kiểm tra tính kháng nguyên của protein nucleocapsid phục vụ việc tạo kit chẩn đoán hội chứng rồi loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường lây chính của bệnh nên bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác Lợn mang virus có thể giải phóng virus trong t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN THỊ KHÁNH LY

KIỂM TRA TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA PROTEIN

NUCLEOCAPSID PHỤC VỤ VIỆC TẠO KIT CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG RỒI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN THỊ KHÁNH LY

KIỂM TRA TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA PROTEIN

NUCLEOCAPSID PHỤC VỤ VIỆC TẠO KIT CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG RỒI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

MÃ SỐ : 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN THỊ MINH HUYỀN

TS NGUYỄN HỮU ĐỨC

HÀ NỘI - 2014

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Khánh Ly

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Minh Huyền

Phòng Công nghệ Tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam và TS Nguyễn Hữu Đức Phó trưởng Khoa Công

nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Với tình cảm sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Quang Huấn

Trưởng phòng Công nghệ Tế bào động Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể cán bộ nghiên cứu trong phòng đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong quá trình học tập

Để thực hiện được nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ từ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hướng Công nghệ sinh học với mã số đề tài VAST02.02/12-13

Để hoàn thành luận văn này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo, tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu Dâu tằm tơ, nơi tôi công tác

Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con đường học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 8 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Khánh Ly

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

1.1 Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3

1.1.2 Bệnh tích và phương thức lây truyền 3 1.1.3 Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

1.1.4 Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

1.2 Giới thiệu chung về virus PRRS 17 1.2.1 Hình thái, cấu tạo phân tử virion của PRRSV 18

1.2.3 Sự đa dạng trong các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giới 19

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

1.2.1 Phương pháp điện di protein (Laemmli, 1970) 27

2.2.4 Gây miễn dịch trên chuột thuần chủng BALB/c 31

2.2.6 Phương pháp tạo kit chẩn đoán dạng que thử 32

3.1 Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên của protein nucleocapsid 34 3.1.1 Kết quả tinh sạch của protein N tái tổ hợp 34 3.1.2 Kết quả kiểm tra hoạt tính của kháng nguyên protein N tái tổ hợp 37 3.1.3 Kết quả kiểm tra hoạt tính của protein N bằng cách gây miễn dịch trên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ARN Ribonucleic Acid

ATP Adenosine triphosphate

BSA Bovine Serum Albumin

bp Base pair (cặp base nitơ)

dNTP Deoxyribonucleotide

DBB Denaturing binding buffer

DNA Deoxyribo – Nucleic Acid

DWB Denaturing wash buffer

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

HRP Horse Radish Peroxidase

IPMA Immunoperoxidase Monolayer Assay

IPTG Isopropyl β- D- 1- Thiogalactopyranoside

kDa Kilo Dalton

LB Luria Broth

MVL Modified live virus

MBP Maltose Binding Protein

OD Optical Density

ORF Open Reading Frame

PCR Polymerase Chain Reaction

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC HÌNH

1.1 Cấu tạo phân tử virion của PRRSV 18

1.3 Cấu trúc que chẩn đoán 26

2.3 Bố trí các thành phần trên que thử 32 3.1 Kết quả tinh sạch protein N tái tổ hợp 35 3.2 Kết quả cắt protein MBP-protein N bằng enzyme Thrombin 37 3.3 Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein N bằng phương pháp

3.8 Hình ảnh điện di protein trước khi làm Western blot 44 3.9 Kết quả western blot với mẫu huyết thanh chuột được gây miễn dịch

3.11(a) Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn 48 3.11 (b) Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn 49 3.11 (c ) Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn 49 3.11(d) Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn 50 3.11 (e) Kết quả kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn 50

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tai xanh hay còn gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) là một bệnh truyền nhiễm, lây lan nhanh, làm ốm và chết nhiều lợn bệnh Trong những năm qua ngành chăn nuôi nước ta cũng như các nước khác trên thế giới vẫn sống chung với loại bệnh này Tuy nhiên, gần đây tại Trung Quốc xuất hiện dịch lớn gây chết hàng loạt trên lợn nuôi Từ Trung Quốc, tác nhân này lây lan sang nhiều nước trong đó có Việt Nam và cũng đã gây thiệt hại rất lớn trên diện rộng Bệnh do một loại virus có tên Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) gây ra Loại virus này làm giảm chức năng miễn dịch, tạo điều kiện cho các loại mầm bệnh khác xâm nhập gây bệnh kế phát ở hệ hô hấp, trong đó

có chứng liên cầu- một bệnh nguy hiểm có thể lây cho người và dễ dẫn đến tử vong

Do đó, vấn đề là phải tìm ra một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, chính xác các tác nhân gây bệnh để kịp thời phòng ngừa Chẩn đoán chính xác sự lây nhiễm

và tiêm vaccine phòng dịch bệnh có ý nghĩa to lớn trong việc kiểm soát tới thanh toán được dịch bệnh nguy hiểm này

Trong ba loại protein cấu trúc chính của virus PRRS thì protein nucleocapside (protein N) quy định bởi ORF7 hiện diện với số lượng lớn nhất trong phân tử virion của PRRS và huyết thanh lợn bị nhiễm PRRSV phản ứng mạnh với protein N Ngoài ra các kit ELISA thương mại cũng sử dụng để phát hiện kháng thể kháng protein N Chính vì thế sản xuất protein N tái tổ hợp có hoạt tính kháng nguyên tương tự như protein N của virus mang tính ứng dụng cao dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán

Hiện nay, việc chẩn đoán sớm hội chứng PRRS thường sử dụng Kit ELISA HerdChek 2XR (IDEXX) của Mỹ, đây được coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS do có độ nhạy cao và đặc hiệu Phương pháp này có thể phát hiện được kháng thể kháng virus PRRS trên lợn sau 9 ngày nhiễm, tuy nhiên Kit ELISA này có giá thành khá đắt, tốn nhiều thời gian thực hiện Gần đây, phương pháp chẩn đoán nhanh dạng que thử trên nguyên lý của phương pháp sắc

ký miễn dịch được quan tâm, do đây là một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

có tính đặc hiệu cao và có thể chẩn đoán ngay ở bất kỳ điều kiện nào Ở nước ta, hiện chưa có các nghiên cứu sản xuất que thử chẩn đoán nhanh cho bệnh PRRS tương tự Vì vậy với mong muốn tạo được que chẩn đoán nhanh với giá thành phù hợp ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Kiểm tra tính kháng nguyên của protein nucleocapsid phục vụ việc tạo kit

chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”

Mục tiêu

- Đánh giá được hoạt tính sinh học của kháng nguyên

Nội dung

- Kiểm tra tính kháng nguyên của protein nucleocapsid

- Thử nghiệm tạo kit chẩn đoán bệnh bằng que thử

- Kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn bằng que thử

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

1.1.1 Triệu chứng lâm sàng

Căn cứ vào các biểu hiện của lợn bị bệnh, người ta có thể chia thành hai loại triệu chứng: các triệu chứng rối loạn sinh sản ở lợn nái và các triệu chứng hô hấp Các triệu chứng rối loạn sinh sản ở lợn nái bao gồm: lợn nái bị sốt 39 – 40oC, bỏ ăn, mệt mỏi, giảm tỷ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy thai (tỷ lệ này có thể đến 50% trong các đàn mới bị nhiễm virus), giảm tiết sữa hoặc mất hoàn toàn, chết thai, đẻ non, chậm động dục hoặc không động dục trở lại, rối loại sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng Biểu hiện các triệu chứng hô hấp bao gồm: loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở, hắt hơi, tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng Khi bị nhiễm virus PRRS lợn con có tỷ lệ chết trước cai sữa cao, gầy yếu, bỏ ăn phù mắt, các nốt phồng rộp trên da, ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân Lợn trưởng thành có biểu hiện sốt nhẹ, bỏ ăn, các triệu chứng khác nhẹ hơn Lợn đực giống có các biểu hiện giảm hưng phấn, giảm thể tích và chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực và nồng độ tinh trùng)(Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

