đánh giá đa dạng di truyền một số quần thể ngao bến tre meretrix lyrata ( sowerby, 1851) tại việt nam bằng chỉ thị microsatellite

NGUYỄN THỊ HIẾN ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ QUẦN THỂ NGAO BẾN TRE Meretrix lyrata Sowerby, 1851 TẠI VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



NGUYỄN THỊ HIẾN

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ

QUẦN THỂ NGAO BẾN TRE Meretrix lyrata ( Sowerby, 1851)

TẠI VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE

CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

MÃ SỐ:60.62.03.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS THÁI THANH BÌNH

HÀ NỘI – 2014

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ bất kỳ một học vị nào Kết quả có được ở luận văn do sự cố gắng làm việc, nghiên cứu và học hỏi một cách nghiêm túc của bản thân

Tác giả

Nguyễn Thị Hiến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Thái Thanh Bình - Trưởng phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế - Trường Cao đẳng Thủy sản, người đã định hướng cũng như tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn ThS Hoàng Thị Phương Hồng cùng các cán bộ làm việc tại Phòng thí nghiệm - Trường Cao đẳng Thủy sản đã nhiệt tình hướng dẫn kỹ thuật phân tích Microsatellite

Tôi xin được trân trọng cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I đã tạo điều kiện cho tôi có được khóa học này

Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ, những lời động viên của bạn bè, đồng nghiệp dành cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng lời cảm ơn xin được dành cho bố, mẹ và những anh chị em trong gia đình, đặc biệt là người chồng của tôi đã động viên, giúp đỡ tôi trong học tập và cuộc sống

Đề tài được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Đánh giá đa dạng

di truyền một số quần thể ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) tại Việt

Nam bằng chỉ thị microsatellite”

Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2014

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đa dạng di truyền 3

1.2 Chỉ thị phân tử Microsatellite 3

1.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) 5

1.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền các loài thủy sản ở Việt Nam 8

1.5 Một số đặc điểm sinh học của ngao Bến Tre 11

1.5.1 Hệ thống phân loại ngao Bến Tre 11

1.5.2 Nguồn gốc và sự phân bố của ngao Bến Tre 12

1.5.3 Đặc điểm hình thái- sinh thái 14

1.5.4 Đặc điểm dinh dưỡng 14

1.5.5 Đặc điểm sinh trưởng 15

1.5.6 Đặc điểm sinh sản và phát triển 15

1.6 Tình hình nuôi ngao Bến Tre ở thế giới và Việt Nam 15

1.6.1 Tình hình nuôi ngao trên thế giới 15

1.6.2 Tình hình phát triển nuôi ngao tại Việt Nam 16

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

1.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền ngao Bến Tre ở Thế Giới và Việt Nam 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.1.2 Phương pháp thu và bảo quản mẫu 24

2.1.3 Thiết bị 24

2.1.4 Hóa chất 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Tách ADN tổng số 27

2.2.2 Nhân ADN đặc hiệu 31

2.2.3 Phân tích đa hình alen các locus Microsatellite 33

2.2.4 Phân tích thống kê 37

2.2.5 Xác định cấu trúc quần thể 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 39

3.2 Kết quả nhân ADN đặc hiệu 40

3.3 Mức độ đa dạng di truyền của một số quần thể ngao Việt Nam 42

3.4 Mức độ cận huyết của các quần thể ngao 45

3.5 Mối quan hệ và khoảng cách di truyền giữa các quần thể 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48

Kết luận 48

Đề xuất 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 55

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Địa điểm thu mẫu và số lượng mẫu phân tích 24

Bảng 2.2: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 31

Bảng 2.3: Cặp mồi dùng để khuếch đại Microsatellite của ngao 32

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32

Bảng 3.1 Số lượng alen, tần số dị hợp tử theo lý thuyết (He), tần số dị hợp tử quan sát (Ho), giá trị thông tin đa hình (PIC), hệ số cận huyết và kết quả kiểm định từng locus Microsatellite với giả thiết không cân bằng di truyền Hardy-Weinberg 42

Bảng 3.2 Tần số dị hợp tử quan sát (Ho), dị hợp tử mong đợi theo lý thuyết (He) trung bình alen trên locut (K), Hệ số đồng huyết (Fis), kiểm định với giả thuyết không tuân theo định luật di truyền Hardy – Weinberg ở các quần thể ngao 44

Bảng 3.3 Ma trận giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa các quần thể phân bố ở 6 quần thể ngao 45

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR 8

Hình 1.2 Ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) 12

Hình 1.3 Phân bố của ngao Meretrix sp trên thế giới (theo Sealife) 13

Hình 1.4 Bãi nuôi ngao tại Giao Thủy – Nam Định 18

Hình 2.1 Bản đồ thu mẫu ngao Bến Tre 23

Hình 2.2 Máy PCR MyGenic 96 Thermal Block 25

Hình 2.3 Cách tiến hành nhuộm 36

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ADN tổng số quần thể ngao Bến Tre tại Thanh Hóa trên gel agarose 1% 40

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm Microsatellte quần ngao Nam Định với loci MME15 - CQ141846 kiểm tra trên gel Agarose1% 41

Hình 3.3 Kết quả sản phẩm Microsatellite với loci MME15-GQ141846 của quần thể ngao Nam Định được điện di trên gel polyacrylamide 4,5% 42

Hình 3.4 Cây phân loài di truyền của một số quần thể ngao ở Việt Nam 46

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN

BP

Acid desoxyribonucleic Base pair

dNTP Deoxy nucleoside triphosphat

Taq

TAE

Thermus a quaticus Tris - glacial acetic acid - ethylene diamine tetra acetic acid)

TB

TE

Trung bình Tris – EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid)

V

UV

Đơn vị đo hiệu điện thế Ultra Violet

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Động vật thân mềm được xem là đối tượng thích hợp cho phát triển nuôi biển Đây là một trong những xu thế của nuôi trồng thủy sản thế kỷ 21 Trong những năm qua, nghề nuôi biển phát triển nhanh chóng đã đem lại công ăn việc làm

và góp phần cải thiện đời sống cộng đồng dân cư ven biển Trong đó, nuôi ngao được xem là điển hình và hiệu quả nhất trong các đối tượng nuôi nhuyễn thể ở vùng cửa sông ven biển Việt Nam (Nguyễn Thanh Tùng, 2007)

