khảo sát một số đặc tính các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh thán thư hại gấc

Mục tiêu của đề tài nhằm khảo sát đặc tính sinh học của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh thán thư trên gấc.. Đề tài được thực hiện gồm 2 phần: Phần 1: Khảo sát đặc điể

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN VĂN NGHĨA

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ TRIỂN VỌNG TRONG QUẢN LÝ BỆNH THÁN THƯ

HẠI GẤC

Luận văn tốt nghiệp Đại học Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HẠI GẤC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS Lê Minh Tường Trần Văn Nghĩa

MSSV: 3113460

Lớp: Bảo Vệ Thực Vật K37

Cần Thơ, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo Vệ Thực Vật với tên đề tài:

“KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ TRIỂN VỌNG TRONG QUẢN LÝ BỆNH THÁN THƯ HẠI GẤC”

Do sinh viên Trần Văn Nghĩa thực hiện và đề nạp

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2015 Cán bộ hướng dẫn

TS Lê Minh Tường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo Vệ Thực Vật với tên đề tài:

“KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ TRIỂN VỌNG TRONG QUẢN LÝ BỆNH THÁN THƯ HẠI GẤC”

Do sinh viên Trần Văn Nghĩa thực hiện và bảo vệ trước hội đồng

Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:

………

………

………

………

………

………

Luận văn tốt nghiệp được hội đồng đánh giá ở mức:………

DUYỆT KHOA Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2015 Chủ tịch hội đồng

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: Trần Văn Nghĩa

Ngày sinh:1993

Nơi sinh: Chợ Mới, An Giang

Họ và tên Cha: Trần Trọng Nhân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào trước đây

Người thực hiện

Trần Văn Nghĩa

Xin cảm ơn ban lãnh đạo trường Đại Học Cần Thơ, ban chủ nhiệm khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã tạo nhiều điều kiện để em hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Chí Cương (cố vấn học tập) và quý thầy, cô trong trường Đại Học Cần Thơ đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong thời gian học tập tại trường

Chân thành biết ơn chị Võ Kim Phương, chị Nguyễn Thị Mỹ Ngân, anh Lý Văn Giang và tất cả các anh, chị trong bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt thí nghiệm

Cảm ơn các bạn lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 37 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Trần Văn Nghĩa, 2015 “Khảo sát một số đặc tính các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh thán thư hại gấc” Luận văn tốt nghiệp kỹ sư

Bảo Vệ Thực Vật, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn Tiến sĩ Lê Minh Tường

TÓM LƯỢC

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 12/2013 đến tháng 10/2014 Mục tiêu của đề tài nhằm khảo sát đặc tính sinh học của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh thán thư trên gấc Đề tài được thực hiện gồm 2 phần:

Phần 1: Khảo sát đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong việc kiểm soát bệnh thán thư hại gấc thông qua các thí nghiệm xác định gram âm/gram dương, đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái

và đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng xạ khuẩn để từ đó làm cơ sở phân

loại xạ khuẩn Kết quả xác định chủng NCT.TG3 có thể là loài Streptomyces

pallidus, chủng NCT.TG4 có thể là loài Streptomyces vinaceus, chủng

NCT.TG10 có thể là loài Streptomyces showdoensis, chủng NCT.TG18 có thể

là loài Streptomyces exfoliates.

Phần 2: Khảo sát các cơ chế liên quan đến khả năng kiểm soát bệnh của các chủng xạ khuẩn có triển vọng như:

Đánh giá khả năng phân giải chitin của các chủng xạ khuẩn triển vọng trong phòng trừ bệnh thán thư hại gấc Kết quả cho thấy các chủng xạ khuẩn đều có khả năng phân giải chitin, trong đó mạnh nhất là chủng NCT.TG3 với chủng NCT.TG4 với bán kính vòng phân giải lần lượt là 13,60 mm và 12,90

mm ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy và khác biệt ý nghĩa so với các chủng xạ khuẩn còn lại

Đánh giá khả năng phân giải β-glucan của các chủng xạ khuẩn triển vọng trong phòng trừ bệnh thán thư hại gấc Kết quả cho thấy các chủng xạ khuẩn đều có khả năng phân giải β-glucan, tuy nhiên chậm hơn so với khả năng phân giải chitin Trong đó chủng có khả năng phân giải β-glucan mạnh nhất là chủng NCT.TG10 với bán kính vòng phân giải 4,00 mm và chủng NCT.TG4 với bán kính vòng phân giải 3,80 mm ở thời điểm 13 ngày sau khi cấy và khác biệt ý nghĩa so với các chủng xạ khuẩn còn lại

Từ khóa: Định danh, xạ khuẩn, đối kháng, phân giải chitin

MỤC LỤC Nội dung Trang

TÓM LƯỢC vi

MỤC LỤC vii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CÂY GẤC 2

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây Gấc 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 2

1.2 BỆNH THÁN THƯ HẠI GẤC DO NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY RA 3

1.2.1 Triệu chứng 3

1.2.2 Tác nhân 3

1.2.3 Đặc điểm phát triển và phát sinh bệnh 4

1.2.4 Biện pháp quản lý bệnh thán thư 5

1.2.4.1 Biện pháp canh tác 5

1.2.4.2 Biện pháp hóa học 5

1.2.4.3 Biện pháp sinh học 6

1.3 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 6

1.3.1 Phân loại và phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên 6

1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh học và ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phát triển xạ khuẩn 7