1.1.2 Bệnh tích và phương thức lây truyền

Đối với lợn nái, ngoài các triệu chứng sảy thai, tăng tỷ lệ thai chết, lợn mắc bệnh thường không có các bệnh tích đặc thù Đối với lợn con thường mang các bệnh tích rõ hơn lợn trưởng thành và lợn nái bao gồm: dịch thẩm thấu trong đường tiêu hóa và đường hô hấp đặc biệt trong các phế quản, phù, thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc, sưng hạch bạch huyết, da nhiều vùng có màu xanh tím (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Virus thường xâm nhiễm thông qua đường hô hấp và xâm nhập vào tế bào đại thực bào của phế nang phổi rồi nhân lên ở đó, chúng kích thích tạo đáp ứng interferon rất ít trước khi phát tán bên trong vật chủ Virus PRRS thích hợp với một loại tế bào chuyên biệt với các đại thực bào đã biệt hóa như đại thực bào túi phôi Tuy nhiên cơ chế chính xác của tế bào đích và thông tin của thụ thể chuyên biệt cho

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

virus PRRS cho đến nay vẫn chưa được hiểu tường tận Một số thụ thể tế bào tiếp nhận PRRS đã được công bố, trong đó bao gồm thụ thể CD163 có nhiều trên các đại thực bào như là PAM (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Trong suốt quá trình xâm nhiễm, PRRSV tạo hội chứng bệnh rối loạn sinh sản

và hô hấp Virus cũng có thể truyền qua tinh dịch và đường từ mẹ sang con và có thể gây tử vong với tỷ lệ khá cao PRRSV có thể tồn tại trong cơ thể lợn, lợn bị xâm nhiễm

có thể phục hồi, khỏi bệnh nhưng vẫn chứa virus trong thời gian dài và lây bệnh cho các con lợn chưa bị nhiễm bệnh khác qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp

Tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường lây chính của bệnh nên bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác Lợn mang virus

có thể giải phóng virus trong thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho công tác theo dõi và phát hiện khống chế bệnh Tinh dịch lợn mang tinh trùng cũng có khả năng nhiễm virus vì vậy bệnh có thể truyền qua đường sinh dục Virus PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân và nước tiểu của lợn bệnh có thể phát tán theo gió, không khí (xa trên 3km), nước hoặc dụng cụ bảo hộ lao động, dụng cụ chăn nuôi và chim hoang truyền dẫn…

Virus có mặt trong hạch lâm ba, phổi với số lượng lớn hơn nhiều trong thịt

và có khả năng giữ được độc lực trong điều kiện lạnh Tuy vậy, khả năng truyền bệnh do cho ăn các phụ phẩm trong quá trình giết mổ các gia súc mắc bệnh chưa được xác định Tuy nhiên, tốt hơn hết nên cách ly toàn bộ đàn lợn có nguy cơ với mọi loại nguồn bệnh và không cho ăn nội tạng từ lợn nghi mắc bệnh (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên thế giới

Virus gây bệnh lợn tai xanh được biết đến vào cuối những năm 1980 ở Mỹ

và Châu Âu, từ đó lan rộng khắp thế giới Thời kỳ này người ta đã công bố một loại bệnh gây ra viêm phổi, chậm phát triển, gây chết trên những con lợn đang sinh trưởng và lợn con, mất khả năng sinh sản ở lợn nái

Tại Trung Quốc, một căn bệnh bí hiểm đã xảy ra còn được gọi là bệnh sốt

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

cao vào năm 2006 và người ta thấy có dấu hiệu của PRRS Căn bệnh này đã lan rộng ra hơn 10 tỉnh và tấn công 2.000.000 lợn, gây chết 400.000 lợn Không giống với PRRS điển hình, căn bệnh bí hiểm này xảy ra nhiều trên lợn lớn với dấu hiệu sốt cao, và một số triệu chứng như dịch tả lợn Khi phân tích hệ gen, người ta thấy các virus PRRS phân lập được thuộc nhóm II và tương đồng rất cao với chủng HB-

1, một chủng PRRS của Trung Quốc (96,5%)

Năm 2007, dịch PRRS xảy ra tại Trung Quốc làm chết gần 70.000 con lợn và buộc nước này phải tiêu hủy khoảng 200.000 lợn nghi bệnh tạo nên cơn sốt giá trên thị trường thịt lên đến 74,6% Người ta cho rằng virus gây bệnh PRRS tại nước này

là chủng Châu Mỹ độc lực cao Chủng virus này sau đó cũng lây lan sang nhiều nước trên thế giới gây khó khăn phức tạp trong quá trình chẩn đoán, phân biệt giữa chủng thường và chủng độc lực cao này

Benfield (1992) đã mô tả, đặt tên cho virus gây bệnh ở Bắc Mỹ là VR- 2332

và đưa ra đặc tính của PRRSV như sức đề kháng của PRRSV Tác giả khẳng định PRRSV thích hợp ở pH từ 6,5- 7,5

Benfield (1992); Saito (1996) đã khẳng định virus gây PRRS có quan hệ họ hàng gần với virus viêm động mạch ngựa, virus tăng enzyme lactate dehydrogenase ở chuột, virus gây sốt xuất huyết ở khỉ Cũng như đưa ra những đặc tính quan trọng của

họ Arteriviridae, bộ Nidovirales

Damrongwatanapokin S và cs (1996) lần đầu tiên đã phân lập được PRRSV Tuy nhiên, có một số nghiên cứu đã khẳng định PRRS lần đầu tiên xuất hiện ở nước này vào năm 1989 Nguồn gốc PRRS tại Thái Lan là do việc sử dụng tinh lợn nhập nội đã bị nhiễm virus PRRS hoặc là do các đàn nhập nội mang virus PRRS

Vezina và cs (1996), Yoon và cs (1995) đã nghiên cứu về quá trình đáp ứng miễn dịch của lợn khi cơ thể lợn nhiễm PRRS Các tác giả đã khẳng định kháng thể IgM xuất hiện vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 IgG xuất hiện sau khi nhiễm PRRS Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4-5 tuần sau nhiễm PRRSV và đạt tối đa vào lúc

10 tuần, miễn dịch kéo dài khoảng 1 năm

Mengeling và cs (1996), Mengeling và cs (1998) nghiên cứu về vaccine

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

chống lại PRRSV Khẳng định virus vaccine kích thích đáp ứng miễn dịch chậm, virus vaccine có thể truyền qua nhau thai, truyền từ con được tiêm vaccine sang con không tiêm vaccine Một số vaccine đã được thương mại hóa nhưng mỗi loại đều có

ưu và nhược điểm, điều quan trọng nhất là sử dụng đúng loại vaccine tùy theo chủng PRRSV lưu hành Hiện nay vẫn chưa có khả năng phân biệt kháng thể do vaccine và kháng thể do virus từ môi trường

