phân tích đa dạng di truyền một số dòng ngô nếp đơn bội kép nhằm tạo giống ngô nếp lai

Trong đó, chỉ thị SSR Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản cho độ đa hình cao nên được sử dụng phổ biến để nghiên cứu đa dạng di truyền, sự liên kết giữa các tính trạng số

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG NGÔ NẾP ĐƠN BỘI KÉP NHẰM TẠO GIỐNG NGÔ NẾP LAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG NGÔ NẾP ĐƠN BỘI KÉP NHẰM TẠO GIỐNG NGÔ NẾP LAI

NGƯỜI HƯỚNG DẤN KHOA HỌC:

1 PGS TS PHAN HỮU TÔN

2 TS NGÔ THỊ MINH TÂM

HÀ NỘI - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi sự giúp đỡ để hoàn thành luận văn thạc sĩ này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn trực tiếp là PGS TS Phan Hữu Tôn – Trưởng Bộ môn Sinh học Phân tử - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Cô Ngô Thị Minh Tâm – Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Nghiên cứu Ngô đã hết sức chỉ bảo, hướng dẫn để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Sinh học Phân tử, Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đào tạo sau đại học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ngô, đặc biệt là

TS Bùi Mạnh Cường – Phó Viện trưởng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện luận văn tại Bộ Môn Công nghệ Sinh học

Tôi xin cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ mọi mặt cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 0

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 4

2.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc tính của ngô nếp 4

2.1.1 Nguồn gốc lịch sử của ngô nếp 4

2.1.2 Phân loại thực vật về ngô nếp 4

2.1.3 Đặc tính của ngô nếp 4

2.2 Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong và ngoài nước 6

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngô nếp trên thế giới 6

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong nước 7

2.3 Ưu thế lai - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng 8

2.4 Phân tích đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai trong chọn tạo giống ngô 10

2.4.1 Chỉ thị hình thái 11

2.4.2 Chỉ thị sinh hoá 12

2.4.3 Chỉ thị phân tử 12

2.5 Dòng thuần và tạo dòng ngô thuần bằng phương pháp đơn bội 18

2.5.1 Khái niệm dòng thuần 18

2.5.2 Tạo dòng ngô thuần bằng phương pháp đơn bội kép 18

2.6 Khả năng kết hợp và phương pháp đánh giá khả năng kết hợp 22

2.6.1 Khả năng kết hợp 23

2.6.2 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp 23

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Vật liệu và hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 27

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 29

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Phương pháp theo dõi, đánh giá thí nghiệm ngoài đồng ruộng 30

3.3.2 Đánh giá ưu thế lai và khả năng kết hợp 32

3.3.3 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR 32

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 36

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng ngô nghiên cứu 37

4.1.1 Thời gian sinh trưởng của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu 37

4.1.2 Đặc điểm hình thái của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu 39

4.1.3 Khả năng chống chịu của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu 40

4.1.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu 42

4.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR 45

4.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 45

4.2.2 Kết quả đánh giá tỷ lệ khuyết số liệu, số alen và hệ số PIC 47

4.2.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các dòng 52

4.3 Kết quả đánh giá khả năng kết hợp về năng suất của 8 dòng triển vọng bằng phương pháp luân giao 57

4.4 Kết quả khảo sát đánh giá các tổ hợp lai luân giao 59

4.4.1 Thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai luân giao 59

4.4.2 Đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai luân giao 61

4.4.3 Khả năng chống chịu của các tổ hợp lai luân giao 63

4.4.4 Yếu tố cấu thành năng suất, năng suất và chất lượng ăn tươi của các tổ hợp lai luân giao 65

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72

5.1 Kết luận 72

5.2 Đề nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 79

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách 25 dòng ngô nếp nghiên cứu 27

Bảng 3.2 Danh sách 22 mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 3.3 Chỉ tiêu chất lượng ăn tươi 32

Bảng 3.4 Thành phần của một phản ứng PCR 34

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 34

Bảng 3.6 Thành phần gel polyacrylamide 4,5% 35

Bảng 4.1 Thời gian sinh trưởng của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu (Thu 2012) 38

Bảng 4.2 Đánh giá đặc điểm hình thái của 25 dòng ngô nếp nghiên cứu (Thu 2012) 39

Bảng 4.3 Khả năng chống đổ và mức độ nhiễm sâu bệnh của 25 dòng ngô nếp (Thu 2012) 41

Bảng 4.4 Một số yếu tố cấu thành năng suất của 25 dòng ngô nếp (Thu 2012) 43

Bảng 4.5 Năng suất hạt của 25 dòng ngô nếp (Thu 2012) 44

Bảng 4.6 Tỷ lệ khuyết số liệu (M% dòng) của các dòng ngô nghiên cứu 47

Bảng 4.7 Tỷ lệ khuyết số liệu (M% mồi) của 22 mồi nghiên cứu 48

Bảng 4.8 Hệ số PIC, số alen xuất hiện ở 22 mồi nghiên cứu 49

Bảng 4.9 Khoảng cách di truyền giữa các cặp dòng trên cơ sở 22 mồi SSR 53

Bảng 4.10 Khoảng cách di truyền trung bình (GD) giữa các nhóm 56

Bảng 4.11 Danh sách 8 dòng ngô đánh giá khả năng kết hợp 57

Bảng 4.12 Giá trị khả năng kết hợp chung (ĝi), khả năng kết hợp riêng (ŝij) và phương sai khả năng kết hợp riêng (σ2 ŝij) về năng suất bắp tươi của 8 dòng triển vọng (Xuân 2013) 58

Bảng 4.13 Thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai luân giao (Xuân 2013) 60

Bảng 4.14 Đặc điểm hình thái của các tổ hợp lai luân giao (Xuân 2013) 62

Bảng 4.15 Khả năng chống chịu của các tổ hợp lai luân giao (Xuân 2013) 64

Bảng 4.16 Một số yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai luân giao

(Xuân 2013) 66 Bảng 4.17 Năng suất bắp tươi, ưu thế lai chuẩn của các tổ hợp lai luân giao

(Xuân 2013) 68 Bảng 4.18 Đánh giá chất lượng ăn tươi của các tổ hợp lai luân giao (Xuân

2013) 70

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Ảnh điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 1% 46

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi phi101049, mồi phi374118 và mồi phi213984 50

Hình 4.3 Sơ đồ phả hệ của 25 dòng ngô nghiên cứu trên cơ sở phân tích 22 locus SSR 55

Hình 4.4 Hình thái một số tổ hợp lai luân giao vụ Xuân 2013 63

Hình 4.5 Hình ảnh một số tổ hợp lai và đối chứng 67

Hình 4.6 Đánh giá chất lượng ăn tươi của các tổ hợp lai 71

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

AFLP Amplifiel Frangment Lengh Polymorphim (Đa hình các đoạn cắt

khuyếch đại) AMBIONET Asian Maize Biotechlonogy Network (Mạng lưới công nghệ sinh

học cây ngô vùng Châu Á)

Bp Base pair - cặp bazơ nitơ

CIMMYT Centro Internacional de Mejoramiento de Maiz y Trigo (Trung tâm

cải lương ngô và lúa mì quốc tế)

CV% Coefficient of variation (hệ số biến động)

GD Genetic Distance (Khoảng cách di truyền)

GS Genetic Similarity (Hệ số di truyền)

Hs Standard Heterosis (Ưu thế lai chuẩn)

NSTT Năng suất thực thu

NSBT Năng suất bắp tươi

NTSYS Numerical Taxonomy System (Hệ thống phân loại)

P 1000 hạt Khối lượng 1000 hạt

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PIC Polymorphic Information Content (Chỉ số thông tin đa dạng của

mồi) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các đoạn ADN

khuyếch đại ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Lengh Polymorphism (Đa hình chiều dài các

phân đoạn cắt giới hạn) SSR Simple Sequence Repeat (Sự lặp lại trình tự đoạn nucleotide

đơn giản)

UPGMA Unweighted Pair - Group Method with Arithmetical Averages

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngô (Zea mays L.) là một cây ngũ cốc có tiềm năng năng suất cao, khả năng

thích ứng rộng, có nhiều ứng dụng đối với đời sống con người Trên thế giới, ngô xếp thứ ba về diện tích và thứ nhất về năng suất, sản lượng các cây lấy hạt Tính đến năm 2012, diện tích trồng ngô đạt 176,9 triệu ha, năng suất trung bình 5,18 tấn/ha

và sản lượng đạt kỷ lục là 875,1 triệu tấn (Faostat, 2011)

Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực đứng vị trí thứ hai sau cây lúa, được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Hạt ngô có hàm lượng dinh dưỡng tương đối cao: hàm lượng tinh bột ở vỏ hạt là 7,30%, nội nhũ là 87,6%, mầm là 8,30% Đặc biệt, trong hạt ngô còn có nhiều loại amino axit không thay thế quan trọng như: Leucin, isoleucin, tyrosin, threonin, lyzin,…(Trần Duy Quý, 1994)

Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng ngô làm thực phẩm (ngô nếp, ngô đường) để ăn, phục vụ công nghiệp chế biến ngày càng tăng, đặc biệt là ngô nếp Diện tích ngô nếp tính đến năm 2014 ước đạt 1- 12% diện tích trồng ngô trên cả nước, đặc biệt phát triển mạnh ở vùng ven đô đã đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng ngô Tuy nhiên, hệ thống giống ngô nếp chủ yếu do nước ngoài cung cấp Chính vì vậy, nhiệm vụ cấp bách của các nhà nghiên cứu ngô trong nước là phải nhanh chóng tạo ra các giống ngô nếp nội có năng suất cao, chất lượng tốt, thời gian sinh trưởng ngắn, đáp ứng yêu cầu sản xuất

Việc khai thác tiềm năng năng suất thông qua ưu thế lai và đưa nhanh các giống ngô lai vào sản xuất trên quy mô rộng lớn là một trong những đóng góp quan trọng làm tăng sản lượng lương thực Muốn tạo giống ngô lai tốt, các nhà chọn giống phải tạo ra các dòng tự phối từ các nguồn nguyên liệu không đồng nhất về mặt di truyền, sau 6 - 8 thế hệ tự phối mới thu được thế hệ đồng hợp tử cần thiết gọi là dòng thuần Sau đó các nhà chọn giống phải tiếp tục nghiên cứu, đánh giá khả năng kết hợp

và thử nghiệm các con lai Như vậy, theo phương pháp truyền thống phải mất nhiều

thời gian (5 - 7 năm) các nhà tạo giống mới tạo ra được giống lai mới (Hallauer A R

et al., 1988)

Tạo dòng thuần là công việc đầu tiên và quan trọng trong chương trình tạo giống ngô lai Tuy nhiên, phương pháp chọn tạo và đánh giá dòng truyền thống còn hạn chế: đòi hỏi thời gian dài, tốn nhiều công sức, các dòng tạo ra sử dụng được cho chương trình tạo giống lai thấp Hiện nay, việc ứng dụng rộng rãi những thành tựu của ngành Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ đắc lực cho phương pháp truyền thống trong cải tạo giống cây trồng Đối với cây ngô, việc tạo dòng thuần bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn hay còn gọi là tạo dòng đơn bội kép (double haploid lines) không chỉ rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần mà các dòng tạo ra có thể mang những đặc điểm ưu việt hơn phương pháp tự phối

Bên cạnh đó, việc chọn tạo giống ngô kết hợp sử dụng chỉ thị phân tử đang được ứng dụng rộng rãi Các nhà khoa học đã sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử như RFLP, RAPD, AFLP, SSR,… để đánh giá quan hệ di truyền nhanh chóng hơn, chính xác hơn Trong đó, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat - trình

tự lặp lại đơn giản) cho độ đa hình cao nên được sử dụng phổ biến để nghiên cứu đa dạng di truyền, sự liên kết giữa các tính trạng số lượng, đánh giá sự sai khác hệ gen của các dòng chọn lọc giúp các nhà tạo giống xác định nhanh các tổ hợp lai năng suất cao, chống chịu tốt đáp ứng yêu cầu của sản xuất, giảm bớt thời gian, chi phí và mang lại độ tin cậy cao

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích

đa dạng di truyền một số dòng ngô nếp đơn bội kép nhằm tạo giống ngô nếp lai”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng ngô nếp được tạo ra từ phương pháp nuôi cấy bao phấn bằng chỉ thị SSR giúp phân nhóm cách biệt di truyền, hỗ trợ xác định các tổ hợp lai cho ưu thế lai cao, đánh giá năng suất phẩm chất của con lai phục vụ công tác chọn tạo giống ngô nếp lai

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Đánh giá đặc điểm nông sinh học của một số dòng ngô nếp đơn bội kép

- Xác định mức độ đa hình của các dòng ngô nếp đơn bội kép bằng chỉ thị phân tử SSR, xây dựng sơ đồ phả hệ, phân nhóm cách biệt di truyền và dự đoán ưu thế lai

- Đánh giá khả năng kết hợp về năng suất của các dòng ngô nếp đơn bội kép triển vọng

- Đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, ưu thế lai của các tổ hợp lai

- Cung cấp thêm thông tin góp phần định hướng cho công tác chọn tạo giống

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng Đồng thời kết hợp với các phương pháp đánh giá đồng ruộng nhanh chóng xác định được các dòng có khả năng kết hợp cao về năng suất, có xác suất tham gia vào các tổ hợp lai cho năng suất cao, chất lượng tốt

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

2.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc tính của ngô nếp

2.1.1 Nguồn gốc lịch sử của ngô nếp

Về nguồn gốc địa lý chính xác của ngô nếp cho đến nay vẫn chưa được xác định Tuy nhiên, theo nhà thực vật học Colins, ngô nếp được phát hiện ở Trung Quốc vào đầu những năm 1900 Kể từ khi phát hiện ra nó ở Trung Quốc, loại này cũng đã được tìm thấy nhiều nơi khác ở Đông Nam Á như Miến Điện, Philipin (Collins G N., 1909)

Về nguồn gốc di truyền, hiện nay các nhà khoa học đã xác định rằng ngô nếp bắt nguồn từ đột biến đơn gen từ ngô thường, do đột biến gen trội Wx thành gen lặn

wx nên ngô nếp có thể xuất hiện ở nhiều vùng khác nhau của trái đất Ngô nếp là kết quả đột biến từ dạng ngô răng ngựa, được tìm thấy và thuần hóa ở Mỹ vào những năm 1930 Gần đây, các nhà khoa học cũng chứng minh được rằng ngô nếp còn được thuần hóa từ dạng ngô đá ở Trung Quốc (Liu H et al., 2008)

2.1.2 Phân loại thực vật về ngô nếp

Ngô nếp (Zea mays var ceratina Kulesh.) là một trong những loài phụ của Zea mays L Hạt ngô nếp có bề mặt ngoài bóng hơn ngô tẻ, lớp ngoài cùng của

mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ngô tẻ, có tính chất quang học giống như sáp và được gọi là ngô sáp, khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon Tinh bột nội nhũ của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong khi ngô thường chứa 75% amylopectin và 25% amylose Khi nhuộm tinh bột ngô nếp với dung dịch I2/KI 2% thì chuyển thành màu nâu đỏ, trong khi tinh bột ngô thường chuyển thành màu xanh tím Theo Fergason (1994) và Hallauer (1994) thì ngô nếp có biểu hiện gen opaque (waxy opaque-2) nên rất giàu axzit amin không thay thế là lyzin, tryptophan và protein Do đó, nó có giá trị dinh dưỡng cao (Fergason V., 1994)

2.1.3 Đặc tính của ngô nếp

Đặc tính ngô nếp được quy định bởi gen lặn, đó là gen wx do đột biến từ gen trội Wx Gen waxy định vị trên cánh tay ngắn ở nhiễm sắc thể số 9 Cấu trúc gen

waxy có kích thước 3718 bp bao gồm 14 exons kích thước từ 64 – 392 bp và 13 introns có kích thước từ 81 – 139 bp, ở các exons và vùng promoter rất giàu G/C (chiếm trung bình khoảng 60%, thậm chí lên đến 75 – 85%) (Klosgen R B et al., 1986; Zhao Y et al., 2008)

Gen waxy mã hóa cho enzyme granule-buond starch synthase (GBSS), đây

là một trong những isoenzyme chính xúc tác sự tổng hợp amylose từ ADP glucose, được biểu hiện ở nội nhũ và hạt phấn Ở ngô thường, isoenzyme GBSS có hoạt tính mạnh và sản phẩm của nó là amylose, khi đó trong con đường chuyển hóa tinh bột thì ADP glucose không thể được chuyển hóa hoàn toàn thành amylopectin Vì vậy

sẽ còn khoảng ¼ tinh bột trong nội nhũ còn lại là amylose và có kiểu hình là ngô thường Ở ngô nếp, gen trội Wx bị đột biến thành gen lặn wx và hoạt động của enzyme GBSS bị ức chế đồng thời tất cả isoenzyme khác tổng hợp amylose cũng hoạt động rất yếu và ADP glucose sẽ được chuyển thành amylopectin bởi enzyme starch branching (SBE) Khi đó, chỉ có amylopectin được tích lũy trong nội nhũ và

có kiểu hình là ngô nếp (Creek R G., 1968)

Wessler và cs (1985) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để xác định cấu trúc của gen Wx trong các dạng đột biến wx Trong nghiên cứu này đã xác định 13 trường hợp di truyền khác nhau có thể làm tăng kiểu hình ngô nếp ở ngô, bao gồm đột biến mất đoạn và chèn đoạn Những đoạn bị chèn vào có kích thước thay đổi từ 150bp đến 6.1kb Và đã xác định được 4 đột biến do mất đoạn, 2 đột biến điểm trong gen

Wx (Wessler S R and Varagona M J., 1985)

Liu và cs (2007) cũng xác định được một loại đột biến gen waxy do sự chuyển vị của gen aldehyde dehydrogenase rf2 vào đầu 3’ của locus waxy (Liu J et al., 2007)

Những đột biến điểm, chèn đoạn hoặc mất đoạn tại các vị trí khác nhau trên locus waxy dẫn đến thay đổi cấu trúc protein GBSS, do đó sẽ ức chế sinh tổng hợp amylose Một vài đột biến là có ý nghĩa, làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme GBSS và kết quả là mang kiểu hình ngô nếp (Huang B Q et al., 2010)