1.3.2.1 Hình thái và kích thước của xạ khuẩn 7

1.3.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn 7

1.3.2.3 Hình thái khuẩn lạc 8

1.3.2.4 Hình thái khuẩn ty 8

1.3.2.5 Hình thành bào tử 8

1.3.2.6 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng của xạ khuẩn 9

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 9

1.4.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 10

1.4.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 11

1.4.3 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11

1.5 CÁC KHẢ NĂNG LIÊN QUAN ĐẾN SỰ ỨC CHẾ TÁC NHÂN GÂY BỆNH CỦA XẠ KHUẨN 13

1.5.1 Khả năng tiết chất kháng sinh 13

1.5.2 Khả năng tiết enzyme phân giải 13

1.5.2.1 Khả năng phân giải cellulose 13

1.5.2.2 Khả năng phân giải chitin 14

1.6 VAI TRÒ CỦA XẠ KHUẨN TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH CÂY 15

1.6.1 Các kết quả nghiên cứu trong nước 15

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 PHƯƠNG TIỆN 17

2.1.1 Thời gian và địa điểm 17

2.1.2 Thiết bị và vật liệu dùng trong thí nghiệm 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP 19

Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong việc kiểm soát bệnh thán thư hại gấc 19

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 20

2.2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Xác định Gram âm/Gram dương của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng (Prescott et al., 2002) 20

2.2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất và sắc tố tan 21

2.2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Quan sát cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình dạng bào tử 21

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát đặc điểm sinh lý – sinh hóa của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong kiểm soát bệnh thán thư hại gấc 22

2.2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Khảo sát khả năng tiết enzym ngoại bào (enzyme protease) các chủng xạ khuẩn có triển vọng 22

2.2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát khả năng tiết enzym lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 22

2.2.2.3 Thí nghiệm 2.3: Khảo sát sự hình thành sắc tố melanin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 23

2.2.2.4 Thí nghiệm 2.4: Khảo sát khả năng đồng hóa nguồn carbon của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 23

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải chitin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 24

2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng phân giải β-glucan của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 24

2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 26

3.1.1 Gram của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 26

3.1.2 Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 27

3.1.3 Đặc điểm nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 28

3.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong kiểm soát bệnh thán thư hại gấc 30

3.2.1 Sự hình thành sắc tố melanin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 30

3.2.2 Khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn triển vọng 30

3.2.3 Khả năng phân giải lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 32

3.2.4 Khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn carbon của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong kiểm soát bệnh thán thư hại gấc 33

3.3 Vị trí phân loại của bốn chủng xạ khuẩn 34

3.3.1 Đặc điểm phân loại chủng NCT.TG3 34

3.3.2 Đặc điểm phân loại chủng NCT.TG4 35

3.3.3 Đặc điểm phân loại chủng NCT.TG10 37

3.3.4 Đặc điểm phân loại chủng NCT.TG18 39

3.4 Các cơ chế liên quan đến khả năng kiểm soát bệnh của các chủng xạ khuẩn

có triển vọng 40

3.4.1 Khả năng phân giải chitin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 40

3.4.2 Khả năng phân giải β-glucan của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

4.1 KẾT LUẬN 44

4.2 ĐỀ NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ CHƯƠNG 1 50

PHỤ CHƯƠNG 2 54

3.3 Bán kính vòng phân giải lipid (mm) của các chủng xạ

khuẩn trên môi trường MS qua 3, 5, 7 ngày sau khi cấy

30

3.4 Khả năng đồng hóa nguồn carbon của các chủng xạ khuẩn 30

3.9 Bán kính vòng phân giải chitin (mm) của các chủng xạ

khuẩn trên môi trường MS qua 3, 5, 7 ngày sau khi cấy

38

3.10 Bán kính vòng phân giải β-glucan (mm) của các chủng xạ

khuẩn trên môi trường MS qua 9, 11, 13 ngày sau khi cấy

40

DANH MỤC HÌNH

1.1 Dạng bào tử của Actinobispora (A), Actinomadura (B),

Actinoplanes (C), Micromonospora (D), Dactylosporangium

(E) và Cetenuplance (F)

9

1.2 Năm dạng bề mặt bào tử cơ bản của xạ khuẩn: dạng mịn (a -

b), nốt sần nhỏ, (c - d), gai (e - f), lông (g - h) và nhăn (i - j)

11

1.3 Dạng bào tử của một số loài Streptomyces 12 3.1 Màu sắc của các chủng xạ khuẩn sau khi nhuộm gram 23 3.2 Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng NCT.TG3 24 3.3 Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng NCT.TG4 24 3.4 Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng NCT.TG10 25 3.5 Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng NCT.TG18 25 3.6 Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng xạ khuẩn 27 3.7 Bán kính vòng phân giải chitin của các chủng xạ khuẩn trên

môi trường MS ở thời điểm 3 ngày sau khi cấy

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gấc (Momordica cochinchinesis) là một cây thực phẩm đặc biệt ở Việt

Nam Gần đây gấc trở thành một mặt hàng có giá trị kinh tế vì gấc không chỉ

là thực phẩm để chế biến thức ăn mà nó còn được sử dụng trong dược liệu vì trong gấc có một lượng lớn lycopene, là chất chống oxy hóa hàng đầu có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh thoái hóa, suy giảm miễn dịch và các chứng bệnh ung thư , ngoài ra trong trái gấc còn có β-Carotene, vitamin E, dầu

là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất thực phẩm chức năng vì vậy hiện nay gấc được người nông dân trồng rất nhiều Tuy nhiên việc canh tác gặp nhiều

khó khăn do sâu bệnh tấn công, đặc biệt bệnh thán thư do nấm Coletotrichum

spp gây ra, đây là bệnh nghiêm trọng gây hại trên lá, cuốn lá, hoa, trái, bệnh thường xuất hiện nặng vào mùa mưa, khi nhiệt độ và ẩm độ trong không khí cao, nước là nhân tố chính giúp phát tán bào tử và các tiểu hạch nấm (Cerckaukas, 2004; Roberts và ctv., 2009)

Hiện nay biện pháp hóa học vẫn là biện pháp chủ lực trong quản lí bệnh thán thư trên gấc Tuy nhiên việc sử dụng thuốc hóa học sẽ gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường Hơn nữa, hậu quả của việc lạm dụng thuốc hóa học còn giết chết các vi sinh vật đối kháng với dịch bệnh, từ đó làm mất cân bằng sinh thái và dịch bệnh dễ bộc phát (Phạm Văn Kim, 2000)