Ngao Bến Tre (Meretrix lyrata) là loài ngao được nuôi phổ biến nhất ở Việt

Nam bởi giá trị dinh dưỡng, khả năng khai thác và đặc tính thích nghi của chúng với môi trường

Phong trào nuôi ngao ở Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ, một số trại sản xuất giống ngao đã hình thành nhưng chưa đáp ứng đủ con giống cho người nuôi

Do miền Bắc thiếu ngao giống nên các tư thương buôn bán giống đã chuyển ngao

từ các tỉnh miền Nam ra các tỉnh miền Bắc như Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An để nuôi Dẫn đến không tránh khỏi sự trộn lẫn giữa các dòng ngao của các vùng miền làm giảm tính đa dạng và có nguy cơ giảm chất lượng giống ngao

Mặc dù ngao Bến Tre là đối tượng nuôi phổ biến nhưng những nghiên cứu

về đối tượng này còn rất hạn chế Nhìn chung các nghiên cứu về ngao ở trong nước

đa số tập trung vào sinh học sinh sản và kỹ thuật sản xuất giống và nuôi thương

phẩm Vấn đề mới đặt ra cho nghiên cứu hiện nay là cần đánh giá được đa dạng

sinh học của các quần thể ngao Bến Tre, so sánh hệ số biến dị di truyền của các quần thể để đưa ra được quần thể nào có thể dùng để chọn giống Ngoài ra cần xem xét có hiện tượng cận huyết hay không giữa các cá thể trong quần thể và các quần thể với nhau

Nhiều năm qua nghề nuôi ngao thương phẩm đã đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người nuôi nhưng từ năm 2005 lại đây, nghề nuôi ngao ở Việt Nam đã gặp không ít khó khăn do hiện tượng ngao chết xuất hiện theo mùa hàng năm Theo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

báo cáo của Chi cục Nuôi trồng thủy sản Thái Bình đến ngày 19/8/2014 tổng diện tích ngao bị chết là 1.096,33ha/2.569 ha diện tích ngao nuôi của tỉnh

Được sự đồng ý của Hội đồng khoa học Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I và sự cho phép phối hợp của Trường Cao

đẳng Thủy sản, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền một số

quần thể ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) tại Việt Nam bằng chỉ thị microsatellite”

2 Mục tiêu của đề tài

- Đánh giá được đa dạng di truyền của quần thể ngao Bến Tre (Meretrix

Bến Tre, Cà Mau bằng chỉ thị microsatellite làm cơ sở cho việc lựa chọn vật liệu ban đầu phục vụ chọn giống và bảo tồn

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của một số các quần thể ngao Bến Tre

- Nghiên cứu mức độ cận huyết của các quần thể ngao Bến Tre

- Nghiên cứu mối liên hệ, khoảng cách di truyền giữa các quần thể ngao Bến Tre

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Cung cấp thêm tư liệu thông tin khoa học hữu ích cho công tác nghiên cứu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền (ĐDDT) là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, thể hiện qua sự khác nhau của tất cả gen di truyền của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật ĐDDT là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT)

ĐDDT tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể ĐDDT chính là

sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần các acid nucleic, tạo thành mã di truyền Nghiên cứu về ĐDDT là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài chịu ảnh hưởng bởi tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể Các cá thể trong một quần thể thường có một bộ gene khác nhau Sự đa dang về bộ gene này là do các cá thể có gene khác nhau, dù chỉ là rất ít (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT)

Những hình thái khác nhau của gene được thể hiện bằng những allen và những khác biệt do sự đột biến Nhưng allen khác nhau của một gene có thể ảnh hưởng tới sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau (Wickneswari R & ctv, 1999)

Tổng các gene và allen trong một quần thể là vốn gene của quần thể và những tổ hợp của các allen mà mỗi cá thể được biểu hiện bởi các đặc điểm về hình thái, sinh lý, hóa sinh và được đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi

trường nhất định (Wickneswari R & ctv, 1999)

1.2 Chỉ thị phân tử Microsatellite

Microsatellite: Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genome, là một đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (được gọi là đơn vị lặp lại) Một Microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100000 vị trí khác nhau trong bộ genome động

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

vật điển hình Ở bất kì một vị trí nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 – 7 “allen” khác nhau, mà mỗi allen có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Những allen này có thể phát hiện bởi PCR, sử dụng primers đuợc thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của Microsatellite Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, allen được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích

cỡ của đơn vị lặp lại, nếu primers tương ứng với dãy duy nhất trực tiếp trên cả 2 mặt của Microsatellite và là đoạn dài 20 base, và một cá thể là dị hợp tử cho một Microsatellite AC với một allen bao gồm sự lặp lại 5 lần và một allen khác lặp lại 6 lần, sự dị hợp sẽ tạo ra 2 bands trên gel, một band dài 20 + (2x5) +20 =50 bases, và alen khác dài 20 + (2x6) + 20 = 60 bases Microsatellites là một marker DNA chuẩn: chúng được phát hiện dễ dàng bằng PCR, và chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome (Butcher PA và ctv, 2000)

Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thước tại mỗi locus

là 20 - 100 bp Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome (Butcher PA và ctv, 2000)

Chỉ thị Microsatellite là chỉ thị ADN nghiên cứu trực tiếp trên gen thông qua việc kiểm tra đánh giá tính biến dị trên ADN bắt đầu bằng tách chiết ADN và tìm biến dị trình tự nucleotide Chỉ thị Microsatellite là một trong những chỉ thị ADN đang được ứng dụng rộng rãi từ nghiên cứu ĐDDT quần thể đến nghiên cứu dòng thuần, phả hệ và chỉ thị liên quan đến tính trạng chọn lọc Microsatellite gồm nhiều phiên bản lặp lại đơn giản của 2-4 nucleotide, phổ biến nhất là lặp lại của 2 nucleotide

Mỗi vị trí Microsatellite được cho là tập hợp của những đoạn mã đồng nhất, trong trường hợp trình tự của vị trí Microsatellite được biết thì có thể thiết kế trình

tự đoạn mồi để khuếch đại vị trí Microsatellite đó bằng phản ứng khuếch đại PCR (Kashi và ctv, 1997)

Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT

Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG

Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC

Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn Dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và Tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa

Chỉ thị Microsatellite là chỉ thị phân tử rất lý tưởng, vì nó có tính đa hình cao

và phân bố rải rác trên hệ gen Ngoài vị trí Microsatellite là những đoạn trình tự ngắn từ vài đến vài trăm lần lặp nên có thể nhanh tìm ra và nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR Mẫu vật để nghiên cứu chỉ thị Microsatellite không cần thiết phải là mẫu tươi và có thể dùng mẫu giữ trong cồn để khô và đông lạnh nên dễ vận chuyển Nghiên cứu đa hình Microsatellite dựa trên sự sai khác về chiều dài do có sự sai khác về đơn vị lặp gồm các alen ở vị trí nhất định Chiều dài của alen có thể được xác định chính xác bằng phương pháp điện di Với tần số đột biến cao ở nhiều vị trí xảy ra trong quá trình nhân đôi ADN nên biến dị tạo ra các alen là rất lớn và mức

độ dị hợp tử cao, do đó rất hữu ích cho phân tích di truyền quần thể, dòng, loài, xác định cá thể và gen liên kết với tính trạng (Butcher PA và ctv, 2000)

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của Microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen Những tính chất đặc biệt của Microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng Microsatellite

có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv, 1997) Do vậy Microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa

1.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường gặp phải trở ngại

về số lượng vật chất di truyền cần có Các phương pháp tạo dòng invitro như: phương pháp lai phân tử, phương pháp véc tơ tách dòng… tuy giải quyết được vấn

đề về số lượng nhưng đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian dài Sự ra đời của nhiều

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

phương pháp khuếch đại invitro có chọn lọc, trong số đó nổi tiếng nhất phải kể đến

phương pháp PCR, đã đảo lộn phương pháp của việc tạo dòng cổ điển, mở ra những

triển vọng ứng dụng to lớn

Kỹ thuật PCR là kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain

Reaction- PCR) do Kary Mullis xây dựng năm 1985 Đây là phương pháp invitro để

nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cần một khối

lượng mẫu ban đầu hạn chế Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các

tính chất của quá trình tái bản ADN Nhưng nó đã sử dụng theo nhiều cách khác

nhau để làm cho việc tách dòng và thao tác với ADN dễ dàng và hiệu quả hơn

Việc sử dụng kĩ thuật PCR trong lĩnh vực ADN tái tổ hợp đã tạo ra một bước

tiến mang tính cách mạng đối với di truyền học phân tử nói riêng cũng như với sinh

học phân tử nói chung, nhờ việc cho phép phân lập, xác định các gen và đi sâu

nghiên cứu chức năng cũng như biểu hiện của gen trong quá trình phát triển, hoặc

phản ứng của gen đối với các điều kiện môi trường Nó cho phép ta tiến hành

những nghiên cứu mà trước đây không có khả năng thực hiện Kỹ thuật này đã

được áp dụng trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử, chẩn đoán các bệnh di

truyền ở người, di truyền quần thể, phân tích pháp y…(Khuất Hữu Thanh, 2003)

Để tiến hành PCR cần có hai mồi (primers) oligonucleotit dài khoảng 17 đến

30 nucleotit có trình tự bổ sung với trình tự đích (trình tự nucleotit kề với đoạn

ADN cần nhân) Một mồi có trình tự giống với một mạch của ADN, giả sử giống

với một mạch có nghĩa, thì mồi kia giống với một mạch đối nghĩa Theo nguyên tắc

bổ sung, mồi có trình tự mạch đối nghĩa sẽ gắn với mạch có nghĩa còn mồi kia sẽ

gắn với mạch đối nghĩa để khởi động quá trình tổng hợp mạch mới (Khuất Hữu

Thanh, 2006)

Phản ứng PCR được chia thành ba giai đoạn như hình 1 Chu kì gồm các giai

đoạn: biến tính- gắn mồi- kéo dài chuỗi được lặp lại khoảng 20 – 30 lần, đảm bảo

nhân bội một cách hiệu quả một đoạn trình tự ADN đặc hiệu

Có thể tóm tắt ba giai đoạn đó như sau:

Giai đoạn 1: gây biến tính ADN:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

Dùng nhiệt để tách hai mạch của ADN đích Nhiệt độ thường dùng khoảng 940C

Giai đoạn 2: gắn mồi:

Hai mạch của ADN đích được làm lạnh trong sự có mặt của các mồi Các mồi

nhận biết và gắn vào các mạch của ADN theo nguyên tắc bổ sung Các mồi được thiết

kế sao cho đầu 3’ định hướng đoạn trình tự cần nhân nên quá trình tổng hợp ADN diễn

ra trên cả hai mạch, qua suốt trình tự đó Nhiệt độ để gắn mồi phụ thuộc vào độ dài,

trình tự của mồi và mức độ đặc hiệu cần thiết ở mỗi phản ứng PCR cụ thể Nhiệt độ

gắn mồi thường dao động từ 45- 600C

Giai đoạn 3: kéo dài chuỗi:

ADN polymerase gắn vào đầu 3’ tự do của mồi và sử dụng dNTP để tổng

hợp các mạch mới theo chiều 5’- 3’ Những thí nghiệm PCR đầu tiên thường dùng

đoạn Klenow cả ADN polymerase I làm enzym tái bản nhưng do nó bị phân hủy

bởi nhiệt độ ở giai đoạn biến tính nên thường phải bổ sung enzym mới Việc phát

hiện và sử dụng Taq ADN polymerase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus là

một bước đột phá Taq ADN polymerase có thể giữ nguyên hoạt tính ở nhiệt độ đến

940C Điều đó có nghĩa là sẽ không phải bổ sung enzym trong quá trình phản ứng

xảy ra Taq ADN polymerase có hoạt tính tối ưu ở 320C (Khuất Hữu Thanh, 2003) Sau chu kì đầu, hai phân tử ADN được tạo ra Vị trí gắn kết của mồi chính là

nơi khởi đầu của quá trình tổng hợp mạch mới theo nguyên tắc bổ sung với trình tự

nucleotit trên mạch khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nói riêng Những nghiên cứu của một số nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, II và Viện Công nghệ Sinh học đã

sử dụng các chỉ thị phân tử cho việc nghiên cứu vật liệu khởi đầu chọn giống ở một

số loài tôm sú, cá tra cho thấy một tiềm năng to lớn ứng dụng công nghệ sinh học trong nuôi trồng thủy sản

Quyền Đình Thi và ctv (2003), sử dụng chỉ thị Microsatellite, mtRFLP và

RAPD để phân tích đa hình tôm Sú (Peneaus monodo) kết quả phân tích trên 20

mẫu tôm sú cho 20 kiểu gen khác nhau và giá trị thông tin đa hình (PIC) luôn luôn