Trong quá trình chọn lọc tự nhiên đã tạo ra một số đột biến gen lặn làm thay đổi chất lượng và hàm lượng tinh bột trong nội nhũ như: Đột biến gen amylose-

extender 1 (ae1) làm tăng hàm lượng đường sucrose gấp 3 lần ngô thường, giảm hàm lượng amylopectin, tăng sự tích lũy của glucopolysaccaride phytoglycogen cao gấp 10 lần ngô thường (Jame M G et al., 1995); Đột biến gen waxy ức chế sinh tổng hợp amylose, làm cho tinh bột trong nội nhũ và hạt phấn cấu tạo bởi gần như 100% amylopectin (Goralski G et al., 2002) Giống như các loại rau thực phẩm khác, chất lượng ngô nếp cũng bị ảnh hưởng bởi hàm làm protein, thành phần axit amin, độ dày vỏ hạt và một số đặc tính khác

2.2 Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngô nếp trên thế giới

Trên thế giới, ngô nếp đã được nghiên cứu từ lâu nhưng do năng suất thấp và nhu cầu sử dụng trước đây không cao nên ít được quan tâm Một số nước Châu Á như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc… đã đưa ngô nếp vào gieo trồng và sử dụng trong hơn 1 thế kỷ nay

Để tạo dòng ngô nếp thuần, đa dạng về mặt di truyền các nhà khoa học đã dùng nguyên liệu ban đầu là các giống nếp địa phương và nhập nội, sau đó bằng phương pháp truyền thống thông qua tự phối và chọn lọc cá thể dựa vào nội nhũ và các đặc tính nông học

Năm 2001, K Lertrat và N Thongnarin đã thành công trong nghiên cứu cải thiện chất lượng và độ ngọt của ngô nếp địa phương từ hỗn hợp hạt siêu ngọt (Lertrat K and Thongnarin N., 2001) Những tổ hợp lai được tạo ra khi lai giữa ngô nếp và ngô đường có thành phần bao gồm 75% hạt ngô nếp và 25% hạt ngô ngọt và rút ngắn được thời gian sinh trưởng, nâng cao năng suất và cải thiện chất lượng dinh dưỡng của con lai

Ngoài ra, dòng ngô nếp có thể được cải tạo từ các dạng ngô thường bằng cách cho lai ngô nếp với ngô thường, sau đó trải qua quá trình tự phối và lai ngược (backcross) được thực hiện luân phiên nhau Sử dụng phương pháp này sẽ tích lũy được tính trạng tốt của bố mẹ đồng thời nâng cao tần suất gen quy định tính trạng ngô nếp (tránh mất đi gen lặn wx từ bố mẹ) Các gen lặn wx được xác định bằng đánh giá

bề mặt bóng của hạt ở thế hệ tự thụ và xác định bằng phân tích hạt phấn qua phản ứng với dung dịch KI/I2 (Feng Z L et al., 2008) Quá trình tạo dòng ngô nếp có thể được

rút ngắn bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử (chỉ thị chọn lọc trong gen) để xác định ngay được các các thể mang kiểu gen dị hợp tử hay đồng hợp tử (WxWx, Wxwx và wxwx) từ quần thể phân ly của thế hệ F2 khi lai giữa dòng ngô nếp và dòng ngô thường mà bỏ qua các thế hệ tự phối phân ly chọn lọc (Liu J et al., 2007)

Như vậy, việc ứng dụng chỉ thị chọn lọc trong gen có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình chọn lọc từng cá thể mà không mất nhiều thời gian, công sức Từ đó, giúp cho nhà tạo giống có thể nhanh chóng xác định cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử lặn ở ngay giai đoạn cây con mà không cần sự biểu hiện kiểu hình của nó ở giai đoạn chín và thậm chí xác định được cá thể mang kiểu gen dị hợp tử Vì vậy, có thể loại bỏ cây con không mang gen lặn wx

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ngô nếp trong nước

Cho đến nay chỉ có một số công trình nghiên cứu về ngô nếp phục vụ cho chương trình tạo giống ngô nếp lai được công bố như:

Ngô Hữu Tình và cs (1990) đã nghiên cứu chọn tạo được giống ngô nếp trắng tổng hợp với năng suất trung bình 25 – 30 tạ/ha, có khả năng thích ứng rộng

và được công nhận giống quốc gia (Ngô Hữu Tình và Nguyễn Thị Lưu, 1990) Nguyễn Thị Lâm và cs (1997) đã phân loại 72 giống ngô nếp địa phương thuộc 3 biến chủng: nếp trắng (48 mẫu), nếp vàng (6 mẫu) và nếp tím (16 mẫu) Trong đó, biến chủng nếp tím có thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, chiều cao đóng bắp và số lá là lớn nhất (Nguyễn Thị Lâm và Trần Hồng Uy, 2007)

Nguyễn Hữu Đống và cs (1997) đã nghiên cứu gây tạo đột biến bằng tia gamma kết hợp với xử lý diethylsunfat ở ngô nếp Kết quả thu được một số dòng biến dị có các đặc tính nông học quý so với giống ban đầu (Nguyễn Hữu Đống và

cs, 1997)

Phan Xuân Hào và cs (2007) tiến hành đánh giá đặc điểm nông sinh học, đánh giá độ thuần, đa dạng di truyền và khả năng kết hợp của 30 dòng ngô nếp Kết quả xác định được 5 dòng nếp ưu tú có khả năng kết hợp chung cao và 6 tổ hợp lai triển vọng phục vụ cho chương trình chọn tạo giống nếp lai Việt Nam (Phan Xuân Hào và Nguyễn Thị Nhài, 2007)

Nguyễn Thị Nhài và cs (2009) đã nghiên cứu chọn tạo được giống nếp lai số

1 đạt năng suất trung bình 54,88 tạ/ha, có chất lượng ngon và thích ứng với nhiều vùng sinh thái Giống nếp lai số 1 đã được công nhận cho sản xuất thử (Nguyễn Thị Nhài và Phan Xuân Hào, 2009)

Tính đến năm 2010, Viện Nghiên cứu Ngô đang lưu giữ 234 mẫu ngô nếp địa phương Trong đó, có 177 nguồn nếp trắng, 33 nguồn nếp vàng, 24 nguồn nếp tím, nâu đỏ Công ty Cổ phần giống cây trồng miền Nam lưu giữ trên 100 mẫu giống ngô nếp thụ phấn tự do địa phương với các màu hạt phổ biến như trắng, vàng, tím (Công ty Cổ phần giống cây trồng miền Nam, 2010)

Trong thời gian qua, diện tích trồng ngô nếp không ngừng tăng do nhu cầu

sử dụng sản phẩm này ngày càng nhiều, không những được dùng làm lương thực, làm đồ ăn tươi (nướng, luộc…) mà còn được chế biến thành các món ăn được nhiều người ưa chuộng như súp ngô, snack ngô,… đồng thời ngô nếp đáp ứng được nhu cầu luân canh tăng vụ, mang lại hiệu quả cao cho người sản xuất Hiện nay, giống ngô nếp địa phương có chất lượng ngon nhưng năng suất thấp, còn giống ngô nếp lai nhập nội có độ đồng đều, năng suất cao, đảm bảo chất lượng nhưng giá thành lại rất cao (khoảng 10 – 15 USD/kg) Do đó, để đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng và giảm giá thành sản phẩm, đặt ra cho các nhà chọn tạo giống ngô Việt Nam nhanh chóng tạo ra các giống ngô nếp lai năng suất cao, chất lượng tốt áp dụng vào sản xuất là rất cần thiết Chính vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình di truyền là cần thiết để hỗ trợ cho phương pháp truyền thống góp phần rút ngắn được thời gian, công sức trong công tác chọn tạo giống nhằm nhanh chóng xác định được các tổ hợp lai triển vọng phục vụ cho chương trình tạo giống ngô nếp lai

2.3 Ưu thế lai - lịch sử nghiên cứu, ứng dụng

Ưu thế lai là sự tăng cường về sức sống, khả năng phát triển, khả năng thích nghi và khả năng sinh sản của con lai thế hệ thứ nhất so với dạng bố mẹ (Luân Thị Đẹp, 2002)

Hiện tượng ưu thế lai bắt nguồn lần đầu tiên được nhà thực vật học người Nga gốc Đức I Koelreuter (1733 - 1806) mô tả vào năm 1760, khi ông quan sát thấy

hiện tượng tăng sức sống của con lai giữa Nicotinanan tabacum và Nitotinana robusta

so với các dạng bố mẹ của chúng (Nguyễn Thị Lưu, 1999) Sau này, nhiều nhà khoa học khác cũng đề cập tới hiện tượng này, tuy nhiên những vấn đề lý luận đầu tiên về

ưu thế lai chỉ được Darwin nêu ra sau những nghiên cứu của ông Darwin là người đầu tiên quan sát thấy hiện tượng ưu thế lai ở ngô vào năm 1871 khi ông thấy những cây giao phấn phát triển cao hơn các cây tự phối 20% Sau nhiều thí nghiệm ông tổng kết: Sự tự phối (tự thụ phấn) thường làm giảm sức sống (có hại) và quá trình

giao phấn (thụ phấn chéo) thường có lợi, trong công trình “Tác động của giao phấn

và tự phối trong thế giới thực vật” xuất bản 1876 Charles Darwin được coi là người

đầu tiên đưa ra lý thuyết về ưu thế lai (Ngô Hữu Tình và cs, 1997)

