phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan từ phân trùn quế

Từ các mẫu phân Trùn Quế thu tại các cơ sở nuôi Trùn Quế ở Sóc Trăng và Cần Thơ đã phân lập được tổng cộng 36 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân vô cơ khó tan trên môi trường NBRIP.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

PHÂN GIẢI LÂN VÔ CƠ KHÓ TAN

TỪ PHÂN TRÙN QUẾ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

MSSV: 3113713

LỚP: VSV K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

PHÂN GIẢI LÂN VÔ CƠ KHÓ TAN

TỪ PHÂN TRÙN QUẾ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

MSSV: 3113713

LỚP: VSV K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

TS Bùi Thị Minh Diệu Trần Thúy Hằng

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Viện nghiên Cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp ngành Vi Sinh Vật Học Tôi xin chân thành cám ơn:

TS Bùi Thị Minh Diệu đã dành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn

Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu tại Viện

Quý thầy cô và cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học Phân Tử Thực Vật, Sinh Hóa đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành nghiên cứu

Gia đình, tất cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian học tập

và nghiên cứu

TÓM LƯỢC

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phân lập được các dòng vi khuẩn phân giải lân từ phân của Trùn Quế Từ các mẫu phân Trùn Quế thu tại các cơ sở nuôi Trùn Quế ở Sóc Trăng và Cần Thơ đã phân lập được tổng cộng 36 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân vô cơ khó tan trên môi trường NBRIP Phần lớn các khuẩn lạc có dạng hình tròn,

có màu vàng hay cam Tất cả các dòng vi khuẩn này đều dạng hình cầu, gram âm và có chuyển động Trên môi trường NBRIP có chứa lân vô cơ khó tan, tất cả 36 dòng xác định là có khả năng phân giải lân dựa trên chỉ số PSI trong đó dòng PB2 có chỉ số PSI cao nhất (PSI = 3.167) Kết quả khảo sát khả năng phân giải lân của 14 dòng sơ tuyển bằng phương pháp so màu đã tuyển chọn được hai 2 dòng có khả năng phân giải lân tốt nhất là PV5 (255.30 mg/L) và (PB7 (241.32 mg/L) Khảo sát sự phát triển của hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn trên các điều kiện nhiệt độ, pH và tốc độ lắc khác nhau cho thấy chúng thích nghi tốt ở nhiệt độ 32 0 C, pH = 6.8 ở cả hai dòng, PB7 phát triển tốt ở tốc độ lắc là 150 vòng/ phút và PV5 phát triển tốt ở 75 vòng/ phút

Từ khoá: Phân giải lân, phương pháp Bergey, vi khuẩn phân giải lân

MỤC LỤC

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về trùn quế 3

2.1.1 Giới thiệu 3

2.1.2 Đặc tính sinh học 4

2.1.3 Đặc tính sinh lý 4

2.1.4 Sự sinh sản và phát triển 5

2.1.5 Hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của trùn quế 5

2.1.6 Đặc điểm và tác dụng của phân trùn quế 6

2.2 Đại cương về lân 9

2.2.1 Các dạng lân trong đất 9

2.2.2 Cơ chế chuyển hóa lân nhờ vi sinh vật 13

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải lân 14

2.3 Một số nhóm vi khuẩn phân giải lân 15

2.3.1 Vi khuẩn Bacillus 15

2.3.2 Vi khuẩn Acinetobacter 16

2.3.3 Vi khuẩn Pseudomonas 17

2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 18

2.4.1 Trên thế giới 18

2.4.2 Ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Phương tiện nghiên cứu 21

3.1.1 Dụng cụ, thiết bị 21

3.1.2 Nguyên vật liệu 21

3.1.3 Hóa chất, môi trường 21

3.2 Phương pháp nghiên cứu 22

3.2.1 Thu mẫu 23

3.2.2 Phân lập vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan 23

3.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn có tiềm năng phân giải lân vô cơ khó tan 23

3.2.4 Tuyển chọn và nhận diện sơ bộ các dòng vi khuẩn phân giải lân mạnh 26

3.2.5 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân vô cơ khó tan của ít nhất một dòng tiêu biểu 29

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn phân giải lân khó tan 31

4.1.1 Nguồn gốc và kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 31

4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được 32

4.2 Khả năng phân giải lân khó tan của các dòng vi khuẩn dựa trên chỉ số PSI 36

4.3 Khảo sát khả năng phân giải lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân lập 38

4.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân vô cơ khó tan của các dòng vi khuẩn tiêu biểu 43

4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43

4.4.2 Ảnh hưởng của pH 44

4.4.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 45

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2: Kết quả

1 Kết quả khảo sát khả năng phân giải lân của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt đo chỉ số PSI

2 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của vi khuẩn bằng phương pháp so màu

3 Kết quả thí nghiệm khảo sát một số yếu tố đến 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn

Phụ lục 3: Kết quả thống kê

4 Kết quả thống kê thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải lân của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt đo chỉ số PSI

5 Kết quả thống kê thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải lân của 14 dòng sơ tuyển

6 Số liệu thống kê thí nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn

DANH SÁCH BẢNG Trang

Bảng 1 – Thành phần các loại phân chuồng 7

Bảng 2 – Thành phần phân trùn nguyên chất 8

Bảng 3 – Thành phần môi trường NBRIP 22

Bảng 4 – Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5 27

Bảng 5 – Nguồn gốc phân lập các dòng vi khuẩn 31

Bảng 6 – Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập 32

Bảng 7 – Đặc điểm hình thái tế bào và nhuộm Gram vi khuẩn 35

Bảng 8 – Chỉ số PSI của các dòng vi khuẩn sau 2 và 7 ngày nhỏ giọt 37

Bảng 9 – Khả năng phân giải lân khó tan của 14 dòng vi khuẩn sơ tuyển qua các ngày khảo sát 39

Bảng 10 – Các đặc tính sinh hóa của 2 dòng vi khuẩn PB7 và PV5 41

Bảng 11 – Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn 43

Bảng 12 – Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn 44

Bảng 13 – Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn 46

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 – Trùn quế 3

Hình 2 – Vòng tuần hoàn phospho trong tự nhiên 11

Hình 3 – Vi khuẩn Bacillus 15

Hình 4 – Vi khuẩn Acinetobacter 16

Hình 5 – Vi khuẩn Pseudomonas 17

Hình 6 – Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường NBRIP 34

Hình 7 – Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 36

Hình 8 – Sự tạo thành vòng sáng halo quanh khuẩn lạc sau 7 ngày nhỏ giọt 36

Hình 9 – Đường chuẩn P2O5 có giá trị dao động từ 0 đến 25 mg/L 39

Hình 10 – Hàm lượng lân trung bình qua các ngày khảo sát của 14 dòng vi khuẩn sơ tuyển 40