Amonsnin và cs (2009) đã phân tích trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen của chủng PRRSV thu từ đợt dịch bệnh năm 2001 tại Thái Lan Kết quả cho thấy kích thước phân tử của hệ gen chủng PRRSV dòng châu Âu (EU) và dòng Bắc Mỹ (NA) tương ứng là 14934 và 15412 nucleotide Cũng giống như các nhà nghiên cứu trước đây về cấu trúc hệ gen PRRSV, hệ gen của virus PRRS Thái bao gồm: 2 vùng không phiên mã (đầu 5’- và đuôi 3’-), 8 ORF, trong đó 2 gen không cấu trúc là ORF1a và ORF1b (Nsp – Nonstructure protein) và ORF2 – 7 là các gen mã hoá protein cấu trúc Dựa trên trình tự hệ gen, cây phả hệ di truyền cho thấy trong 2 chủng PRRSV thì một thuộc về dòng châu Âu và một thuộc về dòng Bắc Mỹ So sánh trình tự toàn bộ hệ gen của 2 chủng virus PRRS phân lập tại Thái Lan với các chủng có nguồn gốc châu Âu, Bắc Mỹ cung cấp thông tin quý giá cho việc đánh giá mức độ biến đổi di truyền và tiến hoá phân tử của các chủng này, cụ thể là: chủng virus 0INPI được cho là có nguồn gốc từ vaccine nhưng tại thời điểm năm 2001 thì vaccine US – MVL (Modified Live Virus) chưa có mặt tại thị trường Thái Lan, vì thế lý do của việc lưu hành chủng vi rút 0INP1 có thể là do sự có mặt của PRRSV trong lợn giống hoặc tinh trùng nhập khẩu từ Mỹ

Zimmermen và cs (1999) đã nghiên cứu một cách đầy đủ và sâu sắc về Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn Các tác giả đã giải thích về nguồn gốc tên gọi PRRS, cũng như cung cấp cho độc giả một bảng danh sách tên gọi trước khi

có tên PRRS

Từ năm 2000 đến 2003, R Thanawongnuwech và cs đã tiến hành một nghiên cứu quy mô rộng lớn tại Thái Lan và đưa ra kết quả PRRSV từ 137 mẫu phân lập từ nhiều điạ phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng Châu Âu và

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

dòng Bắc Mỹ Trong đó, virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58%, dòng Châu Âu chiếm 66,42%

Indik và cs (2005) đã đưa ra bằng chứng về sự có mặt của chủng PRRSV dòng Bắc Mỹ ở Áo ở mức độ phân tử Không giống như nhiều nước khác, chủng vaccine dòng Bắc Mỹ chưa được phép nhập vào Áo, vì thế lý do duy nhất để giải thích sự có mặt của chủng virus PRRS dòng Bắc Mỹ ở Áo là do việc nhập lợn đã được tiêm vaccine chủng virus Bắc Mỹ Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của các phân tích chi tiết trình tự gen của các biến thể di truyền virus PRRS đang lưu hành ở từng khu vực

Jun Han và cs (2006) đã khẳng định về mặt di truyền học và tính kháng nguyên hai loại virus Lelystad và VR- 2332 hoàn toàn khác nhau, nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng được tiến hoá theo hai hướng khác nhau Hai virus này

đã trở thành hai dòng virus nguyên mẫu, dòng Châu Âu (virus Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (VR2332)

Pesente và cs (2006) đã nhận xét trình tự nucleotide ORF5 và ORF7 của chủng virus PRRS phân lập tại các trại lợn ở miền bắc Italia cung cấp các thông tin giá trị cho việc đánh giá dịch tễ học và phát tán virus Kết quả so sánh trình tự nucleotide các dòng virus PRRS đại diện đang lưu hành cho thấy đa hình di truyền lớn trong trình tự ORF5 và ORF7, và cây phả hệ di truyền cũng bộc lộ khác biệt di truyền lớn giữa các chủng virus nghiên cứu Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Stadejek và cs vào năm 2002 khi phân tích các vùng biến đổi trong trình tự axit amin của ORF5 và ORF7

Gonin và cs (2009) đã giải trình tự nucleotide GP5 của virus PPRS phân lập tại Hàn Quốc năm 2007 – 2008 Kết quả cho thấy sự khác biệt di truyền tương đối cao (1,3 – 12,9%) giữa chủng virus đang lưu hành so với chủng virus cải vaccine (Modified live virus) Cây phân loại di truyền cũng cho thấy biến đổi di truyền giữa các chủng tăng theo thời gian từ 1997 – 2008 Vì thế tác giả khuyến cáo cần có đề xuất trong việc lựa chọn loại vaccine thích hợp hơn nhằm khống chế bệnh PRRS hiệu quả mặc dù chủng vaccine đang sử dụng đã và vẫn có tác dụng tốt trong việc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

làm giảm các tín hiệu lâm sàng của bệnh cũng như cải thiện giá trị tăng trọng trung bình ngày của đàn lợn tại các trại nhiễm PRRSV

Shi và cs (2010) đã dựa trên sự phân tích di truyền của 8624 trình tự ORF5

để xây dựng nên một bức tranh toàn diện về sự đa dạng di truyền của PRRSV loại

2, đồng thời phân chia các chủng hiện có thành 9 dòng và các chủng cho mỗi dòng Trong báo cáo này còn bao gồm cả các dòng chưa từng được công bố trước đây Hệ thống phân loại của Shi là một trong những hệ thống đầy đủ và đáng tin cậy nhất, làm cơ sở để so sánh và phân tích cho các nghiên cứu sau này Hơn 85% tất cả các trình tự rơi vào 4 dòng lớn bao gồm dòng số 9 (2800 mẫu), dòng số 1 (2000 mẫu), dòng số 5 (1500 mẫu) và dòng số 8 (1400 mẫu) trong khi các mẫu còn lại rơi vào 5 dòng với kích thước mẫu gần tương đương khoảng từ 14 cho đến 115 mẫu Chủ yếu các trình tự của các dòng quốc tế rơi vào dòng số 5 Một vài trình tự của Thái Lan

và của Canada thuộc dòng số 1 Dòng độc lực cao của Trung Quốc thuộc dòng số 8 Một vài mẫu từ Ý thuộc về dòng số 8 và số 9 Các chủng vacccine đang sử dụng hiện nay cũng được phân tích Vaccine MLV (Boehringer Ingelheim, Germany) và chủng gốc VR – 2332 thuộc chủng số 5.1 tương tự như phần lớn các mẫu của các trình tự trên thế giới Vaccine dòng ATP (Boehringer Ingelheim, Germany) thuộc

về chủng 8.9 Vaccine dòng PrimePac và Neb-1 thuộc về dòng số 7 Chủng có độc lực cao ở Trung Quốc thuộc vào chủng số 8.7 Madsen cũng đã đưa ra dự đoán các chủng có độc lực cao này không bắt nguồn từ một dòng chưa được biết trước đó mà bắt nguồn từ dòng số 8 đã lưu hành ở Trung Quốc 10 năm trước khi bùng nổ dịch vào năm 2006 Thêm vào đó, dựa trên phân tích chủng PRRSV ở các bang của Mỹ

và các chủng khác trên thế giới, Madsen K G và cs đã khẳng định lại chắc chắn kết luận của một số nhà nghiên cứu trước về sự lây truyền của PRRSV không bị hạn chế bởi khoảng cách địa lý

Ngoài ra, báo cáo cũng đồng thời chỉ ra rằng trong suốt 30 năm quá trình phát triển, tiến hóa của mình, PRRSV ORF5 đã đạt tới sự khác biệt trung bình về mặt di truyền là 12,5% với khoảng cách các cặp lớn nhất là 27,8% Shi và cs, (2010) đã khuyến cáo sự phát triển nhanh chóng như vậy có thể gây ra những

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

khó khăn trong chẩn đoán virus và hiệu quả của vắc-xin và vì vậy các công trình nghiên cứu tốc độ phát triển của virus, giải trình tự của các mẫu nên được tiến hành thường xuyên

1.1.4 Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam

Cho đến nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, đặc biệt là nghiên cứu sâu về mầm bệnh, tính chất kháng nguyên cũng như độc lực của virus gây bệnh Các nghiên cứu mới chỉ là những thống kê và chẩn đoán về bệnh tai xanh xuất hiện ở một số tỉnh thành trong cả nước

Năm 1997 Việt Nam nhập 51 lợn giống từ Mỹ khi kiểm tra có 10/ 51 con có huyết thanh dương tính với PRRS Từ năm 1997 đến 2006 có rất nhiều tác giả trong nước nghiên cứu về hội chứng PRRS nhưng chỉ dừng lại ở điều tra, giám sát tỷ lệ lưu hành huyết thanh