Đến năm 1904, George Herrison Shull đã tiến hành tự phối cưỡng bức ở ngô để thu được các dòng thuần và tạo ra những giống ngô lai đơn từ những dòng thuần này Ông là người đầu tiên công bố về năng suất của con lai cao hơn hẳn thế hệ bố mẹ Qua kiểm chứng, Shull và các nhà khoa học đều cho rằng ưu thế lai là hiện tượng con lai có sức sống mạnh hơn, sinh trưởng và phát triển nhanh hơn, cho năng suất và phẩm chất cao hơn hẳn bố mẹ của chúng Dựa vào những quan sát, Shull đã vạch ra kế hoạch sử dụng ưu thế lai trong sản xuất nông nghiệp Thuật ngữ “Heterosis” chỉ ưu thế lai được Shull sử dụng lần đầu tiên vào năm 1913 (Ngô Hữu Tình, 2009)

Sau thành công của ngô lai, hiện tượng ưu thế lai trong chọn tạo giống cây trồng đã được thừa nhận rộng rãi Cho đến nay, ưu thế lai đã được nghiên cứu khá chi tiết từ khái niệm đến giả thuyết giải thích hiện tượng, đánh giá và duy trì ưu thế lai cũng như việc ứng dụng trong thực tiễn sản xuất Ưu thế lai biểu hiện ở hầu hết các tính trạng và được các nhà di truyền chọn tạo giống cây trồng chia thành 5 dạng biểu hiện chính: Ưu thế lai về hình thái; Ưu thế lai về năng suất; Ưu thế lai về tính thích ứng; Ưu thế lai về tính chín sớm; Ưu thế lai về sinh lý, sinh hóa (Dai J R et al., 1989; Hallauer A R et al., 1990)

Ưu thế lai thường được biểu hiện thông qua các tính trạng Để đánh giá mức

độ biểu hiện ưu thế lai, các nhà khoa học đã đưa ra một số phương pháp (Trần Duy Quý, 1994), (Lê Duy Thành, 1999):

- Xác định ưu thế lai trung bình (Hm): Được sử dụng trong giai đoạn lai thử Con lai biểu hiện sự hơn hẳn ở tính trạng nghiên cứu so với số đo trung bình của bố

Sức sống của con lai F1 có biểu hiện tăng lên so với bố mẹ ở một số tính trạng nhất định được gọi là ưu thế lai dương, và ngược lại thì gọi là ưu thế lai âm

Để sử dụng ưu thế lai trong sản xuất, tổ hợp lai F1 không những tỏ ra hơn hẳn giống

bố mẹ mà còn phải hơn hẳn giống thương mại tốt nhất Chính vì vậy, ưu thế lai chuẩn là chỉ số được quan tâm hơn cả trong công tác tạo giống lai

Các nghiên cứu về ưu thế lai cho thấy hiện tượng ưu thế lai tăng khi cách biệt di truyền giữa bố và mẹ lớn Sự khác biệt càng lớn thì tính dị hợp tử càng cao,

do đó ở những tổ hợp lai này ưu thế lai càng cao Ngô là loại cây giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng các cá thể dị hợp tử về kiểu gen Tomov (1990) cho rằng,

sự khác biệt về di truyền của bố mẹ có ảnh hưởng mạnh mẽ tới ưu thế lai trong tổ hợp lai đơn (Ngô Thị Minh Tâm, 2004)

Trong những năm gần đây, phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các dòng thuần dựa vào chỉ thị phân tử để phân nhóm cách biệt di truyền đã giảm bớt được khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng, rút ngắn thời gian đánh giá Phương pháp này không bị phụ thuộc vào môi trường và mùa vụ, do đó tiết kiệm được rất nhiều thời gian, công sức cho các nhà tạo giống

2.4 Phân tích đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai trong chọn tạo giống ngô

Trong công tác chọn tạo giống cây trồng, ý tưởng sử dụng đa dạng di truyền

để đạt ưu thế lai cao được các nhà chọn tạo giống công nhận và áp dụng rộng rãi Khai thác những thông tin về đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các nguồn vật liệu có ý nghĩa to lớn, là sức mạnh của công tác cải tạo giống cây trồng (Hallauer A

R et al., 1988) Vì thế, việc xác định đa dạng di truyền, khai thác những khác biệt di truyền có lợi của nguồn gen hiện có là một trong những mục tiêu của nhà chọn giống Cây ngô là loài giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng và phong phú về kiểu gen, những thông tin về đa dạng di truyền của các nguồn gen là rất cần thiết và vô cùng hữu ích trong công tác đánh giá dòng, phân nhóm ưu thế lai, dự đoán các tổ hợp lai ưu

tú có khả năng cho năng suất cao (Ngô Thị Minh Tâm, 2004)

Đa dạng di truyền có tầm quan trọng rất lớn đối với chương trình chọn tạo giống ngô lai Việc đánh giá đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ giữa các nguồn vật liệu, tìm ra sự khác biệt di truyền của các vật liệu nghiên cứu đòi hỏi cả công sức, thời gian và chi phí tốn kém Người ta không chỉ dựa vào chỉ thị hình thái

để nhận biết riêng rẽ mà còn cần phải phân tích dựa trên các tính trạng số lượng, các chỉ tiêu sinh hóa hay phân tích bằng chỉ thị phân tử

Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được tiến hành dựa trên các chỉ thị di truyền, mỗi loại chỉ thị cung cấp cho người sử dụng các thông tin khác nhau Có hai phương pháp được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền là nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền thông qua các tính trạng hình thái (chỉ thị hình thái - kiểu hình) và thông qua chỉ thị phân tử (kiểu gen)

2.4.1 Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm chính về hình thái (hình dạng, màu sắc, kích thước của thân cây, lá, hạt,…) và dựa trên các tính trạng cơ bản đó để nhận biết và phân biệt giữa các giống với nhau

Chỉ thị hình thái rất dễ nhận biết và được sử dụng như một chỉ thị di truyền Tuy nhiên, số lượng các chỉ thị hình thái lại tương đối ít và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể do đó việc sử dụng các chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: (1)

số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn; (2) chúng bị ảnh hưởng bởi sự tương tác gen

và sự tác động của các nhân tố môi trường; (3) các chỉ tiêu hình thái thể hiện những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể Có thể nói, cùng với sự ra đời và phát triển mạnh mẽ của các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử, thì chỉ thị hình

thái vẫn được cho là không thể thay thế trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại thực vật (Kipling W W and Daniel R., 2004)

Sự đa dạng di truyền ở mức hình thái của cây ngô được thể hiện qua các tính trạng số lượng như: thời gian sinh trưởng, số lá, kích thước lá, chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, số hàng hạt và các tính trạng chất lượng (màu sắc thân cây, màu của bao phấn, màu hạt,…) Dựa vào các tính trạng hình thái để các nhà nghiên cứu phân biệt các giống ngô khác nhau phục vụ công tác phân loại, chọn lọc, lưu giữ và bảo tồn sự đa dạng của các nguồn gen ngô Sự đa dạng về các đặc điểm hình thái còn giúp các nhà chọn tạo giống nghiên cứu về khả năng kết hợp, dự đoán ưu thế lai và xác định cặp lai trong quá trình chọn tạo giống ngô lai

2.4.2 Chỉ thị sinh hoá

Chỉ thị sinh hóa (chỉ thị isozyme) là loại chỉ thị có bản chất đa hình protein Isozyme là những dạng enzyme có hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau Có thể chia làm hai dạng là isozyme đơn gen (các isozyme chịu sự kiểm soát của một gen) và isozyme đa gen (các isozyme chịu sự kiểm soát của nhiều gen hay nói cách khác là được mã hóa bởi

đa gen) (Bùi Mạnh Cường, 2007)

Chỉ thị isozyme thuộc loại đồng trội, có độ tin cậy cao và có thể phân biệt cá thể đồng hợp tử hay dị hợp tử Sự đa hình của isozyme là một công cụ để xác định

đa dạng di truyền giữa các dạng bố mẹ Tuy nhiên, do số lượng không nhiều, khả năng phát hiện nhiều bản sao enzyme ở cùng một locus thấp và sự biểu hiện của chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cá thể nên các chỉ thị isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế trong đánh giá đa dạng di truyền, phân nhóm ưu thế lai

2.4.3 Chỉ thị phân tử

Nguyên tắc cơ bản trong công tác chọn tạo giống cây trồng là việc xác định và khai thác các kiểu ưu thế lai giữa các nguồn vật liệu nghiên cứu (Hallauer A R and Miranda J B., 1988) Đối với cây ngô, thông tin về đa dạng

di truyền giữa các dòng giúp các nhà chọn tạo giống quyết định được kế hoạch lai tạo, cải tạo dòng và phân nhóm ưu thế lai Chính vì thế, các nhà chọn tạo

giống mong muốn mô tả được sự đa dạng di truyền của các nguồn vật liệu và mối quan hệ di truyền giữa chúng (Messmer M M et al., 1992)

Chỉ thị phân tử ADN khác với hai loại chỉ thị hình thái và chỉ thị sinh isozyme bởi sự đa dạng và phong phú của phân tử ADN Chỉ thị ADN có tính ổn định cao, có sự liên kết với các tính trạng trội và siêu trội, không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường cũng như các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của thực vật (Bùi Mạnh Cường, 2007) Sự đa hình dựa trên cơ sở sự biến đổi ở mức độ phân tử là công cụ mạnh để đánh giá đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu cho lai tạo

