nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu nành

Do đó, đề tài “Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu nành” đã được thực hiện nhằm bước đầu nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu nành, đồng thời

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN

TỪ BÃ BIA VÀ BÃ ĐẬU NÀNH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN:

MSSV: 3113748 LỚP: VI SINH VẬT K37

CẦN THƠ, 12/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN

TỪ BÃ BIA VÀ BÃ ĐẬU NÀNH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN:

MSSV: 3113748 LỚP: VI SINH VẬT K37

CẦN THƠ, 12/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

Bùi Thị Minh Diệu Nguyễn Thanh Nhật Phương

DUYỆT CỦA BỘ MÔN

………

… ………

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày 01 tháng 12 năm 2014

TRƯỞNG BỘ MÔN

(ký tên)

LỜI CẢM ƠN



Chân thành cảm tạ!

Cô Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu, góp ý và truyền

đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành luận văn tốt

nghiệp

Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghê Sinh học đã truyền đạt

kiến thức trong suốt thời gian em học tập tại trường

Các anh chị, các bạn ở phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, đặc biệt là

anh Nguyễn Trung Duẩn đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình

thực hiện đề tài

Tập thể lớp Vi sinh vật khóa 37 đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ thông tin và tài

lệu trong quá trình học tập

Kính chúc Quý Thầy Cô, các anh chị và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành

công trong cuộc sống

Ngày 01 tháng 12 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thanh Nhật Phương

TÓM LƢỢC

Hiện nay ở Việt Nam bã bia và bã đậu nành thường được sử dụng làm thức ăn

thô cho gia súc hoặc phân bón nhưng hiệu suất sinh học còn thấp Bã bia và bã đậu

nành chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng (tinh bột, đường, acid amin…) thích hợp

cho sự phát triển của các vi sinh vật, đặc biệt là nấm men Do đó, đề tài “Nghiên cứu

sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu nành” đã được thực hiện nhằm

bước đầu nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu nành, đồng thời

nhân sinh khối tạo ra sản phẩm có chất lượng dinh dưỡng tốt hơn, mang lại hiệu quả

kinh tế cao nhờ sử dụng các phụ phế phẩm công nghiệp như bã bia và bã đậu nành

thô Các thí nghiệm đã được tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi

trường nuôi cấy (độ pha loãng bã bia và bã đậu nành, độ pH, nồng độ rỉ đường bổ

sung, mật số nấm men ban đầu và thời gian nuôi cấy nấm men) lên quá trình tăng sinh

khối của nấm men trên bã bia và bã đậu nành Mật số nấm men được xác định bằng

phương pháp đếm trực tiếp dưới kinh hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu Kết quả thí

nghiệm cho thấy, hàm lượng bã bia và bã đậu nành trong môi trường thích hợp cho sự

phát triển của nấm men là 25% Sinh khối nấm men tăng rõ rệt và khác biệt có ý nghĩa

thống kê ở pH 5 trong môi trường có bổ sung 4% rỉ đường Mật số nấm men ban đầu

thích hợp là 10 4

tế bào/ml và đạt 10 8 tế bào/ml sau 48 giờ nuôi cấy Nghiên cứu cho thấy tiềm năng sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces từ bã bia và bã đậu nành,

mở ra hướng sản xuất thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng từ nguồn phụ phế phẩm này

Từ khóa: bã bia, bã đậu nành, nấm men, Saccharomyces, sinh khối.

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CÁM ƠN

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Thành phần cấu tạo 5

2.1.4 Sinh trưởng và sinh sản 7

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng của nấm men 9

2.1.6 Quá trình trao đổi chất của nấm men 10

2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10

2.2 Bã bia 11

2.2.1 Tổng quan về bã bia 11

2.2.2 Thành phần hóa học 12

2.3 Bã đậu nành 14

2.4 Rỉ đường 16

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sinh khối nấm men 20

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 20

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Phương tiện nghiên cứu 22

3.1.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu 22

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị 22

3.1.3 Hóa chất 22

3.1.4 Vật liệu nghiên cứu 22

3.2 Phương pháp nghiên cứu 23

3.2.1 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm 23

3.2.2 Phân lập nấm men 25

3.2.3 Phương pháp xác định mật số nấm men 25

3.2.4 Qui trình thực hiện 25

3.2.5 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia và bã đậu nành đến khả năng tạo sinh khối nấm men 26

3.2.6 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng tạo sinh khối nấm men 26

3.2.7 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng tạo sinh khối nấm men 26

3.2.8 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và mật số tế bào ban đầu đến khả năng tạo sinh khối nấm men 28

3.3 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Phân lập nấm men 29

4.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia và bã đậu nành đến khả năng tạo sinh khối nấm men 29

4.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng tạo sinh khối nấm men 31

4.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng tạo sinh khối nấm men 33

4.5 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và mật số tế bào ban đầu đến khả năng tạo sinh khối nấm men 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2: Kết quả

Phụ lục 3: Kết quả thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 5

Bảng 2: Hàm lượng các amino acid, vitamin trong tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae 9

Bảng 3 Thành phần bã malt 12

Bảng 4 Thành phần trung bình của tro 13

Bảng 5 Thành phần hóa học của nấm men 13

Bảng 6 Giá trị thức ăn của mầm malt (trong 100 kg mầm malt) 14

Bảng 7 Thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành 15

Bảng 8 Thành phần các acid amin của bã đậu nành 15

Bảng 9 Thành phần các chất hóa học của bã đậu nành 16

Bảng 10 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía 16

Bảng 11: Thành phần chất hữu cơ của rỉ đường mía 18

Bảng 12 Kết quả đếm mật số ở thí nghiệm 1 PL2

Bảng 13 Kết quả đếm mật số ở thí nghiệm 2 PL2

Bảng 14 Kết quả đếm mật số ở thí nghiệm 3 PL2

Bảng 15 Kết quả đếm mật số ở thí nghiệm 4 PL2

Bảng 16 Mật số tế bào Saccharomyces trong 1 ml dung dịch ở các độ pha loãng bã bia

và bã đậu nành khác nhau bằng phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) PL3