Từ năm 1999 – 2002 một số nhà khoa học Nhật Bản kết hợp với Trường Đại học Cần Thơ cũng đã tiến hành điều tra một số trường hợp bệnh ở lợn có hiện tượng lợn con chết và lợn nái sảy thai và điều trị kháng sinh không hiệu quả Trong nghiên cứu này, người ta điều tra một số nguyên nhân gây bệnh trong đó có hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Điều tra được tiến hành ở các đàn lợn gia đình, một

số trại giống của Nhà nước và một số lò mổ Các nhà khoa học đã phát hiện thấy kháng thể PRRS trong huyết thanh ở các đàn lợn nuôi gia đình và có tỷ lệ lưu hành cao ở các trại lợn của Nhà nước cùng với hiện tượng tỷ lệ lợn con chết cao Ngoài

ra, cũng phát hiện thấy virus giả dại và virus Dịch tả lợn

Bắt đầu từ tháng 3 năm 2007, khi các ổ dịch lâm sàng PRRS bùng nổ thì việc nghiên cứu về bệnh ở Việt Nam mới được triển khai toàn diện trên cả nước dưới nhiều hình thức cả về dịch tễ học và các biện pháp chẩn đoán xét nghiệm, phòng chống dịch bệnh Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương đã xác định được nguyên nhân chính gây bệnh lạ xuất hiện trên nhiều đàn lợn ở một số tỉnh như Hưng Yên, Hải Dương, Thái Bình, Hà Nội, Quảng Nam là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) Căn bệnh này có đặc điểm là xảy ra ở tất cả các lứa tuổi lợn và khác biệt với virus PRRS thể cổ điển chủ yếu tấn công lợn nái và lợn con Các mẫu virus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

PRRS phân lập được từ các ổ dịch đã được gửi đi giám định tại Phòng thí nghiệm Chẩn đoán Thú y quốc gia của Hoa Kỳ (USDA-NVSL) và tại Trung tâm Kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Trung Quốc Kết quả giám định cho thấy các mẫu virus của Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ và có độ tương đồng cao (98,7-99,8%) với virus PRRS gây bệnh tại Trung Quốc năm 2006 Phân tích cấu trúc gen NSP2 của virus PRRS phân lập ở Việt Nam cũng thấy có 2 đoạn mất không liên tiếp của axit amin tại vị trí 481 và 532-560 Theo các nhà khoa học Trung Quốc virus PRRS phát hiện được ở Việt Nam có sự mất đoạn giống với PRRS chủng độc lực cao ở Trung Quốc

Tô Long Thành (2007) đã trình bày một cách tổng hợp về hội chứng PRRS nói chung, khẳng định lợn các lứa tuổi đều mắc, nhưng nặng nhất ở lợn nái và lợn con Tác giả đã đưa ra biện pháp phòng hội chứng PRRS, trong đó nhấn mạnh việc phòng bệnh PRRS bằng vaccine

Khi lợn mắc PRRS không chỉ có những bệnh tích đặc trưng nhất của PRRS là ở phổi mà còn có những bệnh tích khác do vi khuẩn kế phát gây ra Những vi khuẩn kế phát ở đường phổi thường gặp là Mycoplasma hyopneumoniae (suyễn lợn), Pasteurella multocida (Tụ huyết trùng), Streptococcus suis type 2 (liên cầu khuẩn type 2), Bordetella bronchiseptica (viêm teo mũi) và Haemophilus parasuis (viêm đường hô hấp)… Theo kết quả nghiên cứu của Viện Thú y Quốc gia do tác giả Cù Hữu Phú thực hiện cho thấy, các bệnh nhiễm trùng kế phát thường gặp ở lợn mắc bệnh tai xanh gồm: Tụ huyết trùng, liên cầu khuẩn và viêm phổi do vi khuẩn ở lợn

Phạm Ngọc Thạch và cộng sự (2007) nghiên cứu về một số chỉ tiêu lâm sàng và chỉ tiêu máu của lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên đã cho thấy, khi lợn mắc PRRS tần số hô hấp, tim mạch, thân nhiệt đều cao hơn sinh lý bình thường, chỉ tiêu sinh

lý, sinh hoá máu thay đổi đặc biệt là số lượng bạch cầu, độ dự trữ kiềm trong máu tăng cao Trong khi hàm lượng protein tổng số, hàm lượng đường huyết lại giảm rõ rệt

Lê Văn Năm (2007) khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể

ở lợn mắc PRRS tại một số địa phương thuộc Đồng bằng Bắc Bộ- Việt Nam đã thấy rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS tương tự như

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

các tài liệu trong và ngoài nước công bố Nhưng điểm khác đó là tỷ lệ tiêu chảy, lạc giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo bón ở lợn lớn hơn

Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự (2007) đã sử dụng kỹ thuật RT- PCR để phát hiện virus PRRS trong các mẫu huyết thanh, tinh dịch, mô của lợn có kết quả dương tính và âm tính với kháng thể PRRS khi dùng phương pháp ELISA Tác giả đã không ghi nhận được mối tương quan giữa sự liên hệ của kháng thể kháng PRRS và kết quả dương tính với virus PRRS chẩn đoán bằng kỹ thuật RT- PCR

Tô Long Thành và cộng sự (2008) đã cho biết năm 2008 số lượng bệnh phẩm lợn mắc PRRS gửi đến Trung tâm chẩn đoán thú y TW nhiều hơn năm

2007, khẳng định những mẫu bệnh phẩm dương tính với PRRS có sự bội nhiễm vi khuẩn Chủng virus độc lực cao của Việt Nam có sự tương đồng về cấu trúc gen với chủng virus độc lực cao của Trung Quốc đến 99% Khi sử dụng virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam tiêm cho lợn thí nghiệm lợn không chết, huyễn dịch bệnh phẩm lấy tại ổ dịch của Việt Nam gây chết 100% lợn trong 72h Điều này cho thấy vai trò của vi khuẩn bội nhiễm

Trần Thị Bích Liên (2008) đã tổng quát về tình hình dịch PRRS cả Việt Nam

và thế giới cũng như những đặc điểm cơ bản về PRRSV Đặc biệt tác giả đưa ra phương pháp chẩn đoán PRRS như phân lập virus bằng phương pháp IPMA kết hợp với PCR, phương pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể Tác giả chỉ rõ để phát hiện kháng nguyên sử dụng phương pháp RT- PCR là hiệu quả nhất, phát hiện kháng thể có hai phương pháp có độ chính xác cao là IPMA và ELISA

Youjun Feng và cs (2009) đã chỉ rõ các biến chủng của PRRSV của Trung Quốc và Việt Nam có bộ gen tương đồng tới 99% Phân tích di truyền đã cho thấy các chủng virus này đều có sự đứt đoạn acid amin trên protein không cấu trúc NSP2 Nhóm tác giả khẳng định các biến chủng của PRRSV tại Việt Nam và Trung Quốc là đồng nhất

Lê Thanh Hòa và cộng sự (2009) đã phân tích gen M mã hóa protein màng của virus PRRS gây dịch tại tỉnh Quảng Nam chỉ ra virus có chuỗi gen M dài 525bp, thuộc type II dòng Bắc Mỹ, có thành phần nucleotide và axit amin tương đồng từ 99 – 100% các chủng của Trung Quốc, từ đó cho thấy có thể chủng virus ở