Để khắc phục những nhược điểm của biện pháp hóa học, biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang được sử dụng rộng rãi Gần đây, xạ khuẩn (Actinomycetes) được xem là tác nhân có triển vọng trong việc quản lí một số

bệnh hại thực vật Các nghiên cứu cho thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces sp

có khả năng đối kháng với nấm Coletotrichum orbiclare gây bệnh thán thư

trên ớt và có tiềm năng mạnh mẽ cho việc kiểm soát bệnh thán thư trên dưa

leo (Shimizu và ctv., 2008) Xạ khuẩn có khả năng chống lại Fusarium

oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật (Ngô Đình Quang Bính, 2005)

Gần đây, Lê Thị Mỹ Linh (2014) đã tìm ra được một số chủng xạ khuẩn

có khả năng phòng trị bệnh thán thư hại gấc do nấm Colletotrichum spp gây

ra Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ dừng lại ở mức độ thử nghiệm trong điều kiện nhà lưới và chưa có sản phẩm để có thể phục vụ cho nông dân cũng như việc định danh xạ khuẩn vẫn chưa được thực hiện

Vì thế đề tài “Khảo sát một số đặc tính của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh thán thư hại gấc” nhằm mục tiêu khảo sát

một số đặc tính sinh học của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CÂY GẤC

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố cây Gấc

Gấc tên khoa học là Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng., thuộc

bộ Vioales, họ Bầu bí (Cucurbitaceae), chi Momordica L, loài Cochinchinensis Còn gọi là mộc tất tử, Mắc khấu (Thổ), Mákkhâu (Thái) Họ này có 96 giống với 750 loài được trồng tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới nóng ẩm Cây Gấc có nguồn gốc Châu Á nhiệt đới, mọc hoang trong rừng Sau đó cư dân phát hiện đem về trồng khắp nơi, tập trung chủ yếu ở vùng Đông Nam Á như miền Nam Trung Quốc, Lào, Campuchia, Philippine và Việt Nam (Trần Đức Ba và ctv., 2006) Phân bố khắp Châu Á như Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Mã Lai (Võ Văn Chi, 2004)

Cây Gấc ở Việt Nam mọc hoang và đã được trồng khắp nơi Đây là nguồn nguyên liệu phong phú dồi dào cần được khai thác và chế biến làm nguồn chất màu thực phẩm và nguồn β-Carotene Ở nước ta, cây Gấc được trồng từ khắp vùng đất nước, nhưng nhiều nhất là miền Bắc là chủ yếu để làm thuốc và làm chất màu thực phẩm (Trần Đức Ba và ctv.,2006)

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Gấc thuộc dây leo (thân bò) Đa niên nhưng mọc như cây hằng niên Mỗi năm kết thúc một chu kì sinh trưởng dây rụng gần hết lá, khi đó cần chặt dây gần sát gốc và sau đó vào mùa xuân ở Miền Bắc hay đầu mùa mưa Miền Nam

từ gốc lại mọc ra nhiều chồi mới Mỗi gốc có nhiều dây và trên mỗi dây có nhiều đốt và mỗi đốt có mang một lá (Trần Đức Ba và ctv., 2006; Đỗ Tất Lợi, 2006)

Hoa Gấc thuộc dạng đơn tính biệt chu, có dây đực và dây cái (Phạm Hoàng Hộ, 1999) Hoa Gấc nở vào tháng 4 – 5 dương lịch, đực cái riêng biệt Hoa cái khi mới nẩy có hình trái Gấc con Hoa đực lúc đầu nấp trong lá bắc, được lá bắc bọc kính lại trông như tổ kiến, sau đó hoa nở thành hình loa màu vàng nhạt (Đỗ Tất Lợi, 2006)

Trái non có màu xanh nhạt chuyển dần sang xanh lục khi trái già, đến khi chín trái có màu vàng gạch đến đỏ rực hoặc đỏ thẩm trông rất đẹp Trái Gấc hơi tròn, to nhỏ tùy theo giống và điều kiện chăm sóc, toàn thân trái có gai to

và nhọn Trong trái có nhiều hạt, trung bình từ 30 – 40 hạt khá to xếp thành hàng dọc Vỏ hạt có màu đen, cứng, chung quanh mép hạt có răng cưa, tù và rộng Trong hạt chứa phôi mầm và nhân, nhân hạt chứa nhiều dầu (Trần Đức

Gấc trồng một năm thì cho trái, thu hoạch được quanh năm và nhiều năm, năm sau năng suất thường cao hơn năm trước Gấc là loại cây không kén đất, dễ trồng, có sức chống chịu cao với sâu bệnh (Trần Đức Ba và ctv., 2006; Trần Xuân Định, 2008)

1.2 BỆNH THÁN THƯ HẠI GẤC DO NẤM COLLETOTRICHUM SPP

GÂY RA

1.2.1 Triệu chứng

Theo Sở Khoa Học Và Công Nghệ Hải Dương (2012), bệnh thán thư có thể phá hoại từ giai đoạn mộc mầm, cây con Trên lá tử diệp cây con vết bệnh hình tròn, màu nâu đen, hơi lõm Trên thân cây con vết bệnh kéo dài, màu nâu vàng, hơi lõm xuống và nứt nẻ Bệnh nặng nhiều vết bệnh hợp lại thành vệt dài làm cây con khô chết, đổ rạp xuống Trên lá cây đã lớn vết bệnh thường nằm dọc theo gân lá, hình tròn, hình đa giác hoặc hình bất định Vết bệnh lúc đầu màu vàng nâu, sau đó chuyển sang màu nâu sẫm, có viền màu đỏ Trên vết bệnh có nhiều chấm nổi màu đen Trên cuống lá và thân cành vết bệnh kéo dài màu nâu sẫm, hơi lõm, cây còi cọc, lá vàng dễ rụng Bệnh nặng còn gây hại cả hoa và quả non làm rụng hoa và quả Trên vỏ quả vết bệnh hình tròn màu nâu vàng hơi lõm

