phân lập và tuyển chọn nấm men tạo sinh khối cao trên rỉ đường

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn đã xác định được điều kiện thích hợp cho quá trình sản xuất sinh khối của dòng nấm men này là: n

y

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP: VSV K37

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP: VSV K37

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

Bùi Thị Minh Diệu Tô Hải Bình

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

… ………

…… ………

……… ………

…………

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM ƠN

-* -

Hoàn thành luận văn là một phần quan trong đánh giá quá trình học tập và nghiên cứu tại Viện Nghiên Cứu & Phát Triển Công Nghê Sinh Học Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự hỗ trợ, động viên từ gia đình, thầy cô, các anh chị hướng dẫn và bạn bè Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

- Cô Bùi Thị Minh Diệu và anh Nguyễn Trung Duẩn (lớp VSV K36) đã tận tình hướng dẫn tôi về kiến thức, kỹ năng cũng như động viên tinh thần giúp tôi hoàn thành luận văn

- Các thầy cô, anh chị hướng dẫn và các bạn trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử thực vật Viện NC & PT CNSH đã tận tình hỗ trợ và hướng dẫn trang thiết bị trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn

- Các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 3 năm học

- Anh Nguyễn Quang Vinh và các bạn: Phan Hoàng Việt Khoa, Nguyễn Thanh Nhật Phương, Trần Âu Khánh Ngân và Lâm Phước Thịnh đã giúp tôi hoàn thành các chỉ tiêu trong luận văn

- Các thầy cô, anh chị cao học, bạn sinh viên học tập tại Viện NC & PT CNSH đã thăm hỏi và động viên tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

- Thầy Trần Nguyên Tuấn và gia đình là chỗ dựa tinh thần vững chắc cũng là nguồn động viên lớn nhất, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong hoạt động và học tập giúp tôi hoàn thành luận văn cũng như các nhiệm vụ khác

Tôi xin chân thành cảm ơn Chúc mọi người sức khỏe, công tác và học tập tốt

Cần Thơ, ngày 15 tháng 11 năm 2014

Tô Hải Bình

TÓM LƢỢC

Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt chúng có nhiều ở nho và các hoa quả khác Từ lâu, người ta đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu bia, các dạng đồ uống khác Ngày nay, sinh khối nấm men được sử dụng sản xuất các thực phẩm, chế phẩm sinh học ứng dụng trong công nghiệp Do đó, nhu cầu về các dòng nấm men cho sinh khối cao ngày càng tăng Nấm men là loại vi sinh vật có khả năng phát triển trên những nguyên liệu, phế phẩm rẻ tiền như rỉ đường Rỉ đường là một phụ phẩm có khối lượng rất lớn từ ngành công nghiệp mía đường Đề tài được tiến hành nhằm phân lập và tuyển chọn nấm men từ các dòng nguồn khác nhau có thể phát triển trên môi trường rỉ đường Kết quả đã phận lập được 13 dòng nấm men Trong số đó, dòng KH2 có khả năng tạo sinh khối tốt nhất (0,59 gram/100mL)

và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn đã xác định được điều kiện thích hợp cho quá trình sản xuất sinh khối của dòng nấm men này là: nồng độ môi trường rỉ đường 20%, độ pH môi trường = 5 với mật số ban đầu là 10 5

tế bào/mL và thời gian nuôi cấy là 48 giờ

Từ khóa: nấm men, rỉ đường, sinh khối

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM ƠN

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Nấm men 3

2.1.1 Đặc điểm nấm men 3

2.1.2 Hình dạng và kích thước 3

a) Hình dạng tế bào nấm men 3

b) Kích thước tế bào nấm men 4

2.1.3 Cấu tạo tế bào nấm men 4

2.1.4 Sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của nấm men 4

a) Sinh trưởng 4

b) Phát triển 6

c) Sinh sản 6

Sinh sản vô tính 6

Sinh sản hữu tính 7

2.1.5 Các quá trình sinh lý của tế bào nấm men 7

a) Sinh dưỡng của nấm men 7

b) Quá trình trao đổi chất của nấm men 9

2.1.6 Phân loại nấm men 9

2.1.7 Vai trò và ứng dụng của nấm men 10

2.2 Rỉ đường 12

2.2.1 Khái niệm rỉ đường 12

2.2.2 Các loại rỉ đường 12

a) Rỉ đường mía 12

b) Rỉ đường củ cải 13

c) Một số loại rỉ đường khác 14

2.2.3 Thành phần hóa học của rỉ đường 14

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 15

2.2.5 Thông tin dinh dưỡng 16

2.2.6 Ứng dụng 17

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men 17

2.3.1 Hàm lượng đường 17

2.3.2 Mật số tế bào ban đầu 17

2.3.3 pH môi trường 17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Phương tiện nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian và địa điểm 18

3.1.2 Nguyên liệu 18

3.1.3 Thiết bị - dụng cụ và hóa chất 18

a) Thiết bị - dụng cụ 18

b) Hóa chất 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 19

a) Khóm, nho, chuối, bưởi 19

b) Bã bia 19

c) Rỉ đường 19

3.2.2 Thí nghiêm 1: Phân lập nấm men từ các nguồn khác nhau 19

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tăng sinh khối của các dòng nấm men trên dịch rỉ đường 21

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến quá trình tạo sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn 22