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

Việt Nam có cùng nguồn gốc phát sinh các chủng của Trung Quốc

Võ Khánh Hưng và cộng sự (2010) khi phân tích trình tự gen N (ORF7) của các chủng PRRSV phân lập tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp HCM đã xác nhận các chủng virus PRRS đang lưu hành tại địa phương thuộc dòng châu Mỹ, cùng nhóm với chủng virus độc lực cao của Trung Quốc (tương đồng 98,4 – 99,5% nucleotide) Đặc biệt, hai chủng phân lập từ Bà Rịa – Vũng Tàu có sự biến đổi di truyền lớn so với các chủng thực địa khác tại các tỉnh thành được nghiên cứu (89,5 – 90,3% nucleotide tương đồng) và so với chủng vaccine BSL – PS100 (mức tương đồng 91,1% nucleotide), và tách riêng biệt so với các chủng khác xuất hiện trước đây Kết quả này cho thấy đang có xu hướng biến đổi di truyền của virus PRRS tại một số tỉnh miền Nam Việt Nam cụ thể là ở Bà Rịa – Vũng Tàu Điều này đóng góp vào hiểu biết về dịch tễ học cũng như xu hướng biến đổi di truyền của các chủng virus PRRS tại thực địa và hiệu quả của việc sử dụng vaccine hiện tại ở các tỉnh nói trên

Võ Khánh Hưng và cộng sự (2012) đã phân tích và so sánh trình tự GP5 của

6 chủng virus PRRS phân lập tại Tp HCM và Đồng Nai trong năm 2009 cho thấy các chủng virus PRRS lưu hành tại Đồng Nai và Tp HCM thuộc dòng châu Mỹ, cùng nhóm với các chủng virus PRRS độc lực cao của Trung Quốc (98,5 – 99,7%),

và tương đồng 87,9 – 88,6% so với chủng vaccine đang khuyến cáo sử dụng tại Việt Nam, BSL – PS100 của Bestam Singapo

Nguyễn Ngọc Hải và cs (2012) đã sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR để xác định kiểu gen của PRRSV nhiễm trên 46 mẫu bệnh phẩm thu được từ các trại chăn nuôi lợn ở TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Bắc Giang và Hà Nội Kết quả ghi nhận PRRSV nhiễm trên đàn lợn Việt Nam thuộc kiểu gen Bắc Mỹ với 100% mẫu dương tính Kiểu gen Châu Âu của PRRSV chỉ chiếm 2,18% (1/46 mẫu) mẫu xét nghiệm

Nguyễn Thị Lan và cộng sự (2012) khi chẩn đoán bằng kỹ thuật bệnh lý cho thấy các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn sau cai sữa mắc PRRS bao gồm: sốt,

bỏ ăn, khó thở, tím tái Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và hạch lâm ba với hiện tượng viêm là phổ biến Các biến đổi vi thể phổ biến ở phổi với hiện tượng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

thâm nhiễm tế bào viêm, các cơ quan khác như hạch, lạch, thận cũng xuất hiện các tổn thương vi thể Bằng kỹ thuật RT-PCR, đã xác định được chính xác được lợn sau cai sữa mắc PRRS

Nguyễn Đức Hiền (2012) đã nghiên cứu tình hình nhiễm PRRS trong đàn lợn

ở Cần Thơ Xét nghiệm cho thấy 290 mẫu huyết thanh lợn chưa tiêm phòng vaccine PRRS bằng phương pháp ELISA cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV ở lợn nuôi tại thành phố Cần Thơ là 16,90% Trong đó, tỷ lệ nhiễm PRRS ở lợn của những trại chăn nuôi tập trung cao hơn lợn nuôi ở các nông hộ (64,0 % so với 38,12%) Tỷ lệ nhiễm PRRSV cao nhất được tìm thấy trên lợn nái (69,57%), kế đến trên lợn con (33,33%) và thấp nhất trên lợn thịt (12,16%) Xét nghiệm 194 mẫu huyết thanh lợn

đã tiêm 04 loại vacxin phòng bệnh PRRS cho thấy tỉ lệ lợn có kháng thể sau tiêm chủng là 59,79%

Nguyễn Bá Hiên (2013) nghiên cứu trên 50 mẫu bệnh phẩm của lợn nghi bệnh thu thập được, bằng kỹ thuật RT-PCR, đã chẩn đoán chính xác 15 lợn mắc PRRS Các mẫu dương tính này được dùng cho phân lập virus trên môi trường tế bào Marc 145 và đã phân lập thành công Đã khảo sát đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 15 chủng virus PRRS phân lập được, chọn ra 5 chủng có đặc tính sinh học và sinh học phân tử khá ổn định, có hiệu giá virus cao để phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin phòng hội chứng PRRS

*Tình hình dịch Tai xanh ở Việt Nam

Tại Việt Nam, bằng chứng của virus PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở đàn lợn giống nhập khẩu từ Hoa Kỳ vào năm 1997 Sau đó, một số nghiên cứu giám sát khẳng định có sự lưu hành của virus PRRS tại các tỉnh miền Nam ở các mức độ khác nhau tùy theo từng địa phương và trại chăn nuôi Tuy nhiên, đến trước tháng 3/2007 không có ổ dịch PRRS nào được báo cáo từ các địa phương trong cả nước Tháng 3/2007, lần đầu tiên dịch bệnh trên lợn xuất hiện tại Hải Dương và 5 tỉnh khác của miền Bắc Sau đó, với sự hỗ trợ của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), nguyên nhân gây bệnh đã được khẳng định là do virus PRRS chủng Bắc Mỹ gây ra Virus này đã được xác định là có tương đồng ở mức độ cao về kháng nguyên so với virus PRRS gây bệnh trầm trọng tại Trung Quốc vào năm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

2006 Tuy nhiên, những đặc điểm dịch tễ của bệnh PRRS tại Việt Nam chưa được hiểu rõ ràng, các giải pháp xử lý lợn mắc bệnh và lợn trong vùng dịch vào thời điểm

đó còn gặp nhiều khó khăn Kết quả điều tra ổ dịch tại các tỉnh miền Bắc (Hưng Yên, Hải Dương và Thái Bình), các tỉnh miền Bắc Trung bộ và miền Trung (Thanh Hóa, Quảng Nam) và các tỉnh miền Nam (Long An, Vĩnh Long và Bạc Liêu) cho thấy:

- Nguyên nhân phát dịch PRRS tại Việt Nam có thể liên quan đến tình hình dịch ở các nước láng giềng, cụ thể: nguồn bệnh có thể từ Trung Quốc vào Việt Nam qua cửa khẩu Quảng Ninh, Lạng Sơn Việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm không được kiểm soát triệt để nên nguồn bệnh đã xâm nhập vào nước ta và sau đó đã lây lan theo đường vận chuyển, gây ra dịch tại các tỉnh Hải Dương, Bắc Giang, Hưng Yên, Thái Bình ở đợt dịch đầu năm 2007 Nhận định này tương đồng với thông báo của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) là trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nước trong khu vực, đặc biệt dịch đã đồng loạt xảy ra ở nhiều nơi trên toàn lãnh thổ Trung Quốc Ngoài ra, kết quả phân tích cấu trúc gen của virus PRRS do phía Trung Quốc và Mỹ thực hiện cho thấy, virus PRRS gây dịch tại Việt Nam đều

có mức tương đồng về amino acid từ 99-99,7% so với chủng virrus PRRS thể độc lực cao gây dịch ở Trung Quốc

- Việc giám sát và sớm phát hiện dịch bệnh chưa được địa phương thực hiện đầy đủ do nhiều nguyên nhân khác nhau, dẫn đến nhiều nơi dịch đã xảy ra và nhiều ngày sau thú y cơ sở mới báo dịch (ví dụ như ở Quảng Nam, Hà Tĩnh, ở Thanh Hóa dịch xuất hiện tại hơn 40 xã, phường trong vòng một ngày,…); và chưa thực hiện triệt để các biện pháp chống dịch, tiêu huỷ lợn bệnh ngay từ khi dịch còn ở phạm vi nhỏ Nghiên cứu tại 11 tỉnh cho thấy: Tỷ lệ hộ chăn nuôi không thông báo cho thú y

cơ sở hoặc chính quyền mà tự xử lý là tương đối cao (31.94%)