1.2.2 Tác nhân

Do nấm Colletotrichum spp gây ra Nấm Colletotrichum thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes), bộ nấm đĩa đài (Molanconiales) (Phạm Văn Kim, 2003) Sợi nấm Colletotrichum spp có vách ngăn, sinh sản vô tính cho

ra các bào tử đính Bào tử đính đơn bào, không màu có hình trụ hai đầu nhọn hoặc hình lưỡi liềm, đĩa đài mang nhiều gai cứng (Phạm Văn Kim, 2000) Đĩa đài dạng tròn hoặc dạng gối, có sáp màu đen, có gai ở mép bìa đĩa đài hoặc giữa các cành bào đài; cành bào đài đơn giản, thon dài, bào tử trong suốt, một

tế bào, dạng trứng hoặc dạng thon đến hình liềm (Sutton, 1980) Ở giai đoạn

sinh sản hữu tính, nấm Colletotrichum thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes) có tên là Glomerella cũng cho ra dạng bào tử nang đơn bào (Agrios, 2005)

Chi Colletotrichum được mô tả có 21 loài (trích dẫn của Cao Ngọc Điệp

và Nguyễn Văn Thành, 2009) Sutton (1992) đã phân loại Colletotrichum

thành 39 loài dựa trên tiêu chuẩn chi tiết về hình thái, đặc điểm nuôi cấy và

khả năng gây bệnh, trong đó C coccodes, C dematium, C gloeosporioides, C

graminicola, C falcatum và C capsici…là những loài thường gây bệnh thán

thư thường gặp

Sợi nấm nội sinh, mảnh, không màu, không phân nhánh, có vách ngăn,

có nội bào tử và gian bào Khi già sợi nấm trở nên sậm màu và bệnh xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng (Cao Ngọc Diệp và ctv, 2009)

Theo Bartnett et al (1998) mô tả chi Colletotrichum spp có dạng đĩa đài

tròn hoặc dạng gối, có sáp màu đen, có gai ở mép rìa đĩa đài hoặc giữa các cành bào đài Cành bào đài đơn bào, có sáp màu đen, có gai ở mép rìa đĩa hoặc giữa các cành bào đài Cành bào đài đơn bào, thon dài, bào tử trong suốt Một

tế bào dạng trứng hoặc dạng thon đến dạng liềm, nấm sống ký sinh và là giai

đoạn bất toàn của chi Glomerella

Colletotrichum chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát

triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử; Cụm cuống bào tử có dạng địa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào

tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Cùng với bào tử và cuống bào tử các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ (Cao Ngọc

Điệp và ctv, 2009)

Sự hình thành một số lượng lớn bào tử gây nứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử mọc từ một đến nhiều ống mầm để hình

thành hệ sợi nấm; Đĩa bám là dạng của Colletotrichum spp trong nuôi cấy

(Sutton, 1962) Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử (Chlamydospores), nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới (Cao Ngọc Điệp và ctv, 2009)

1.2.3 Đặc điểm phát triển và phát sinh bệnh

Khi độ ẩm không khí tăng cao tạo điều kiện cho sự mộc mầm của bào tử

và sự xâm nhiễm bệnh Nước là nhân tố chính giúp phát tán bào tử và các tiểu hạch nấm (Cerckaukas, 2004; Roberts và ctv., 2009) Bào tử nấm

Colletotrichum spp mọc mầm rất nhanh trong điều kiện có giọt nước mưa bắn

tung tóe bào tử lên các bộ phận sinh trưởng của cây và sẽ xâm nhiễm rất nhanh (Sharma, 2006;Vũ Triệu Mân, 2007) Trên trái nhiệt độ khoảng 280C,

ẩm độ 95,7% bệnh sẽ bộc phát rất nhanh (Sharma, 2006)

Nhờ các yếu tố như: gió , nước mưa, côn trùng hay con người, nấm được phát tán từ nơi này đến nơi khác (Phạm Văn Biên và ctv.,2003; Sharma, 2006) Trái ở vị trí gần mặt đất thì dễ bị xâm nhiễm hơn do nước mưa bắn tung bào tử lên hay do tiếp xúc trực tiếp với mặt đất (Cerkauskas, 2004)

Ngoài ra, hạt từ trái bị nhiễm bệnh cũng là nguồn phát sinh mầm bệnh sơ khởi (Phạm Văn Biên và ctv.,2003; Sharma, 2006)

Theo Mai Thị Phương Anh (1999), bệnh thường xuất hiện vào lúc trái chín rộ, vào thời điểm nhiệt độ cao (300C), mưa nhiều Theo thí nghiệm của Astuti, Suhardi (1986) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ và sự chín của trái đã kết luận rằng ở nhiệt độ 300C bào tử của nấm Colletotrichum

capsicum được hình thành cao nhất

1.2.4 Biện pháp quản lý bệnh thán thư

Cây trồng, mầm bệnh, kỹ thuật canh tác, điều kiện môi trường có mối quan hệ tác động qua lại lẫn nhau Quá trình tấn công của một loại mầm bệnh nào đó trên cây trồng phụ thuộc rất nhiều yếu tố như áp lực nguồn bệnh, điều kiện môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…), tình trạng sức khỏe của cây, sự khác biệt về loài và kĩ thuật canh tác của người sản xuất Cần phải hiểu được đặc điểm sinh trưởng và phát triển của các đối tượng này để có thể lợi dụng tự nhiên, áp dụng kĩ thuật canh tác nhằm tác động bất lợi cho sự phát triển của mầm bệnh, tạo điều kiện thuận lợi cho cây trồng khỏe mạnh thì việc quản lí bênh hại sẽ nhẹ và đơn giản hơn (Phạm Văn Kim, 1999)

Đối với bệnh thán thư thì việc phòng ngừa hết sức quan trọng vì bệnh chỉ phát triển dưới điều kiện ẩm ướt, việc dùng hóa chất gặp nhiều khó khăn, đôi khi không đem lại hiệu quả, gây lãng phí Chính vì vậy, để có thể giảm tối đa

thiệt hại do nấm Colletotrichum spp gây ra, một cách tổng quát là phải phối

hợp liên hoàn từ khâu chọn giống, biện pháp canh tác cho đến biện pháp hóa học, có như vậy thì hiệu quả sẽ mang lại thiết thực hơn (Trần Khắc Phi, Nguyễn Văn Thắng, 1999)