Bảng 17 Mật số tế bào Saccharomyces trong 1 ml dung dịch ở các pH khác nhau bằng

phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) PL3

Bảng 18 Mật số tế bào Saccharomyces trong 1 ml dung dịch ở các nồng độ rỉ đường

bổ sung khác nhau bằng phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) PL3

Bảng 19 Mật số tế bào Saccharomyces trong 1 ml dung dịch ở các nghiệm thức thời

gian nuôi cấy và mật số nấm men ban đầu khác nhau bằng phương pháp đếm hồng cầu

(qui về giá trị logarit) PL3

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae 4

Hình 2 Cấu tạo nấm men Saccharomyces cerevisiae 6

Hình 3 Đường cong sinh trưởng của quần thể nấm men trong môi trường nuôi cấy 7

Hình 4 Quy trình thực hiện chung cho các thí nghiệm 25

Hình 5 Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia và bã đậu nành đến khả năng tạo sinh khối nấm men 29

Hình 6 Mật số tế bào Saccharomyces trong 72 giờ nuôi cấy ở các độ pha loãng bã bia và bã đậu nành 30

Hình 7 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối nấm men 31

Hình 8 Mật số tế bào Saccharomyces trong 72 giờ nuôi cấy ở các mức pH khác nhau 32

Hình 9 Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng tạo sinh khối nấm men 33

Hình 10 Mật số tế bào Saccharomyces trong 72 giờ nuôi cấy ở nồng độ rỉ đường bổ sung 34

Hình 11 Ảnh hưởng của mật số tế bào men giống đến khả năng tạo sinh khối nấm men theo thời gian 35

Hình 12 Mật số tế bào Saccharomyces ở thời điểm 36 giờ và 48 giờ nuôi cấy

ở các mật số tế bào khác nhau (qui về giá trị logarit) 36

Hình 13 Mật số tế bào Saccharomyces trong 1ml dung dịch sau 48 giờ ở các mật số tế bào khác nhau (qui về giá trị logarit) 35

Hình 14 Hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm PL1

Hình 15 Hình sinh khối nấm men PL1

Hình 16 Khuẩn lạc nấm men Sacchromyces PL1

Hình 17 Tế bào nấm men Saccharomyces dưới kính hiển vi độ phóng đại E40 PL1

Hình 18 Tế bài nấm men Sacchromyces dưới kính hiển vi độ phóng đại E100 PL1

Hình 19 Tế bài nấm men Sacchromyces trong môi trường bã bia và bã đậu nành ở các

thời điểm nuôi cấy dưới kính hiển vi độ phóng đại E40 PL1

TỪ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

YEPD Yeast Extract Peptone Dextrose

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Nấm men là một loài vi sinh vật công nghiệp lâu đời được con người sử dụng và

nghiên cứu, ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: công nghê thực phẩm, sinh hóa, công

nghệ lên men, công nghệ môi trường…

Nấm men là nguồn protein đơn bào có nhiều ưu thế hơn so với nguồn protein

truyền thống như đỗ tương, thịt và cá Nó không những giàu protein, thời gian tạo sinh

khối nhanh, liên tục, không phụ thuộc vào thời tiết khí hậu mà còn có thể phát triển

trên những nguyên liệu rẻ tiền như phụ phẩm của ngành mía đường, sản xuất bia, chế

biến tinh bột và hoa quả… Nấm men thô được sử dụng trước hết là nguồn protein

trong dinh dưỡng động vật, chủ yếu là trong chăn nuôi

Ngày nay công nghệ sản xuất và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát triển, sản

lượng bia được tạo ra với một số lượng lớn, kéo theo lượng bã bia thải ra cũng tăng

Một số các phụ phẩm được sản xuất gắn với sản xuất bia, bao gồm các loại bã bia ướt

hoặc khô và men bia khô Trong quá trình sản xuất và chế biến sữa đậu nành đã tạo ra

nguồn phụ phẩm là bã đậu nành, thành phần không hòa tan của hạt đậu nành với nước,

có màu trắng vàng nhạt và rất mịn Bã đậu nành được sử dụng rất nhiều trong các món

ăn truyền thống của Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc Bã bia và bã đậu nành chứa

rất nhiều thành phần dinh dưỡng (tinh bột, đường, acid amin, vitamin, calcium,

photpho, kali, sắt, kẽm,…) rất thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật trong đó

có nấm men Trong tế bào nấm men chứa rất nhiều các chất dinh dưỡng có giá trị nổi

bật như protein và vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm B Hàm lượng protein của

nấm men dao động trong khoảng từ 40 – 60 % vật chất khô tế bào Protein nấm men

gần giống protein có nguồn gốc từ động vật, chứa khoảng 20 acid amin, trong đó có đủ

các acid amin thiết yếu

Ở Việt Nam, hiện nay các nhà máy sản xuất bia và đậu nành vẫn chưa ứng dụng

bã bia, bã đậu nành thải ra một cách có hiệu quả mà chỉ dừng lại ở việc dùng làm thức

ăn thô cho gia súc hoặc làm phân bón và cho hiệu suất sinh học thấp Nghiên cứu ứng

dụng các kỹ thuật xử lý bã bia, bã đậu nành và kỹ thuật sản xuất các sản phẩm từ bã

bia, bã đậu nành sẽ mang lại hiệu quả kinh tế nhờ tận dụng hiệu quả các sản phẩm phụ

để tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Xuất phát từ những lý do trên, đề

tài“Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu nành”được đưa ra

nhằm bước đầu nghiên cứu ứng dụng sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu

nành

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định các mức độ thích hợp về tỉ lệ bã bia, bã đậu nành, độ pH, nồng độ rỉ

đường bổ sung mật số tế bào nấm men ban đầu trong môi trường nuôi cấy để nấm men

phát triển cho sinh khối cao

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces

2.1.1 Phân loại

Chi Saccharomyces có khoảng 40 loài (Van der Walt, 1970) và các loài trong chi

này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu,… chúng

hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, trái cây chín, phấn hóa…

Một số loài Saccharomyces phổ biến:

- Saccharomyces boulardi

- Saccharomyces cerevisiae

- Saccharomyces uvarum…

Trong đó, loại được con người sử dụng phổ biến là Saccharomyces cerevisiae

được dùng để sản xuất rượu vang, bánh mì và bia từ hàng nghìn năm trước

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Hình 1 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae

(Nguồn: http://microbewiki.kenyon.edu - ngày 22/2/2014)

Nấm men Saccharomyces có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6-8 µm x

5-6 µm Nấm men Saccharomyces có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ

5-14 µm, là loại nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, gồm có nấm men chìm và nấm

men nổi

Nấm men nổi: tế bào nấm men mẹ và con sau khi nảy chồi thường dính lại với

nhau tạo thành chuỗi tế bào nấm men Hình dạng chủ yếu là hình cầu hoặc ovan với

kích thước 7-10 µm Sự khác nhau giữa nấm men nổi và nấm men chìm là khả năng

lên men các loại đường trisacarit, ví dụ raffinose Trong nấm men chìm có enzyme có

thể sử dụng hoàn toàn đường raffinose trong khi đó nấm men nổi chỉ sử dụng được 1/3

đường sacarose Ngoài ra chúng còn khác nhau về khả năng hô hấp, khả năng trao đổi

chất khi lên men và khả năng hình thành bào tử Quá trình trao đổi chất của nấm men

chìm chủ yếu xảy ra trong quá trình lên men, còn của nấm men nổi xảy ra mạnh trong

quá trình hô hấp, vì vậy sinh khối nấm men nổi thu được nhiều hơn nấm men chìm

Nấm men chìm có nồng độ enzyme thấp hơn nấm men nổi Khả năng tạo bào tử của

nấm men chìm lâu hơn và hạn chế hơn nấm men nổi

Khuẩn lạc men thường có màu trắng hoặc màu kem khi được nuôi cấy trên môi

trường dinh dưỡng rắn Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước trong các

giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh, trừ khi đươc nuôi cấy trong

các môi trường dnh dưỡng tiêu chuẩn (Lương Đức Phẩm, 2006) Nếu môi trường giàu

dinh dưỡng, nấm men Saccharomyces có hình bầu dục, trong điều kiện yếm khí có

hình tròn và tế bào kéo dài hơn trong điều kiện hiếu khí

2.1.3 Thành phần cấu tạo

Nấm men Saccharomyces gồm những thành phần chủ yếu sau:

- Vách tế bào: chiếm 26-32 % trọng lượng khô của tế bào Có chứa protein, lipid

và ít nhất 2 loại polysaccharide, mannan, glucan và glycogen Glycogen trong vách tế

bào không có chức năng như thành phần cấu trúc Mannan liên kết với protein hiện

diện trong tế bào Vách tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài là màng nhẵn, dày 10-30 nm gồm

chủ yếu lipoprotein, lớp tiếp theo chứa phức hợp mannan protein dày 100nm, lớp trong

cùng dạng keo và sợi li ti dày 10-250 nm, cấu tạo từ những gốc glucan gồm 94%

glucose và 6% hexoamin (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000)

Bảng 1 Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces

(Nguồn: Klis Fras et al., 2006)

- Màng tế bào: nằm sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu là lipoprotein,

photpholipid, giữ vai trò điều hòa vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào

- Tế bào chất gồm có mạng lưới nội chất là vị trí của nhiều hệ thống enzyme

khác nhau, đảm bão sự vận chuyển vật chất cho tế bào và các cấu tử khác nhau như bộ

máy Golgi, lysosome, không bào Chứa các sản phẩm bị phân cắt hay chất độc lạ có

thể hại cho tế bào Năng lượng cung cấp cho tế bào qua những phản ứng xảy ra trong

ty thể cũng nằm trong tế bào chất Trong tế bào và các thành phần liên quan trong quá

trình sinh tổng hợp và sinh sản của tế bào Nhân nấm men có phần trên là trung thể và

centrochrometin, phần đáy của nhân có thêm không bào, bên trong chứa 6 cặp nhiễm

sắc thể (NST) và bên ngoài màng nhân có nhiều ty thể bám quanh Ngoài ra còn có hạt

glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào

- Nhân: được bao bọc một lớp màng, bên trong là dịch nhân và hạch nhân Nhân

chưa protein và acid nucleic Trong trạng thái lên men, nhân tang từ 20 đến 30 lần so

với trạng thái hô hấp Nhân của Saccharomyces chứa 17 cặp nhiễm sắc thể DNA

trong tế bào có khối lượng phân tử là 1x1010 Da (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)

- Không bào: không bào thường xuất hiện lúc tế bào nấm men bị già Trong

không bào chứa các enzyme thủy phân, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung

gian Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hòa áp suất

thẩm thấu của tế bào (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007)

- Ty thể: có vai trò như nhà máy cung cấp năng lượng cho tế bào

Hình 2 Cấu tạo nấm men Saccharomyces cerevisiae

(Nguồn: http://icfood.vn - ngày 27/6/2014)

Nấm men được sử dụng để tạo ra men chiết xuất được sử dụng như là một chất

điều vị trong chế biến thực phẩm hay làm thành phần cung cấp nguồn nitơ và các chất

kích thích sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy vi sinh Men chiết xuất gồm các sản

phẩm có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao như dịch chiết nấm men (yeast extract), dịch

tự phân nấm men (yeast autolysate), dịch vách tế bào nấm men (yeast cell wall), hay

dịch chiết nấm men chứa nucleotide tự nhiên

2.1.4 Sinh trưởng và sinh sản

- Sinh trưởng

Cũng như các vi sinh vật khác, quá trình sinh trưởng của nấm men gồm pha: pha

tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy vong

Hình 3 Đường cong sinh trưởng của quần thể nấm men trong môi trường nuôi

cấy

(Nguồn: http://www.doko.vn - ngày 28/6/2014)

+ Pha lag (pha tiềm phát)