3.2.4.1 Khảo sát nồng độ rỉ đường và mật số nấm men ban đầu đến quá trình tạo

sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn 22

3.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình tạo sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn 22

3.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình tạo sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập nấm men từ các nguồn khác nhau 24

4.2 Khả năng tăng sinh khối của các dòng nấm men trên dịch rỉ đường 31

4.3 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến quá trình tăng sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn 32

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường và mật số nấm men ban đầu đến quá trình tăng sinh khối của nấm men 33

4.3.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình tăng sinh khối của nấm men 35

4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình tăng sinh khối của

nấm men 37

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2 Kết quả

Phụ lục 3 Kết quả thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần hóa học của nấm men 8

Bảng 2 Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm 11

Bảng 3 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía(%) 13

Bảng 4 Thành phần chất hữu cơ của rỉ đường 14

Bảng 5 Khối lượng trung bình sinh khối khô nấm men thu được tăng sinh trên môi trường dịch rỉ đường 31

Bảng 6 Khối lượng trung bình sinh khối khô nấm men thu được với các điều kiện nồng độ rỉ đường và mật số ban đầu khác nhau 33

Bảng 7 Khối lượng trung bình sinh khối khô nấm men thu được với các điều kiện pH khác nhau 35

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Nấm men Saccharomyces Cerevisiea 3

Hình 2 Rỉ đường 12 Hình 3 Quy trình phân lập nấm men 20 Hình 4 Khả năng tạo sinh khối khô của các dòng nấm men thuần tren môi trường rỉ đường sau 48 giờ 32 Hình 5 Khối lượng sinh khối khô thu được ở các điều kiện khác nhau về nồng độ rỉ đường và mật số ban đầu sau 48 giờ 33 Hình 6 Khối lượng trung bình sinh khối khô nấm men thu được với các điều kiện pH khác nhau 36 Bảng 8 Khối lượng trung bình sinh khối khô nấm men thu được ở điều kiện thời gian khác nhau 37

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề:

Nấm men là một nhóm vi sinh vật đơn bào được loài người sử dụng từ hàng nghìn năm nay để sản xuất nước uống có cồn và làm bánh Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, nấm men là một trong những vi sinh vật có hàm lượng protein cao nhất, chiếm đến khoảng 50% khối lượng khô của tế bào Đồng thời, đây là giống vi sinh vật dễ nuôi cấy từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, chủ yếu là những phế phụ phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm

Sinh khối nấm men dùng trong công nghiệp dưới dạng tế bào sống, dùng làm thực phẩm bổ sung protein, các vitamin nhóm B và chất khoáng cho người và thức ăn cho gia súc dưới dạng sinh khối sấy khô

Ngày nay, những hiểu biết về khoa học và công nghệ đã cho phép phân lập và sản xuất công nghiệp những dòng nấm men có những tính chất đặc biệt, thoả mãn ngày càng cao nhu cầu thực phẩm của con người và dùng làm nguồn bổ sung protein quý cho gia súc, gia cầm và cá Nhu cầu sử dụng nấm men ngày càng tăng vì vậy việc chọn lọc dòng nấm men có chất lượng tốt ứng dụng sản xuất sinh khối đặc biệt là từ nguồn nguyên liệu

rẻ tiền, dễ kiếm như rỉ đường – phế phẩm của ngành công nghiệp là cần thiết

Việt Nam là một nước có khí hậu nóng ẩm thích hợp cho cây mía và ngành công nghiệp sản xuất đường phát triển mạnh Hằng năm, lượng rỉ đường thải ra từ các nhà máy sản xuất đường rất lớn nên thuận lợi cho việc sản xuất sinh khối nấm men

Vì vậy, đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men tạo sinh khối cao trên rỉ đường” được thực hiện nhằm góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất sinh

khối nấm men đạt chất lượng cao, ít tốn thời gian, có lợi về mặt kinh tế

1.2 Mục tiêu đề tài:

Phân lập và tuyển chọn dòng nấm men tự nhiên có khả năng tăng sinh khối cao trên môi trường rỉ đường, đồng thời xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho dòng nấm men này sản xuất sinh khối đạt hiệu quả cao

1.3 Nội dung đề tài:

- Phân lập và tuyển chọn các dòng nấm men có khả năng sản xuất sinh khối cao từ các loại quả, bã bia và rỉ đường

- Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nồng độ rỉ đường, pH, mật số nấm men ban đầu) đến quá trình tăng sinh khối của một dòng nấm men được chọn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Nấm men

2.1.1 Đặc điểm nấm men

Nấm men là vi sinh vật chân hạch, hiện tại có khoảng hơn 1.500 loài được tìm thấy, chiếm khoảng 1% trong tổng số các chủng nấm (Kurtzman và Fell, 2006) Hầu hết nấm men có cấu tạo đơn bào Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi Đặc biệt chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Ngoài ra, chúng có mặt trên trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.1.2 Hình dạng và kích thước

a) Hình dạng tế bào nấm men

Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau Tùy loại và tùy giống, nhưng chúng

thường có hình cầu, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như

Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apicultus, đôi khi hình

chai như Saccharomyces ludwugii hoặc hình ống dài như Pichia Nói chung hình dạng

nấm men của tế bào nấm men ở các loài khác nhau thì khác nhau , trong cùng một loài hình dạng tế bào cũng có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào (Lê Xuân Phương, 2001)

Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số loài như Candida albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty giả và Eremothecium

gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piškur, 2006)

Hình 1 Nấm men Saccharomyces cerevisiea

(Nguồn:http://www.thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/vsv/3551-nam-men-yeas.html, ngày 10/06/2014)

2.1.3 Cấu tạo tế bào nấm men

- Thành tế bào: Thành tế bào nấm men dày khoảng 25 nm, chiếm 15-30% trọng lượng khô của tế bào nấm men, được cấu tạo chủ yếu từ glucan (60% khối lượng thành tế bào), mannoprotein, chitin và một lượng nhỏ lipid

- Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác nhau, được

cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khô), phần còn lại là lipid và một ít polysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999)

- Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme

- Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là

chất dịch nhân có chứa hạch nhân Nhân tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có

chứa 17 đôi nhiễm sắc thể

- Volutin: thường thấy trong không bào, không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chỉ xuất hiện ở điều kiện môi trường nuôi cấy giàu carbon hydrat và photphate vô cơ

- Các bào quan và thành phần khác: ty thể, không bào, ribosome,…

2.1.4 Sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của nấm men

a) Sinh trưởng

Cũng như các vi sinh vật khác, quá trình sinh trưởng của nấm men gồm 4 pha: pha tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy vong

- Pha lag (pha tiềm phát)

Trong pha tiềm phát nấm men hầu như không sinh sản do nấm men còn thích nghi với môi trường mới, trong đó, một số tế bào bị ức chế, thậm chí có thể bị chết Số lượng nấm men trong giai đoạn này không tăng hoặc tăng không đáng kể nhưng sự trao đổi chất của chúng diễn ra mạnh mẽ Tế bào có kích thước tăng đáng kể, hàm lượng protein, acid

nucleic đều tăng lên Các enzyme thích ứng cũng được tổng hợp mạnh mẽ Trong môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng, giống nấm men cấy vào càng trẻ thì pha tiềm phát càng ngắn Có thể cấy một lượng giống lớn các tế bào khỏe làm cho pha này rút ngắn và giống

có thể phát triển ngay sau khi cấy Pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến khi nấm men đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại

- Pha logarid (pha log)

Trong pha này nấm men sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa Kích thước của tế bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý, nói chung không thay đổi theo thời gian Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là “những tế bào tiêu chuẩn”

- Pha ổn định (pha cân bằng)

Trong pha này quần thể nấm men ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi Kết quả là số tế bào sống không tăng cũng không giảm Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hoàn toàn) tốc độ sinh trưởng của nấm men cũng giảm Do đó việc chuyển từ pha log sang pha ổn định diễn ra dần dần Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định rõ ràng là do sự tích lũy sản phẩm độc của trao đổi cơ chất (các loại rượu, acid hữu cơ) và việc cạn chất dinh dưỡng (thường là chất dinh dưỡng có nồng độ thấp nhất)

- Pha suy vong

Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa (mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm) Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzyme của bản thân Thực ra chưa có một qui luật chung cho pha suy vong Sự chết của tế bào có thể nhanh hay chậm và có liên quan đến quá trình tự phân Nguyên nhân của pha suy vong chưa thật rõ ràng, nhưng có liên quan đến điều kiện bất lợi của môi trường Trong trường hợp môi trường tích lũy các acid là nguyên nhân của sự chết tế bào tương đối dễ hiểu Nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả làm giảm hoạt tính trao đổi chất, phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết của hàng loạt tế bào Ngoài đặc tính của bản thân chủng nấm men, tính chất của các sản phẩm trao đổi chất tích lũy lại cũng ảnh hưởng đến tiến trình của pha suy vong Một số enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác cực đại trong pha tử vong như deaminase, decarboxylase, các amylase và protease ngoại bào Ngoài chức năng xúc tác một số quá trình tổng hợp những enzyme nói trên chủ yếu xúc tác cho quá trình phân giải

b) Phát triển

Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già Vì rằng tế bào được phân chia thành hai cứ như vậy

tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa

Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách

đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian

Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như:

- Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch

- Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào,

c) Sinh sản

- Sinh sản vô tính

Sinh sản bằng hình thức nảy chồi: đây là hình thức sinh sản thường gặp nhất ở nấm men, chồi mới phát triển từ nấm men mẹ khi có các điều kiện thích hợp và sau đó, khi một chồi hoàn chỉnh sẽ phát triển ngay, ở đó chồi sẽ nối liền với tế bào mẹ và cho tới khi đạt kích thước của nấm men trưởng thành chồi rời khỏi tế bào mẹ gọi là điểm sinh sản

Saccharomyces cerevisiae là một ví dụ cho sự sinh sản bằng cách nảy chồi của nấm men

Theo Horst Feldmann (2005), chồi của nấm men S.cerevisiae được bắt đầu khi một tế bào

mẹ đạt tới một kích thước tới hạn cùng lúc với sự khởi đầu của sinh tổng hợp DNA Tiếp theo là làm yếu đi một vị trí trên vách tế bào, cùng với sức căng bề mặt do áp suất, cho

phép phun tế bào chất vào trong vùng giới hạn bởi vật liệu của vách tế bào mới

Sinh sản bằng cách phân chia: một số loài phân đôi tế bào thành 2 tế bào con, lúc đầu chất nhân phân chia làm hai phần, sau đó ở phần giữa của tế bào xuất hiện thành tế bào, thành này lớn lên dần và màng sinh chất lọt vào bên trong Lúc này thành tế bào mới

phát triển hoàn thiện và chia tế bào mẹ thành 2 tế bào con độc lập

- Tiếp hợp đẳng giao: do 2 tế bào nấm men có hình thái, kích thước giống nhau, tiếp

hợp với nhau mà thành (Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces)