> 0,5, cho thấy tính đa hình Microsatellite cao Phân tích RFLP của hai phân đoạn 16S rRNA và 12S rRNA của mtDNA cho thấy tính đa hình thấp Phân tích tính đa hình 20 mẫu tôm sú bằng 4 mồi ngẫu nhiên, ở mỗi mồi ngẫu nhiên đều cho các chỉ thị đặc trưng, cây di truyền được chia thành 5 nhóm

Cũng trên đối tượng tôm sú (Peneaus monodo) Nguyễn Thị Thảo & ctv

(2004), sử dụng chỉ thị Microsatellite đánh giá tính đa hình 3 quần đàn tôm sú nuôi

ở Việt Nam, kết quả phân tích trên 3 quần đàn, quần đàn I có nguồn gốc ở Miền Nam, quần đàn II có nguồn gốc ở Miền trung và quần đàn III có nguồn gốc nhập ngoại từ Singapore tác giả đã chỉ ra với 6 locus CSCUPmo1, CSCUPmo2 CSCUPmo3 CSCUPmo4 CSCUPmo6 CSCUPmo7; tính đa hình bên trong mỗi quần đàn rất cao với giá trị thông tin đa hình (PIC) > 0,829, tính đa hình giữa các quần đàn tôm sú cũng cao (PIC) > 0,913 và khoảng cách di truyền giữa các quần đàn lớn 0,4693 – 0,7268, quần đàn I và II có đồ thị phân bố tần số allen tương tự nhau hơn so với quần đàn III

Đào Thị Tuyết & ctv (2003), Sử dụng phương pháp RAPD đánh giá đa hình

di truyền quần đàn cá tra nuôi (Pangasius hypophthamus) ở Việt Nam có 4 quần

đàn được ký hiệu R (trại bà Rô); D (trại ông Dương), T (trại ông Tường) và TN (quần đàn tự nhiên) Kết quả phân tích RAPD mồi A7 phân biệt quần đàn R với D,

T, TN ở dấu chỉ thị phân tử 2400 base; R và T với D và TN ở dấu chỉ thị phân tử

2200 base, mỗi A8 phân biệt được quần đàn D với các quần đàn còn lại ở dấu chỉ thị phân tử > 500 base; D và R với T và TN ở dấu chỉ thị phân tử 1800 – 1900 base, mồi 101 phân biệt quần đàn TN với các quần đàn còn lại ở dấu chỉ thị phân tử

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

1800 – 2200 base , mồi 456 phân biệt quần đàn D với T, TN, R ở dấu chỉ thị 1800 –

2000 base; T, TN với D, R ở dấu chỉ thị 3000 – 3500 base, mồi 459 phân biệt quần đàn R với các quần đàn còn lại ở chỉ thị phân tử 1800 – 2000 base; R , T với D,TN

ở dấu chỉ thị phân tử 3500 base

Quyền Đình Thi & Phạm Anh Tuấn (2004), dùng chỉ thị RAPD và mtDNA

phân tích tính đa hình quần đàn cá tra (Pangasius hypophthamus) nuôi ở Việt Nam

Kết quả phân tích RAPD của 4 quần đàn với 9 mồi ngẫu nhiên A7, A8, 101, 456,

459, A10, A13, CRL32 và Y13 tìm thấy một số chỉ thị đặc trưng cho từng quần đàn, phân tích mtDNA cho thấy các quần đàn có tần suất cắt của enzyme cắt hạn chế khác nhau tức kiểu gen đơn bội thể ở ty thể là khác nhau Qua kết quả nghiên cứu cho thấy có thể kết hợp nghiên cứu các tính trạng của từng quần đàn cá tra để tìm ra mối quan hệ giữa chỉ thị phân tử đặc trưng và tính trạng nhằm mục đích chọn giống, ở nghiên cứu này tác giả cũng cho thấy một số chỉ thị phân tử đặc trưng cho

cá tra mỡ vàng và cá tra mỡ trắng

Nguyễn Thu Thúy & ctv (2004), dùng chỉ thị AFLP để so sánh đa hình giữa

hai nhóm cá tra có trọng lượng phân biệt (Pangasius hypophthalmus) Phân tích đa

hình AFLP cá tra bằng 54 tổ hợp mồi chọn lọc cho thấy tỷ lệ đa hình trọng lượng loài tương đối thấp, trung bình 1,35% Tuy nhiên, tỷ lệ này đủ tin cậy trong việc xác định các chỉ thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng AKLP có tần số khác biệt trên 50% Tuy nhiên chỉ có 2 băng: AF 7-4 của tổ hợp mồi E-ACC/M-CAA và AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT có tính ổn định và vẫn giữ nguyên tỷ lệ này khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn

Thai Thanh Binh TT và Austin (2009), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của các quần đàn cá chép ở 12 tỉnh Việt Nam bằng chỉ thị Microsatellite, SSCP và giải mã trình tự ADN Kết quả phân tích số liệu Microsatellite và SSCP cho thấy

hệ số đa dạng di truyền giữa các quần đàn rất lớn đạt 90,6% nhưng giữa các cá thể trong cùng một quần đàn chỉ đạt 5%

Phạm Anh Tuấn và Nguyễn Hữu Ninh (2003), dùng chỉ thị Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc thị trắng và thịt vàng của cá tra Kết quả nghiên cứu cho thấy sự sai khác về tần số allele, sự xuất hiện allele đặc trưng (allele F) ở locus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

Phy03 giữa cá tra thịt trắng và cá tra thịt vàng Ngoài ra khoảng cách di truyền của hai đàn cá có màu sắc thịt khác nhau này cũng rất lớn (0,145) Phân tích cho thấy không có sự liên kết về di truyền giữa các màu sắc thịt cá tra thí nghiệm dựa trên hai locus Phy01 và Phy03

Nguyễn Thành Tâm & Phạm Thanh Liêm (2012), Sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD để kiểm tra sự khác biệt di truyền của 2 quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi Microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD Kết quả cho thấy chỉ có một vệt băng cho tất cả 6 mồi Microsatellite giữa tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc Tuy nhiên khi phân tích RAPD cho thấy sự khác biệt di truyền giữa 2 quần đàn tôm Trung bình là 14,9 alen (TCXTQ)

và 12,9 alen (TCXVN) Trung bình dị hợp tử, giá trị đa dạng di truyền PIC lần lượt

là 0,156; 0,84 – 0,88 (TCXTQ) và 0,179; 0.86 – 0,88 (TCXVN) Chỉ số Shanmon là 0,2242 (TCXTQ), 0,279 (TCXVN)