- Dịch lây lan rất nhanh (giữa các tỉnh phía Bắc hoặc từ Bắc vào miền Trung năm 2007) do không quản lý được việc vận chuyển lợn ốm Cụ thể, tại 11 tỉnh nghiên cứu tỷ lệ các hộ chăn nuôi lợn bị bệnh có thương lái đến thăm đàn lợn trong vòng 1 tháng chiếm 34,29%; hoặc có thú y cơ sở đến thăm khám, tiêm phòng tại 42% số hộ chăn nuôi lợn trong vòng 1 tháng trước khi xảy ra Ngoài ra, 70/70 (100%) số hộ chăn nuôi có dịch PRRS đều mua thịt lợn từ nơi khác để ăn thịt và

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

cho lợn ăn nước rửa hoặc các chất phụ phẩm khác mà chưa qua xử lý; sử dụng lợn đực giống từ các cơ sở khác (chiếm 51,43%), mua lợn giống từ các xã, huyện khác (chiếm 57,14%)

- Dịch đã xuất hiện tại trại chăn nuôi lợn giống của một số tỉnh (Hải Dương, Vĩnh Long và Gia Lai), sau đó lây lan sang các địa phương xung quanh do việc bán lợn giống, tinh dịch (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2008)

* Tổng hợp các đợt dịch bệnh PRRS ở Việt Nam từ 2007 đến 2011

Năm 2007: Vào ngày 12/3/2007 lần đầu tiên dịch PRRS xuất hiện ở nước ta

trên đàn lợn của tỉnh Hải Dương làm cho 8.179 con lợn mắc bệnh, 844 lợn chết Đến hết đợt dịch thứ nhất (đến ngày 15/5/2007), dịch PRRS xảy ra tại 172 xã, phường, thuộc 30 huyện, thị xã của 09 tỉnh Sau đó vào tháng 6/2007, dịch xuất hiện tại Quảng Nam và lây lan sang các tỉnh miền Trung và miền Nam tại 233 xã, phường thuộc 45 huyện, thị của 14 tỉnh, thành phố Trong năm 2007, toàn quốc có

324 xã, phường của 65 huyện, quận thuộc 18 tỉnh, thành phố có dịch Số lợn mắc bệnh là 70.577 con (chiếm 0,26% tổng đàn, toàn quốc có 26.560.651 con), số lợn chết và phải tiêu huỷ là 20.366 (chiếm gần 0,08%) (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2007)

Năm 2008: Dịch Tai xanh đã xảy ra thành hai đợt chính tại 956 xã, phường

thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con trong

đó số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con Từ ngày 20/3 - 25/5/2008 (67 ngày) xuất hiện tại 821 xã, phường và thị trấn, 59 huyện, thị và thành phố của 10 tỉnh Nặng nhất là Thanh Hóa với 187.436 lợn mắc bệnh, 37.159 lợn chết và có ngày trên 40 xã, phường báo cáo có dịch PRRS, tiếp đến là Hà Tĩnh với 29.875 lợn mắc bệnh, 296 lợn chết (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2008)

Năm 2009: Dịch tai xanh xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh thành là

BR Vũng Tàu, Bạc Liêu, Bến Tre, Bắc Giang, Bình Dương, Đắc Lắc, Đồng Nai, Gia Lai, Hưng Yên, Quảng Ninh, Quảng Nam, Tiền Giang và Vĩnh Long với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu hủy (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2009)

Năm 2010:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

Đợt 1/2010 tại miền Bắc: Dịch lợn tai xanh đã xảy ra từ ngày 23/3/2010 tại Hải Dương Tính đến hết tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại

461 xã, phường, thị trấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố gồm Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con trong đó số tiêu hủy là 65.911 con

Đợt 2/2010 tại miền Nam: Theo kết quả điều tra, đợt dịch này bắt đầu từ ngày 11/6/2010 tại Sóc Trăng Sau đó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Lào Cai (11/7), Quảng Trị (01/7) Tổng số lợn trong đàn là 926.333 con, số mắc bệnh là 621.086 con, trong

đó số chết, tiêu hủy là 336.975 con (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2010)

Năm 2011:

Đợt 1: Dịch lợn tai xanh đã xảy ra từ ngày 25/2/2011 tại 01 hộ chăn nuôi lợn nái tại xã Đức Long, huyện Đức Thọ, tỉnh Hà Tĩnh, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 128 xã, phường, thị trấn của 21 quận, huyện thuộc 7 tỉnh là Bắc Ninh, Hải Dương, Thái Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị và Bình Dương Tổng số lợn mắc bệnh là 14.759 con trong đó có 1.468 con lợn nái, 5.346 con lợn thịt và 7.665 con lợn con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 14.158 con trong đó 1.373 con lợn nái, 4.850 con lợn thịt và 7.581 con lợn con

Đợt 2: Dịch lợn tai xanh đã xảy ra từ ngày 30/8/2011 tại tỉnh Tây Ninh, đến nay toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 137 xã, phường, thị trấn của 29 quận, huyện thuộc 8 tỉnh là Tây Ninh, Long An, Tiền Giang, Sóc Trăng, Quảng Nam, Cần Thơ, Khánh Hòa và Hà Nội Tổng số lợn mắc bệnh là 27.558 con lợn trên tổng đàn 46.328 con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 12.361con

Tình hình dịch PRRS năm 2011 đã giảm so với cùng kỳ năm 2010 cả về phạm vi, quy mô dịch và số lượng gia súc phải tiêu hủy (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2011)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

Tính từ đầu năm đến 25 tháng 12 năm 2012 toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 453 xã/ phường, thị trấn của 95 quận/ huyện thuộc 28 tỉnh Tổng số lợn mắc bệnh là 90.688 con, tổng số chết là 14.065 con, tổng số lợn phải tiêu hủy là 51.761 con Qua giám sát diễn biến của từng ổ dịch theo từng tháng của năm, có thể thấy rằng dịch bắt đầu xuất hiện lẻ tẻ vào đầu tháng 1 đến cuối tháng 3, sau đó phát triển lây lan trên diện rộng trong giai đoạn tháng 4 đến cuối tháng 7 (Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn, 2012)

1.2 Giới thiệu chung về virus PRRS

Virus PRRS thuộc chi Arterivirus, virus này được phân lập và định loại vào năm 1999 Những con vật mang bệnh là vật gieo rắc mầm bệnh nguy hiểm cho môi trường, không khí cũng phát tán virus một cách nhanh chóng đặc biệt khi độ ẩm cao, nhiệt độ thấp và tốc độ gió mạnh Ngoài ra, các loài côn trùng như muỗi, ruồi và vịt trời… cũng có thể là trung gian truyền bệnh Một đặc trưng của Arteriviruses là chúng sao bản sơ cấp, sinh sản trong tế bào chất quanh nhân của các tế bào chủ Những virion mới được giải phóng bởi exocytosis từ bề mặt của tế bào Tế bào đích sơ cấp của virus

là đại thực bào túi phổi của lợn, virus rất thích hoạt động ở vùng phổi

Bình thường, đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể nhưng riêng đối với virus PRRS nó không những không bị tiêu diệt mà còn có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào Virus PRRS có thể tiêu diệt tới 40% đại thực bào làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và virus khác có cơ hội phát triển và gây bệnh Sau khi xâm nhập vào tế bào đại thực bào, chúng nhân lên và phá huỷ rất nhanh tế bào Lúc đầu virus PRRS kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai đoạn đầu quá trình xâm nhiễm do virus PRRS dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại virus và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do

sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm trên

cơ thể lợn

Virus tương đối mẫn cảm và dễ dàng bị tiêu hủy bởi các yếu tố vật lý và hóa

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

học Cụ thể, virus bị tiêu hủy nhanh chóng khi môi trường có pH <5,5 hoặc pH > 6,5

và tính gây bệnh cũng giảm đi đến 90% ở những môi trường như vậy Đối với tác động của nhiệt độ, virus có thể tồn tại khoảng 120 giờ khi ở nhiệt độ 40oC, 20 giờ ở nhiệt độ 20 oC, 3 giờ ở nhiệt độ 37 oC và 6 phút ở nhiệt độ 56 oC Virus cũng bị vô hoạt nhanh chóng khi bị tác động bởi các loại hóa chất thông thường như chloroform (Cục Thú Y 2008)