- Tiếp hợp dị giao: do 2 tế bào nấm men khác nhau về hình thái, kích thước tiếp hợp

với nhau tạo thành (Zigopichia, Nadsonia)

- Sinh sản đơn tính: tạo thành bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng lẽ không thông qua tiếp hợp Bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men mới Tế bào này lại tiếp tục sinh sản bằng cách nảy chồi Sự hình thành bào

tử túi là một quá trình vừa mang ý nghĩa sinh sản vừa tạo dạng bền vững vì bào tử túi có

võ dày chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường, chịu được nhiệt độ cao và sự khô hạn

2.1.5 Các quá trình sinh lý của tế bào nấm men (Lương Đức Phẩm, 2005)

a) Sinh dưỡng của nấm men

Cấu tạo của tế bào nấm men thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi và môi trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm:

- Nước: 75-85%

- Chất khô: 15-25% Trong đó chất khoáng chiếm 2-14% hàm lượng chất khô

Lên men

Bảng 1 Thành phần hóa học của nấm men

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, carbon, nitơ, phospho, kali, magie,…

- Dinh dưỡng carbon: nguồn carbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose,…

cơ là các muối amon khử nitrate, sulfate,…

- Các vitamin và chất khoáng: chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men

+ Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn

Carbon CaO Nitơ Hydro

P2O5

K2O

SO3MgO

Fe2O3SiO

49,8 12,4 6,7 3,54 2,34 0,04 0,42 0,38 0,035 0,09

+ Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme + Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men

+ Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác

+ Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào

sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic

+ Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê

b) Quá trình trao đổi chất của nấm men

Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm 2 giai đoạn: Chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào Chuỗi các phản ứng hóa học, biến đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp chất liệu cho tế bào Môi trường dinh dưỡng chứa những thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau Các chất không điện tích như đường saccharose, rượu acid hữu cơ, amino acid xâm nhập qua màng tế bào bằng cách khuếch tán hay vận chuyển thụ động, do sự khác nhau về nồng độ các chất này giữa tế bào và môi trường Các chất điện tích trong dung dịch như muối KCl, Mg, Ca và các kim loại khác có thể vào tế bào thụ động theo thang nồng độ hay vận động ngược lại thang nồng độ (vận chuyển hoạt động) Ngoài nguồn hydratcarbon và nguồn nitơ hoặc vô cơ hoặc hữu cơ, nấm men còn sử dụng các nguyên tố vi lượng như K, Na, Ca, Mg có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng nấm men Riêng natri có ý nghĩa quan trọng trong sự tăng trưởng của tế bào nấm men Ion natri là thành phần duy nhất di chuyển vào tế bào bằng cả 2 cơ chế: thụ động và hoạt động và khi nó thâm nhập vào tế bào nấm men, mang theo cả saccharose, amino acid, ngay cả khi không có sự chênh lệch nồng độ các chất này giữa tế bào và môi trường

2.1.6 Phân loại nấm men (Lương Đức Phẩm, 2006)

Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi imporfecti)

Lớp nấm men thật (lớp Ascomyces – lớp nấm túi): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces bao gồm

Endomyces và Schizosaccharomyces Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti – nấm men bất

toàn): Crytococus (toscula, tornlopsis), Mycoderma, Eandida, Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc) và Rhodotorula

- Khóa phân loại nấm men (Kurtzman và Fell, 1997)

Phân loại các giống nấm men dựa vào một số đặc điểm về hình thái, sinh lý nấm men: sự nảy chồi của nấm men, hình dáng nấm men, sự hình thành bào tử, khả năng lên men các loại đường, khả năng đồng hóa urea

Giống Saccharomyces: sinh sản sinh dưỡng: tế bào nảy chồi nhiều hướng, đôi khi

có khuẩn ty giả Sinh sản hữu tính: Túi khá bền và hình thành trực tiếp từ một tế bào lưỡng bội Mỗi túi có chứa 1-4 (ít khi nhiều hơn) bào tử túi hình ô van hoặc tròn nhẵn Đặc điểm sinh lý: lên men đường, không hoạt hóa urease

Giống Hanseniaspora: sinh sản sinh dưỡng: nảy chồi ở hai cực hoặc một cực, có

thể có khuẩn ty giả không tạo khuẩn ty thật Sinh sản hữu tính: các túi không tiếp hợp Mỗi túi chứa 1-4 bào tử túi hình mũ hay hình cầu, nhẵn hay xù xì, có hoặc không có gờ ở giữa Đặc điểm sinh lý: lên men đường, không hoạt hóa urease

2.1.7 Vai trò và ứng dụng của nấm men

Nấm men có mặt trong quá trình chế biến nhiều loại thực phẩm và thức uống, không chỉ giúp hoàn tất quá trình chế biến mà còn rất tốt cho sức khỏe

Men là một loại nấm đơn bào hiển vi, có hình trứng hoặc tròn Đặc điểm lớn nhất của men là một vi sinh vật sống Cũng như ở con người, tế bào men là tế bào sống rất tự nhiên và chúng cần không khí để sinh sôi Môi trường thiếu không khí sẽ để lại không ít hậu quả cho sự phát triển của men Có rất nhiều loại men nhưng phổ biến nhất là