Hình 11 – Hình nhuộm Gram của dòng vi khuẩn PV5 và PB7 khi xem dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần 42

Hình 12 – Kết quả thử nghiệm catalase 42

Hình 13 –Kết quả thử nghiệm oxidase 42

Hình 14 – Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn 44

Hình 15 – Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn 45

Hình 16 – Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân giải lân của 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn 46

TỪ VIẾT TẮT

OD Optical Density

NBRIP National Botanical Research Institute’s phosphate

PSI Phosphate Solubilizing Bacteria

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, sự phát triển không ngừng của nông nghiệp đã tạo sức ép cho nông dân về vấn đề năng suất cây trồng, ngày càng có nhiều nông hộ sử dụng phân hóa học không kiểm soát làm cho lượng phân hóa học dư thừa trong đất ngày càng nhiều Lân là phân tử cơ bản rất cần thiết cho sự sống và đặc biệt đối với sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng Vì vậy, phân bón có chứa lân đặc biệt là phân hóa học có chứa lượng lớn lân hòa tan được áp dụng tối đa trong nông nghiệp để tối đa hóa sản xuất (Del Campillo

et al.,1999; Shenoy and Kalagudi, 2005) Tuy nhiên, lân hòa tan trong phân bón lân thường dễ dàng và nhanh chóng kết tủa với các chất khoáng không hòa tan là các cation như Ca2+, Fe3+, Al3+, Co2+ hoặc Zn2+ hoặc hấp thụ với canxi carbonat, oxit nhôm, oxit

sắt và nhôm silicat (Del Campillo et al., 1999; Wakelin et al., 2004) Cây trồng không

thể hấp thu được nguồn lân khó tan này vì thế nó đã giảm hiệu quả phân bón cũng như trực tiếp hay gián tiếp làm ô nhiễm môi trường, giảm độ tơi xốp của đất, giết chết loài

vi sinh vật có lợi trong đất làm mất cân bằng sinh thái Ngoài ra, tốc độ đô thị hóa cùng

với sự phát triển của các ngành công nghiệp như chế biến lương thực thực phẩm, sản xuất các sản phẩm sinh học, các ngành chăn nuôi….tạo ra số lượng lớn chất thải rắn và nước thải chứa nhiều polysaccharide, các hợp chất vô cơ, nitơ, phospho gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng

Do đó, việc sử dụng các nhóm vi khuẩn phân giải lân khó tan là một trong những vấn đề được quan tâm và nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay nhằm nâng cao năng suất cây trồng cũng như giảm thiểu vấn đề ô nhiễm môi trường Hiện nay, biện pháp sinh học là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phân giải lân khó tan thành lân dễ tan, chi phí đầu tư thấp, không có những tác dụng không mong muốn cho môi trường góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường

Một số nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện các nhóm vi khuẩn trong hệ tiêu hóa

của trùn Quế gồm có các chi Bacillus, Pseudomonas, Azospirillum , Acinetobacter,

Klebsiella, Azotobacter cũng có khả năng phân giải lân, kích thích tăng trưởng cây

trồng (Shinha et al., 2009) và tận dụng được lân không hòa tan trong các loại phân bón

và đất (Rodríguez and Fraga, 1999) Vì thế đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan từ phân của trùn quế” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập, đánh giá để tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan hiệu quả từ phân trùn quế hướng tới ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân vô cơ khó tan từ phân trùn quế

Đánh giá để tuyển chọn ít nhất một dòng có hoạt tính phân giải lân mạnh từ các dòng phân lập được

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân vô cơ khó tan của hai dòng vi khuẩn tiêu biểu nhằm xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu của các dòng vi khuẩn

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về trùn quế

2.1.1 Giới thiệu

Phân loại khoa học

Ngành: Giun đốt (Annelida)

Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata)

Lớp: Giun ít tơ (Oligochaeta)

Trùn Quế là một trong những giống trùn đã được thuần hoá, nhập nội và đưa vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ Đây là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác

ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch Chúng được sử dụng rộng rãi trong việc chuyển hóa chất thải ở Philippines, Australia và một số nước khác (Gurrero, 1983; Edwards, 1995)

2.1.2 Đặc tính sinh học

Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, độ dài vào khoảng 10 cm, thân hơi dẹt, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ Khi di chuyển, các đốt co duỗi kết hợp các lông tơ phía bên dưới các đốt bám vào cơ chất đẩy cơ thể di chuyển một cách dễ dàng

Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu O2 và thải CO2 trong môi trường nước Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng Amoniac và Ure Trùn quế nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày tương đương với trọng lượng cơ thể của

nó Sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, phân được thải ra ngoài rất nhiều chất dinh dưỡng, những vi sinh vật cộng sinh này cùng với phân ra khỏi

hệ thống tiêu hóa, nhưng chúng vẫn hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài Đây được cho là nguyên nhân chính làm cho lượng phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn các lọaị phân hữu cơ thông thường khác

2.1.3 Đặc tính sinh lý

Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ, biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Chúng có thể sống ở phổ pH khá rộng từ 4 – 9, tuy nhiên trùn quế sống và sinh sản tốt nhất ở pH 7 – 7,5 Nhiệt độ thích hợp nhất cho trùn phát triển là từ 20oC - 30oC Độ ẩm luống nuôi thích hợp cho trùn quế phát triển từ

70 - 80% Ở 30oC và độ ẩm thích hợp chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh Ngược lại ở nhiệt độ quá thấp chúng sẽ ngừng hoạt động hoặc có thể chết

Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm,…) Tuy nhiên những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn vì giàu chất dinh dưỡng, giúp chúng sinh sản và phát triển Chúng sẽ ngửi được và tự tìm đến

Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rảnh, nơi có nhiều chất hữu cơ thối rửa và phân hủy như trong đống phân đang phân hủy hay rác đang hoai mục Chúng rất ít hiện diện trong đồng ruộng canh tác dù ở những nơi này có nhiều chất thải

hữu cơ Có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất này thường cao, không hấp dẫn và không đảm bảo được điều kiện ánh sáng, ẩm độ thường xuyên