1.2.4.1 Biện pháp canh tác

Để hạn chế bệnh thán thư thì đồng ruộng phải thoát nước tốt (Roberts và ctv., 2009) Sử dụng màn phủ giúp hạn chế sự tung tóe mầm bệnh lên trái và các lá ở vị trí thấp gần mặt đất (Cerkaukas, 2004) Bênh cạnh đó cần vệ sinh đồng ruộng, diệt cỏ dại và thu dọn các tàn dư cây trồng ở vụ trước (Phạm Văn Biên và ctv., 2003; Roberts và ctv., 2009) Khi sử dụng trái để làm giống thì

nên chọn những trái khỏe (Sharma, 2006)

1.2.4.2 Biện pháp hóa học

Việc kiểm soát bệnh phụ thuộc vào việc xác định đúng tác nhân gây bệnh, chon đúng thời điểm áp dụng và chọn đúng loại thuốc (Cho, 1986) Sử dụng các loại thuốc trừ nấm ngay khi trái bắt đầu nhiễm bệnh có thể ngăn chặn

hoặc hạn chế tối đa sự xuất hiện bệnh Ngoài việc sử dụng đúng liều cần đảm bảo cho thuốc tiếp xúc tốt với trái (Cerkaukas, 2004)

Khi bệnh mới phát sinh có thể phun các loại thuốc gốc đồng, Carbendazim, Score, Mancozeb, Daconil (Phạm Văn Biên và ctv., 2003)

1.2.4.3 Biện pháp sinh học

Kết quả khảo sát về khả năng kiểm soát bệnh thán thư gây ra bởi

C.gloeosporioides trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy dịch trích từ

chồi của cây tỏi (Alliumsativum) với nồng độ 10% cho hiệu quả ức chế sự phát triển sợi nấm là 54,75%; dịch trích từ lá của cây neem (Azadirachta indica) và

từ chồi của cây tre (Dendrocalamus hemiltonii) cho hiệu quả ức chế lần lượt là

42,23% và 40,72% (Nugllie và ctv., 2010)

Hai loài vi khuẩn Pseudomonas fluorescens và Bacillus subtilis được

phân lập từ đất vùng rễ của cây ớt đã được đánh giá có khả năng đối kháng với

nấm Colletotrichum capsici gây bệnh thối trái trên ớt (Bharathi và ctv., 2004)

1.3 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN

1.3.1 Phân loại và phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacterria) thuộc nhóm vi khuẩn thật ( Eubacterria) phân

bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không thể phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức

độ canh tác và thảm thực vật (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002)

Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 – 7,5

Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 – 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh ( Bùi Thị Hà, 2008)

1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh học và ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phát triển xạ khuẩn

1.3.2.1 Hình thái và kích thước của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương, thường có tỉ lệ GC trong AND cao hơn 55% Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố

có khoảng 100 chi và 1000 xạ khuẩn

Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám v.v… Màu sắc của

xạ khuẩn là một đặc điểm phân loại quan trọng Đường kính của xạ khuẩn khoảng từ 0,1 – 0,5 µm (Bùi Thị Hà, 2008)

Có thể phân biệt được hai loại sợi Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn Sợi cơ chất là sợi cấm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh Đây cũng là đặc điểm phân loại quan trọng (Đỗ Thu Hà, 2004)

1.3.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn

Xạ Khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ

cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào: có kết cấu dạng lưới, dày 10-20 nm có tác dụng duy trì

hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp trong và lớp giữa Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và chitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và vận chuyển vật chất qua màng tế bào Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv (2002) cho biết thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 8 loại dựa trên các đặc điểm về thành phần acid amin, đặc biệt là acid diaminopimelic, lysine và thành phần đường trong thành tế bào

Màng nguyên sinh chất: dày khoảng 50nm, được cấu tạo chủ yếu bởi 2

thành phần là phospholopid, protein và có cấu trúc giống với màng sinh chất của vi khuẩn Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổichất

và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002)

Nguyên sinh chất và nhân: có cấu tạo tương tự như tế bào vi khuẩn

Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn có chứa: mezoxom,ribosome, các vật thể

ẩn nhập gồm các hạt polyphosphate hình cầu, bắt màu nhuộm Soudan III, các hạt polysaccharide bắt màu dung dịch lugol (Nguyễn Xuân Thành và ctv.,

( Prokaryotes) ở chỗ chúng có tỷ lệ G+C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ 25 – 45% (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002)

1.3.2.3 Hình thái khuẩn lạc

Xạ khuẩn có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (action-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces) (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Kim Nữ Thảo, 2006) Màu sắc cũng như kích thước của khuẩn lạc rất khác nhau tùy theo loài và tùy vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,

da cam, vàng, nâu, xám, trắng… Tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ từ 0,5 – 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm hoặc lớn hơn Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ông ( Trích dẫn bởi Bùi Thị Hà, 2008)

1.3.2.4 Hình thái khuẩn ty

Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai loại xạ khuẩn ty: Một loại phát triển trên bề mặt cơ thể gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) và một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty

cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ năng chủ yếu là dinh dưỡng Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh Khi đó hệ sợi khí sinh vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006; Lê Xuân Phương, 2008; Prescott và ctv., 2008)

1.3.2.5 Hình thành bào tử

Theo Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo (2006), xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng bào tử Bào tử hình thành trên cuống bào tử theo 2 phương pháp: kết đoạn hoặc cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng tế bào có thể nhẵn, gai khối u, nếp nhăn Tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores) Nếu bào tử nằm trong bào nang hay bạo bào

tử (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores) Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành vách ngăn (septa) Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vât nhân sợi nhưng

chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử như chi

Streptosporangium, micromonospora và bào tử di động như chi Actinoplanes, Kineosporia (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006)

Hình 1.1 Dạng bào tử của Actinobispora (A), Actinomadura (B),

Actinoplanes (C), Micromonospora (D), Dactylosporangium (E) và Cetenuplance (F) (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006)