Saccharomyces cerevisiae, được gọi là men bia, men bánh mì hay bột nổi Tuy nhiên,

bằng cách chọn lọc giống gốc và phát triển các kỹ thuật tăng sinh, men được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như nông sản thực phẩm, hương thơm, y dược, sức khỏe gia súc…

Men có thể ở dạng nước, bột hay viên và là một quân chủ bài cho sức khỏe Là một nguyên liệu tốt giúp gìn giữ hoặc phục hồi sức khỏe, gìn giữ sắc đẹp một cách tự nhiên trong thức ăn căn bản, viên bổ sung và mỹ phẩm Từ rất lâu men thực phẩm – sống hoặc chết – đã là đề tài của nhiều nghiên cứu và báo cáo khoa học chứng minh men có tính năng dinh dưỡng và trị liệu vượt trội Nấm men có nhiều thành phần sinh học như a xít amin, khoáng chất, vitamin, enzyme… cần thiết cho hoạt động của cơ thể trong các giai đoạn tăng trưởng, chuyển hóa tế bào, hệ miễn dịch, mà chế độ ăn hằng ngày có thể không cung cấp đủ Men được xem như thành phần bổ sung lý tưởng cho các chế độ ăn chay, ăn

kiêng, nuôi dưỡng tóc, móng tay và da Giàu vitamin nhóm B, sélenium, chrome, kẽm, đồng và molybden, men tác động đến tất cả các dạng thiếu hụt chất

Bảng 2 Sự hiện diện và ứng dụng của nấm men trong một số thực phẩm

Bánh mì và bột nhão bánh mì S cerevisiae, S exiguus, S rosei

D-Arabitol (chất làm ngọt) Candida did nsiae

Chất tạo nhũ tương C lipolytica

Thức ăn gia cầm và cá Phaffia rhodozyma

Lactose và sữa lên men C pseudotropicalis, Kluyveromyces

fragilis, K lactis

Lên men bia lager S carlsbergensis

Mannitol (chất hút ẩm) Torulopsis manitofaciens

Xylitol (chất làm ngọt) T candida

Lên men D-xylose C shehatae, Pachysolen tannophilus,

Pichia stipitis, Pichia segobiensis

(Nguồn: Jacobson và Jolly, 1989)

Nấm men có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như dùng trong sản xuất ethanol, bánh mì, rượu vang, bia,… Trong đó việc ứng dụng nấm men vào việc lên men các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol rất đáng được quan tâm, nguồn ethanol giá thành rẻ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết vấn đề về nhiên liệu

và ô nhiễm môi trường Một số sản phẩm ứng dụng của từng dòng nấm men cụ thể được liệt kê trong bảng 2

Ngăn ngừa stress ô xy hóa: Mỗi ngày oxygen mà chúng ta hít thở làm ô xy hóa các

tế bào, kết hợp với quá trình ô xy hóa của cơ thể được khuếch tán bởi ô nhiễm và stress trong đời sống hằng ngày, đặt cơ thể vào tình trạng stress ô xy hóa Men có chứa nhiều sélénium, dễ dung nạp gấp đôi so với các dạng khoáng chất, sẽ giúp bảo vệ các thành phần của tế bào con người một cách hiệu quả

Hệ miễn dịch giữ vai trò phòng ngự giữa con người và môi trường bên ngoài Phòng vệ tốt cho phép bảo vệ cơ thể một cách hiệu quả khỏi các viêm nhiễm và những

bệnh khác Từ nấm men Saccharomyces cerevisiae người ta có thể tách ra những glucan có tác dụng kích thích hệ miễn nhiễm Mặt khác, peptid và glutathion chiết xuất từ men cũng được khắp thế giới ưa chuộng, nhất là các nước châu Á

beta-2.2 Rỉ đường

2.2.1 Khái niệm rỉ đường

Rỉ đường hay rỉ mật, mật rỉ, mật rỉ đường, còn được gọi ngắn gọn là mật, là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô và kết tinh Đây là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến đường (đường mía, đường nho, đường củ cải) Trong tiếng Anh,

rỉ mật được gọi là molasses, xuất phát từ tiếng Bồ Đào Nha melaco, là dạng so sánh hơn nhất của mel, từ Latin (và Bồ Đào Nha) của "mật ong" Chất lượng của rỉ đường phụ thuộc vào độ chín của mía hoặc củ cải nguyên liệu, lượng đường chiết được và phương pháp chiết đường

Cây mía sau khi thu hoạch được cắt bỏ lá Thân mía được nghiền hoặc cắt nhỏ rồi

ép lấy nước Đun sôi nước để cô đặc, đến khi tạo nên các tinh thể đường Các tinh thể đường được tách ra và phần mật mía tiếp tục được cô Sau khoảng 3 lần cô đặc, hầu như không thể tạo thêm các tinh thể đường bằng các biện pháp thông thường, chất lỏng còn lại chính là rỉ mật hay rỉ đường

Khoảng 75% tổng lượng rỉ mật của thế giới có nguồn gốc từ mía (Saccharum officinarum), gần 25% từ củ cải đường (Beta vulgaris) Nói chung, sản lượng rỉ mật bằng khoảng 1/3 sản lượng đường sản xuất, khoảng 100 tấn cây mía đem ép thì có 3-4 tấn rỉ mật được sản xuất