Trong pha tiềm phát nấm men hầu như không sinh sản do nấm men còn thích

nghi với môi trường mới, trong đó, một số tế bào bị ức chế, thâm chí có thể bị chết Số

lượng nấm men trong giai đoạn này không tang hoặc tang không đáng kể nhưng sự

trao đổi chất của chúng diễn ra mạnh mẽ Tế bào có kích thước tăng đáng kể, hàm

lượng protein, acid nucleic đều tặng lên Các enzyme thích ứng cũng được tổng hợp

mạnh mẽ

+ Pha logarit (pha log)

Trong pha này nấm men sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa Kích thước của

tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý,… nói chung không thay đổi theo thời

gian Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là ―những tế bào tiêu chuẩn‖

+ Pha ổn định (pha cân bằng)

Trong pha này quần thể nấm men ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới

được sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi Kết quả là số tế bào sống không tang cũng

không giảm

+ Pha suy vong

Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa (mặc dù số

lượng tế bào tổng cộng có thể giảm) Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzyme

của bãn thân Thực ra chưa có một qui luật chung cho pha suy vong Sự chết của tế

bào có thể nhanh hay chậm và có liên quan đến quá trình tự phân Khả năng kết lắng

của nấm men có vai trò rất quan trọng Men chìm kết lắng ở dạng bông dưới đáy các

thùng lên men còn men nổi thì nổi lên bề mặt dịch lên men Tốc độ lên men tùy thuộc

vào nhiều yếu tố: khả năng lên men của nấm men, hoạt tính sinh lý và số lượng tế bào

của chúng torng môi trường phụ thuộc vào nhiệt độ, pH, thành phần hóa học của dịch

lên men… Ngoài ra còn phụ thuộc vào hàm lượng các chất protein trong tế bào nấm

men

- Sinh sản

Men có thể sinh sản vô tính thông qua mọc chồi hoặc hữu tính thông qua sự hình

thành của nang bào tử Trong quá trình sinh sản vô tính, chồi mới phát triển từ men mẹ

khi các điều kiện thích hợp và sau đó, khi chồi đạt tới kích thước của men trưởng

thành thì nó tách ra khỏi men mẹ Khi các điều kiện dinh dưỡng kém, men có khả năng

sinh sản hữu tính sẽ tạo ra các nang bào tử

+ Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính ở nấm men thường gặp nhất là nẩy chồi, khi

một chồi hoàn chỉnh sẽ phát triển ngay, ở đó chồi sẽ nối liền với tế bào mẹ và khi chòi

rời ra tế bào mẹ gọi là điểm sinh sản

+ Sinh sản hữu tính: Nấm men không sinh ra các cơ quan sinh dục mà chúng sinh

ra 2 tế bào dinh dưỡng có nhiệm vụ giống như các giao tử Quá trình hợp tế bào chất

và hợp nhân xảy ra và thành lập tế bào nhị bội, nang và cuối cùng là bảo tử nang thành

lập trong nang Số bào tử nang tùy thuộc vào số lần phân chia nhân nhưng thường là 8,

bảo tử nang được giải phóng, nẩy mầm để hình thành tế bào dinh dưỡng mới từ đây

chúng sinh sản vô tính bằng sự nẩy chồi hay phân đôi

2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của nấm men

Nấm men rất giàu chất đạm, chất khoáng, chất xơ, sinh tố và khoáng chất Ngoài

ra, nấm men còn chứa các polysaccharic (mannan, glucan), sterol (ergosterol,

zymosterol) có giá trị cao Ngoài việc cung cấp nhiều dưỡng chất bổ dưỡng, người ta

còn dung men tươi, men khô (còn sống) để uống, giúp điều hòa môi trường ruột, trị

nhiều bệnh rối loạn tiêu hóa, biến dưỡng đường ruột Nấm men thường được dùng để

trị tiêu chảy, giúp ăn ngon miệng, mún trứng cá và là nguồn cung cấp vitamin B

Trong nấm men có một số enzyme tiêu hóa (amylase, protease…) và vitamin (đặc biệt

là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất, kích thích tăng trưởng Tuy nhiên,

sinh khối tế bào nấm men có nhược điểm là mặc dù hàm lượng protein cao khoảng 55

– 60%, nhưng đồng thời nó cũng chứa lượng acid nucleic quá cao (10%), điều này ảnh

hưởng đến sức khỏe con người Do đó, cần có các biện pháp làm giảm lượng acid

nucleic này Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững chắc nên cần có biện pháp thích

hợp để phá vỡ màng khi thu protein

Bảng 2: Hàm lƣợng các amino acid, vitamin trong tế bào nấm men

Alanine 8,7 Vitamin B5 2 - 19

Proline 2,0 Vitamin B6 14 - 39

Tyrosine 2,8

(Nguồn: Lương Đức Phẩm et al., 2006)

2.1.6 Quá trình trao đổi chất của nấm men

Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm 2 giai đoạn

Chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào Chuỗi các phản ứng hóa học, biến

đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp chất liệu tế bào Môi trường dinh dưỡng chứa những

thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau Các chất không điện tích như đường

saccharose, rượu acid hữu cơ, amino acid xâm nhập qua màng tế bào bằng cách

khuếch tán hay vận chuyển thụ động, do sự khác nhau về nồng độ các chất này giữa tế

bào vào môi trường Các chất điện tích trong dung dịch như muối KCl, Mg, Ca và các

kim loại khác có thể vào tế bào thụ động theo thang nồng độ hay vận động ngược lại

thang nồng độ (vận chuyển hoạt động) Ngoài nguồn hydratcarbon và nguồn nitơ hoặc

vô cơ hoặc hữu cơ, nấm men còn sử dụng các nguyên tố vi lượng như K, Ca, Na, Mg

có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng nấm men Riêng Na có ý nghĩa quan trọng

trong sự tăng trưởng tế bào nấm men Ion natri là thành phần duy nhất di chuyển vào

tế bào bằng cả 2 cơ chế: thụ động và hoạt động và khi nó thâm nhập vào tế bào nấm

men, mang theo cả saccharose, amino acid, ngay cả khi không có sự chênh lệch nồng