Trần Thị Thúy Hà và ctv (2012), dùng 5 chỉ thị Microsatellite với hai phản

ứng PCR đa mồi được sử dụng trên 5 quần đàn tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus

trên mỗi vị trí Microsatellite dao động từ 6 – 8 alen và có alen xuất hiện với tần số thấp (<0,1) Giá trị dị hợp tử quan sát (Ho, dao động từ 0,21 - 0,50) thấp hơn so với

dị hợp tử mong đợi (He, dao động 0,41 – 0,72) Giá trị tương đồng (Fis) trung bình

dao động khoảng 0,18 – 0,40 và cao ở 2 vị trí TUMXL v6.23 và Lvan 01 trên các

quần đàn, lần lượt đạt 0,446 – 0,496 Giá trị Fst ở mức trung bình (0,054 -0,185) và không thể hiện sự sai khác lớn về di truyền giữa các quần đàn

1.5 Một số đặc điểm sinh học của ngao Bến Tre

1.5.1 Hệ thống phân loại ngao Bến Tre

Theo Habe, Sadao (1966) và Nguyễn Chính (1996), hệ thống phân loại của ngao như sau:

Ngành thân mềm: Mollusca

Lớp hai mảnh vỏ: Bivalvia

Họ ngao: Veneridae

Giống ngao: Meretrix

Loài ngao: Meretrix lyrata (Sowerby, 1851)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

Hình 1.2 Ngao Bến Tre (Meretrix lyrata)

Tên Tiếng Anh: Lyrate Asiatic Hard Clam

Ở Việt Nam, hiện đang sử dụng hai từ “ngao” và “nghêu” để chỉ các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thuộc họ Veneridae, cùng có tên tiếng Anh là “hard clam”,

đó là ngao dầu (Meretrix meretrix), ngao mật (M lusoria), ngao lụa (Paphia

Bắc, trong khi miền Nam sử dụng từ “nghêu” Để thống nhất trong luận văn này tôi

sẽ dùng cách gọi của người Miền Bắc là “ngao” để gọi tên cho tất cả các loài thuộc

họ Veneridae ở Việt Nam, trong trường hợp cần phân biệt đến loài sẽ dùng tên Latin kèm theo

1.5.2 Nguồn gốc và sự phân bố của ngao Bến Tre

Ngao là loài sống ở vùng nhiệt đới Trên thế giới ngao phân bố tự nhiên từ tây Inđônêxia đến bắc Philipin, từ miền bắc đến miền đông Đài Loan, miền Nam

Inđônêxia, miền Bắc Úc (Hình 1.1)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

Hình 1.3 Phân bố của ngao Meretrix sp trên thế giới (theo Sealife)

Ngao phân bố trên các bãi biển, trong các eo vịnh có đáy là cát pha bùn (cát chiểm 60-80%), sóng gió nhẹ, có lượng nước ngọt nhất định chảy vào Ở nơi đáy nhiều bùn ngao dễ bị chết ngạt, nơi đáy cát chiếm 100% ngao bị khô nóng Ngao sống ở trung, hạ triều cho đến độ sâu tới 10m ở đáy biển Ngao là động vật nhuyễn thể rộng nhiệt (www.godaco-seafood.com.vn)

Nghiên cứu của Nguyễn Chính (1996), cho thấy ngao Bến Tre phân bố chủ yếu ở vùng biển ấm Tây Thái Bình Dương từ biển Đài Loan đến Việt Nam Ở Việt Nam chúng phân bố chủ yếu ở khu vực Tây Nam Bộ như: Cần Giờ (Tp.HCM), Gò Công (Tiền Giang), Bình Đại, Ba Tri và Thạnh Phú (Bến Tre), Vĩnh Châu (Sóc Trăng), Vĩnh Lợi (Bạc Liêu), Ngọc Hiển (Cà Mau) và Cầu Ngang, Duyên Hải của

Trà Vinh Ngao (Meretrix meretrix ) phân bố ở các tỉnh ven biển miền Bắc

Theo Nguyễn Hữu Phụng (1996), ngao phân bố ở những vùng có nền đáy cát hay cát bùn trong đó cát phải chiếm từ 60 - 90% với kích cỡ hạt từ 0,006-0,25mm Trương Quốc Phú (1999), cho rằng ngao phân bố chủ yếu ở vùng trung triều

và dưới triều, nơi có độ dốc tương đó bằng phẳng Độ sâu cực đại tìm thấy ngao lúc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

nước ròng là 2,5 m Ngao phân bố ở vùng có nền đáy cát mịn đến cát trung có pha lẫn hàm lượng bùn lỏng và xác hữu cơ (10 – 18%), vào mùa mưa bùn lỏng bao phủ nền đáy bãi Ngao (1,5 - 2,5cm) Độ mặn đặc trưng cho bãi ngao dao động từ 7 – 25‰, pH nước 6,5 – 8,5 và nhiệt độ là 26 – 32oC

1.5.3 Đặc điểm hình thái- sinh thái

Vỏ ngao Bến Tre có hình tam giác, hai vỏ đều bằng nhau, bản lề nằm ở mặt lưng, vỏ mở ở mặt bụng Gờ tăng trưởng phía trước thô và sâu, ở phía sau vỏ mịn hơn Vết cơ khép vỏ trước nhỏ, hình bán nguyệt, vết cơ khép vỏ phía sau lớn hơn, hình mặt nguyệt Màu sắc của vỏ phía ngoài màu vàng nhạt, màu trắng sữa hoặc màu nâu, phía trong có màu trắng (http://www.godaco-seafood.com.vn)

1.5.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Các nghiên cứu của Nguyễn Hữu Phụng và ctv (2001) và Trương Quốc Phú

(1999), đều cho thấy ngao là loài ăn lọc thành phần thức ăn tự nhiên của ngao là mùn bã và các mảnh vụn hữu cơ lơ lửng trong nước khoảng 75-90%, thực vật phù

du chiếm tỷ lệ thấp khoảng 10-25% về số lượng cũng như tần số bắt gặp, chủ yếu là tảo silic (tảo khuê)