Trong rỉ đường mía còn một lượng đường nhỏ Không giống như trong đường tinh luyện, rỉ đường chứa một lượng vết vitamin và một lượng đáng kể một số chất khoáng như canxi, magie, kali và sắt, mỗi thìa cà phê rỉ mật có thể cung cấp 20% giá trị hàng ngày cần thiết đối với các khoáng chất này Rỉ đường được sử dụng trong chế biến thực phẩm và dùng để sản xuất cồn etylic cũng như làm thức ăn cho trâu bò

Bảng 3 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía(%)

Với kỹ thuật hiện đại ở quy mô công nghiệp, phần được trong rỉ củ cải đường có thể tiếp tục được tách ra Rỉ đường củ cải cũng được dùng trong sản xuất nấm men

Nguồn: Sreg và Van de Meer (1985)

- Đường

Các loại gluxit hoà tan (đường đôi và đường đơn) là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ mật, trong đó saccharose là chủ yếu (bảng 3) Rỉ mật mía có đặc điểm là có tỷ lệ đường khử tương đối cao Trong chu trình kết tinh các loại đường khử tăng lên tới mức

mà saccharose không thể kết tinh được nữa bởi vì đường khử làm giảm khả năng hoà tan của saccharose Các chất khoáng có xu hướng giữ saccharose trong dung dịch, cho nên cân bằng giữa đường khử và chất khoáng sẽ quyết định sản lượng saccharose lý thuyết có

từ cây mía Phần sirô còn lại thường được coi là rỉ mật Tồng lượng đường trong rỉ mật củ cải đường thường thấp hơn trong rỉ mật mía, nhưng lại chứa hầu như toàn bộ là saccharose

Bảng 4 Thành phần chất hữu cơ của rỉ đường Thành phần Rỉ đường mía Rỉ đường củ cải

- Chất hữu cơ không đường

Các chất hữu cơ không phải là đường của rỉ mật quyết định nhiều tính chất vật lý của nó, đặc biệt là độ nhớt dính Nó bao gồm chủ yếu là các loại gluxit như tinh bột, các hợp chất chứa N và các axit hữu cơ Nói chung hàm lượng các chất hữu cơ không phải là đường của rỉ mật củ cải đường cao hơn rỉ mật mía Trong rỉ mật không chứa xơ và lipit

Tỷ lệ protein thô trong rỉ mật mía tiêu chuẩn là rất thấp (3-5%) Trong rỉ mật mía còn có một lượng đáng kể các axit hữu cơ, trong đó chủ yếu là axit acotinic Rỉ mật cũng chứa một lượng axit béo bay hơi, trung bình khoảng 1,3%

- Chất khoáng

Rỉ đường là một nguồn giàu khoáng So với các nguồn thức ăn năng lượng thông dụng khác như hạt ngũ cốc thì hàm lượng Ca trong rỉ đường mía cao (tới 1%), trong khi đó thì hàm lượng P lại thấp Rỉ đường mía giàu Na, K, Mg và S Rỉ đường cũng chứa một lượng đáng kể các nguyên tố vi lượng như Cu (7 ppm), Zn (10 ppm), Fe (200 ppm), Mn (200 ppm) Rỉ đường rất giàu các chất sinh trưởng như: acid pentotenic, nicotinic, folic, B1, B2

và đặc biệt là biotin (Trương Thị Minh Hạnh et al., 2006)

Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin

và các chất điều hoà sinh trưởng Trong đó có vitamin H (biotin) là chất kích thích sinh trưởng đối với phần lớn nấm men Trong 2 loại rỉ đường thì rỉ đường từ mía có hàm lượng biotin cao hơn rỉ đường từ củ cải đường Chính vì thế, ở nhiều nước không có mía, người

ta phải nhập rỉ đường từ mía về trộn chung với rỉ đường từ củ cải đường để đảm bảo hàm lượng biotin cho nấm men phát triển Tuy nhiên rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men Muốn sử dụng cho quá trình lên men, ta phải tiến hành một số quá trình xử lý

2.2.4 Các đặc điểm của rỉ đường ảnh hưởng đến quá trình lên men

Rỉ đường thường có màu nâu sẫm, được tạo ra trong quá trình chế biến đường Màu này rất khó bị phá hủy trong quá trình lên men Sau khi lên men, chúng sẽ bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men có màu vàng sẫm Màu này không phải màu tự nhiên của nấm men và việc tách màu ra khỏi sinh khối rất tốn kém và khó khăn Các chất màu này bao gồm các hợp chất caramen, phức chất của phenol – Fe +2, Melanoidin, Melanin Hàm lượng đường khá cao, nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng

độ thích hợp cho sự phát triển của nấm men

Hệ keo trong rỉ đường có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men Hệ keo trong rỉ đường hình thành bởi protein và pectin Hệ keo này tạo ra độ nhớt cao làm giảm khả năng hoà tan của oxy, làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men Nếu hệ keo không được phá sẽ gây thoái hoá tế bào, dẫn đến hiệu suất thu nhận sinh khối nấm men thấp