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trong nhất trong phân loại xạ khuẩn Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh giảm đi (Bùi Thị Hà, 2008)

1.3.2.6 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong dải pH từ 5 – 9, khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh nhiều nhất là pH =7 Xạ khuẩn sinh trưởng được ở nhiệt độ trên 25 – 400C, hoạt tính kháng sinh và sinh khối cao nhất ở 30 –

350C, nhiệt độ trên 400C thì khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất kháng sinh đều giảm đáng kể (Phạm Văn Ty và Đào Thị Lương, 2003)

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN

Hiện nay, có nhiều khóa phân loại khác nhau được đưa ra nhằm mục đích phân loại xạ khuẩn tới chi và loài, như các khóa phân loại của Waksman (1916, 1919, 1961), của Craxilnhicop (1949, 1970), của Flaig – Kutzner (1954, 1960), của Gause (1957), Pridham (1972), Bergey (1989), Goodfellow (2000)…Đồng thời để thống nhất trong cách mô tả xạ khuẩn, chương trình xạ

khuẩn quốc tế (ISP) đã đưa ra các phương pháp chung và môi trường chuẩn để phân loại nhóm VSV này Đánh giá của ISP dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn trên các môi trường từ ISP1 đến ISP9 (Trích bởi Đỗ Thị Tuyến, 2011)

Theo Waksman (1961), nguyên tắc phân loại của xạ khuẩn dựa trên các đặc điểm sau:

1 Hình thái của bào tử: kích thước, hình dạng và bề mặt của bào tử

2 Màu sắc của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất

3 Màu sắc của môi trường khi có xạ khuẩn phát triển

4 Sự hình thành sắc tố màu đen trên môi trường protein

5 Sự hình thành sắc tố hoà tan trên môi trường tổng hợp

6 Một số đặc tính sinh hoá, đặc biệt là khả năng phân huỷ tinh bột, phân giải lipid, khử nitrat, đồng hoá nguồn cacbon và hình thành các cơ chất kháng sinh đặc hữu hiệu

Dưới đây là một số đặc điểm cơ bản để phân loại xạ khuẩn:

1.4.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào từ, hình dạng và

bề mặt bào tử

Theo Pridham và cộng sự (1958), cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm:

RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn

Hình 1.2 Năm dạng bề mặt bào tử cơ bản của xạ khuẩn: dạng trơn (a - b), nốt sần nhỏ, (c - d), gai (e - f), lông (g - h) và nhăn (i - j) (John, 2010) Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản trong phân loại xạ khuẩn Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau

về mặt hình thái Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học…(Bùi Thị Hà, 2008)

1.4.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

Hopwood (1997) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý – sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi (Bùi Thị Hà, 2008)

1.4.3 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và

Henrici đặt tên năm 1943 Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 – 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có

chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi khuẩn ty khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi

khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng… Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn…tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất

khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi

nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm vi sinh vật này

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh)

Hình 1.3 Dạng bào tử của một số loài Streptomyces (Nguyễn Lân Dũng và

Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006)

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động

vật Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà

phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau (Bùi Thị Hà, 2008)

1.5 CÁC KHẢ NĂNG LIÊN QUAN ĐẾN SỰ ỨC CHẾ TÁC NHÂN GÂY BỆNH CỦA XẠ KHUẨN

1.5.1 Khả năng tiết chất kháng sinh

Đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng tiết chất kháng sinh Cho tới nay khoảng 8000 chất kháng sinh được biết trên thế giới thì có tới 80% là

do xạ khuẩn sinh ra Trong đó, chất kháng sinh chủ yếu là do Streptomyces sản xuất ra chiếm 45,6% (Ambarwati et al., 2012 trích bởi Tô Huỳnh Như, 2012)

Tuy nhiên có trên 15% chất kháng sinh có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn

hiếm như: Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium,

Treptosporagium…Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều

chất kháng sinh có giá trị đang dung trong y học như hentamycin, tobramycin, vancomycin, rovamycine (Vi Thị Đoan Chính, 2000 trích bởi Bùi Thị Hà, 2008)

Theo kết quả nghiên cứu của Nishimura et al (2002) đã phân lập được

xạ khuẩn nội sinh là chủng Streptomyces sp AOK-30 được phân lập từ cây

nguyệt quế có khả năng tiết chất kháng sinh chống lại các loại nấm gây bệnh

là Phytopthora cinamomi, Pythium sp pestalotiopsis sydowiana, Colletotrichum sp., Phomopsis sp Bên cạnh đó, thì Streptomyces sp (MTCC

6819) là chủng sản xuất chất kháng sinh với phổ kháng khuẩn rộng đối với cả

vi khuẩn gram dương và gram âm gây bệnh (Banga et al., 2008)

Theo kết quả nghiên cứu của Kim et al (1998) đã phân lập được 481

chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất ở hang động và đất ven biển của Hàn Quốc Trong đó, 189 chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế các loại nấm gây bệnh quan

trọng trên cây trồng như: Alternaria solani, Colletotrichum gloeosporioides,

Fusarium oxysporum f.sp lycopersici, Magnaporthe grisea, P capsici và Rhizoctonia solani Bên cạnh đó, đã phân lập được chất kháng sinh

approximately 10% trên môi trường M3 được tiết ra từ xạ khuẩn

1.5.2 Khả năng tiết enzyme phân giải

1.5.2.1 Khả năng phân giải cellulose

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tập và bền vững như cellulose, chất mùn, chitin, lignin, v.v…Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12); một số axit hữu cơ như axit lactic, axit acetic và nhiều axit amin như axit glutamic, axit metiomin, tritofan, lizin Xạ khuẩn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp enzyme, chế tạo các chế phẩm enzyme hoặc ứng dụng các enzyme do xạ

khuẩn có khả năng sinh ra nhiều như: protease, amylase, cellulose, chitinase…(Phạm Văn Kim, 2000; Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2006;

Shimizu et al., 2009)