Các chỉ thị phân tử ADN có thể chia theo 2 nhóm chính: (1) nhóm chỉ thị

phân tử dựa trên cơ sở lai phân tử ADN: Chỉ thị RFLP dựa vào các băng ADN

trên gen điện di có thể phát hiện các thể đồng hợp tử hoặc dị hợp tử; (2) nhóm chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở khuyếch đại gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR là: Chỉ thị RAPD, chỉ thị AFLP, chỉ thị SSR,… Trong những năm gần đây, nhiều chỉ thị thuộc nhóm này đã thành công trong đánh dấu hệ gen thực vật và trong nghiên cứu

đa dạng di truyền

Chỉ thị RFLP ((Restriction Fragment Lengh Polymorphism)

Chỉ thị RFLP (đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn) được phát triển và

sử dụng đầu tiên trong nghiên cứu lập bản đồ hệ gen người (Botstein D et al., 1980) Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (một trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng để xác định mức độ sai khác giữa của các trình tự nucleotide: do mỗi cá thể sinh vật có một bộ ADN genome đặc trưng về trình tự nucleotide trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzyme giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò đã được đánh dấu (bằn phóng xạ hoặc bằng phương pháp hóa học)

Theo lý thuyết, sự đa hình trong phân tích RFLP có thể được ghi nhận như

sự có mặt hay vắng mặt của một băng riêng biệt trên gel Đó chính là những biến

đổi về cặp bazơ nitơ có thể xuất hiện hoặc do biến đổi chuỗi ADN trên phạm vi rộng lớn như là kết quả của sự đảo đoạn, chuyển đoạn, khuyết đoạn

Chỉ thị RFLP được ứng dụng khá phổ biến để lập bản đồ di truyền, phân tích các locus tính trạng số lượng, đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu quá trình tiến hóa và phân loại dưới loài đối với nhiều loại cây trồng Chỉ thị RFLP cũng được sử dụng để xây dựng các bản đồ di truyền ở ngô (Gardiner J M et al., 1993); xác định mối quan hệ di truyền giữa các dòng ngô nội phối và phân chúng thành các nhóm khác nhau (Melchinger A E., 1993); đánh giá đa dạng di truyền và nghiên cứu mối quan hệ di truyền của chúng (Pejic I et al., 1998)

Chỉ thị RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và cá thể dị hợp tử (Aa) Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là quy trình thực hiện phức tạp, tốn kém, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm, cần một lượng lớn ADN có chất lượng cao và sử dụng chất đồng

vị phóng xạ gây nguy hiểm cho con người Do đó, hiện nay có xu hướng sử dụng các chỉ thị phân tử đơn giản hơn trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR

Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR mở ra một hướng mới có thể giảm thời gian, công sức và chi phí trong lập bản đồ di truyền Kỹ thuật RAPD cho phép

phát hiện đa hình các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên, được phát triển bởi

William, Welh và Mc Clellan (1990) đã trợ giúp đắc lực cho các phương pháp đánh giá ưu thế lai truyền thống (Bùi Mạnh Cường, 2007)

Nguyên lý của phương pháp RAPD là sử dụng một đoạn oligonucleotide có chiều dài từ 9 - 12 nucleotide sắp xếp theo trình tự ngẫu nhiên làm mồi cho phản ứng PCR (Bùi Mạnh Cường, 2007) Đoạn mồi có thể bám vào bất kỳ vị trí bổ sung nào trên mạch DNA khuôn, có thể ở nhiều locus khác nhau Sau khi điện di và quan sát sản phẩm PCR trên bản gel agarose nhuộm với EtBr (ethidium bromide) dưới đèn tử ngoại, người ta đã phát hiện thấy sự khác nhau trong phổ giữa các phân đoạn DNA được khuyếch đại Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như lập bản đồ di truyền liên kết, đánh dấu gen, xác định giống cây trồng, đánh giá sự biến dị di truyền trong quần thể và loài…

Trên đối tượng cây ngô, Lanza và cs (1997) đã sử dụng chỉ thị RAPD với 32 mồi để đánh giá khoảng cách di truyền của 18 dòng ngô thuần và xác định mối tương quan giữa khoảng cách di truyền với sự biểu hiện của các tổ hợp lai giữa chúng (Lanza L L B et al., 1997) Moeller và Schaal (1999) cũng sử dụng 11 mồi RAPD

để nghiên cứu sự sai khác di truyền của 15 giống ngô bản địa của Mỹ Kết quả tỷ lệ

đa hình của các mồi RAPD trung bình là 70,7% (Khuất Hữu Trung, 2009)

Ở Việt Nam chỉ thị RAPD cũng được Bùi Mạnh Cường và cs nghiên cứu và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống ngô lai (Bùi Mạnh Cường và cs, 2000; Bùi Mạnh Cường và cs, 2003)

Kỹ thuật RAPD có quy trình phân tích đơn giản, dễ làm, rẻ, nhanh chóng, cho phép tiến hành với số lượng mẫu lớn, không sử dụng chất phóng xạ và không cần biết thông tin về trình tự Mặc dù vậy, chỉ thị RAPD lại khá nhạy cảm với các điều kiện phản ứng (nồng độ muối, tỷ lệ giữa kích thước mồi và đoạn mẫu); RAPD

là chỉ thị trội dựa vào sự xuất hiện hay vắng mặt những băng ADN đặc trưng nên không phân biệt được thể dị hợp Chính vì mức độ phát hiện sự đa hình thấp và không ổn định nên phương pháp này còn có nhiều hạn chế

Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Lengh Polymorphism)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình chiều dài các đoạn cắt khuếch đại, là

kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR Kỹ thuật AFLP được phát triển bởi Vos và cs (1995) (Vos P et al., 1995) Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt DNA bộ gen bằng enzym giới hạn tạo đầu so le và gắn các đoạn oligonucleotit tiếp hợp (adapter), cặp mồi được thiết kế bổ sung với trình tự adapter gắn vào sẽ được sử dụng để nhân đoạn ADN giữa hai vị trí nhận biết giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA được nhân lên AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, thêm hoặc mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt

Các mồi sử dụng trong kỹ thuật AFLP cũng tương tự như RAPD nhưng kích thước mồi dài hơn bao gồm một đoạn ADN cố định có kích thước 15bp và một đoạn ADN ngắn ngẫu nhiên có kích thước từ 2 - 4bp Đoạn cố định tạo nên sự ổn

định cho cặp mồi (vì vậy tăng khả năng bắt cặp) và cho phép chúng phát hiện từng locus đặc trưng Ngoài ra, AFLP có một số thuận lợi khác như: (1) không cần biết trình tự của đoạn gen; (2) dựa trên kỹ thuật PCR nên thời gian thí nghiệm nhanh; (3) tỷ lệ đa hình cao (có thể đến 100 locus được thống kê trên mỗi thí nghiệm) Kỹ thuật này rất phù hợp khi nghiên cứu đa dạng di truyền các tập đoàn cây trồng với

số lượng lớn cá thể

Kỹ thuật AFLP nhanh, đơn giản (không phức tạp như RFLP), khảo sát được toàn bộ gen, đòi hỏi ít lượng ADN ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương mại

có thể dùng cho hầu hết các loài) Đây là một phương pháp có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen Tuy nhiên, AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế khả năng phân biệt cá thể đồng hợp

tử và dị hợp tử, giá thành cho nghiên cứu tương đối cao

Ở ngô, chỉ thị AFLP cũng đã được các nhà nghiên cứu ứng dụng để: (1) phân nhóm ưu thế lai, xác định phả hệ và chuẩn đoán các cặp lai ưu tú (Bùi Mạnh Cường, 2007); xác định mối quan hệ giữa khoảng cách di truyền và khả năng kết hợp về năng suất (Ajmone - Marsan P et al., 1998); (2) nghiên cứu sự tương đồng di truyền của các dòng ngô nội phối (Pejic I et al., 1998)

Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat hay Microsatellite)

Chỉ thị SSR (hay còn gọi là vi vệ tinh) là sự lặp lại trình tự đoạn nucleotide

đơn giản cực ngắn (chỉ từ 1 - 6 cặp base) Các SSR xuất hiện khá phổ biến trong bộ

gen của sinh vật nhân thực (eukaryote) Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại thay đổi khác nhau và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn Các đoạn lặp lại di, tri

và tetranucleotit như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật Phương thức lặp lại cũng rất đa dạng, nhưng chỉ yếu có

ba kiểu sau: (1) lặp hoàn toàn (các đơn vị sắp xếp nối tiếp nhau); (2) lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác); (3) lặp lại phức tạp (sự xen kẽ những đơn vị lặp lại khác nhau) (Bùi Mạnh Cường, 2007) Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng

số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR

Nghiên cứu về SSR và ứng dụng kỹ thuật PCR cho thấy các locus SSR là những chỉ thị có ưu thế về cung cấp thông tin đáng tin cậy hơn RAPD và RFLP vì: khả năng lặp lại chuẩn xác do đó có hiệu quả cao trong việc phân tích đa dạng di truyền; chỉ thị SSR có tính đa hình cao, là marker đồng trội rất hữu hiệu trong nghiên cứu di truyền ở mức độ quần thể, có thể phát hiện các alen khác nhau trong một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử ở locus đó; chỉ thị SSR dựa vào kỹ thuật PCR nên có khả năng tự động hóa cao, kết quả dự đoán nhanh, thời gian thí nghiệm ngắn và có chi phi khá thấp (Khuất Hữu Trung, 2009)