2.2.5 Thông tin dinh dƣỡng

Mỗi thìa rỉ đường (20 g) chứa 58 Kcal , 14,95 g of carbohydrat và 11,10 g các loại đường sau:

a) Trong ngành thực phẩm

- Làm nguyên liệu lên men để sản xuất rượu rum

- Sử dụng trong sản xuất một số loại bia đặc biệt có màu tối

- Sử dụng để tạo hương cho thuốc lá

- Dùng để bổ sung sắt cho các đối tượng không dung nạp khoáng chất này trong viên sắt

bổ sung

- Phụ gia trong chế biến thức ăn chăn nuôi

- Sử dụng làm mồi câu cá

b) Hóa chất

- Là nguồn cacbon trong một số ngành công nghiệp

- Được tẩy trắng bằng magie clorua và dùng để làm chất chống tạo băng

- Sản xuất cồn etylic dùng làm nhiên liệu động cơ

c) Trong công nghiệp

- Làm tác nhân chelat hóa

- Sử dụng trong sản xuất gạch

- Được hỗn hợp với keo để dùng trong ngành in

d) Trong nông nghiệp

- Bổ sung vào đất trồng để tăng hoạt tính sinh học của đất

- Sử dụng trong thủy canh để cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, gồm các loại carbohydrat là thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào thực vật và cây trồng có thể sử dụng nhanh như deoxyribose, lyxose, ribose, xylulose và xylose

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men

2.3.1 Hàm lượng đường

Đa số các loại nấm men hoạt động bình thường trong môi trường đường dưới 20%

Có một số chủng hoạt động ở môi trường có đường cao hơn Khi nhân giống thường dùng môi trường có đường thấp dưới 10%

2.3.2 Mật số nấm men ban đầu

Lượng nấm men gieo cấy ban đầu liên quan mật thiết đến tiến trình lên men qua các chỉ số sau:

- Thời gian để thiết lập được thế cân bằng động giữa các quần thể nấm men với môi trường lên men (cơ chất )

- Lượng tế bào nảy chồi, từ đây dẫn đến lượng chất hòa tan (chất dinh dưỡng) bị tiêu phí cho xây dựng tế bào mới và cường độ trao đổi chất trong tế bào non

- Thời gian lên men

- Hàm lượng các sản phẩm phụ tạo thành và tỉ số tương quan giữa chúng

cấy ban đầu Nếu mật độ gieo cấy càng nhiều thì thời gian đó càng ngắn và ngược lại Nếu lượng nấm men gieo cấy quá ít, khả năng nảy chối của chúng không thể đạt được mức độ tối đa cần thiết

2.3.3 pH của môi trường

Trong thực tế lên men những dịch quả chua thường được rượu vang ngon Đối với dịch quả thường có độ pH từ 2.8 – 3.8 Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được Vùng pH tối thích của nấm men là 4 – 6

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 08/2014 đến 12/2013

Địa điểm: Phòng Công nghệ Sinh học Phân tử Thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát

triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Nguyên liệu

- Khóm thu thập từ chợ Cái Khế, quận Ninh Kiều, TPCT

- Nho, chuối thu thập từ Đồng Tháp

- Rỉ đường thu tại nhà máy đường CASUCO Hậu Giang

- Bã bia được thu ngay sau quá trình lọc bã malt tại công ty cổ phần bia Phong Dinh, TPCT, sau đó trữ lạnh ở 00

- Giấy nhôm, kẹp, kéo

- Tủ cấy vô trùng Telstar (Spain)

- Nồi khử trùng Pbi (Italia)

-Lò vi sóng (Panasonic)

- Tủ ủ Binder (Germany)

- Máy ly tâm (Hermle)

- Máy vortex (Italia)

- Cân điện tử (USA)

- Kính hiển vi Olympus (Japan)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu

- Dịch quả lên men (khóm, nho, chuối): Chọn những chỗ bị dập, có mùi rượu, thái nhỏ và

nghiền Bã bia, rỉ đường: pha loãng 10 lần với nước cất

- Sau đó bổ sung glucose 2%, yeast extract 0.5%, peptone 0.5%, lên men tự nhiên trong

48 giờ ở nhiệt độ phòng (28- 320C)

3.2.2 Phân lập nấm men từ các nguồn khác nhau

Mục đích thí nghiệm: Phân lập những dòng nấm men tự nhiên từ các nguồn khác

nhau để tuyển chọn các dòng nấm men cho thí nghiệm khảo sát khả năng tăng sinh khối trên môi trường rỉ đường

Hình 3 Quy trình phân lập nấm men

Giải thích quy trình: Cấy trải trên môi trường rỉ đường agar ủ ở 300C Sau 48 giờ nấm men phát triển thành khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc rời để cấy ria vào đĩa môi trường mới Quan sát bằng mắt thường nhận dạng khuẩn lạc rời, trắng đục, tiếp tục cấy chuyển và quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ ròng Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường PGA và trữ ở 40C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.Quan sát khuẩn lạc và tế bào nấm men phân lập ròng

Chỉ tiêu theo dõi:

Đo kích thước và nhận dạng khuẩn lạc và tế bào nấm men

Nguyên liệu

Xay nhuyễn

Bổ sung đường

Ủ 2 – 3 ngày ở nhiệt độ phòng

3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sản xuất sinh khối của các dòng nấm men trên môi trường dịch rỉ đường