Glucan là một loại polymers trong thành tế bào của nấm, thông thường là

β-1,3 hoặc β-1,4-glucan Do đó, Streptomyces là một tác nhân phòng trừ sinh

học có thể đối kháng lại với nhiều nấm bệnh quan trọng thông qua việc tiết các enzyme phân giải thành phần quan trọng của cấu tạo vách tế bào nấm như 1,3

β-D-glucanase (Park et al., 2012) Theo Nagpure et al (2013) cho biết chủng

Streptomyces sp MT7 có khả năng tiết ra các enzyme thủy phân quan trọng

như: chitinase, β-1,3-glucanase, protease và siderophores Do đó, chủng

Streptomyces sp MT7 được xem như một tác nhân sinh học để kiểm soát các

tác nhân gây bệnh Theo kết quả nghiên cứu khác cũng tìm ra Streptomyces sp EF-14 có khả năng chống lại nấm Phytopthora spp vì chúng có khả năng tiết

enzyme phân giải β-1,6-glucanase là thành phần đặc biệt trong cấu tạo vách tế

bào nấm Phytopthora spp (Fayad et al., 2001)

1.5.2.2 Khả năng phân giải chitin

Theo Phạm Văn Kim (2000) cho biết vách tế bào nấm có nhiều thành phần như glucan, chitin, và protein Trong đó, chitin chiếm khoảng 22-44%

trong vách tế bào của nấm (Berahim, 2007).Theo Quecine et al., (2008) thì

chitinase kiểm soát nấm gây bệnh bằng hai cơ chế là tác động trực tiếp trên thành tế bào nấm và làm tăng khả năng kháng bệnh của cây Cũng theo ghi

nhận của Radjacommare et al (2004) thì chitinase thuộc nhóm (PRs)

(pathohenesis-ralated proteins) là một trong những enzyme liên quan đến cơ chế kích kháng ở cây trồng Theo cơ chế này thì khi chitin bị phân giải bởi enzyme chitinase và thành N-acetylglucosamine đã gây nên những phản ứng

sublineolum và F oxysporum hơn đối với các nấm thuộc lớp nấm noãn

(Oomycetes) như P parasitica và Pythium sp (Taechowisan et al., 2003; Quecine et al., 2008)

1.6 VAI TRÒ CỦA XẠ KHUẨN TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH CÂY

1.6.1 Các kết quả nghiên cứu trong nước

Theo Phạm Văn Kim (2000) cho biết trong nhóm xạ khuẩn, bộ Actinomycetales và đặc biệt là họ Streptomycetaceae có liên hệ với nông nghiệp nhất Hiện nay, chúng ta đã dùng rất nhiều loại thuốc phòng trị bệnh cây là những chất kháng sinh do các xạ khuẩn tiết ra như: aureofungin do

Streptomyces cinnamomens var tericola, blasticidin – S do S griseo – Chromogenes, kasugamycin do S kasugagiensis và validamycin do S hygroscopicus var limoneus nov var Iwasa và ctv…

Đỗ Thu Hà (2004) cho biết 2 chủng Streptomyces QN-29 và ĐN-110 có

khả năng diệt nấm gây bệnh thối gốc và lở cổ rễ ở cây cà chua và cây đậu đỗ làm giảm hẳn tỉ lệ mắc bệnh ở cây con, không gây dị ứng ở cây con Đối với cây cà chua con, chủng QN-29 đã làm giảm từ 50% xuống còn 30% cây bị bệnh, chủng ĐN-110 làm giảm từ 50% xuống 32% Còn đối với cây đậu đỗ chủng QN-29 làm giảm từ 65% xuống còn 38%, chủng ĐN-110 làm giảm từ 65% xuống còn 40% Đối với nấm gây bệnh héo rũ mốc đen ở lạc do

Aspergillus niger thì chủng QN-29 đã làm giảm từ 45% xuống còn 25%,

chủng ĐN-110 làm giảm từ 45% xuống 28%

Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Việt Hà (2006) cho biết đã phân lập được 508 chủng xạ khuẩn và chọn ra được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính

kháng nấm gây bệnh thực vật cao nhất là Streptomyces antimycoticus,

Streptomyces diastatochromogenes và Streptomyces hygrocopicus Bên cạnh

đó đã bước đầu ứng dụng 3 loại chế phẩm sản xuất từ 3 chủng xạ khuẩn này

trong phòng trừ bệnh mốc trắng ở cà chua do nấm Sclerotium rolfsii, bệnh lở

cổ rễ và thối bắp trên bắp cải, bệnh khô vằn trên lúa do Rhizoctonia solani

Cũng theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Hà (2008) đã phân lập được 80

chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Trong đó, có 30 chủng có hoạt tính

kháng nấm ở mức độ khác nhau đối với 3 chủng nấm 1A, 2E và 5X

CT-Đặng Thị Kim Quyên (2010) cho biết chủng Streptomyces-SOFRI 1 có khả năng đối kháng tốt với nấm Fusharium solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên chanh Volka Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy chủng Streptomyces- SOFRI 1 có khả năng kiểm soát tốt bệnh do nấm F solani gây ra và còn có

khả năng kích khả năng nẩy mầm và phát triển của cây chanh Volka

Theo kết quả nghiên cứu của Tô Huỳnh Như (2012) chủng xạ khuẩn

gây ra Bênh cạnh đó, Đoàn Thị Kiều Tiên (2012) cũng đã ghi nhận được 4 chủng xạ khuẩn là 3, 6, 25 và 79 có khả năng ức chế và kiểm soát bệnh héo rũ

trên mè do nấm F oxysporum

1.6.2 Các nghiên cứu trên thế giới

Một số chủng xạ khuẩn có tiềm năng để làm tác nhân phòng trừ sinh học

hiệu quả và kích thích tăng trưởng thực vật Trong đó, chi Streptomyces đã

được nghiên cứu và ứng dụng để kiểm soát các tác nhân gây bệnh có nguồn

gốc từ đất vì có khả năng tiết ra các chất kháng nấm khác nhau (Shimizu et al.,

2009) Xạ khuẩn đối kháng được với một loạt tác nhân gây bệnh cây trồng như

Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium, Fusarium và Macrophomina spp