2.1.4 Sự sinh sản và phát triển

Trùn quế là sinh vật lưỡng tính - chúng có cả cơ quan sinh dục đực lẫn sinh dục cái, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu của cơ thể Mặc dù vậy, chúng không thể tự sinh sản được mà phải tìm một con khác để trao đổi tinh trùng, giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng, kén trùn di chuyển dần về phía đầu Kén áo hình dạng thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu trắng đục,

sau chuyển sang xanh nhạt rồi vàng nhạt Mỗi kén có thể nở từ 1 – 10 con

Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3mm, sau 5 – 7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một vằn đỏ thẫm trên lưng Khoảng từ 15 –30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện đai sinh dục (Arellano, 1997) ; từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản Con

trưởng thành khỏe mạnh có màu mận chín và có sắc ánh kim trên cơ thể

Trùn Quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định

và có độ ẩm cao Cứ một tuần đẻ một lần, sau 3 tuần trứng nở, sau 3 tháng giun trưởng thành Theo nhiều tài liệu, từ một cặp ban đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo

ra từ 1.000 –1.500 cá thể trong một năm

2.1.5 Hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa cùa trùn quế

Trùn quế mang nhiều vi khuẩn trên da, trong chất nhầy ở trong ruột và đặc biệt

là trong phân trùn Ruột trùn quế chứa hàng triệu vi khuẩn có lợi, chúng sống cộng sinh trong ruột góp phần vào quá trình phân hủy vật chất hữu cơ khoáng hóa N và P cung cấp chất vi lượng cần thiết cho cây trồng thông qua sản phẩm bài tiết của chúng

(Buchanan et al., 1988)

Sự đa dạng của vi sinh vật phụ thuộc vào điều kiện sinh học và các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, độ pH và chất hữu cơ là một phần của chế độ ăn uống của chúng Theo các nghiên cứu cho thấy cộng đồng vi khuẩn trong đường tiêu hóa của trùn gắn liền với bốn nhóm vi khuẩn sau: kích thích tăng trưởng thực vật, cố định nitơ sống tự do, chất

diệt sinh vật và phân giải lân chủ yếu gồm có các chi Bacillus, Pseudomonas,

Acinetobacter, Azospirillum, Klebsiella, Azotobacter, Serratia, Aeromonas và Enterobacter

Ngoài các nhóm vi khuẩn sẵn có trong hệ tiêu hóa của trùn thì khi trùn nuốt thức

ăn vào miệng có một lượng đất cũng như vi sinh vật có lợi trong đất sẽ theo thức ăn vào trong hệ tiêu hóa của trùn và dưới điều kiện thuận lợi có nhiều chất hữu cơ thì hệ vi sinh vật đất này sẽ sinh sôi gấp 10 lần và thực hiện quá trình phân hủy thức ăn và góp phần vào việc phân giải hợp chất hữu cơ cũng như khoáng hóa N, P một cách nhanh chóng Kết quả của quá trình này cung cấp các chất dinh dưỡng cho cả trùn quế và vi khuẩn Sau quá trình tiêu hóa ở ruột, số lượng lớn các vi khuẩn được phóng thích trở lại vào thùng nuôi trùn Quế cùng với phân trùn Phân trùn Quế được các vi khuẩn chuyển hóa dưới dạng các nguyên tố và hợp chất đơn giản, vì vậy đây chính là loại phân hữu cơ vô cùng cần thiết cho cây trồng sử dụng Không những thế các vi khuẩn này lại tiếp tục phát triển trong đất và một lần nữa góp phần vào việc phân giải các hợp chất lân lân khó tan trong đất, cố định đạm cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng (Mitchel and Edward, 1997) Hệ tiêu hóa trùn quế tập trung nhiều các thành phần hữu cơ, khoáng chất và các vi khuẩn có lợi vì vậy phân của chúng luôn có các chất giàu dinh dưỡng Nhiều nghiên cứu cho thấy phân trùn quế cho lượng phosphate nhiều gấp 4 lần bề mặt đất nhờ trùn quế có chứa hệ vi sinh vật phân giải lân khó tan thành dạng dễ tan cho cây hấp thu (Rebeca Lines-Kelly, 2004)

2.1.6 Đặc điểm và tác dụng của phân trùn quế

Thành phần phân trùn: Phân trùn là loài hữu cơ giàu NPK (nitơ 2-3% kali 2,25% và phospho 1,55-2,25%), ngoài ra còn một số phân đa lượng khác (Atiyeh et,al., 2000) Phân trùn còn chứa các enzyme như amylase, lipase, cellulase, phosphatase và các acid amin mà các phân hữu cơ khác không có Khi được thải ra môi trường ngoài chúng chứa các chất dinh dưỡng, các vi khuẩn có lợi như vi khuẩn cố định đạm, phân giải lân chúng tiếp tục phá vỡ các thành phần khó hấp thu trong đất để giải phóng chất dinh dưỡng và làm cho nó có sẵn cho các rễ cây dễ hấp thu, kích thích tố tăng trưởng thực vật (Edwards, 2004)

1,85-Phân trùn chứa đựng một hỗn hợp vi sinh có hoạt tính cao của trùn quế cung cấp các chất khoáng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng như đạm, lân, kali, canxi, magic

và có khả năng cải tạo đất rất tốt Sự hữu dụng nhất là các chất này có thể được cây hấp thu ngay không như những phân hữu cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi cây trồng hấp thu (Nakamura, 1996)

Các nghiên cứu của Agawal cũng cho thấy rằng hàm lượng dinh dưỡng N,P, K trong phân trùn tăng 3- 4 lần so với phân thông thường không được xử lý bằng trùn quế

Bảng 1 - Thành phần của các loại phân chuồng

C Vật chất hữu cơ C/N

10-11

( *Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003)

Qua bảng 1 và bảng 2 ta thấy rõ hàm lượng N, P, K trong phân trùn nguyên chất cao hơn so với phân chuồng thông thường trong đó đặc biệt hàm lượng lân dễ tan trong phân trùn rất cao điều này cho thấy có thể một lượng lân khó tan có trong khẩu phần ăn của trùn đã được phân giải sau khi qua hệ thống tiêu hóa cùng với hệ vi khuẩn có lợi

Tác dụng phân trùn quế

Phân trùn quế là loại phân hữu cơ sinh học có hàm lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loại cây trồng, không gây ra tình trạng “sốc” phân, yêu cầu trữ dễ dàng, đặc biệt thích hợp cho các loại hoa kiểng, vườn ươm và là nguồn phân thích hợp cho việc sản xuất rau sạch Ngoài ra, còn là loại phân bón thiên nhiên giàu dinh dưỡng có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Không giống như phân chuồng, phân trùn được hấp thu ngay một cách dễ dàng bởi cây trồng Không chỉ kích thích tăng trưởng cây trồng mà phân trùn còn tăng khả năng duy trì giữ nước trong đất và thậm chí còn có thể ngăn ngừa các bệnh về rễ Phân trùn quế chứa một sinh vật có hoạt tính cao

như vi khuẩn, nấm mốc, đặc biệt là hệ vi khuẩn cố định đạm tự do (Azotobacter), vi

khuẩn phân giải lân, phân giải celluose và chất xúc tác sinh học Vì thế hoạt động của các vi sinh vật lại tiếp tục phát triển trong đất