1.2.1.Hình thái, cấu tạo phân tử virion của PRRSV

Virus Nidovirales hay còn được gọi là virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) thuộc họ Arteviridae, giống Artevirus, đây là virus ARN sợi đơn, dương có vỏ envelope bao bọc Phân tử virion PRRS có dạng hình cầu hoặc trứng với đường kính trung bình là 58nm, trong đó có một số ít phân

tử có đường kính lớn hơn 70nm, phân tử virus có bề mặt ngoài trơn với chỉ một vài điểm lồi ra, cách biệt với vỏ bọc một khoảng 2-3nm bên trong phân tử virion là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39nm

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử virion của PRRSV (Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp)

Phân tử virion PRRS bao gồm một vỏ bọc lipid có chứa vài envelope protein, protein GP2, GP5, E và M bao quanh vòng nucleocapsid của PRRSV Protein N là thành phần chính của protein vỏ bao bọc RNA của virus, protein màng GP5 và M, còn GP2, GP4, E và GP3 là thành phần phụ

1.2.2 Cấu trúc genome của PRRSV

Toàn bộ trình tự bộ gene của PRRSV đã được giải mã thành công và được

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

ghi nhận vào năm 1993, genome của virus dài khoảng 15kb và gồm tám khung đọc

mở ORF ORF 1a và 1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba bộ gene

và mã hóa cho RNA polymerase của virus được xem là protein chịu trách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus Sáu ORF nhỏ hơn là ORF 2-7, nằm ở phía sau của ORF 1b, ở đầu 3’ của genome, mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion

Hình 1.2 Sơ đồ hệ gen của vi rus PRRS

(Nguồn: http://ias-cnsh.org/Portals/0/PRRS virus-structure)

Sản phẩm của các ORF 5,6,7 bao gồm các protein chính của virus Cho đến nay người ta đã xác định được 3 protein cấu trúc chính của PRRSV đó là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa quy định bởi ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDa quy định bởi ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng lượng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5 Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng ORF 2,3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của PRRS virus mã hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là: 29-30 kD GP2; 45-50 kD GP3; 31-35kD GP4(Van Nieuwstadt và cộng sự, 1996)

1.2.3 Sự đa dạng trong các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giới

PRRS lưu hành trên thế giới với 2 dòng khác nhau: dòng Châu Mỹ (tiêu biểu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

là chủng VR-2332) và dòng Châu Âu (tiêu biểu là Lelystad-LV) Những chủng virus giữa hai dòng Châu Mỹ và Châu Âu khác nhau về đặc tính gây bệnh và chúng

có sự khác nhau về đặc điểm bộ gene và yếu tố kháng nguyên.Các chủng trong cùng một dòng thì có sự tương đồng về cấu trúc kháng nguyên Tùy theo ORF mà sự tương đồng về gene của hai dòng virus PRRS Châu Âu và Châu Mỹ dao động từ 52% đến 81%.Việc giải mã trình tự nucleotide của từng ORF là cơ sở dữ liệu phân

tử quan trọng cho phép xác định và sử dụng trình tự nào trong việc so sánh, chẩn đoán phân biệt các dòng PRRSV cũng như xác định sự tiến hóa của chúng Ví dụ qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng PRRSV người ta đã xác định được rằng ở PRRSV dòng Châu Mỹ, các ORF 6 và 7 có tính

ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hóa của dòng virus này Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng virus PRRS Châu Âu và Châu

Mỹ ở hai khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự acid amin của ORF7 giữa hai dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORF6 là 70- 81%.Trong khi đó khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng một dòng Châu Mỹ (giống nhau chỉ từ 88-97%) và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng từ 51-59% Các epitope trung hòa chính nằm trên protein quy định bởi ORF5, tuy có sự biến động lớn trong vùng ORF5 giữa các chủng virus PRRS nhưng các epitope trung hòa thường có sự bảo tồn tốt giữa các dòng PRRS khác nhau Các epitope trung hòa khác nằm ở trên GP3, GP4 và protein M Sự tương đồng về trình tự acid amin quy định do các khung đọc mở ORF 2, 3, và 4 giữa các dòng Châu Âu và Châu Mỹ chỉ ở mức độ từ 63, 58, và 68%.Sự khác biệt kiểu gene đương nhiên đưa đến sự khác biệt về kiểu hình và như vậy có thể dựa vào đặc điểm gene để chẩn đoán dòng virus và ngược lại Đây chính là cơ sở cho việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR, RFLP… để chẩn đoán PRRSV và phân biệt dòng PRRSV Châu Âu

và Châu Mỹ.(Nguyễn Ngọc Hải-công nghệ sinh học trong thú y, nhà xuất bản Nông Nghiệp, 2007)

Gần đây tại Trung Quốc đã xuất hiện dòng mới là biến chủng của dòng Châu Mỹ, chủng này có độc lực cao hơn, nguyên nhân được đưa ra là do sự mất 30acid amin của protein Nsp2, gây bệnh không chỉ cho lợn con mà còn cho cả lợn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

trưởng thành, gây ra tỉ lệ chết cao hơn (khoảng 20%), biến chủng này khó chẩn đoán và hiện chưa có vaccine đặc hiệu, đây là thách thức mới cho các nhà quản lý dịch bệnh cũng như cho các nhà sản xuất vaccine

1.2.4 Protein Nucleocapsid

Protein Nucleocapsid có kích thước phân tử khoảng 14–15kDa, được cấu thành từ 123aa hay 128aa tương ứng với 2 chủng của virus PRRS nguyên thủy: VR2332 (dòng Bắc Mỹ) hay Lelystad (dòng Châu Âu) (Mardassi H và cs, 1996) Cấu trúc phân tử của protein nucleocapsid gồm 5 vùng cấu trúc chính:

- Vùng I nằm ở vị trí của vùng amino – terminal giữa amino acid thứ 18 và

52 bao gồm vùng quan trọng quyết định yếu tố kháng nguyên nằm giữa amino acid thứ 30 và 52

- Vùng II từ amino acid 37 đến 52, bao gồm các epitope tuyến tính

- Vùng III từ amino acid 52 đến 69 nằm trong vùng bảo tồn cao của protein

N Nhóm amino acid này là thành phần của immunodominant epitope Các amino acid từ 40 đến 66 nằm trong vùng ưa nước của protein N và nằm ở vùng dễ phát hiện trên bề mặt ngoài của capsid

- Vùng IV trải dài từ amino acid thứ 69 tới 112 được phát hiện bởi sự gắn kết đặc hiệu của kháng thể đơn dòng SR30

- Vùng V từ amino acid 112 đến amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu hình chung của protein

Protein Nucleocapsid là protein không glycosyl hóa, không có peptide tín hiệu (signal peptide) Protein Nucleocapsid (N) mang tính kháng nguyên cao và là protein