Mục đích thí nghiệm: Từ các dòng phân lập được, chọn được dòng nấm men có

khả năng sản xuất sinh khối cao trên môi trường dịch rỉ đường để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là

các dòng nấm men

Cách tiến hành: Sau khi tiến hành tăng sinh khối các dòng nấm men thuần trong

môi trường PG chỉnh mật số tế bào là 105

tế bào/mL để chuẩn bị chủng vào môi trường nuôi ủ Đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu

Mật số tế bào của huyền phù mẫu được tính theo công thức (Nguyễn Xuân Thành, 2005):

a 4000 103 c

N =

b Trong đó: a – Số tế bào trong 4 ô lớn

b – Số ô con trong 4 ô lớn

103 – Chuyển mm3 bằng ml (1000mm3 = 1ml)

c - Độ pha loãng (100 lần) Chuẩn bị môi trường dịch rỉ đường: Sau khi pha loãng dịch rỉ đường 20%, tiến hành khử trùng dịch rỉ ở 1210C trong 10 phút Chủng 30µL (0,001%) dịch nấm men ở mật số tế bào 105 tế bào/mL vào bình thủy tinh chứa 30mL dịch rỉ đường được đậy bằng nút gòn và nắp giấy Bình sau khi chủng giống được lắc qua đêm trên máy lắc trong 48 giờ, 150v/phút ủ ở nhiệt độ phòng

Thu hoạch sinh khối bằng cách ly tâm 7000v/phút trong 20 phút Sinh khối nấm men thu được ở dạng nhão (paste) và sấy khô ở 450

C trong 48 giờ (Dung et al,.2007) Cân sản phẩm xác định sinh khối khô của các dòng nấm men cần khảo sát

Chỉ tiêu theo dõi: Trọng lượng sinh khối nấm men

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn

Từ thí nghiệm 1 chọn ra 1 dòng có khả năng tăng sinh khối tốt nhất trên môi trường rỉ đường và tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men để lựa chọn dòng nấm men tự nhiên sản xuất sinh khối tốt nhất

3.2.4.1 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ rỉ đường và mật số nấm men ban đầu đến sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn

Mục đích thí nghiệm: Xác định mật số nấm men và nồng độ rỉ đường thích hợp cho

quá trình sản xuất sinh khối nấm men

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 2 nhân tố và 3 lần

Cách tiến hành: Chủng 30µL nấm men vào bình tam giác chứa 30mL dịch rỉ

đường với các nồng độ 15%, 20%, 25%, mật số sau khi chủng lần lượt là 103

, 104, 105 tế bào/mL Sau đó đậy bình tam giác bằng nút gòn và nắp giấy Lắc ủ trên máy lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng 24 giờ thì thu hoạch Sau đó tiến hành ly tâm thu sinh khối bằng máy ly tâm lạnh

Chỉ tiêu theo dõi: Trọng lượng sinh khối nấm men

3.2.4.2 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH đến sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn

Mục đích thí nghiệm: Xác định độ pH thích hợp cho quá trình sản xuất sinh khối

nấm men trong điều kiện hiếu khí

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 4

nghiệm thức gồm các mức pH 4; 5; 6; 7 Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tổng cộng có 12 đơn vị thí nghiệm

Cách tiến hành: Điều chỉnh dịch rỉ đường ở pH 4; 5; 6; 7 Sử dụng dung dịch HCL

0,1N để điều chỉnh pH xuống, sử dụng dung dịch NaOH 1N để điều chỉnh pH tăng lên

Sử dụng kết quả mật số tế bào ban đầu và nồng độ rỉ đường tốt nhất được chọn từ thí

nghiệm trên Lắc ủ trên máy lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ tiến hành ly tâm thu sinh khối, cân và ghi nhận kết quả

Chỉ tiêu theo dõi: Trọng lượng sinh khối nấm men ở từng độ pH khác nhau

3.2.4.3 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian đến sinh khối của dòng nấm men được tuyển chọn

Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho quá trình sản xuất

sinh khối nấm men

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức

gồm 4 mốc thời gian 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Tổng cộng có 12 đơn vị thí nghiệm

Cách tiến hành: Dịch lên men được chuẩn bị theo các kết quả tốt nhất được chọn

từ các thí nghiệm trên Tiến hành sản xuất sinh khối ở nhiệt độ phòng trong điều kiện hiếu khí trên máy lắc 150 vòng/phút với các khoảng thời gian khác nhau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ Ly tâm thu sinh khối nấm men ở các mốc thời gian, cân và ghi nhận kết quả

Chỉ tiêu theo dõi: Trọng lượng sinh khối của nấm men thu được ở các mốc thời

gian

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập nấm men từ các nguồn khác nhau

Kết quả đã tìm được 13 dòng nấm men thuần từ 5 nguồn nguyên liệu Trong đó, bã bia thu được 4 dòng (ký hiệu: BB1, BB2, BB3, BB4), rỉ đường thu được 2 dòng (ký hiệu: RĐ1, RĐ2), nho thu được 3 dòng (ký hiệu: NH1, NH2, NH3), khóm thu được 3 dòng (ký hiệu: KH1, KH2, KH3) và chuối thu được 1 dòng ( ký hiệu: CH1 )

BB1

Mô tả: khuẩn lạc nhỏ, bìa

nguyên, dạng mô nổi, màu

trắng sữa đục, kích thước

khoảng 2 – 4 mm

Mô tả: tế bào hình trứng, vách tế bào mỏng,có 2 nhân, không bào phân bố rộng khắp tế bào Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, tế bào riêng rẻ