Phân trùn quế giàu những chất dinh dưỡng hòa tan trong nước và chứa đựng hơn 50% chất mùn được tìm thấy trong lớp đất mặt Không như phân động vật, phân trùn được cây trồng sử dụng ngay Phân trùn cung cấp các chất khoáng cần thiết cho sự phát triển cây trồng như đạm, lân, kali, canxi, magic Nó cũng chứa mangan, đồng, kẽm,

coban, borat, sắt Sự hữu dụng của các chất này được cây hấp thụ ngay không như những phân hữu cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi hấp thụ Sẽ không có bất cứ rủi ro hay cháy cây nào xảy ra trong khi sử dụng phân trùn quế Chất mùn trong phân loại trừ được những độc tố, nấm hại và vi khuẩn có hại trong đất nên nó có thể đẩy lùi những bệnh của cây trồng Do vậy, phân trùn hạn chế khả năng gây hại cho cây trồng Mặt khác phân trùn còn có khả năng cố định các kim loại nặng trong chất thải hữu cơ Điều này ngăn ngừa cây trồng hấp thu nhiều phức hợp khoáng hôn nhu cầu của chúng Phân trùn quế có pH=7 nên nó hoạt động như một rào cản, giúp cây phát triển trong đất

ở độ pH quá cao hay quá thấp

Acid Humid trong phân trùn quế, kích thích sự phát triển của cây trồng, thậm chí ngay cả nồng độ thấp Trong phân trùn, Acid Humid ở trạng thái mà cây trồng có thể hấp thu dễ dàng nhất Acid Humid cũng kích thích sự phát triển của vi khuẩn trong đất Phân trùn tăng khả năng giữ nước của đất vì phân trùn có dạng hình khối, nó là những cụm khoáng chất kết hợp theo cách mà chúng có thể để chống sự xói mòn và sự va chạm cũng như khả năng giứ nước, góp phần làm cho đất tơi xốp và giữ ẩm được lâu Phân trùn quế làm giảm hàm lượng dạng Acid carbon trong đất và gia tăng nồng độ nitơ trong một trạng thái cây trồng có thể hấp thụ được Phân trùn cũng chứa IAA (Indol Acetic Acid) có trong phân trùn quế là một trong những chất kích thích hữu hiệu giúp cây trồng phát triển tốt

2.2 Đại cương về lân

2.2.1 Các dạng lân trong đất

Lân là nguyên tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng ( N, P, K) là nguyên tố cơ bản cần thiết cho sự sống của tất cả các loài sinh vật đặc biệt là thực vật Lân là thành phần xây dựng nên các hợp chất quan trọng bậc nhất của tế bào như: Phosphoprotein, phospholipit, phosphoeste, trong các vitamin (B1, B6) Đặc biệt phospho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP, GTP, FAD, NADP, coA, đây là những phân tử trao đổi năng lượng, có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình quang hợp và hô hấp của thực vật ( Hoàng Thị Hà, 1998)

Lân rất quan trọng với cây trồng nhưng hiệu suất sử dụng của cây không quá 25%

do chúng tích trữ trong đất và tồn tại ở dạng khó tan Nhiều loại đất có lượng lân tồn trữ rất cao, bình quân tổng số chiếm khoảng 0.05% thành phần đất, tuy nhiên trong đó chỉ

có tổng số 0.1% phospho có ích cho cây trồng, còn lại chúng tồn tại ở dạng khó tan mà cây trồng không thể hấp thụ (Zou et al., 1992) Lân tồn tại ở 2 dạng chính: lân vô cơ và lân hữu cơ Mỗi dạng là một dãy liên tục nhiều hợp chất của phospho, tồn tại ở các dạng khác nhau Lân có thể ở dạng hòa tan có giá trị với cây trồng, cây trồng có thể hấp thu

sử dụng được hoặc ở dạng khó tan, cây trồng không hấp thu được

Lân hữu cơ: Tồn tại trong xác bã thực vật và trong vi sinh vật Trong xác bã thực vật, lân nằm trong hợp chất hữu cơ như: phytin, phospholipid, nucleic acid, các nucleoprotein, các chất đường có chứa lân, các men (enzyme, coenzyme) và các hợp chất khác Phần lớn lân trong tế bào thực vật ở dưới dạng phosphate

Lân vô cơ: Theo A.E Vosbuscaia, lân có nguồn gốc vô cơ chiếm khoảng 0.09% thạch quyển, khoáng chứa nhiều lân vô cơ nhất là apatit Khoáng apatit chứa nhiều trong các loại đá, khi tập trung nhiều tạo thành mỏ apatit Apatit không hòa tan trong nước Ngoài ra còn khoáng phosphoric trong đá trầm tích cũng chứa lân

Trong quá trình phong hóa, các khoáng chứa lân bị phá hủy và tạo thành các muối đơn như phosphate canxi, magiê, nhôm,…Chúng thường ngậm nước khác nhau Tùy theo loại môi trường mà muối của phosphate hiện diện khác nhau

▪ Vai trò của lân đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Lân có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng của cây trồng Dưới tác dụng của lân cây trồng có hạt chín sớm hơn từ 5-7 ngày, cây ăn quả có số quả chín sớm nhiều hơn đạt tới 78% (nếu không có lân thì khoảng 32%) Bón phân lân sẽ tăng tính chịu rét, tăng độ đường cho củ cải, tăng lượng tinh bột cho khoai tây Nhìn chung lân có tác dụng tăng chất lượng cùng năng suất cây trồng đáng kể Ngoài ra, lân còn tăng tính chịu hạn của cây nhờ tính ngậm nước cao của nó Đối với cây họ Đậu lân còn giúp cho quá trình cố định đạm xảy ra hiệu quả hơn Trong quá trình sinh trưởng của cây, lân có tác dụng khống chế độ độc của lượng đạm khoáng cao trong cây vì nó giúp cho thực vật tăng cường việc chuyển hóa đạm khoáng thành đạm Protein Ngoài ra sự góp mặt của nó làm cây hấp thu được lượng đạm khoáng nhiều hơn

Trên thực tế, nhiều nhà khoa học đã chứng minh được rằng thiếu lân sự hình thành

tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc, ít phân cành đẻ nhánh Thiếu lân năng suất cây trồng giảm mạnh, ngay cả khi được cung cấp đầy đủ Nitơ Lân có vai trò đặc biệt đối với sự

phát triển của cây trồng , tuy nhiên có tồn tại một số dạng lân khó tan cây trồng không thể hút trực tiếp Chúng phải chuyển hóa ra dạng P2O5 vô cơ dễ tan, cây trồng mới hấp thụ được Vi sinh vật giữ vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa các dạng của lân này Trong thiên nhiên lân được chuyển hóa theo một chu trình khép kín

Chu trình lân trong tự nhiên

Vòng tuần hoàn của lân không giống như vòng tuần hoàn của Nitơ Trong khi Nitơ luôn khan hiếm trong đất thì lạn tồn tại một lượng đáng kể ở dạng khó tan Nitơ được đưa vào đất nhờ vi sinh vạt cố định đạm từ không khí thì lân được tạo ra nhờ các vi sinh vật phân giải lân từ các nguồn vô cơ và hữu cơ khác nhau

Hình 2 – Vòng tuần hoàn phospho trong tự nhiên

( http://img442.imageshack.us/img442/9624/236u.png )

Lân vô cơ

▪ Lân vô cơ tồn tại ở hai dạng chính sau:

Loại lân không tan trong nước: Thực vật không trực tiếp sử dụng loại lân này đó

là các Apatit, các muối gốc phosphate của kim loại mang tính acid như: FeP04, AlP04, phosphate của kim loại kiềm thổ mang tính kiềm hoặc trung tính: Ca3(P04)2, Al3(P04)2

(Omar, 1988)

Loại lân tan trong nước thường gặp là KH2PO4, Na2HPO4 K2HPO4, Ca(HPO4)2, Mg(HPO4)2 Thực vật dễ dàng sử dụng tốt các loại lân này, nhưng đáng tiếc là hàm lượng của chúng lại rất thấp chỉ chiếm 0,1- 1% so với lượng lân tổng số cho nên cây trồng thường bị thiếu lân nghiêm trọng

Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối của những nguyên tố Ca, Fe, Al Tùy vào môi trường mà chúng ở dạng tồn tại khác nhau Ở môi trường trung tính và kiềm thì dạng tồn tại chủ yếu là phosphate Ca, còn môi trường acid thì dạng tồn tại phosphate Fe, Al Phosphate Ca dễ huy động làm chất dinh dưỡng cho cây trồng hơn Fe, Al Sự tồn tại của ion phosphate trong môi trường phụ thuộc vào ion phosphate bị chuyển đổi hóa trị Môi trường acid: H2PO4-, HPO42-, PO43- Trong thực tế thì dạng được cây trồng dễ hấp thu nhất là H2PO4-, các dạng còn lại là những dạng mà cây trồng khó hấp thu, tích trữ trong đất gây ô nhiễm môi trường trầm trọng Vì vậy để cây trồng dễ hấp thụ thì cần một quá trình biến đổi thành dạng dễ tan Nhờ vi sinh vật lân hữu cơ được vô cơ hóa tạo thành muối của acid phosphoric Các dạng lân này được cây trồng sử dụng như nguồn lân hữu

cơ và một phần bị cố định ở dạng vô cơ khó tan như Ca3PO4, AlPO4, FeSO4 Những dạng này sẽ chuyển thành dạng dễ tan khi pH môi trường thích hợp Trong quá trình này

vi sinh vật chiếm vai trò quan trọng (Fox và Comeford, 1992)

Lân hữu cơ

Lân hữu cơ tồn tại trong xác bã thực vật và trong vi sinh vật Trong xác bã thực vật, lân nằm trong hợp chất hữu cơ như: phytin, phospholipid, nucleic acid, các nucleoprotein, các chất đường có chứa lân, các men (enzyme, coenzyme) và các hợp chất khác Phytate là dạng tồn tại chính của lân hữu cơ chiếm từ 1 đến 5% (w/w) của đậu hạt, ngũ cốc, hột chứa dầu, phấn hoa và hạnh nhân (Cheryan, 1980) Theo Posternak (1902) là người đầu tiên phát hiện ra phytin Ông dùng phytin để chỉ một chất lân trong các loại hạt mà ông khám phá ra và xem nó như sản phẩm trung gian trong quá trình

tổng hợp diệp lục tố nhưng Pfeffer tìm ra acid phytic từ năm 1872 Trong tế bào vi sinh vật, phần lớn lân là hợp chất trong nucleic acid của vi sinh vật, các hợp chất khác trong nguyên sinh chất như các orthophosphate, metaphosphate, đường có chứa lân và các men có chứa từ 15-25 % lân trong tế bào vi sinh vật ở dưới dạng hợp chất acid dễ tan Lân có vai trò đặc biệt đối với sự phát triển của cây trồng , tuy nhiên có tồn tại một số dạng lân khó tan cây trồng không thể hút trực tiếp Chúng phải chuyển hóa ra dạng P2O5 vô cơ dễ tan, cây trồng mới hấp thụ được Vi sinh vật giữ vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa các dạng của lân này

2.2.2 Cơ chế chuyển hóa lân nhờ vi sinh vật

▪ Phân giải phosphate khó tan do sự tạo thành acid của vi sinh vật

Một số loài vi khuẩn có khả năng phân hủy lân khó tan (Ali Khan et al., 2009) Cơ

chế chủ yếu của sự phân giải lân khó tan của các loài vi khuẩn là sự tổng hợp acid hữu

cơ và làm giảm pH trong đất (Kpomblekou and Tabatabai, 1994)

Theo nghiên cứu của Bardia and Gaur (1972-1974), cho thấy trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật khi pH môi trường bị giảm sút mạnh, thì hàm lượng lân tan trong môi trường tăng lên Sau khi nuôi cấy vi khuẩn phân giải lân khó tan người ta tìm thấy nhiều acid hữu cơ như: Acid acetic, acid fomic, acid gluconic, acid oxalic, acid sucinic, acid malic, acid xitric trong môi trường Có nghĩa là ngay sau khi vi sinh vật tiết ra các acid thì chúng tác dụng lên lân khó tan và cho ra ngay lân hòa tan Các acid hữu cơ này tác dụng với hợp chất lân không tan nhờ sự liên kết với cation: Mg+2, Ca+3, Al+3, Fe+3 qua

đó tạo nên hợp chất lân mới tan trong nước

Goldstein A.H (1996) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxi hóa glucose sinh ra acid gluconic và 2-ketogluconic có ở vùng xung quanh tế bào vi khuẩn dẫn đến sự làm tan lân khó tan của môi trường

Một số loại acid hữu cơ phân lập từ vi khuẩn Rhizobium leguminosarum,

Rhizobium meliloti, Bacillus firmus và một số vi khuẩn khác là acid α- ketogluconic

Nhưng với loài vi khuẩn Pseudomonas sp., Erwinia herbicola và Burkholderia cepacia

là acid hữu cơ chính để phân giải lân

Một số loại acid khác cũng được ghi nhận trong các loài vi khuẩn phân giải lân là glycolic, oxalic, malonic và succinic (Illmer and Shinner, 1992) Chất chelate và acid

vô cơ được xem như là cơ chế khác của quá trình phân giải lân Nhưng hiệu quả và sự đóng góp của chúng trong quá trình phân giải lân ít hơn acid hữu cơ