độ các chất này giữa tế bào và môi trường

2.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

a Nồng độ dịch đường

Nấm men có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích

hợp từ 10% - 18%, nồng độ đường quá cao sẽ dẫn tới tăng áp suất và làm mất cân

bằng trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả là cồn nhiều sẽ ức chế không những tạp

khuẩn mà cả nấm men, dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men Ngược lại,

nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất lên men Ở các

nồng độ dịch đường khác nhau tương ứng với thời gian tiến vào pha log cũng khác

nhau Điều này cho thấy rằng nồng độ glucose có tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng

và phát triển của nấm men từ khi bắt đầu quá trình lên men cho đến khi kết thúc quá

trình (Lương Đức Phẩm, 2006)

b pH

Quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản của nấm men chịu ảnh hưởng mạnh

mẽ bởi pH của môi trường nuôi cấy, nếu pH thích hợp sẽ tạo ra điều kiện thuận lợi cho

nấm men phát triển và sinh sản, nếu pH ở ngoài ngưỡng giới hạn sẽ kìm hãm sự phát

triển của nấm men (Nguyễn Lân Dũng, 2000) Nấm men có thể phát triển trong môi

trường có chỉ số pH từ 2-8 nhưng thích hợp nhất là 4-5,5 Nồng độ ion H+ có khả năng

làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu

các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men

c Thời gian

Phụ thuộc vào giống vi sinh vật, dạng sản phẩm cần thu nhận và nhiều yếu tố

khác (mật số nấm men ban đầu, độ pH, nồng độ dịch dường, nồng độ ethanol…) Khi

thu nhận các sản phẩm trao đổi chất như acid amin, acid hữu cơ, dung môi hữu cơ,

enzyme hay thu sinh khối….thời gian lên men thường kéo dài từ 1 đến 3 ngày Ngược

lại, đối với nhóm thực phẩm lên men, thời gian lên men và tàng trữ có thể kéo dài hàng

tuần, hàng tháng và thậm chí hàng năm

Bên cạnh các yếu tố về môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm

men, mật số và chất lượng men giống cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến

hiệu quả của quá trình nuôi cấy (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000)

2.2 Bã bia

2.2.1 Tổng quan về bã bia

Một số các phụ phẩm được sản xuất gắn với sản xuất bia, bao gồm các loại bã bia

ướt hoặc khô Thành phần dinh dưỡng của vật liệu sẽ khác nhau tùy thuộc vào loại

chất nền được sử dụng Nhà máy bia cho ra phụ phẩm là bã bia ướt Bã bia ướt cần

phải được sử dụng trong thời gian ngắn vì chúng có chứa một lượng lớn nước

(75-80%) và vận chuyển có thể tốn kém Trong ngành chăn nuôi, mầm malt được sử dụng

làm thức ăn gia súc vì hạm lượng chất dinh dưỡng trong mầm malt rất cao Trong công

nghiệp thực phẩm, mầm malt được dùng để sản xuất acid lactic và làm nguồn cung cấp

nitơ cho quá trình sản xuất từ rỉ đường Ngoài ra do trong mầm malt còn có các

enzyme khác nhau nên mầm malt có khả năng thúc đẩu sự lên men của dịch đường

Do đó, mầm malt là nguyên liệu rất tốt để điều chế các chế phẩm enzyme như

protease

2.2.2 Thành phần hóa học

Bã malt được tạo ra trong quá trình dịch hóa và lọc dịch đường Trong quá trình

dịch hóa, dưới tác dụng của enzyme amylase protease và các men khác thì 65 – 70%

vật chất khô của malt sẽ chuyển vào dịch sau khi lọc, phần còn lại nằm ở trong bã

malt Tùy thuộc vào phương pháp tách mà độ ẩm của bã dao động từ 75 – 85% Với độ

ẩm này thì bã malt được dùng làm thức ăn gia súc Bã malt tươi thường có dạng sền

sệt, có màu nâu, vị ngọt và mùi mạch nha

Bảng 4 Thành phần trung bình của tro

Bảng 6 Giá trị thức ăn của mầm malt (trong 100 kg mầm malt)

Bã đậu nành là phần thừa sau quá trình làm sữa đậu nành hoặc đậu hũ, có thể sử

dụng như một chất bổ sung cho các thực phẩm nhằm tăng cường hàm lượng chất xơ và

làm giảm năng lượng của thực phẩm như trong bánh biscuit hoặc snack… Với giá

nguyên liệu rẻ, có giá trị dinh dưỡng cao, bã đậu nành nếu được xử lý hợp lý không

những là nguồn bổ sung các chất dinh dưỡng quý (đặc biệt là chất xơ) cho các loại

thực phẩm khác nhau, mà còn giúp sản phẩm có giá thành rẻ hơn so với một số sản

phẩm thực phẩm sử dụng nguyên liệu là các loại bột mì

Bã đậu nành là sản phẩm còn lại sau khi giải nén hầu hết các dầu từ đậu tương

toàn bộ Dầu có thể được loại bỏ bằng cách chiết xuất dung môi hoặc bởi một quá

trình ép, trong đó đậu được đun nóng và ép Bã đậu nành cung cấp chất đạm, năng

lượng và là một loại thức ăn gia súc ngon miệng và có thể được sử dụng như là bổ

sung protein quan trọng trong khẩu phần ăn cho bò sữa

Bảng 7 Thành phần dinh dƣỡng của bã đậu nành

Chất xơ không hòa tan trong acid 9,5

Chiết xuất nitơ tự do 15,5

(Nguồn: Krasucki & Grela, 2004)

Bảng 8 Thành phần các acid amin của bã đậu nành

Bảng 9 Thành phần các chất hóa học của bã đậu nành

Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của

quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế

nữa bới các công nghệ thông thường Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản

xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường Mía được trồng ở các nước nhiệt

đới (châu Á và Nam Mỹ), còn củ cải đường có nguồn gốc ở các vùng ôn đới (Châu Âu

và Bắc Mỹ)

Thành phần chính của rỉ đường là đường, chủ yếu là sucroza với một ít glucose

và fructose Thành phần chính xác của rỉ đường rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào

điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết-khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như

quy trình sản xuất đường trong từng nhà máy Do vậy rỉ đường thay đổi đáng kể về

thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và độ nhớt Bảng 10 cho thấy biến động của

(Nguồn: Wolfrom và Binkley 1953)

Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường thường được chia thành 3 phần: đường, chất

hữu cơ không đường và chất khoáng Ở đường, các loại gluxit hoà tan (đường đôi và

đường đơn) là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó sucrose là chủ yếu

(bảng 2) Rỉ đường mía có đặc điểm là có tỷ lệ đưởng khử tương đối cao Trong chu

trình kết tinh các loại đường khử tăng lên tới mức mà sucrose không thể kết tinh được

nữa bởi vì đường khử làm giảm khả năng hoà tan của sucrose Các chất khoáng có xu

hương giữ sucrose trong dung dịch, cho nên cân bằng giữa đường khử và chất khoáng

sẽ quyết định sản lượng sucrose lý thuyết có từ cây mía Phần sirô còn lại thường được

coi là rỉ đường Tồng lượng đường trong rỉ đường củ cải đường thường thấp hơn trong

rỉ đường mía, nhưng lại chứa hầu như toàn bộ là sucrose

Bảng 11: Thành phần chất hữu cơ của rỉ đường mía

(Nguồn: Sreg và Van de Meer 1985)

Các chất hữu cơ không phải là đường của rỉ đường quyết định nhiều tính chất vật

lý cuả nó, đặc biệt là độ nhớt dính Nó bao gồm chủ yếu là các loại gluxit như tinh bột,

các hợp chất chứa N và các acid hữu cơ Nói chung hàm lượng các chất hữu cơ không

phải là đường của rỉ đường củ cải đường cao hơn là rỉ đường mía Trong rỉ đường

không chứa xơ và lipit Tỷ lệ protein thô trong rỉ đường mía tiêu chuẩn là rất thấp

(3-5%) Trong rỉ đường mía còn có một lượng đáng kể các acid hữu cơ, trong đó chủ yếu

là acid acotinic Rỉ đường cũng chứa một lượng acid béo bay hơi, trung bình khoảng

1,3%

Rỉ đường là một nguồn giàu khoáng So với các nguồn thức ăn năng lượng thông

dụng khác như hạt ngũ cốc thì hàm lượng Ca trong rỉ đường mía cao (tới 1%), trong

khi đó thì hàm lượng P lại thấp Rỉ đường mía giàu Na, K Mg và S Rỉ đường cũng

chứa một lượng đáng kể các nguyên tố vi lượng như Cu (7 ppm), Zn (10 ppm), Fe

(200 ppm), Mn (200 ppm)

Rỉ đường trên thế giới được dùng chủ yếu (trên 50%) làm thức ăn cho gia súc Rỉ

đường còn được dụng như một chất bổ sung trong sản xuất thức ăn ủ xanh Ngoài ra, rỉ

đường cũng được dùng để lên men tạo ra các sản phẩm như cồn ethanol, nấm men,

acid amin và acid xitric cũng như được dùng trong ngành sản xuất gạch ngói

Rỉ đường đã được dung làm thức ăn cho gia súc và gia cầm từ thế kỷ thứ 19 Vào

thời đó, người ta dùng rỉ đường như là một nguồn năng lượng và còn là như một chất

hút bụi Hạn chế bụi có tầm quan trọng lớn bởi vì gia súc rất dễ bị các bệnh về phổi do

bụi gây ra, đồng thời bụi cũng là một vấn đề đối với người chăn nuôi Bụi cũng làm

tăng thức ăn thừa Tài liệu cho thấy rằng 10% rỉ đường thực tế có thể loại trừ được

toàn bộ bụi và 30% thì loại trừ được các tiểu phần mịn

Châu Âu và Mỹ là hai thị trường tiêu thụ rỉ đường chủ yếu của thế giới để làm

thức ăn gia súc Rỉ đường đã được sử dụng để nuôi gia súc (cả nhai lại và dạ dày đơn)

ở nhiều nước nhiệt đới (Preston và Leng, 1986) Trước đây rỉ đường thường được

dùng cho gia súc ăn ở mức tương đối thấp trong khẩu phần (thường dưới 20% khẩu

phần) Tuy nhiên, gần đầy các nghiên cứu ở Cuba cho thấy rằng rỉ đường có thể dung

như một loại thức ăn thay thế cho ngũ cốc như là một giải pháp cho việc thâm canh

chăn nuôi ở vùng nhiệt đới

Rỉ đường có thể được cho gia súc ăn theo một số cách khác nhau như trộn rỉ

đường với các thức ăn khác, tảng liếm rỉ đường, rỉ đường hoà loãng để cung cấp năng

lượng trực tiếp hay dùng như là một chất mang cho các chất chứa Nitơ, vitamin,

khoáng và cả thuốc thú y

Theo Harland (1995) những ưu điểm chính của việc dung rỉ đường làm thức ăn

gồm:

- Tăng mật độ năng lượng

- Tăng tính ngon miệng

- Giảm bụi bặm

- Tăng chuyển hoá nên giảm chi phí thức ăn

- Cải thiệt chất lượng (vật lý) của sản phẩm

- Bao bọc các thành phần thức ăn kém ngon miệng

- Giá rẻ

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất sinh khối nấm men

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Con người đã hiểu biết về nấm men và những tính chất của nó khoảng 150 năm

trở lại đây Đến đầu thế kỷ XIX, nấm men bia, nấm men thải ra từ nhà máy sản xuất

bia đã được con người áp dụng vào sản xuất bánh mì Cuối thế kỷ XIX, nhiều cải tiến