(Valois et al., 1996)

Theo Valois et al (1996) ghi nhận tại Trung Quốc đã sử dụng

Streptomyces sp chủng 5406 để chống lại các mầm bệnh từ đất trên cây bông

Hơn nữa, một số thí nghiệm đã chứng minh rằng các chủng Streptomyces cụ

thể có thể giảm đáng kể thiệt hại gây ra bởi Pythium hoặc Phytophthora trên cây họ đậu Gần đây, một thuốc sinh học diệt nấm có chứa tế bào sống

Streptomyces griseoviridis bảo vệ cây trồng chống lại sự xâm nhiễm của nấm Fusarium và Alternaria

Theo kết quả nghiên cứu của Zarandi et al (2009) có 10 chủng

Streptomyces có thể chống lại bệnh đạo ôn lúa do nấm Mafnaporthe oryzae

gây ra trong điều kiện nhà kính

Theo kết quả nghiên cứu của Gangwar et al (2011) với tổng số 40 chủng

xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ, thân, lá của ba loại cây Aloe vera, Mentha và ocimum sanctu có khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh quan

trọng: Aspergillus niger, A flavus, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea,

Penicillium digitatum Fusarium oxysporum, P pinophilum, Phytophthora dresclea, và Colletotrichum fulcatum

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 12/2013 đến tháng 10/2014

Địa điểm: Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông

nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

2.1.2 Thiết bị và vật liệu dùng trong thí nghiệm

Nguồn vi sinh vật đối kháng: 4 chủng xạ khuẩn NCT.TG3, NCT.TG4,

NCT.TG10, NCT.TG18 có khả năng quản lý bệnh thán thư hại gấc nhận được

từ phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp

và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ Các chủng xạ khuẩn trên do Hoàng Trọng Nam (2013) phân lập trên môi trường chọn lọc xạ khuẩn (chitin agar) từ những mẫu đất thu thập được tại vườn gấc ở Nhị Bình, Châu Thành, Tiền Giang

Dụng cụ sử dụng trong phòng thí nghiệm: Gồm micropipette, đĩa

petri, ống nghiệm, bình tam giác ống đông, que cấy, đèn cồn, bông gòn, cồn

700 …

Thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm: Tủ cấy vi sinh (PVP clean

bench, Japan), nồi hấp, cân điện tử…

Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

 Môi trường MS (Mannitol Soyal four medium) (Hobbs et al., 1989)

 Môi trường ISP – 2 (Shurtleff and Averre, 1997)

 Môi trường ISP - 7 (Shinobu, 1958) (trích dẫn bởi Shirling and

 Môi trường Skim milk agar (Jha et al., 2009)

Sữa bột gạn béo thanh trùng 70 g

 Môi trường tinh bột (Santos et al., 2012): tinh bột tan - 10g;

yeast extract – 1g; agar – 15g; NaNO3 - 1.2g; KH2PO4 3g; K2HPO4 – 6g; MgSO4.7H2O - 0.2g; CaCl2.2H2O - 0.05g; MnSO4.7H2O 0.01g; ZnSO4.7H2O - 0.001g; pH =7; Nước cất – 1 lít

2.2 PHƯƠNG PHÁP

Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong việc kiểm soát bệnh thán thư hại gấc

Mục tiêu: nhằm khảo sát các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý, sinh

hóa của các chủng xạ khuẩn triển vọng có khả năng đối kháng với nấm

Colletotrichum spp gây bệnh thán thư hại gấc

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng

2.2.1.1 Thí nghiệm 1.1: Xác định Gram âm/Gram dương của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng (Prescott et al., 2002)

Mục tiêu: nhằm xác định các chủng xạ khuẩn triển vọng thuộc gram

Iodine 1g Potassium iodied 2g Nước cất 100ml + Dung dịch C (carbon fuchsin)

Basic fuchsin 1g Absolute ethanol 10ml Phenol 5g

Nước cất 1600ml

Cách thực hiện:

Bước 1: Trãi đều giọt huyền phù xạ khuẩn trên lame, sau đó cố định

xạ khuẩn bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn

Bước 2: Nhỏ dung dịch A lên lame (xạ khuẩn đã cố định) trong thời gian từ 1-2 phút, tiếp theo nhỏ dung dịch B trong 1 phút Đổ bỏ thuốc thừa và rửa lame bằng cồn 950

cho đến khi nào không còn màu chảy ra nữa, kế tiếp rửa qua nước cất, để khô và nhuộm với dung dịch C trong 15 giây, rửa nước và để khô

Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 100X, xạ khuẩn Gram âm sẽ có màu đỏ, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím

2.2.1.2 Thí nghiệm 1.2: Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất

Ghi nhận màu sắc của khuẩn ty cơ chất theo Szabó and Marton (1964): quan sát màu sắc khuẩn lạc của xạ khuẩn ở mặt sau đĩa Petri Ghi nhận các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh

da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây Nếu thấy các màu trên ký hiệu

là (1), nếu không ký hiệu là (0) ( trích bởi Shirling & Gottlieb,1966)

Sắc tố hòa tan vào môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím… Nếu có ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0)

2.2.1.3 Thí nghiệm 1.3: Quan sát cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình dạng bào tử

Mục tiêu: Quan sát và ghi nhận hình dạng cuống sinh bào tử của các

chủng xạ khuẩn triển vọng

Tiến hành:

Bước 1: Cắt những miếng thạch môi trường MS (1cm x 1cm) đặt lên miếng lam vô trùng Tiếp theo cấy xạ khuẩn lên miếng thạch môi trường, sau đó đậy lamen lại

Bước 2: Đặt miếng lame trong đĩa petri đã vô trùng trong điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối, ở nhiệt độ 280C Tiến hành nuôi cấy mỗi chủng trên năm đĩa petri

Bước 3: Sau 10 ngày quan sát cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử của

xạ khuẩn dưới kính hiển vi điện tử