▪ Sự phân giải lân khó tan nhờ phản ứng Carbondioxit (CO 2 và H 2 S)

Nhiều nghiên cứu trước đây cho rằng CO2 sản sinh bởi rễ cây và vi sinh vật có tác dụng phân giải các hợp chất lân khó tan Sau đó Goerge (1938) tìm ra rằng: CO2 làm tăng cường khả năng tan của lân và sử dụng lân của cây trồng Trong quá trình phát triển, cây trồng và vi sinh vật đã tạo ra một lượng lớn Carbondioxit Hợp chất này cùng với nước đồng thời tác dụng lên các dạng lân khó tan biến chúng thành dạng dễ tan như phương trình:

Ca3(PO4)2 + CO2 + H2O = 2CaHPO4 + CaCO3

Ca3(PO4)2 + 2CO2 + 2H2O = 2Ca(H2PO4)2 + 2CaCO3

Năm 1985 Sawby và Sperber đã chứng minh rằng vi sinh vật phân hủy aminoacid chứa lưu huỳnh hoặc vi khuẩn lưu huỳnh oxi hóa Sulfer hoặc tạo ra H2S H2S có khả năng phân giải hợp chất lân khó tan như phương trình: H2S + FeSO4 = FeS + H2SO4

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải lân

pH: pH không ảnh hưởng lớn đến khả năng phân giải lân Tuy nhiên pH từ 7,8-

8,0 ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của vi khuẩn phân giải lân (Nguyễn Kim Phụng,

2002)

Nhiệt độ: Tùy theo từng loại vi khuẩn mà có khoảng nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân giải lân khác nhau Nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân giải lân trong khoảng 20- 400C (Phạm Thanh Hà và ctv, 2003)

Hợp chất hữu cơ: Chất hữu cơ làm tăng nhanh quá trình sinh trưởng của vi khuẩn

do đó khả năng phân giải của chúng sẽ cũng tăng lên (Đoàn Chiến Thắng, 2010)

Độ ẩm: Độ ẩm cao hoạt động của vi khuẩn mạnh, tạo nhiều acid hữu cơ làm tăng khả năng phân giải (Đoàn Chiến Thắng, 2010)

Tỷ lệ N và C trong môi trường: N và C là những thành phần cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Tỷ lệ N, C trong môi trường cao sẽ thúc đẩy khả năng phân giải lân của chúng

2.3 Một số nhóm vi khuẩn phân giải lân

Bacillus megaterium là vi khuẩn hình que một trong những loài thuộc chi Bacillus

có khả năng phân giải lân mạnh, có khả năng hình thành bào tử, di chuyển dễ dàng, là

vi khuẩn yếm khí, và hình thành acid lactic.Vi khuẩn này được sử dụng như là một vi sinh vật công nghiệp, có khả năng sản xuất nhiều loại protein và nguồn xử lý sinh học, sản xuất ra một lượng lớn enzyme (Martin et al., 1995)

Vi khuẩn Acinetobacter có dạng hình cầu, chiều rộng vi khuẩn khoảng 0,9-1,6

µm và dài 1,5-2,5 µm (Towner, 2006) Là vi khuẩn gram âm và không hình thành bào

tử Nhiệt độ vào khoảng 33-350C và pH khoảng 5,5-6,0 là điều kiện thuận lợi cho loài

vi khuẩn này phát triển (Juni, 2005) Khuẩn lạc tạo thành từ loài vi khuẩn này thường

không có màu và một số ít có màu trắng, màu kem và bề mặt khuẩn lạc nhày hoặc trơn láng Đường kính khuẩn lạc vào khoảng 1 đến 2 mm (Towner, 2006)

Acinetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, bùn, hệ thống bùn

của hệ thống xử lý nước thài và trong phân của một số loại vật nuôi như gia súc và gia cầm Có thể phát triển trên môi trường với các thành phần chất khoáng, năng lượng và nguồn carbon đơn giản như acetate, pyruvate, hay lactate (Baumann, 1968)

Một số dòng trong Acinetobacter được ứng dụng để xừ lý các chất thải gây ô

nhiễm môi trường như: biphenyl, chlorinated biphenyl, phenol, benzoate, dầu thô, loại

bơ phosphate hữu cơ khó tan và kim loại nặng (Abdel-El-Haleem,.2003) Acinetobacter

hấp thu lân trong chất thải bằng cách tổng hợp thành dạng polyphosphate tích lũy bên trong tế bào (Beacham et al., 1992)

Một số loài vi khuẩn thuộc Acinetobacter có khả năng phân hủy lân hữu cơ khó tan như: Acinetobacter aerobacter, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter

Pseudomonas có khả năng phân hủy các loại chất thải chứa lân vô cơ và hữu cơ

khó tan ở phạm vi rộng và trong những điều kiện khác nhau Loài vi khuẩn này tồn tại khắp nơi trong môi trường đất, nước và trong cả phân của các loài gia súc, gia cầm Nhiều loài của chúng phát triển rất nhanh và có khả năng sử dụng các loại cơ chất kể cả các loại cơ chất mang tính độc hại như hydrocarbon vòng thơm và các chất béo (Moore

et al., 2006)

Vi khuẩn Pseudomonas có hình que hơi cong hoặc thẳng không có xoắn ốc Vi

khuẩn Gram âm, hiếu khí không bắt buộc, di chuyển bằng tiêm mau ở một đầu Chiều

dài 1,5- 5,0 μm và đường kính 0,5 – 1,0 μm Vi khuẩn Pseudomonas không tăng trưởng

trong điều kiện pH < 4.5 , nhiệt độ sinh trưởng 28- 300C và pH =7 (Moore et al., 2006)

Một số loài vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas bao gồm: Pseudomonas stutzeri,

Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, pseudomonas agarici, Pseudomonas amidgdali, Pseudomonas gracilis…

2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam

2.4.1 Trên thế giới

Hàm lượng lân trong các loại đất thường rất thấp vì vậy bón phân là biện pháp hữu hiệu để tăng hàm lượng lân dễ tan trong đất Nhưng 2/3 lượng phân bón vào đất bị chuyển hóa trở thành lân khó tan khiến cây trồng không hấp thụ được hoặc bị rửa trôi