kỹ thuật như hệ thống thông khí (nước Anh), kỹ thuật ly tâm tách men ra khỏi môi

trường (nước Mỹ) đã dùng để sản xuất men bánh mì

Năm 1878, L Pasteur nghiên cứu ảnh hưởng của oxy đến sự phát triển của nấm

men Kết quả cho thấy khi có mặt oxy hiệu suất thu nhận nấm men rất cao Khó khăn

nhất trong việc cung cấp oxy cho quá trình lên men ở giai đoạn này là môi trường

nhão, rất khó cho oxy phân tán đều môi trường Năm 1886, người châu Âu thay đổi

môi trường thành dung dịch nước đường và bổ sung bột lúa mì

Cùng khoảng thời gian đó Jonathan R Mielenz, John S Bardsley, Charles E

Wyman đã đưa ra kết luận nấm men Saccharomyces cerevisiae có thể tăng sinh khối

và chuyển hóa carbohydrate thành ethanol trên cơ chất là vỏ đậu nành Kết quả cho

thấy hàm lượng các acid amin thiết yếu tăng hơn so với ban đầu, có khả năng được sử

dụng trong thức ăn chăn nuôi

Gary M Hawkins và Joy Doran-Peterson đã sử dụng chủng Saccharomyces

cerevisiae với mật số giống ban đầu là 105 tế bào/ml để thí nghiệm sự tăng trưởng và

khả năng lên men ở nồng độ cơ chất cao và có sự hiện diện của hợp chất ức chế

Yan Lin, Wei Zhang, Chunjie Li, Kei Sakakibara, Shuzo Tanaka, Hainan Kong

(2012) nghiên cứu độ pH ảnh hưởng đến quá trình lên men của giống Saccharomyces

cerevisiae đưa ra kết quả rằng pH từ 4 – 5,5 là tốt nhất cho hoạt động của nấm men

Érika Durão Vieira, Maria da Graça Stupiello Andrietta, và Silvio Roberto

Andrietta (2013) sử dụng giống Saccharomyces cerevisiae để làm sinh khối cho kết

quả sau 16 giờ sinh khối nấm men đã tăng gấp 100 lần

Ngày nay, với sự hiểu biết về vi sinh vật học, con người đã phần nào giải thích

được quá trình lên men và tăng sinh Nấm men Saccharomyces được sử dụng nhiều

nhất trong công nghiệp sản xuất bia, cùng với đó là khả năng phát triển nhanh, do đó

được sử dụng rộng rãi để làm thức ăn gia súc, giàu chất dinh dưỡng hay đưa vào làm

thực phẩm chức năng

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, nước ta chưa nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces

trên bã bia và bã đậu nành Bã bia và bã đậu nành là phế phẩm của các công ty sản

xuất bia và sữa đậu nành, dễ tìm

Nấm men Saccharomyces có khả năng sinh trưởng trên môi trường rỉ đường, đạt

mật số cao nhất khoảng từ 36-48 giờ, sinh khối nấm men tăng 95 lần so với mật số ban

đầu (Võ Thị Trúc Giang, 2012)

Theo Dương Ánh Nguyệt (2012) có thể sản xuất sinh khối nấm men

Saccharomyces trên môi trường rỉ đường mía với nồng độ đường 6%, pH 4,5, có bổ

sung 0,15g ure, 0,15g DAP nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (30 – 33oC) trong 3

ngày

Bã bia và bã đậu nành là một nguồn nguyên liệu rẻ, dễ tìm, chất mang an toàn,

hiệu suất sinh học cao, khả năng tái sử dụng nhiều lần và không ô nhiễm môi trường

Do đó việc ứng dụng sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia và bã đậu nành để làm thức

ăn gia súc có tiềm năng phát triển ở nước ta

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014 tại phòng thí nghiệm

Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học,

Trường Đại học Cần Thơ

- Giấy nhôm, kẹp, kéo

- Tủ cấy vô trùng Telstar (Spain)

- Nồi khử trùng Pbi (Italia)

- Lò vi sóng (Panasonic)

- Tủ ủ Binder (Germany)

- Máy ly tâm (Hermle)

- Máy vortex (Italia)

- Cân điệm tử (USA)

- Kính hiển vi Olympus (Japan)

3.1.4 Vật liệu nghiên cứu

- Chủng nấm men Saccharomyces phân lập từ men bia của nhà máy sản xuất bia

trường Đại học Cần Thơ

- Bã bia được thu ngay sau quá trình lọc bã malt tại Công ty Cổ phần Bia Phong

Dinh, Thành phố Cần Thơ sau đó trữ lạnh ở 0oC

- Bã đậu nành thu tại cơ sở sản xuất sữa đậu nành thuộc thành phố Cần Thơ

- Rỉ đường thu tại công ty CASUCO Hậu Giang

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm

a Chuẩn bị giống nấm men

Nấm men được nuôi trên môi trường YEPD đặc sau đó cấy nấm men sang môi

trường YEPD lỏng nuôi trong bình tam giác trong 3 ngày Đếm mật số nấm men bằng

buồng đếm hồng cầu

b Chuẩn bị môi trường bã bia và bã đậu nành

Bã bia và bã đậu nành sấy khô ở 105oC sau đó nghiền thành dạng bột mịn Bã bia

và bã đậu nành phối trộn theo tỉ lệ 1:1, pha loãng với nước cất, lọc qua vải thu 30 ml

dung dịch và bổ sung rỉ đường theo tỉ lệ được bố trí trong các thí nghiệm Khử trùng ở

121oC trong 20 phút

3.2.2 Phân lập nấm men

- Mục đích: Phân lập được dòng nấm men có trong mẫu đã chọn

- Phương pháp tiến hành:

+ Thu mẫu: Mẫu men bia từ nhà máy sản xuất bia trường Đại học Cần Thơ

+ Nuôi tăng sinh:

Pha môi trường nuôi tăng sinh với thành phần môi trường gồm:

+ Để nguội môi trường

+ Cho vào mỗi bình tam giác 100ml môi trường đã khử trùng (thực hiện trong

tủ cấy vô trùng)

+ Cho mẫu vào môi trường (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

+ Ủ lắc 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

+ Khử trùng môi trường, đĩa petri, ống nước cất pha loãng trong nồi khử trùng

nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút

+ Đổ môi trường vào đĩa petri (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

+ Pha loãng mẫu đã nuôi tăng sinh ở 4 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 (thực hiện

trong tủ cấy vô trùng)