Còn kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đinh Hùng (2000) mùa sinh sản chính của ngao từ tháng 5 đến tháng 7 và mùa phụ từ tháng 11 đến tháng 1 năm sau (có năm không thấy xuất hiện mùa phụ) với mật độ ngao giống xuất hiện thấp hơn, tỷ lệ đực/cái trong tự nhiên là 1/1

Theo Trương Quốc Phú (1999), tốc độ sinh trưởng ngao thay đổi theo mùa: sinh trưởng nhanh vào tháng 5 - 9, sinh trưởng chậm vào tháng 10 - 4 năm sau Nhân tố chính ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng là độ mặn, sóng gió, hàm lượng chất lơ lửng trong nước

Nghiên cứu của Trương Quốc Phú (1999), cho rằng sau một năm tuổi ngao thành thục sinh dục và tham gia sinh sản, kích cỡ thành thục lần đầu khoảng 3,5 cm Ngao phân tính đực, cái riêng biệt, một số cá thể ngao lưỡng tính, tỷ lệ cá thể lưỡng tính thấp, chiếm 6,82% trong quần thể Các yếu tố môi trường như nồng độ muối,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

sóng gió và hàm lượng vật chất lơ lửng là những yếu tố chính ảnh hưởng đến sinh trưởng của ngao

1.5.5 Đặc điểm sinh trưởng

Tốc độ sinh trưởng của ngao phụ thuộc vào lượng thức ăn phân bố nhiều hay

ít Ngao phân bố ở vùng cửa sông nơi phong phú về thành phần thực vật phù du và mùn bã hữu cơ, ngao sống vùng triều thấp lớn nhanh hơn vùng triều cao (Sổ tay hướng dẫn kỹ thuật nuôi ngao giống, 2009)

1.5.6 Đặc điểm sinh sản và phát triển

Theo nghiên cứu Chu Chí Thiết và Martin S Kumar (2008), cho thấy ngao đực đã thành thục tốt khi làm vỡ phần mềm ở dưới bụng tinh dịch sẽ chảy ra nhưng

ở con cái dù thành thục ở mức độ tốt cũng không có hiện tượng chảy ra Sự thành thục sinh dục của ngao tùy thuộc vào độ tuổi, kích thước và địa lý phân bố Sản lượng trứng, tinh trùng và sự hình thành giao tử liên quan đến kích thước của ngao, nhiệt độ nước, số lượng và chất lượng thức ăn, đặc biệt quan trọng trong thời kỳ ban đầu của quá trình này

Ngao đạt kích thước 500mg sẽ bắt đầu thành thục sinh dục vào sau 12 tháng nuôi có thể tham gia sinh sản lần đầu Mùa vụ sinh sản cảu ngao diễn ra vào thời gian cuối mùa Xuân tới hết mùa hè (từ tháng Tư đến tháng Chín)

1.6.Tình hình nuôi ngao Bến Tre ở thế giới và Việt Nam

1.6.1 Tình hình nuôi ngao trên thế giới

Theo thống kê của FAO (2012), Sản lượng nhuyễn thể (bao gồm cả loài

USD Trong đó, sản lượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu được từ nuôi trồng tăng nhanh hàng năm Năm 1999, sản lượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ ước đạt 8,1 triệu tấn, tăng lên 12,2 triệu tấn vào năm 2008 (Tăng trưởng bình quân hơn 5%/năm) Sản lượng ngao nuôi chiếm khoảng 32 đến 38% sản lượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ

và cũng tăng nhanh hàng năm Năm 1999, sản lượng ngao ước đạt 2,5 triệu tấn, tăng lên 4,5 triệu tấn vào năm 2009 (tăng trưởng bình quân 4,5%/năm) Giá trị thương mại thu được từ nghề nuôi ngao tăng trưởng đều trong vòng 10 năm qua, từ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

86,3 triệu USD năm 1999, tăng lên 210,5 triệu USD vào năm 2008, với tốc độ tăng trưởng bình quân gần 6%/năm

Ngao (Meretrix sp) có giá trị kinh tế cao và là loài nuôi thủy sản ở nhiều

nước trên thề giới Trung Quốc là nước cho sinh sản ngao và sản xuất ngao thương

phẩm lớn nhất trên thế giới ở Mỹ ngao (Mercenaria mercenaria) được xem là đối

tượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ nuôi từ năm 1920 (Jack và ctv, 2005) Theo Jones và

ctv (1993), ngao được nuôi tại Nhật Bản hơn một nghìn năm trước Ngao Meretrix

Đông Nam Á, bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ Theo Chen

(1982), Ngao Meretrix lusoria bắt đầu được nuôi tại Đài Loan vào năm 1925 nuôi

ngao dầu trong ao đáy cát cho hiệu quả kinh tế cao nhất (Wang và ctv (2006)

1.6.2 Tình hình phát triển nuôi ngao tại Việt Nam

Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng nhuyễn thể năm 2013 đạt 170.598 tấn với diện tích nuôi là 29.088 ha, 6 tháng đầu năm 2014 đạt 132.109 tấn với diện tích nuôi là 27.193 ha Những tỉnh có diện tích và sản lượng nuôi nhuyễn thể lớn như: Quảng Ninh,Tiền Giang, Bến Tre, Bạc liêu, TP Hồ Chí Minh (Báo cáo tại hội nghị 21/8/2014 tại Quảng Ninh, Hiện trạng phát triển nuôi nhuyễn thể, thách thức và định hướng phát triển,Tổng Cục Thủy sản)

Nhiều loại nhuyễn thể đang được nuôi tại Việt Nam, trong đó ngao được coi

là đối tượng nuôi quan trọng (Bộ Thủy sản và Ngân hàng Thế giới, 2006) Sản phẩm ngao Việt Nam được xuất sang hơn 10 nước và vùng lãnh thổ, thị trường lớn nhất là Nhật vì ngao là thức ăn truyền thống của người Nhật Bên cạnh đó các nước nhập khẩu được kể đến như Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan, Hồng Kông, Thái

Lan và nước có tiềm năng phát triển như Mỹ (Bộ Thủy Sản, 2006) Hiện nay, ngao

Bến Tre được xem là đối tượng nuôi trồng thủy sản chủ lực ở Việt Nam, bởi nó là đối tượng có giá trị kinh tế, sản lượng cao, thị trường xuất khẩu rộng lớn, do đáp ứng được tiêu chuẩn HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) và chứng chỉ MSC của Hội đồng bảo tồn biển Quốc tế (Marine Stewardship Council)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