đi Do đó hiệu quả của việc bón phân lân bị giảm đi nhiều Việc nghiên cứu ra các vi sinh vật phân giải lân khó tan đã giải quyết được vấn đề này Chúng vừa giảm được lượng phân bón cho cây vừa có thể sử dụng được lượng lân khó tan trong đất Từ những lợi ích như vậy, vi sinh vật phân giải lân được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm Nhiều công trình nghiên cứu ở Ấn Độ, Châu Âu và Mỹ cho thấy hiệu quả to lớn của các

vi sinh vật phân giải lân

Các nghiên cứu của Sen và Paul, 1957, Katznelson và Bose, 1967; Ostwal và

Bhide, 1999 cho thấy các chủng vi khuẩn đặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus, các chủng nấm thuộc loài Penicillium, Asperillus có khả năng chuyển hóa lân khó tan

thành dễ tan trong đất nhờ tiết ra các aid hữu cơ như acid fomic, acetic, lactic, propionic, fumaric, gluconic và acid succinic Các acid này làm giảm pH môi trường và hòa tan các dạng lân khó tan

Ở Liên Xô (cũ) sản phẩm phân bón vi sinh vật thương mại “phosphobacterin” với

sự có mặt của B.megaterium và phosphaticum đã được sử dụng rộng rãi ở Liên Xô và

các nước Đông Âu, làm tăng năng suất cây trồng từ 5-10% so với đối chứng Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngô cũng tăng đáng kể so với mẫu đối chứng Người ta tính nếu sử dụng vi sinh vật phân giải lân tương đương với bón 50 kg P2O5/ha

Grimer and Mount (1981) đã nghiên cứu tác động của Pseudomonas putida phân lập từ đất xung quanh cây họ đậu Ông thấy rằng khi bổ xung P.putida vào đất trồng làm

cho cây tăng khả năng hấp thu lân của cây

Datta et al (1982) đã ứng dụng thành công vi khuẩn Bacillus firmus có khả năng

phân giải lân khó tan làm tăng năng suất lúa ở vùng đông bắc Ấn Độ Chủng này vừa có khả năng sinh IAA là hormon sinh trưởng rất cần thiết cho cây trồng vừa có khả năng chuyển hoá lân khó tan

Gopal et al (2009) cũng đã phân lập được vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong ruột của giun đất Eudrilus sp có khả năng phân giải lân khó tan cung cấp lượng

khoáng cần thiết giúp tăng trưởng cây trồng ngoài ra còn ức chế được nấm bệnh

Alvaro (2009) phân lập được 2 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân và kích

thích sinh trưởng của cây trồng từ rễ cỏ ở Tây Ban Nha thuộc chi mới là Acinetobacter

N Uma Maheswari and S Sudha (2013) đã phân lập được 4 loài vi khuẩn phân

giải lân trong ruột của giun đất Eisenia Foetida là Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogens, P Fluorescens.

2.4.2 Ở Việt Nam

Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Mai (1999) đã nghiên cứu khả năng tiết enzyme phosphatase của 10 chủng vi sinh vật phân giải lân và nhận thấy rằng ngoài khả năng phân giải lân khó tan các chủng vi sinh vật này có khả năng sản sinh enzyme photphatase (chủ yếu là nấm sợi và vi khuẩn) enzyme này đóng vai trò xúc tác không thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa lân

Việt Nam, năm 2007 Quyền Đình Thi et al phân lập Acinetobacter từ mẫu nước

biển và nghiên cứu các yếu tố như nguồn carbon, nitrogen, nhiệt độ và mọi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp enzume protease trong vi khuẩn này Nguyễn Thị Dơn (2012) đã phân lập được 26 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan

cả K và P từ mẫu vật liệu phong hóa núi Sập, tỉnh An Giang Trong đó có 4 dòng vi

khuẩn có khả năng phân giải lân cao nhất có mức độ đồng hình với Bacillus,

Brevibacillus, Acinetobacter soli

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

Sử dụng thiết bị và dụng cụ nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ

3.1.1 Dụng cụ, thiết bị

‒ Đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, bình tam giác

‒ Tủ lạnh trữ mẫu

‒ Que cấy, đèn cồn, lam, lamen

‒ Tủ cấy vi sinh vật Biosafe II và tủ ủ vi sinh vật

‒ Cân điện tử Sartorius (Đức)

‒ Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)

‒ pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)

3.1.3 Hóa chất, môi trường

 Hóa chất

‒ Nhuộm Gram: Crystal violet, iod, ethanol + aceton, Safranin (hoặc fuchsin) và nước cất

‒ Định lượng lân hòa tan: (NH4)6MoO24.4H2O ( Amoniummolybdate) KsbOC4H2O6

(Potassium antymonyl tartrate) , H2SO4 đậm đặc, acid ascorbic

▪ Dung dịch A :

(1) 12g ( NH4)6MoO24.4H2O ( Amoniummolybdate) + 250ml H2O

(2) 0,2908g KsbOC4H2O6 ( Potassium antymonyl tartrate) + 100ml H2O

(3) Lấy 140ml H2SO4 đậm đặc và thêm H2O vào từ từ cho đủ 1 lít

(4) Cho (1), (2) vào (3) sau đó thêm H2O vào cho đủ 2 lít

▪ Dung dịch B: 1,05g acid ascorbic + 200ml dung dịch A

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Thời gian thực hiện: Bắt đầu từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014

Địa điểm: Thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Vi sinh vật thuộc Viện Nghiên Cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ

3.2.2 Phân lập vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan

Cân 1g phân trùn đem hòa tan trong 99ml dung dịch nước muối 0,9%, lắc trong

10 phút

Sau đó pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-2 đến 10-5

Dùng pipet hút 0.1mL dung dịch pha loãng ở các nồng độ cấy trải trên đĩa petri

có chứa môi trường phân lập NBRIP (Bảng 3) Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Ủ khoảng 2-3 ngày ở nhiệt độ 300C trong tủ ủ để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc

Khi khuẩn lạc phát triển trên đĩa petri, chọn khuẩn lạc cấy vào đĩa petri khác chứa cùng loại môi trường phân lập, lập lại nhiều lần đến khi thu được vi khuẩn ròng

Cấy chuyển vi sinh vật phân lập được vào ống thạch nghiêng có chứa môi trường phân lập để ở 300C trong 48h và được trữ lạnh ở 40C

3.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn có tiềm năng phân giải lân vô cơ khó tan

Để khảo sát khả năng phân giải lân vô cơ của các dòng vi khuẩn phân lập được trước tiên ta lấy vi khuẩn từ ống trữ ria, cấy trên môi trường NBRIP đặc chứa lân vô cơ khó tan

Những dòng vi khuẩn có khả năng tồn tại được trên môi trường đặc thù để kiểm tra được xem là có khả năng phân giải lân vô cơ và sẽ được kiểm tra chỉ số PSI (chỉ số hòa tan lân) dựa trên đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn và đường kính vòng halo (vòng sáng hình thành trên môi trường kiểm tra)