+ Rút 10 µl dung dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường (thực

hiện trong tủ cấy vô trùng)

+ Tiến hành trải mẫu (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

Trong 1000 ml môi trường

Trong 1000 ml môi trường

+ Úp ngược đĩa và cho vào tủ ủ ở 30oC trong 24 giờ

Tiến hành cấy chuyển nhiều lần đến khi ròng

Kiểm tra hình thái tế bào nấm men dưới kính hiển vi

Kiểm tra khả năng lên men đường trong ống Durham

3.2.3 Phương pháp xác định mật số nấm men

Mật số tế bào của huyền phù mẫu được tính theo công thức:

N = (a/0,016) x 103 x hệ số pha loãng

Trong đó: N là số tế bào trong 1ml

a là số tế bào đếm được trong 4 ô lớn

3.2.4 Quy trình thực hiện

Hình 4 Quy trình thực hiện chung cho các thí nghiệm

Bã bia và bã đậu nành

Xay nhuyễn

Pha loãng với nước cất

Nuôi trên môi trường

3.2.5 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia và bã đậu nành đến

khả năng tạo sinh khối nấm men

Mục đích thí nghiệm: Chọn được độ pha loãng bã bia và bã đậu nành thích hợp

cho sự phát triển và tăng sinh khối của nấm men trong thời gian ngắn, hiệu quả cao

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm

thức là bã bia và bã đậu nành được pha loãng với nước cất theo 5 mức khác nhau, mỗi

nghiệm thức 3 lần lặp lại Tổng cộng có 15 đơn vị thí nghiệm

Nghiệm thức 1: bã bia và bã đậu nành 10%

Nghiệm thức 2: bã bia và bã đậu nành 15%

Nghiệm thức 3: bã bia và bã đậu nành 20%

Nghiệm thức 4: bã bia và bã đậu nành 25%

Nghiệm thức 5: bã bia và bã đậu nành 30%

Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1 Chủng 0,3

ml dung dịch nấm men giống đã chuẩn bị có mật số 6,2x105 tế bào/ml Lắc ủ 120

Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm

thức gồm 5 mức pH, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tổng cộng có 15 đơn vị thí

nghiệm

Nghiệm thức 1: pH = 3

Nghiệm thức 2: pH = 4

Nghiệm thức 3: pH = 5

Nghiệm thức 4: pH = 6

Nghiệm thức 5: pH = 7

Cách thức tiến hành: thao tác được thực hiện như đã trình bày ở mục 3.2.1 Độ

pha loãng bã bia và bã đậu nành 25% Chủng 0,3ml nấm men giống có mật số 5,1x105

tế bào/ml

Chỉ tiêu theo dõi: mật số nấm men sau mỗi khoảng 12 giờ và kết thúc sau 72 giờ

ủ

3.2.5 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng

tạo sinh khối nấm men

Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ rỉ đường bổ sung thích hợp cho sự phát triển

của nấm men

Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm

thức gồm 4 mức rỉ đường bổ sung và nghiệm thức đối chứng không bổ sung rỉ đường,

mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tổng cộng có 15 đơn vị thí nghiệm

Nghiệm thức 1: Không bổ sung rỉ đường

Nghiệm thức 2: Bổ sung rỉ đường 2%

Nghiệm thức 3: Bổ sung rỉ đường 4%

Nghiệm thức 4: Bổ sung rỉ đường 6%

Nghiệm thức 5: Bổ sung rỉ đường 8%

Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1 Độ pha

loãng bã bia và bã đậu nành, thời gian nuôi cấy, mật số tế bào ban đầu được chọn lựa

từ thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 Chủng nấm men giống có mật số 3,6x105 tế bào/ml

Chỉ tiêu theo dõi: mật số nấm men sau mỗi khoảng 12 giờ và kết thúc sau 72 giờ

ủ

3.2.6 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và mật số tế bào ban

đầu đến khả năng tạo sinh khối nấm men

Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian nuôi cấy và mật số tế bào ban đầu thích

hợp cho sự phát triển của nấm men

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố

- Thời gian nuôi cấy (giờ): 12, 24, 36, 48, 60 và 72

- Mật số tế bào ban đầu (tế bào/ml): 100, 102, 104, 106

- Tổng số nghiệm thức: 6 x 4 = 24 Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, tổng cộng có

72 đơn vị thí nghiệm

Cách thức tiến hành: Thực hiện thao tác như đã trình bày ở mục 3.2.1 Độ pha

loãng bã bia và bã đậu nành 25% Chủng nấm men giống theo các nghiệm thức, lắc ủ

120 vòng/phút ở 30oC và đếm mật số ở các mốc thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48

giờ, 60 giờ và 72 giờ

Chỉ tiêu theo dõi: mật số nấm men sau mỗi khoảng 12 giờ và kết thúc sau 72 giờ

ủ

3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu trung bình được xử lý bằng phần mềm Excel Dùng phần mềm Minitab

kiểm tra phương sai và so sánh trung bình các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập nấm men

Chủng nấm men Saccharomyces trong men bia của nhà máy sản xuất bia trường

Đại học Cần Thơ được phân lập trên môi trường thạch YEPD

Mô tả khuẩn lạc: tròn đều, màu trắng sữa, bìa nguyên, mô nổi, bề mặt nhẵn bóng,

kích thước đường kính 3-4 mm

Tế bào hình elip, hình dạng gần giống hình trụ, vách tế bào dày Sinh sản vô tính

bằng cách nảy chồi, chồi thường xuất hiện ở một đầu của tế bào nấm men Tế bào

riêng rẻ, không kết chùm

Khả năng lên men đường trong ống Durham dương tính sau 12 giờ

4.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia và bã đậu nành đến khả

năng tạo sinh khối nấm men

Bã bia và bã đậu nành được pha loãng để đạt mức nồng độ theo các nghiệm thức

là 10%, 15%, 20%, 25% và 30% Chủng 0,3ml dung dịch nấm men giống đã chuẩn bị

có mật số 6,2x105 tế bào/ml

Hình 5 Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia và bã đậu nành

đến khả năng tạo sinh khối nấm men