đa dạng trong hạt virus (Costers S và cs, 2009) Protein N là protein cơ bản nhất của virus, được phát hiện với lượng lớn trong các tế bào bị nhiễm và chiếm khoảng 20 – 40% lượng protein có trong hạt virus Protein N là protein gây đáp ứng kháng thể sớm nhất và hầu hết những xét nghiệm chẩn đoán bệnh PRRS chủ yếu là phát hiện kháng thể kháng lại protein này Vài nghiên cứu về Nucleocapsid protein trước đây cho thấy protein N chứa vùng chức năng gắn RNA được xem là giữ vai trò quan trọng trong việc sao chép virus (Rowland R R và cs, 2003) Qua phân tích sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng virus PRRS Bắc Mỹ người ta đã xác định rằng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

khung đọc mở ORF7 của chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng virus PRRS châu Âu và Bắc Mỹ ở khung đọc mở này là rất rõ, cụ thể sự tương đồng về trình tự nucleotide là 57-59% và tương đồng về trình tự axit amin là 62% (Andrey V G và cs, 1997)

ỉa chảy, tốc độ lây lan nhanh đặc biệt ở một số con lợn bệnh chóp tai bị ứ huyết có màu xanh tím

Khi thấy lợn có các triệu chứng trên, bước đầu có thể chẩn đoán là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp Tuy nhiên, để đảm bảo độ chính xác cần phải lấy mẫu bệnh phẩm (máu lợn bệnh còn sống hoặc các tổ chứng bệnh phẩm phổi, hạch của lợn chết)

để làm xét nghiệm chẩn đoán trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên phương pháp chẩn đoán dựa trên biểu hiện lâm sàng không rõ ràng vì biểu hiện này biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn lợn, các yếu tố môi trường, phân lập virus đối với PRRS rất khó khăn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

1.3.2 Phương pháp chẩn đoán dựa trên kháng nguyên- kháng thể

Chẩn đoán nhanh sự tồn tại của tác nhân gây bệnh dựa trên cơ sở phản ứng kháng nguyên – kháng thể là một trong những hướng ứng dụng đang được quan tâm trên thế giới cũng như Việt nam

1.3.2.1 Bản chất của sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giới hạn giữa phân tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của phân tử kháng thể (trung tâm hoạt động).Theo Pauling, phân tử kháng thể thường hóa trị hai nghĩa là cùng một lúc có thể kết hợp với hai phân tử kháng nguyên Còn kháng nguyên đa hóa trị nên cùng một lúc có thể kết hợp với nhiều phân tử kháng thể Cho

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

nên kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau để tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong không gian ba chiều Vì kích thước quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết

Kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau theo bất cứ tỷ lệ nào nhưng phản ứng yếu đi nếu thừa hoặc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể Phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với số phân tử kháng thể Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu Một kháng nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành Do đó phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết

Hiệu giá của kháng thể ở trong huyết thanh người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên Ngược lại nhờ kháng thể đã biết những kháng nguyên khác nhau của một

vi sinh vật có thể nhận mặt Mặt khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép chọn lựa thích đáng vi sinh vật dùng làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng

1.3.2.2.Phản ứng kết tủa

Nguyên lý

Phản ứng kết tủa là sự kết hợp giữa kháng nguyên hòa tan lúc gặp kháng thể tương ứng, tạo thành tủa có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc nhờ soi kính lúp Kháng nguyên đa hóa trị kết hợp với kháng thể hóa trị hai để tạo thành kết tủa hình mạng lưới 3 chiều Phản ứng có thể thực hiện ở môi trường lỏng hoặc môi trường gel

1.3.2.3 Phản ứng ngưng kết

Nguyên lý

Phản ứng ngưng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên hữu hình với kháng thể tương ứng tạo thành các hạt ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường Kháng nguyên có thể là vi khuẩn, hồng cầu, bạch cầu, tinh trùng…Phản ứng ngưng kết chỉ xảy

ra nếu có chất điện giải, rõ nhất, nhanh nhất ở pH từ 7 đến 7,2 và ở nhiệt độ 37oC

1.3.2.4.Phản ứng kết hợp bổ thể

Nguyên lý

Kháng thể đặc hiệu với sự tham gia của bổ thể sẽ gây ly giải tế bào vi khuẩn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

ra Phản ứng này được sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cũng như định type virus Mặt khác cũng có thể định lượng kháng thể của virus ở trong huyết thanh bằng cách trộn hỗn hợp kháng huyết thanh với virus rồi tiêm hỗn hợp vào một nhóm động vật nhạy cảm Nếu động vật thử nghiệm không cho thấy triệu chứng bệnh thì sự hiện diện của kháng thể trung hòa đã được chứng minh

1.3.2.6 Phản ứng miễn dịch enzym (Enzyme-Linked- ImmunoSorbent Assay: ELISA)

Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong

đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất

có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

1.3.2.7 Phản ứng miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay: RIA)

Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như ThymidinH3, Cacbon 14, đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể) đã đánh dấu đồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản tổ chức học,sau đó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường

1.3.3 Phương pháp RT-PCR

Phương pháp RT-PCR cần được sử dụng trong việc kiểm soát tính sạch bệnh

ở tinh dịch sử dụng trong thụ tinh nhân tạo và theo dõi các đàn lợn nhiễm khi cần tái lập tình trạng sạch bệnh Phương pháp RT-PCR đơn giản, ít tốn kém và nhanh hơn rất nhiều so với thử nghiệm có tên là “swine bioassay” vốn được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong việc xác đinh PRRSV Kỹ thuật RT-PCR nhạy hơn phân lập virus, có thể phát hiện 10 phần tử virus/ml tinh dịch và hoàn toàn đặc hiệu Hai vùng gene bảo tồn cao là ORF 6 mã hóa protein màng và ORF 7 mã hóa protein nhân (nucleocapsid) thường được dùng để thiết kế primer (mồi) cho phản ứng RT-PCR phát hiện PRRSV Một số vùng khác như ORF 5 mã hóa protein vỏ (envelope) được sử dụng khi cần phân biệt các chủng (chủng độc lực cao- chủng thường)

2.3.4 Phương pháp chẩn đoán nhanh dưới dạng que thử

Nguyên lý hoạt động của que chẩn đoán, khá đơn giản: khi nhỏ huyết thanh (50 µl) được pha loãng với PBS theo tỷ lệ 1:2 lên đệm mẫu qua vị trí tra mẫu, huyết thanh sẽ thấm vào đệm mẫu và chuyển dịch đến đệm conjugate

Tại đệm conjugate, kháng thể (nếu có trong huyết thanh) sẽ gắn với kháng nguyên cộng hợp, phức hợp kháng nguyên cộng hợp-kháng thể sẽ tiếp tục thấm theo màng nitrocelluose và sẽ kết hợp với kháng nguyên đã được gắn ở vị trí đường thử làm xuất hiện màu hồng tím ở đường thử Mặt khác, kháng nguyên cộng hợp sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu đã được gắn sẵn ở đường đối chứng làm xuất hiện màu hồng tím ở đường đối chứng

Nếu xuất hiện màu đồng thời tại đường thử và đường đối chứng, phản ứng được xem là dương tính; nếu chỉ xuất hiện màu ở đường đối chứng thì phản ứng được xem là âm tính; kết quả sẽ được xác định trong vòng 15 phút

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng que chẩn đoán có nhiều ưu thế hơn các phương pháp trước đây Chẳng hạn, phương pháp ELISA và phương pháp PCR, thường mất nhiều thời gian, công sức và bắt buộc phải có thiết bị chuyên dụng, đắt tiền mới có thể thực hiện được.Trong khi đó, dùng que chẩn đoán nói trên cho phép chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và tính đặc hiệu cao, ít tốn kém, không cần sử dụng thiết bị đắt tiền, không cần kỹ thuật viên trình độ cao mà vẫn có thể chẩn đoán chính xác bệnh ở trong hoặc ngoài phòng thí nghiệm, ở vùng sâu vùng xa và thậm chí ở trong chuồng trại chăn nuôi /