Quyết định số 1628/QĐ - BNN – TCTS ngày 20/7/2011 về “Quy hoạch nuôi nhuyễn thể tập chung đến năm 2020” Phấn đấu đến năm 2020 diện tích nuôi nhuyễn thể sẽ đạt 43.360 ha và sản lượng đạt 427.940 tấn

Ngao được thả nuôi chủ yếu là ngao Bến Tre Meretrix lyrata (Sowerby, 1851) số còn lại là ngao địa phương như ngao dầu Meretrix meretrix (Linnd, 1758)

Nuôi nhuyễn thễ ven biển được bắt đầu sớm ở Việt Nam vì loài Meretrix

năm 1970 ở Bến Tre sau đó chuyển sang Tiền Giang (1987) và ở Trà Vinh ngao được nuôi vào năm 1995 (Bộ Thủy Sản, 2004) Ngao Bến Tre còn được nuôi khá thành công ở Thái Bình và Nam Định (John Kleinen, 2003)

Ở phía Nam, vùng phân bố và khai thác tự nhiên của ngao khoảng 12.000

ha, kéo dài dọc theo vùng biển từ huyện Cần Giờ (TP Hồ Chí Minh) tới Cà Mau, tập trung nhất là vùng ven biển thuộc tỉnh Tiền Giang (Gò Công Đông), Bến Tre (Bình Đại, Ba Tri, Thạnh Phú) và Trà Vinh (Cầu Ngang, Duyên Hải) (www.laodong.com.vn)

Từ năm 1998, các tỉnh miền Bắc đã chuyển sang nuôi ngao Bến Tre, tại Nam Định loài ngao này chiếm trên 90% sản lượng thu hoạch (Bộ Thủy sản và Ngân hàng Thế giới, 2006; Trung tâm bảo tồn biển và Phát triển cộng đồng, 2009) Hiện nay, ngao Bến Tre trở thành đối tượng nuôi chính của các tỉnh phía Bắc như Thanh Hóa, Nam Định và Thái Bình, chỉ có một số ít ngao dầu được thả xen tại các vây nuôi với sản lượng thu hoạch không cao (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thanh Hóa, 2011; Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Nam Định, 2011 và Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thái Bình, 2011)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

Hình 1.4 Bãi nuôi ngao tại Giao Thủy – Nam Định

Nghề nuôi ngao ở Thanh Hóa bắt đầu phát triển từ năm 1998, cho đến nay nghề này được phát triển mạnh mẽ và thực sự trở thành nghề sản xuất hàng hóa với năng suất và sản lượng cao Tính đến năm 2010, diện tích nuôi ngao của Thanh Hóa khoảng 1.000 ha, với sản lượng ước tính khoảng 5.500 tấn Loài ngao được nuôi tại Thanh Hóa là ngao Bến Tre, những năm trước 2010, nguồn giống được nhập chủ yếu từ Bến Tre Từ năm 2010, Thanh Hóa đã tiếp nhận công nghệ sản xuất ngao giống từ Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thanh Hóa, 2011) Vì vậy cũng đã bắt đầu chủ động một phần con giống tại chỗ cung cấp cho các hộ nuôi trong vùng

Nam Định là tỉnh có diện tích nuôi ngao lớn nhất miền Bắc với tổng diện tích nuôi là 1.709 ha Hoạt động liên quan đến phát triển nghề nuôi ngao ở tỉnh rất phong phú, bao gồm sản xuất giống nhân tạo, ương con giống và nuôi thương phẩm theo quy mô hộ cá thể hoặc nhóm hộ gia đình với gần 1.200 vây nuôi và trên 3.000 lao động thường xuyên tham gia Theo ước tính, năm 2010 sản lượng nuôi ngao toàn tỉnh đạt 18.751 tấn, đạt tiêu chuẩn cung cấp cho thị trường (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Nam Định, 2011) Năm 1997, hiện tượng ngao dầu chết nhiều

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

đã làm cho nhiều hộ nuôi thua lỗ, một số hộ phải bỏ nghề, số lượng vây nuôi giảm đáng kể, nguồn ngao dầu tự nhiên còn lại rất ít Vì vậy nhu cầu tìm kiếm và thay thế đối tượng nuôi mới đã trở thành vấn đề cấp bách Năm 1998, loài ngao Bến Tre được ông Nguyễn Văn Cửu và Phạm Văn Thực nuôi thử nghiệm thành công trên cùng bãi triều xã Giao Xuân – Giao Thủy – Nam Định Năm 1999, các hộ nuôi ngao bắt đầu nhập giống ngao Bến Tre (khai thác tại xã Thới Thuận, huyện Bình Đại, tỉnh Bến Tre) về thay thế hoàn toàn loài ngao bản địa (Trung tâm bảo tồn biển

và Phát triển cộng đồng, 2009)

Tại Thái Bình, trong những năm gần đây, nghề nuôi ngao vùng bãi triều đã

có sự đầu tư, phát triển mạnh mẽ, kể cả đầu tư vốn, mở rộng diện tích nuôi và nguồn nhân lực tham gia Sản lượng ngao nuôi năm sau đều cao hơn năm trước, giá trị đạt hàng trăm tỷ đồng, giải quyết việc làm cho hàng nghìn lao động Theo số liệu của Cục Thống kê tỉnh, năm 2005 diện tích nuôi ngao mới có 850 ha, năng suất 11,16 tấn/ha, tổng sản lượng đạt 9.150 tấn, giải quyết việc làm cho 850 lao động; năm 2010 đã tăng lên 1.089 ha, năng suất 27,66 tấn/ha, sản lượng trên 30.000 tấn, giải quyết việc làm cho 1.200 lao động (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thái Bình, 2011; Tạp chí Thủy sản online (tháng 10/2011)

Trong những năm qua, nghề nuôi biển phát triển nhanh chóng đã đem lại công ăn việc làm góp phần cải thiện đời sống cộng đồng dân cư ven biển Trong đó, nuôi ngao được xem là điển hình và hiệu quả nhất trong các đối tượng nuôi nhuyễn thể ở vùng cửa sông ven biển ĐBSCL (Nguyễn Thanh Tùng, 2007) Đến năm 2006 đầu năm 2007, diện tích nuôi ngao trên 20.000 ha với tổng sản lượng của ngao ở toàn bộ khu vực Nam Bộ đạt khoảng 70 – 80 ngàn tấn/năm và đã trở thành một mặt hàng xuất khẩu lớn (Lê Xuân Sinh, 2007) Theo Bộ tài nguyên và môi trường (2011), hai huyện Giao Thủy và Nghĩa Hưng tỉnh Nam định có khoảng 1.000ha nuôi ngao mỗi năm cho từ 18.000-20.000 tấn ngao