▪ Sau 2-5 ngày, những vi khuẩn có khả năng phân giải lân sẽ phát triển trên môi trường và có tạo thành những vùng sáng, là những vòng tròn đồng tâm trong suốt quanh khuẩn lạc

▪ Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng halo ở ngày thứ 2 và thứ 7 sau khi dòng Từ đó tính được chỉ số hòa tan lân (PSI) của mỗi dòng dựa trên công thức:

PSI = 𝑑(𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐)+𝑑(𝑣ò𝑛𝑔 𝑠á𝑛𝑔)

𝑑(𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐)

Trong đó: d (khuẩn lạc) là đường kính tạo bởi khuẩn lạc

D (vòng sáng) là đường kính tạo bởi vòng sáng halo

▪ Sau khi tính toán được PSI, chọn ra ít nhất 2 dòng vi khuẩn có chỉ số PSI cao để quan sát hình dạng, khả năng chuyển động, thực hiện các thí nghiệm sinh hóa tiếp theo

Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Vi khuẩn được quan sát chuyển động bằng giọt ép dưới kính hiển vi quang học

ở độ phóng đại 400lần

Các bước quan sát vi khuẩn

▪ Lau sạch kính mang vật bằng cồn và làm khô

▪ Nhỏ một giọt nước cất tuyệt trùng lên kính mang vật

▪ Khử trùng kim cấy hay kim mũi giáo bằng ngọn lửa đèn cồn và làm nguội

▪ Dùng đầu kim cấy vào khuẩn lạc,lấy một ít vi sinh vật hòa lẫn vào giọt nước trên

Chú ý: Mẫu dược cho là ròng khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ thấy được một loại

vi khuẩn, có sự tương đồng về hình dạng, kích thước và không lẫn tạp một loại vi sinh vật nào khác

Nhuộm Gram

Sau khi xác định được các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn (kính mang vật được lau sạch bằng cồn và làm khô)

▪ Nhỏ một giọt nước đã khử trùng lên kính mang vật

▪ Khử trùng kim cấy trong ngọn lửa đèn cồn

▪ Dùng kim cấy lấy một ít vi sinh vật cho vào giọt nước,trải đều và mỏng theo hình xoắn ốc

▪ Hơ mặt dưới của kính mang vật dưới ngọn lửa đèn cồn để giết chết vi sinh vật và

cố định chúng trên kính mang vật

▪ Nhỏ 1 hay 2 giọt Crystal violet cho phủ nơi cố định vi sinh vật,để trong 60s

▪ Rửa nước từ 2-3 lần; chậm nhẹ cho khô nước

▪ Nhỏ dung dịch iod để yên trong 60s

▪ Rửa cồn + aceton thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính đến khi giọt cồn và aceton không còn màu tím nữa

▪ Nhỏ một đến hai giọt fushin hay safranin để yên trong 60s

▪ Rửa nước vài giây

▪ Dùng giấy chậm nhẹ cho khô nước hoặc hơ dưới lửa đèn cồn

▪ Quan sát trên kính hiển vi

Chú ý màu của vi khuẩn Nếu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet thì đó

là vi khuẩn Gram dương, còn vi khuẩn có màu hồng của fucshin là vi khuẩn Gram

âm (Gs.Ts Cao Ngọc Điệp - PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương, 2012)

3.2.4 Tuyển chọn và nhận diện sơ bộ các dòng vi khuẩn phân giải lân mạnh

Mục đích: Tuyển chọn ra được 2 dòng vi khuẩn phân giải lân vô cơ hữu hiệu nhất

từ các dòng đã phân lập được

Phương pháp

Đánh giá hoạt tính phân giải lân vô cơ khó tan của các dòng vi khuẩn dựa nồng

độ P2O5 có trong dịch nuôi cấy Nồng độ P2O5càng cao thì lượng lân khó tan được hòa tan càng nhiều Người ta thường dùng thuốc thử Ascorbic- Amoniummoplydate- Potassium antymonyl tatrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩn phân giải bằng phương pháp xanh molipdate (Watanable and Olsen, 1965) để xác định nồng độ P2O5

Lân sau khi được hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với amoniummolybdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolybdate có màu vàng

H2PO4- + NH4++ MoO42++ 2H+  (NH4)3[P(MoO10)4] (màu vàng)

Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo+6 bị khử thành Mo+3 hay Mo+2 cho dung dịch

có màu xanh Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân hòa tan có trong huyền phù vi khuẩn điều kiện khử của môi trường Trong môi trường acid vừa phải nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định nồng độ lân ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ với hàm lượng P theo quy luật của Bir Lambeg

Các bước thực hiện

Chuẩn bị vi khuẩn gốc

▪ Chuẩn bị vi khuẩn gốc: Lấy một phần vi khuẩn đã được phân lập ròng cho vào ống nghiệm chứa NBRIP lỏng chứa Ca3(PO4)2, ủ lắc trong 3 ngày với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng

▪ Chủng 1ml vi khuẩn gốc vào bình tam giác 50ml chứa 20ml môi trường NBRIP lỏng ( Nautiyal, 1999), để trên máy lắc ở tốc độ 120 vòng/phút, 3 lần lặp lại (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007)

▪ Vào ngày nuôi thứ 5, 10 và 15 tiến hành lấy mẫu Lấy 2ml phần dịch trong xác định hàm lượng lân hòa tan bằng phương pháp Blue - molypden

Xác định hàm lượng lân hòa tan (Cao Ngọc Điệp, 2012)

▪ Dựng đường chuẩn P2O5: Có 6 ống nghiệm (20ml) được đánh dấu từ 0 tới 5 theo hàm lượng P2O5 có trong ống, tiếp tục thêm vào mỗi ống nghiệm các hóa chất theo bảng sau:

Bảng 4 – Thành phần của dãy đường chuẩn P 2 O 5

Các thành phần trong ống nghiệm sau đó được trộn đều trên máy vortex và để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng chờ phản ứng xảy ra Theo lý thuyết là nồng độ P2O5

càng cao thì màu dung dịch tạo thành càng đậm tức là các ống nghiệm sẽ đậm dần từ 0 đến 5

▪ Chuẩn bị mẫu để đo OD

Hút 2 ml mẫu ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và sử dụng phần dịch trong để tiến hành xác định hàm lượng lân trong mẫu bằng phương pháp Blue – molypden Cho vào ống nghiệm các hóa chất như sau:

Đo OD ở 6 ống nghiệm đường chuẩn trước,sau đó đo OD của mẫu

Giá trị OD của ống số 0 (không có P2O5, không có màu xanh) được coi là mẫu blank

và đưa giá trị về 0 rồi tiến hành đo các ống còn lại

Dùng các phần mềm thống kê chuyên dụng để vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn của P2O5