiềm Plasmid sau khi tách được tiến hành bằng các phương pháp sau:

- Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi đặc hiệu

- Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi thương mại

- Kiểm tra bằng phương pháp enzyme cắt hạn chế

- Giải trình tự, so sánh độ tương đồng trình tự lý thuyết và sự đồng khung dịch

mã

* Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R

Plasmid sau khi tách được PCR kiểm tra với chương trình chạy và thành phần phản ứng tương tự như kiểm tra PCR khuẩn lạc ở mục 2.2.1.6b

* Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi T7promoter/T7terminator

Chương trình chạy PCR được trình bày như hình 2.6

Hình 2.6 Chương trình PCR plasmid bằng mồi thương mại

Ngoài ra, plasmid cũng được xử lý với enzyme EcoRI để kiểm tra kích thước plasmid và đồng thời cũng được xử lý với 2 enzyme NdeI và BamHI để xác nhận sự hiện diện của gen fgf2 trong plasmid pET-fgf2 Thành phần phản ứng cắt được trình

sự đồng khung dịch mã bằng phần mềm Jelly fish

Chủng được bảo quản trong 20% glycerol, ở -80oC

2.2.2 Cấu trúc chủng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 2.2.2.1 Thu nhận plasmid pET-fgf2

Các plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 được tách chiết bằng phương pháp

SDS-kiềm tương tự như mục 2.2.1.2

2.2.2.2 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3)

Chuẩn bị tế bào E coli BL21(DE3) khả nạp, biến nạp plasmid pET-fgf2 vào tế bào khả nạp E coli khả nạp và quá trình biến nạp tương tự như mục 2.2.1.5

Sau khi biến nạp và trải lên đĩa LB-Amp100 Đĩa sau khi trải sẽ được ủ 37oC

trong khoảng 16-18 giờ Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E coli BL21(DE3) không được biến nạp plasmid

2.2.2.3 Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc

Khuẩn lạc E.coli BL21(DE3) được PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu F/FGF2-R tương tự như kiểm tra PCR khuẩn lạc E.coli DH5α ở mục 2.2.1.6

FGF2-2.2.3 Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong E coli BL21(DE3)

2.2.3.1 Cảm ứng biểu hiện protein FGF-2

- Hoạt hóa tế bào E coli BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 tái tổ hợp vào

ống nghiệm chứa 5ml LB-Amp100 Lắc 250 vòng/phút ở 37°C qua đêm