Trên đối tượng cây ngô, do sự biến đổi lớn trong số đơn vị lặp lại nên kết quả phân tích bằng chỉ thị SSR có độ đa dạng cao và hiệu quả hơn khi so sánh với một

số chỉ thị khác Chỉ thị SSR rất hữu ích và được sử dụng khá rộng rãi trong đánh giá

đa dạng di truyền của các dòng ngô thuần: Senior và cs (1998) đã sử dụng 70 mồi SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 94 dòng ngô thuần ưu tú của Mỹ Tác giả đã chỉ ra được mối quan hệ di truyền giữa các dòng ngô nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu phân loại trước đó trên phả hệ của các nguồn gen ngô ở Bắc Mỹ (Senior

M L et al., 1998) Pejic và cs (1998) đã phân tích sự tương đồng di truyền giữa 33 dòng ngô thuần bằng 4 loại chỉ thị (RFLP, RAPD, AFLP, SSR) Từ kết quả thu được, tác giả chỉ ra rằng chỉ thị SSR có mức độ đa hình cao hơn, số alen thể hiện nhiều hơn so với các chỉ thị khác (Pejic I et al., 1998)

Sử dụng kỹ thuật SSR cho phép xác định mức đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể, hiệu quả để đánh giá đa dạng di truyền và ưu thế lai sớm ở ngô, phân nhóm ưu thế lai trợ giúp cho công tác chọn tạo giống Tuy nhiên, phương pháp này

có nhược điểm là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một locus đa hình (đặc trưng cho một loài)

Hiện nay, chỉ thị phân tử được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trên các đối tượng cây trồng khác nhau với sự đa dạng về chủng loại Sự lựa chọn chỉ thị phân tử nào là phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu (phục vụ cho lai tạo, đánh dấu phân tử,

phân tích khoảng cách di truyền, lập bản đồ so sánh…) và phụ thuộc vào các điều kiện khác như khả năng thao tác kỹ thuật và mức độ của từng phòng thí nghiệm

2.5 Dòng thuần và tạo dòng ngô thuần bằng phương pháp đơn bội

2.5.1 Khái niệm dòng thuần

Dòng thuần là khái niệm để chỉ các dòng tự phối đã đạt tới độ đồng đều và

ổn định cao ở nhiều tính trạng như chiều cao cây, chiều cao đóng bắp, năng suất, màu và dạng hạt…Dòng thuần thường đạt được sau 6 – 8 đời tự phối Như vậy, dòng thuần là dòng có kiểu gen đồng hợp tử với tỷ lệ cao ở nhiều tính trạng (Brown B., 1953)

Việc xác định dòng thuần làm bố, mẹ trong cặp lai phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm hình thái, sinh lý và năng suất của các dòng đó (Ngô Hữu Tình và Nguyễn Đình Hiền, 1996)

2.5.2 Tạo dòng ngô thuần bằng phương pháp đơn bội kép

Kỹ thuật đơn bội kép được đề xuất, nghiên cứu ứng dụng nhằm nhanh chóng tạo được các dòng ngô đồng hợp tử hoàn toàn, rút ngắn thời gian tạo giống, tăng hiệu quả chọn lọc trong chọn tạo giống lai Phương pháp này rất hữu ích cho quá trình xác lập mối quan hệ giữa các vật liệu mà đôi khi còn gặp khó khăn đối cới các nguồn vật liệu mới chưa rõ nguồn gốc

2.5.2.1 Phương pháp tạo dòng đơn bội kép bằng phương pháp sử dụng dòng kích tạo đơn bội

Dòng kích tạo đơn bội (haploid inducer) là những dòng có khả năng tham gia vào quá trình thụ phấn nhưng không đóng góp bộ nhiễm sắc thể vào việc hình thành hạt, do đó đã tạo thành các hạt đơn bội một cách tự nhiên

Cây ngô đơn bội đầu tiên đã được Randolph mô tả vào năm 1932 (Randolph

L F., 1932), sau đó nghiên cứu của Chase cho thấy: tần số gây tạo đơn bội tự nhiên

ở ngô thấp (khoảng 0,1%) và ông đã dự đoán rằng các dòng đơn bội có thể sử dụng trong nghiên cứu di truyền và tạo giống ngô lai Tuy nhiên, do tần số tạo hạt đơn bội

tự nhiên quá thấp nên không đáp ứng được nhu cầu của các nhà tạo giống Do đó, rất nhiều tác giả đã nghiên cứu nhằm tìm ra các dòng ngô có tần số tạo cây đơn bội

cao, Rober và cs đã thu được tỷ lệ tạo đơn bội đạt 8,1%, cao nhất so với các dòng trước đó (Rober F K et al., 2005)

Cho đến nay những cơ chế dẫn đến việc kích tạo đơn bội vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ Những nghiên cứu phân tích locus tính trạng số lượng (QTLs)

của Rober và cs đã chỉ ra rằng: quá trình kích tạo đơn bội in vivo ở ngô được kiểm

soát bởi nhiều gen nằm trên các locus khác nhau (Rober F K et al., 2005)

Ưu thế của phương pháp sử dụng dòng mang gen kích tạo đơn bội là rút ngắn thời gian tạo dòng, thu được dòng thuần sau hai thế hệ, ít bị phụ thuộc vào kiểu gen

và có thể áp dụng trong điều kiện không có phòng thí nghiệm Song, việc ứng dụng phương pháp này còn hạn chế do tần suất tự lưỡng bội rất thấp từ 0 – 10%, hơn nữa việc tách hạt đơn bội và hạt lưỡng bội cũng rất khó khăn (Beckert M., 1994)

Ở Việt Nam, trước đây phương pháp sử dụng dòng kích tạo đơn bội trong chọn tạo giống ngô còn hạn chế do các dòng có khả năng tạo hạt đơn bội chủ yếu có nguồn gốc ôn đới Hiện nay, sau khi các dòng kích tạo đơn bội được nhiệt đới hóa thì phương pháp này cũng được các nhà chọn tạo giống Việt Nam quan tâm ứng dụng

2.5.2.2 Phương pháp tạo dòng đơn bội kép bằng phương pháp nuôi cấy noãn ngô

Phương pháp tạo dòng ngô đơn bội kép bằng nuôi cấy noãn ngô in vitro đã được nghiên cứu từ đầu những năm 1980 [Andre I., 1981; Ao G M et al., 1982) Các tác giả đã nghiên cứu tạo mô sẹo (callus) từ noãn ngô chưa thụ tinh, sau đó tái sinh cây từ callus thu được Nghiên cứu tạo dòng thuần được tạo ra bằng phương pháp này ở mức phân tử cho thấy cây ngô được tái sinh là do tế bào trứng chưa thu tinh tự lưỡng bội hóa tạo thành Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh phụ thuộc rất lớn vào khả năng sinh sản đơn tính cái đại bào tử (megaspore – gynogenesis) của các nguồn vật liệu nuôi cấy Tỷ lệ phản ứng tạo callus và khả năng tái sinh cây không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen (genotypes) mà còn phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng, chất lượng của vật liệu cho noãn và kỹ thuật nuôi cấy nên hiệu quả của quá trình nuôi cấy còn thấp Vì vậy, phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi

Ở nước ta, nghiên cứu về nuôi cấy noãn ngô cũng đã được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ngô và Viện Di truyền Nông nghiệp Các nghiên cứu tập trung chủ yếu

vào việc xác định công thức môi trường và nguồn vật liệu cho phản ứng tạo callus

và tái sinh cây cao [Bùi Mạnh Cường, 2007; Nguyễn Hữu Đống và cs, 1995; Nguyễn Hữu Đống và cs, 1997)

2.5.2.3 Phương pháp tạo dòng đơn bội kép bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời

Trong nuôi cấy bao phấn, khả năng sinh sản của các thể đơn bội trước hết phụ thuộc vào các phương thức hình thành thể đơn bội và số lượng thể đơn bội Thông qua kỹ thuật này cho phép tạo ra hàng loạt các cá thể đơn bội kép

Phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô được Anonymous nghiên cứu từ năm

1975, sau đó được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và hoàn thiện quy trình Cấu trúc dạng phôi hình thành từ nuôi cấy hạt phấn tách rời cũng đã được nghiên cứu từ cuối những năm 1980 (Pescitelli S M et al., 1989) Sự tái sinh thành công cây ngô đơn bội từ tiểu bào tử cũng đã được báo cáo Những nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời ở ngô có tầm quan trọng rất lớn trong việc tạo ra các dòng thuần (dòng đơn bội kép – double haploid lines) phục vụ công tác tạo giống ngô lai [Buter B et al., 1994; Goralski G., 2002)

Sự thành công của kỹ thuật nuôi cây bao phấn và hạt phấn tách rời phụ thuộc rất lớn vào khả năng sinh sản đơn tính đực (Androgenesis) của các nguồn vật liệu nuôi cấy Trong tự nhiên, tần suất sinh sản đơn tính ở ngô khoảng 1/1.0000.000, trong đó sự sinh sản đơn tính đực khoảng 1/80.000 (Chase S S., 1951) Trong điều

kiện in vitro, sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy bao phấn phụ thuộc trước tiên vào

sự chọn lọc các kiểu gen, môi trường nuôi cấy, điều kiện sinh trưởng của cây và các biện pháp kỹ thuật tác động Kết quả nghiên cứu của các tác giả cho thấy: khi bào tử phát triển ở một nhân muộn và hai nhân sớm là giai đoạn thích hợp nhất đối với quá

trình sinh sản đơn tính in vitro Ở môi trường cảm ứng, các tiểu bào tử có thể tạo

thành callus hoặc tái sinh cây trực tiếp Tùy vào mục đích và điều kiện thí nghiệm

mà sử dụng các phương pháp khác nhau để nâng cao tỷ lệ tái sinh cây

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới

tỷ lệ tái sinh cây Chu và cs đã sử dụng môi trường N6 để thay cho môi trường khoáng MS và thu được tỷ lệ phản ứng là 1% nhưng không tái sinh được cây (Chu

C C et al., 1975) Sau đó, nhiều môi trường có thành phần khác nhau đã được các tác giả nghiên cứu và sử dụng như môi trường YP, Zhen 14, 6M, 6N1 (Nitsch C et al., 1982)

Những nghiên cứu bổ sung nguồn hydratcacbon (đường) vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau cũng nâng cao tỷ lệ tái sinh cây Kết quả nghiên cứu của Buter, Obert và cs chỉ ra rằng hiệu quả của phản ứng tạo phôi và tái sinh cây cao nhất ở nồng độ đường là 9% Xử lý nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của các bao phấn nuôi cấy: xử lý lạnh bao phấn trước khi nuôi cấy đã kích thích các tiểu bào tử phát triển tạo phôi; nhiệt độ và thời gian xử lý khác nhau thì hiệu quả thu được cũng khác nhau Điều kiện sinh trưởng của cây cho bao phấn và mùa vụ cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ phản ứng (Dieu P and Beckert M., 1986) Ngoài

ra, các yếu tố kỹ thuật như pH môi trường, thời gian chiếu sang, kỹ thuật chọn mẫu, phương pháp khử trùng, kỹ thuật và thời gian cấy chuyển… cũng đều ảnh hưởng tới

sự phát triển của tiểu bào tử để tạo phôi và tái sinh cây

Ở Việt Nam, phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô bắt đầu được nghiên cứu

và ứng dụng trong khoảng 15 năm trở lại đây và đã thu được một số kết quả nhất định [Bùi Mạnh Cường và cs, 1998; Lê Huy Hàm và cs, 1998; Lê Huy Hàm và cs, 1999) Những nghiên cứu cải tiến qui trình nuôi cấy nhằm nâng cao tỉ lệ tạo phôi và tái sinh cây cũng đã được đề cập như: xử lý lạnh bao phấn trước và sau khi cấy, cải tiến thành phần muối khoáng trong môi trường nuôi cấy, bổ sung các chất hữu cơ… (Lê Huy Hàm và cs, 1998; Lê Huy Hàm và cs, 1999) Phương pháp truyền tính cảm ứng thông qua lai nguồn có phản ứng cao với vật liệu của Việt Nam đã nâng cao tỷ

lệ tái sinh cây lên hàng chục lần Kết quả nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Ngô giai đoạn 1996 – 1998 cho thấy tỷ lệ phản ứng tạo cấu trúc phôi trung bình chỉ đạt 4%,

tỷ lệ tái sinh cây khoảng 2,1%, bằng việc cải tiến các nguồn vật liệu đã nâng tỷ lệ này lên tương ứng là 10% và 11% Đặc biệt đã xác định được một số nguồn vật liệu

có tỷ lệ tạo phôi trên 30% và tái sinh cây trên 14% Hiện nay, hướng nghiên cứu này vẫn được triển khai để tạo dòng có giá trị thương mại (Bùi Mạnh Cường, 2007) Triển vọng và tiềm năng của phương pháp tạo dòng đơn bội kép có tầm quan trọng rất lớn trong công tác chọn tạo giống ngô Bằng phương pháp này không chỉ

rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần mà các dòng đơn bội kép tạo ra có thể mang các đặc điểm ưu việt của nguồn vật liệu cho bao phấn nuôi cấy hơn phương pháp tự phối Các dòng đơn bội kép có thể sử dụng ngay để chọn lọc và đánh giá khả năng kết hợp do có mức độ ổn định di truyền rất cao nên có thể cố định ưu thế lai ở ngay thế hệ S1 Trong khi các dòng tạo ra bằng phương pháp tự phối cần đạt đến sự ổn định cần thiết mới có thể khai thác và sử dụng (Smith J S C et al., 2008) Ngoài

ra, dòng đơn bội kép còn được sử dụng trong phân tích di truyền và xác định các chức năng của gen lặn, cũng như tạo ra các nguồn tế bào mô sẹo đơn bội và nhị bội kép dùng trong các nghiên cứu chuyển gen (Khush G S and Virlnani S S., 1996)

Năm 2007, Pedro và cs đã khẳng định tầm quan trọng của việc tạo dòng đơn bội kép trong các chương trình phát triển ngô lai ở vùng nhiệt đới (Pedro R B et al., 2007) Hiện nay, hầu hết các công ty giống đều có chương trình nghiên cứu, sản xuất các dòng đơn bội kép để tạo giống ngô lai thương mại

Phương pháp tạo dòng đơn bội kép từ nuôi cấy bao phấn cũng được khẳng định là một trong những hướng nghiên cứu hiệu quả ở Việt Nam (Bùi Mạnh Cường, 2007) Kết quả của các nghiên cứu cho thấy: các dòng đơn bội kép tạo ra đáp ứng được tiêu chuẩn của dòng có thể tham gia vào chương trình chọn tạo giống ngô lai (Bùi Mạnh Cường và cs, 2002); Tỷ lệ các dòng đơn bội kép hữu dục trên đồng ruộng đạt 10 - 12% và có thể tham gia vào các tổ hợp lai triển vọng

2.6 Khả năng kết hợp và phương pháp đánh giá khả năng kết hợp

Đánh giá khả năng kết hợp được áp dụng rộng rãi trong công tác đánh giá dòng, thông qua khả năng kết hợp của các dòng bố mẹ có thể dự đoán được mức độ

ưu thế lai của con lai Thông thường, những bố mẹ có khả năng kết hợp tốt cho tần suất những tổ hợp lai có ưu thế lai cao hơn những bố mẹ có khả năng kết hợp kém

Vì thế, mục tiêu của các nhà tạo giống ngô lai là chọn được những dòng bố mẹ có khả năng kết hợp cao Tùy từng nghiên cứu cụ thể mà tập trung đánh giá khả năng kết hợp của dòng về thời gian sinh trưởng, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, song yếu tố năng suất luôn được các nghiên cứu hướng tới

2.6.1 Khả năng kết hợp

Khả năng kết hợp là một thuộc tính được chế định di truyền, truyền lại thế hệ sau qua tự phối và qua lại (Darrah L L and Hallauer A R., 1972) Khả năng kết hợp là thuật ngữ chung để chỉ khả năng của một dòng hay một kiểu gen có thể tạo

ra thế hệ tốt nhờ vào việc lai tạo với các dòng giống khác Khả năng kết hợp phụ thuộc vào kiểu gen và sự tương tác giữa chúng (Griffing B., 1956) Khả năng kết hợp được xác định thông qua đánh giá khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp riêng (Zhao Y et al., 2008)

Khả năng kết hợp chung (GCA) được biểu thị bằng giá trị ưu thế lai trung bình của bố mẹ ở tất cả các tổ hợp lai

Khả năng kết hợp riêng (SCA) được biểu thị bằng độ lệch của một cặp lai cụ thể nào đó so với giá trị ưu thế lai trung bình của nó

Khả năng kết hợp là một phức hợp tính trạng do nhiều gen kiểm soát do vậy đánh giá khả năng kết hợp thực chất là xác định tác động gen Khả năng kết hơp chung được kiểm soát bởi kiểu di truyền cộng tính của gen trội nên khá ổn định dưới tác động của các yếu tố môi trường còn khả năng kết hợp riêng được xác định bởi các yếu tố trội, siêu trội, yếu tố ức chế của các gen và chịu tác động rõ rệt của điều kiện môi trường (Sprague G F and Tatum L A., 1942)

2.6.2 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp

Đánh giá khả năng kết hợp thực chất là xác định tác động gen Việc giữ lại hay loại bỏ dòng thuần dựa trên các kết quả đánh giá khả năng kết hợp (Hallauer A

R and Miranda J B., 1988) Khó khăn nhất trong việc đánh giá khả năng kết hợp của một dòng là tính không đo đếm được của nó Ngoài ra, giữa các tính trạng đo đếm được của dòng không có sự tương quan hoặc tương quan rất thấp với khả năng kết hợp

Cho đến nay, phương pháp chắc chắn nhất để đánh giá khả năng kết hợp của các dòng thuần là lai thử và thử nghiệm các tổ hợp lai (Ngô Hữu Tình, 2009)

Sprague và Tatum (1942) đã chứng minh rằng, ảnh hưởng của khả năng kết hợp chung lớn hơn và quan trọng đối với nhưng dòng không được chọn lọc, ảnh hưởng của khả năng kết hợp riêng quan trọng hơn ở tổ hợp lai giữa các dòng mà đã

được thử trước Những dòng không được thử trước, sự khác nhau về khả năng kết hợp chung lớn hơn sự khác nhau về khả năng kết hợp riêng (Sprague G F and Tatum L A., 1942)

Quan hệ giữa khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp riêng thông qua tác động trội và ức chế được xác định bằng việc tính toán các phương sai di truyền cộng, di truyền trội và ức chế trội (Darrah L L and Hallauer A R., 1972)

Từ kết quả đánh giá khả năng kết hợp của các dòng tự phối, thông qua các tính trạng ở tổ hợp lai của chúng, từ đó có quyết định về việc giữ lại những dòng có khả năng kết hợp cao, loại bỏ những dòng có khả năng kết hợp thấp không có tác dụng khi lai, cũng như sử dụng các dòng có khả năng kết hợp chung và riêng cao vào các mục đích tạo giống khác (Mai Xuân Triệu, 1998)

Phương pháp lai thử để đánh giá khả năng kết hợp của dòng thuần được nhiều nhà chọn tạo giống ngô áp dụng, trong nghiên cứu thường sử dụng hai hệ thống lai thử là lai đỉnh và lai luân giao

* Giai đoạn thử và chọn cây thử

Giai đoạn lai thử phụ thuộc nhiều vào các nhà chọn giống: Lai thử muộn nếu nhà chọn giống cho rằng chọn lọc là hiệu quả đối với đặc tính mong muốn, lai thử sớm nếu muốn loại bỏ các dòng có khả năng kết hợp kém để tập trung chọn lọc ở các thế hệ sau đối với các dòng có khả năng kết hợp tốt hơn Theo Bauman thì khoảng 60% các nhà chọn giống đánh giá dòng bằng phương pháp lai thử sớm ở thế

hệ S3, S4, khoảng 22% lai thử ở thế hệ tự phối S5 hoặc muộn hơn (Bauman L F., 1981) Đối với dòng đơn bội kép có thể lai thử ở thế hệ đầu tiên

Cây thử (tester) – theo như các nhà khoa học CIMMYT định nghĩa là một kiểu gen (giống thụ phấn tự do, giống tổng hợp, dòng thuần hay giống lai) giúp: dễ dàng phân biệt các dòng về giá trị di truyền và khả năng kết hợp, giảm được các giai đoạn thử trong quá trình chọn tạo giống lai và nhận biết các tổ hợp lai triển vọng (Vasal S K et al., 1995)

Chỉ tiêu chung được các nhà tạo giống chấp nhận đó là chọn cây thử không

có quan hệ họ hàng với các vật liệu đem thử và tốt nhất là thuộc nhóm thế hệ lai đối

ứng Để tăng mức độ tin cậy thường sử dụng hai hoặc nhiều cây thử có nền di truyền khác nhau (Ngô Hữu Tình và Nguyễn Đình Hiền, 1996)

Xuất phát từ thực tế, các nhà chọn tạo giống thương mại ưu tiên sử dụng dòng thuần ưu tú làm cây thử với mong muốn phát hiện nhanh một tổ hợp lai đỉnh

sẽ là một giống lai đơn triển vọng

* Đánh giá khả năng kết hợp bằng phương pháp lai đỉnh

Lai đỉnh (topcross) là phương pháp lai thử để xác định khả năng kết hợp chung do Davis đề xuất năm 1927, Jenkins và Bruce phát triển năm 1932 (Hallauer

A R and Miranda J B., 1988) Phương pháp lai đỉnh rất có ý nghĩa trong giai đoạn đầu của quá trình chọn lọc khi khối lượng vật liệu trong thí nghiệm còn quá lớn Trong lai đỉnh tất cả các vật liệu cần xác định khả năng kết hợp được lai với một dạng chung gọi là cây thử (tester), quyết định sự thành công của lai đỉnh là chọn đúng cây thử

* Lai đỉnh toàn phần

Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi dạng mẹ được lai với tất cả các cây thử Phân tích thống kê khả năng kết hợp của lai đỉnh toàn phần tiến hành theo các bước: Xác định tác động của khả năng kết hợp chung của dòng, của cây thử; Tác động tương tác dòng x cây thử (tác động của khả năng kết hợp riêng) và xác định độ tin cậy qua sai số và LSD

Trong các chương trình tạo giống, để chọn lọc các dòng ưu tú có khả năng tham gia vào tổ hợp lai cho ưu thế lai cao phục vụ sản xuất, các nhà chọn tạo giống ngô Việt Nam đã áp dụng phương pháp lai đỉnh trong nghiên cứu: Bùi Mạnh Cường chọn 2 cây thử LDB3, TSB1 cho nhóm chín muộn và 2 cây thử LDSB2, TSB2 cho nhóm chín sớm để đánh giá khả năng kết hợp của 50 dòng ngô (Bùi Mạnh Cường, 1994); Mai Xuân Triệu sử dụng các cây thử khác nhau để đánh giá khả năng kết hợp của 12 dòng dài ngày, 10 dòng trung ngày và 11 dòng ngắn ngày với các cặp cây thử tương ứng là IL25 và TSB1, P11 và Bighei, TSB2 và IL246 (Mai Xuân Triệu, 1998)

* Đánh giá khả năng kết hợp bằng phương pháp lai luân giao

Luân giao là phương pháp đánh giá khả năng kết hợp do Sprague và Tatum

đề xuất, được phát triển bởi nhiều nhà khoa học mà đặc biệt là Griffing (Griffing B., 1956) Qua phân tích luân giao sẽ thu được các thông tin về: bản chất và ước lượng các chỉ số di truyền; khả năng kết hợp chung và riêng của bố mẹ và các tổ hợp lai của chúng

* Luân giao toàn phần

Là hệ thống lai thử trong đó các vật liệu được lai theo tất cả các tổ hợp có thể Các dòng này vừa là cây thử của các dòng khác, vừa là cây thử của chính mình Phân tích lai luân giao cho thông tin về: bản chất và giá trị thực của tham số di truyền, khả năng kết hợp chung và riêng của các bố mẹ biểu hiện ở các con lai Có 2 phương pháp chính trong phân tích luân giao:

+ Phương pháp Hayman: có thể xác định được một số tham số di truyền của các nguồn vật liệu cũng như ước đoán giá trị tổ hợp lai (Hayman B I., 1954)

+ Phương pháp Griffing: giúp chúng ta xác định các thành phần phương sai khả năng kết hợp chung và riêng Từ đó có thể ước lượng các thành phần biến động

do khả năng kết hợp chung, khả năng kết hợp riêng được qui đổi sang thành biến động do hiệu quả cộng tính, hiểu quả trội và siêu trội của các gen (Griffing B., 1956)

Kết quả đánh giá khả năng kết hợp của dòng bằng phương pháp lai luân giao giúp các nhà nghiên cứu phân nhóm ưu thế lai và sử dụng chúng trong tạo giống, chọn ra những tổ hợp lai tốt phục vụ cho sản xuất

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu:

+ Gồm 25 dòng ngô nếp tạo ra từ phương pháp nuôi cấy bao phấn thuộc tập đoàn dòng của Viện Nghiên cứu Ngô (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Danh sách 25 dòng ngô nếp nghiên cứu

4 N4 C1152 Nếp trắng Chư

Sê/Wax44 17 N17 C1258

Fancy white super 212

+ Giống dùng làm đối chứng trong khảo nghiệm là: MX10 và Wax44 hiện đang được sản xuất phổ biến ở các vùng trồng ngô trên cả nước

+ 22 mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi AMBIONET – CIMMYT (bảng 3.2) (Ambionet - Cimmyt, 2004)

Bảng 3.2 Danh sách 22 mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên mồi Trình tự mồi xuôi (F) và mồi ngược (R)

Từ đầu 5’ đến 3’ Kiểu lặp lại

Kích thước các alen (bp)

Số alen

- Hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

+ Hóa chất: Tris - HCl, EDTA, RNAse, Agarose, Acrylamide, Urea, Bis -

Acrylamide, Primer, Taq DNA polymerase, dNTP, PCR buffer, Ethydium bromide, TEMED, Marker DNA được mua từ hãng Invitrogen (Mỹ), Chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Ammonium acetate, Tris - Base, Boric acid, Acid acetic, NaCl, CTAB, SDS, AgNO3, được mua từ hãng Sigma (Mỹ), Nitơ lỏng mua tại Việt Nam Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử

+ Máy móc, thiết bị thí nghiệm: Máy PCR MJ Research PTC - 100 Thermal

Cycler; máy quang phổ kế Ultrospec 3000 pro; máy chạy điện di gel agarose EPS

301 và polyacrylamide Sequi - Gen GT; máy ly tâm lạnh; máy lắc ổn nhiệt; máy khuấy từ, cân phân tích, máy đo pH, tủ ổn nhiệt, máy soi gel, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh

và các trang thiết bị khác Các thiết bị được sử dụng thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Nghiên cứu Ngô

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Tại Viện Nghiên cứu Ngô - Đan Phượng - Hà Nội

- Thời gian: Vụ Thu 2012 và Vụ Xuân 2013 (Từ 8/2012 đến 7/2013)