Theo Bộ Thủy Sản (2005) thì sản lượng ngao năm 2001 xấp xỉ 100.000 tấn năm 2005 là 180.000 tấn và hướng đến năm 2010 là 380.000 tấn Theo Bộ Thủy Sản (2004) thì cả nước diện tích nuôi là 12.417 ha cho sản lượng là 118.945 tấn,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

trong đó tỉnh ở Miền Bắc cho sản lượng cao nhất là Nam Định với 700 ha cho sản lượng khoảng 9.000 tấn và Bến Tre ở miền Nam với 4.075 ha sản lượng thu hoạch khoảng 42.012 tấn, bên cạnh Bến Tre thì Trà Vinh có diện tích nuôi khoảng 1.000

ha cho sản lượng 5.000 tấn với năng suất bình quân 5 tấn/ha

Diện tích nuôi Ngao năm 2014 của tỉnh Thái Bình đạt 2.569 ha, sản lượng 29.950 tấn, giá trị sản xuất 524,12 tỷ đồng, tăng 4% so với cùng kỳ năm 2013 (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thái Bình, tháng 8/2014)

Diện tích nuôi nhuyễn thể có chiều hướng tăng từ 19.234 ha năm 1999 lên đến 26.254 ha năm 2005, đạt tốc độ tăng trung bình năm 5%/năm Trong khi đó sản lượng đạt tốc độ tăng trung bình năm 9%/năm (62.969 tấn năm 1999 và năm 2005 đạt 114.570 tấn), trong khi khả năng cung cấp con giống nhân tạo còn hạn chế và nguồn lợi con giống tự nhiên ngày càng giảm (Nguyễn Thị Xuân Thu và ctv, 2005)

1.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền ngao Bến Tre ở Thế Giới và Việt Nam

Ở Trung Quốc nhiều nghiên cứu phân loại cũng như đa dạng di truyền của ngao đã được thực hiện Các nghiên cứu này đã làm sáng tỏ mối liên hệ giữa các loài ngao và sự đa dạng của ngao ở từng vùng khác nhau He và ctv (2010) đã giải

mã thành công toàn bộ gen ty thể của ngao M Meretrix Tổng genenome là 19,826bp Mối quan hệ phả hệ của các loài ngao M Meretrix, M lamarckii, M

tác giả đã giải mã trình tự ADN vùng gen COI ở ty thể các loài ngao và cho rằng

M meretrix, M lusoria và M petechialis chỉ là một loài do cùng chung một số

haplotype 10 microsatellite của ngao dầu được Wang và ctv phân lập thành công

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

Nhìn chung các nghiên cứu về ngao ở trong nước đa số tập trung vào sinh học sinh sản, kỹ thuật sản xuất giống và nuôi thương phẩm một số đối tượng kinh

tế Trong đó có một vài nghiên cứu công trình nghiên cứu như của Nguyễn Tác An

và Nguyễn Văn Lục (1994) ở Trà Vinh về điều tra và đánh giá nguồn lợi hoặc một vài tác giả khác như của Nguyễn Hữu Phụng (1996) và Võ Sĩ Tuấn và ctv (1998) Trương Quốc Phú (2001), nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh hóa và kỹ

thuật nuôi ngao (Meretrix lyrata) , thực hiện tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu

Long chủ yếu tại bãi Tân Thành huyện Gò Công tỉnh Tiền Giang

Nghiên cứu sản xuất giống ngao của Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II do Nguyễn Đình Hùng và ctv (2000) thực hiện, kết quả cho thấy hiện tượng lưỡng

tính ở ngao (Meretrix lyrata), ngao sinh sản hàng năm, mùa sinh sản chính từ tháng

5 đến tháng 7, mùa phụ từ tháng 11 đến giêng năm sau, với tỷ lệ đực cái trong tự nhiên là 1/1 Chu Chí Thiết và ctv (2005), nghiên cứu kỹ thuật sản xuất giống ngao tại các tỉnh miền Trung

Mặc dù ngao Bến tre là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam, nhưng chưa

có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể ngao ở Việt Nam

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Ngao Bến Tre sử dụng trong nghiên cứu được thu ngoài tự nhiên tại Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Bến Tre, Tp Hồ Chí Minh và Cà Mau

Thời gian thu từ tháng 7 - 11/2013

Mẫu thu về được phân tích tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thủy sản - Trường Cao đẳng thủy sản Bắc Ninh

Thời gian nghiên cứu từ tháng 4/2013 - 4/2014

Bản đồ thu mẫu:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

Hình 2.1 Bản đồ thu mẫu ngao Bến Tre

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

Kí hiệu mẫu: Bảng 2.1

Bảng 2.1 Địa điểm thu mẫu và số lượng mẫu phân tích

STT Quần thể Kí hiệu Địa điểm thu mẫu

Số mẫu thu

Số mẫu phân tích microsatellite

1 Thái Bình TB Đông Minh-Tiền

2.1.2 Phương pháp thu và bảo quản mẫu

Phương pháp thu mẫu: Dùng cào chuyên biệt để thu, ở mỗi vùng ngao phân

bố ngoài tự nhiên chọn năm xã tại mỗi quần thể, mỗi xã thu 10 mẫu và mỗi mẫu lấy khoảng 5g phần cơ màng áo của ngao Bến Tre(mẫu phải tươi), bảo quản mẫu trong Ethanol 80% Cỡ ngao thu mẫu dao động từ 15-20g/con Ngao tự nhiên có đường vân ở đỉnh sinh trưởng dầy hơn so với ngao nuôi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

Hình 2.2 Máy PCR MyGenic 96 Thermal Block

- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: 4 loại deoxynucleotit triophosphat (dNTPs) của hãng BioRad , Taq – ADN Polymerase của BioRad

- Để nhân đoạn microsatellite của ngao, 4 cặp mồi được lựa chọn trong nghiên cứu của Wang và ctv (2009) gồm: MME02 - GQ141833, MME12 - GQ141843, MME13 - GQ141844, MME15 - GQ141846 để khuyếch đại Microsatellite của ngao

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể ngao Bến

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

Tre được thực hiện theo sơ đồ sau: