nghiên cứu sự phát triển in vitro của tế bào sâu khoang (spodoptera litura)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC CÁC BẢNG 3.1 Số lượng nguồn tế bào đã phân lập và nhân nuôi tạo thực liệu 3.2 Hàm lượng tế bào sa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

HÀ THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN IN VITRO

CỦA TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

HÀ THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN IN VITRO

CỦA TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn cao học này là công trình nghiên cứu của riêng cá nhân tôi Các tài liệu, số liệu được nêu trong luận văn là trung thực Các luận điểm và các kết quả nghiên cứu chưa từng được ai công bố trong bất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn nhiệt tình, sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị nơi tôi công tác cũng như nơi học tập Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới:

PGS.TS Lê Văn Trịnh – Giám đốc Trung tâm đấu tranh Sinh học,

Viện Bảo vệ thực vật, một người thầy đáng kính trong công việc cũng như trong cuộc sống, đã trực tiếp hướng dẫn và định hướng chuyên môn đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình công tác và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

TS Nguyễn Hữu Đức - Phó Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học,

Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người thầy kính mến đã luôn quan tâm, giúp đỡ tận tình và chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Để thực hiện được nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ

từ đề tài cấp Nhà nước: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-spl

(Nucleo Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại

cây trồng nông nghiệp”

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, các chị trong nhóm đề tài, Trung tâm Sinh học và Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô giáo; các chuyên viên Ban quản lý đào tạo – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn này

Hà Nội, năm 2014

Tác giả luận văn

Hà Thị Thu Thủy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 3

1.2 Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài 3

1.2.1 Mô bào và điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào 3

1.2.2 Kỹ thuật bảo quản tế bào 12

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển sinh khối của tế bào 14

1.3 Kết quả nghiên cứu ở trong nước 23

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu, đối tượng và địa điểm nghiên cứu 25

2.1.1 Vật liệu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu 25

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.1 Nghiên cứu xác định mô bào và điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào khởi đầu 26

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

2.2.2 Nghiên cứu xác định mức độ ảnh hưởng của các yếu tố môi

trường nhân nuôi đến khả năng phát triển sinh khối tế bào 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Các thí nghiệm thu thập và phân lập tế bào sâu khoang 26

2.3.2 Nghiên cứu nhân nhân nuôi in vitro tế bào sâu khoang 30

2.3.3 Phương pháp đếm tế bào 32

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Phân lập mô bào và nhân nuôi sơ cấp tạo vật liệu khởi đầu 35

3.2 Nhân nuôi thứ cấp 42

3.3 Kiểm tra tế bào bằng kĩ thuật PCR 49

3.4 Kỹ thuật bảo quản lạnh đông tế bào ở nhiệt độ - 800C 51

3.5 Khả năng phát triển in vitro của tế bào sâu khoang 53

3.5.1 Môi trường nhân nuôi thích hợp 53

3.5.2 Nhiệt độ nhân nuôi thích hợp 55

3.5.3 Điều kiện pH môi trường nhân nuôi thích hợp 57

3.5.4 Tỷ lệ FBS bổ sung thích hợp cho nhân nuôi 59

3.5.5 Xác định mật độ tế bào tối đa đạt được khi nhân nuôi trong các điều kiện in vitro tối ưu 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Số lượng nguồn tế bào đã phân lập và nhân nuôi tạo thực liệu

3.2 Hàm lượng tế bào sau nhân nuôi sơ cấp mô tiền phôi 363.3 Hàm lượng tế bào sau nhân nuôi sơ cấp mô phôi 373.4 Hàm lượng tế bào sau nhân nuôi sơ cấp mô trứng 383.5 Hàm lượng tế bào từ các mẫu mô bào tiềm năng sau 10 ngày

3.6 Hàm lượng tế bào qua các chu kỳ nhân nuôi sơ cấp các mẫu tế

3.7 Hàm lượng tế bào của các nguồn thực liệu qua các chu kỳ nhân

3.8 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu cấy vào bình đến sự phát

3.9 Hàm lượng tế bào sau khi nhân nuôi trở lại qua các tháng bảo

quản của mẫu tế bào 2.tp khi sử dụng các mức DMSO trong bảo

3.10 Mật độ tế bào khi nhân nuôi ở môi trường khác nhau 543.11 Hàm lượng tế bào ở các mức nhiệt độ nhân nuôi khác nhau 563.12 Ảnh hưởng của độ pH môi trường nhân nuôi đến sinh khối tế bào 583.13 Mật độ tế bào thu được khi bổ sung chất bổ trợ FBS với các tỷ lệ

3.14 Xác định mật độ tế bào thu được khi nhân nuôi in vitro 63

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Sơ đồ của một loài côn trùng cho thấy các mô có thể được sử

dụng cho sự phát triển của các dòng tế bào (Theo Lynn, 2001) 4 1.2 Số dòng tế bào được phát triển từ năm 1962 đến năm 2000 (Theo

3.2 Diễn biến hàm lượng tế bào trong sinh khối qua các chu kỳ nhân

3.4 Tế bào tròn nhỏ, hơi dính hình thành một khối trôi nổi trên

3.8 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu cấy vào bình đến sự phát

3.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR các mẫu tế bào sâu khoang đã nhân nuôi 50 3.10 Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining 50 3.11 Hàm lượng tế bào ở các môi trường nhân nuôi khác nhau 55 3.12 Mật độ tế bào ở các mức nhiệt độ nhân nuôi khác nhau 57 3.13 Diễn biến mật độ tế bào sâu khoang khi nhân nuôi ở các mức pH

3.14 Mật độ tế bào sâu khoang khi nhân nuôi trong môi trường có bổ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13 NPV Nucleo Polyhedrosis Virus

14 PBS Phosµphate Buffered Saline

16 Schneider Schneider S9895

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Sâu khoang (Spodoptera litura) là một đối tượng sâu hại quan trọng

trên các loại rau màu Để phòng trừ sâu hại này, người nông dân thường phun thuốc hóa học bảo vệ thực vật với liều lượng cao định kỳ 7 - 10 ngày/lần Hiện trạng sử dụng thuốc quá mức đã làm dư lượng thuốc hóa học độc hại lưu tồn trong sản phẩm thường cao gấp 1,5 - 4,2 lần so với mức dư lượng cho phép Gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng sản phẩm, gây ô nhiễm môi trường và làm tổn hại đến quần thể các loài có ích trên đồng ruộng

Việc sử dụng các chế phẩm trừ sâu sinh học bằng cách sử dụng tác

nhân vi rút NPV (Nucleo polyhedrosis virus) chuyên tính với sâu khoang có

hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp Tuy nhiên, vi rút NPV chỉ có thể sinh trưởng và phát triển trong mô tế bào sống, vì vậy sản xuất chế phẩm vi rút NPV khó thực hiện với qui mô công nghiệp để phòng chống sâu hại hiệu quả

Lâu nay, việc sản xuất NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủ công với qui mô nhỏ hẹp Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm vi rút NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Nguyễn Văn Cảm và Cs., 1996) Theo cách này thì sản xuất chế phẩm NPV để trừ sâu hại khó có thể thực hiện, vì để nuôi được số lượng lớn một loài sâu hại phục

vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn và phải có đủ nhà xưởng, trang thiết bị

Để khắc phục những hạn chế nói trên, các nước như: Mỹ, Hà Lan, Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v đã ứng dụng công nghệ nhân nuôi tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp Vì

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

vậy, đã và đang sản xuất, cung cấp cho thị trường nhiều loại chế phẩm NPV

có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu hại Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV trên cơ sở ứng dụng kỹ thuật công nghệ nhân nuôi tế bào côn trùng vẫn là vấn đề mới và chưa được thực hiện nhiều ở các

cơ quan nghiên cứu

Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu sự phát triển in vitro của tế bào sâu khoang (Spodoptera litura )”

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu phân lập và xác định mức độ tác động của các yếu tố có ảnh hưởng đến khả năng nhân nuôi thành công tế bào sâu khoang, nhằm phục vụ phát triển chế phẩm sinh học vi rút để phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

+ Ý nghĩa khoa học

Thực hiện đề tài sẽ góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu về tế bào côn trùng Đặc biệt là nắm vững về khả năng phát triển của tế bào động vật nói chung và tế bào côn trùng nói riêng Xác định được các mô tế bào có thể nhân nuôi, dần từng bước xây dựng ngân hàng dòng tế bào côn trùng ở Việt Nam, làm cơ sở để phục vụ cho các nghiên cứu khoa học cơ bản và khoa học ứng dụng về lĩnh vực nuôi cấy tế bào ở nước ta

Việc nghiên cứu nhân nuôi tế bào của các loài côn trùng và phát triển các kỹ thuật công nghệ nhân sinh khối tế bào côn trùng còn góp phần phục vụ nghiên cứu giám định bệnh lý côn trùng ở Việt Nam

+ Ý nghĩa thực tiễn

Các kết quả nghiên cứu nhân nuôi tế bào sẽ góp thêm tư liệu nhằm phát triển sinh khối tế bào côn trùng, phục vụ sản xuất chế phẩm vi rút NPV để phòng trừ sâu hại trên các cây trồng nông lâm nghiệp Góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo vệ sức khỏe người sản xuất, bảo tồn các loài sinh vật có ích và an toàn môi trường đồng ruộng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu

Trong mỗi loài sinh vật, để tồn tại và sinh trưởng, phát triển thì quá trình hình thành các bộ phận cơ thể đều được duy trì dưới sự điều khiển của gen mã hóa và tồn tại trong tế bào gốc Đó là các tế bào có khả năng tự đổi mới với các tính năng riêng biệt mới, có khả năng sinh ra các tế bào khác, có khả năng phân chia liên tục trong quá trình nuôi cấy và có thể phát triển thành các tế bào chuyên hóa trong các điều kiện môi trường thích hợp (Louise Ainscough, 2009) Cũng như tế bào động vật nói chung, các dòng tế bào của các loài côn trùng cũng thuộc nhóm Eukaryota, là tế bào của sinh vật có nhân chuẩn, có màng nhân ngăn cách nhân với tế bào chất và trong nhân tế bào phân tử DNA kết hợp với các protein tạo thành các sợi nhiễm sắc thể (Sills, 2005) Chúng được chia thành 2 nhóm cơ bản: Tế bào toàn năng (totipotent)

và tế bào vạn năng (pluripotent) bao gồm: tế bào mầm (còn gọi là nguyên bào), tế bào phôi, tế bào đĩa mầm và tế bào tái sinh; Tế bào gốc đa năng (multipotent) và tế bào đơn năng (unipotent), gồm: tế bào thần kinh, tế bào máu và tế bào biểu mô ruột giữa (Phan Kim Ngọc và Cs., 2010) Việc phân lập và xác định kỹ thuật nhân nuôi các mô tế bào này sẽ có ý nghĩa to lớn phục vụ các mục đích khác nhau trong khoa học và thực tiễn đời sống con người

1.2 Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài

1.2.1 Mô bào và điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào

1.2.1.1 Các loại mô bào có thể phân lập để nhân nuôi

Theo tổng kết của Guy Smagghe (2009) buồng trứng là những mô đầu tiên được sử dụng và được sử dụng chung cho nuôi cấy tế bào trong suốt thập

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

kỉ 1960 và 1970, đặc biệt với các loài thuộc bộ Lepidoptera Phôi cũng được

sử dụng làm nguồn để nuôi cấy tế bào Lynn (2001) đã chỉ ra rằng gần một nửa số dòng tế bào côn trùng đã được phân lập từ phôi Kể từ khi phôi chứa tất cả các loại tế bào mà sẽ phân hóa vào trong mô trưởng thành và mô nhộng, những dòng tế bào từ những mô này có thể chứa lượng lớn tế bào có hình thái

đa dạng; Hemocytes thu được một cách dễ dàng nhưng không sinh trưởng dễ dàng trong nuôi cấy vì Melanization là vấn đề chung trong nuôi cấy hemocyte

và việc sử dụng chất ức chế phenyloxidase (có tác dụng làm giảm gluthione, cysteine hoặc phenylthiourea) là cách để khắc phục vấn đề này

Hình 1.1: Sơ đồ của một loài côn trùng cho thấy các mô có thể được sử dụng cho sự phát triển của các dòng tế bào (Theo Lynn, 2001)

Ngoài các mô trên thì tổng hợp các tế bào tiền thân của mô trưởng thành (Imaginal discs) cũng là những mô quan trọng trong sự phát triển của tế bào côn trùng bởi vì chúng được xác định phát triển để trở thành cấu trúc đặc biệt, chúng không bao gồm những tế bào giống nhau; Mô mỡ là mô sinh lí quan trọng có nhiều chức năng tương đương với việc duy trì sự sống của côn trùng Nó cũng là

mô mục tiêu của nuôi cấy tế bào côn trùng Tế bào mô mỡ cũng là nguồn cho nhân tố sinh trưởng vì vậy việc đồng nuôi cấy với các mô khác có thể cải thiện sinh trưởng tế bào, đặc biệt nuôi cấy sơ cấp; Ruột giữa là mô rất quan trọng và

có mối quan hệ trong điều khiển dịch hại và bệnh lí dịch hại

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

Theo tổng kết của Elanchezyan K (2009); Lynn D.E (2005), Sudeep A.B., Mourya D.T và Mishra A.C (2005), các dòng tế bào côn trùng có thể phát triển từ các mô bào phân lập từ buồng trứng, mô phôi, mô bào hồng cầu,

từ tế bào đĩa mầm (gồm các tế bào tiềm năng), thể mỡ, mô bào ruột giữa, tuyến sinh dục, buồng trứng trưởng thành, từ sâu non mới nở và các mô tế bào khác như: tế bào mô biểu bì, hệ thần kinh, hệ nội tiết, hệ cơ Các mô này được tách vô trùng và đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào có chứa huyết thanh bào thai (FBS) Các tế bào sinh trưởng thành lớp đơn bám dính vào bề mặt bình nuôi cấy

Tuy nhiên, các tác giả này cũng chỉ rõ mức độ thành công đến mức nào thì còn tùy thuộc vào từng đối tượng côn trùng cụ thể mà định hướng mô bào

có thể phát triển thành dòng tế bào của loài côn trùng đó Để có thể phân lập và tạo dòng tế bào của một loài côn trùng thành công đòi hỏi phải định hướng mô bào tách chiết phù hợp, phải có tính kiên trì, các bước thao tác kỹ thuật trong quá trình thực hiện phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng và môi trường nuôi cấy phải phù hợp với từng đối tượng côn trùng và mô bào phân lập để sử dụng Theo Elanchezyan K (2009), một số loại mô bào chưa thành thục có thể phân lập nhân nuôi, như: mô phôi, sâu non mới nở, mô mầm của trưởng thành

và tế bào trứng Tuy nhiên, việc thành lập các dòng tế bào sử dụng các mô chưa trưởng thành hoặc mô chưa biệt hóa thì dễ thành công hơn các mô trưởng thành hoặc mô đã biệt hóa bởi vì chúng có tỉ lệ cao hơn tế bào gốc trong chúng Nhưng sự phát triển các dòng tế bào từ các mô bào thành thục lại

có tính ưu việt hơn vì 5 lý do:

1/ Nhận biết hình thái của nó dễ dàng hơn khi tiến hành phân lập, 2/ Dễ nhận biết sự sinh trưởng của tế bào khi nhân nuôi sơ cấp,

3/ Dễ dàng đánh giá được ảnh hưởng của thành phần môi trường đối với sự sống sót của loại tế bào chuyên biệt khi nhân nuôi sơ cấp,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

4/ Nhận biết được sự thay đổi hình thái tế bào khi nhân nuôi và

5/ Dễ thiết kế protein đánh dấu (marker protein) để xác định gen lạ Cũng theo Elanchezyan (2009), dòng tế bào Lepidoptera chủ yếu được thiết lập để phục vụ lây nhiễm, sản xuất chế phẩm sinh học vi rút côn trùng,

sử dụng như một loại thuốc trừ sâu sinh học để kiểm soát côn trùng gây hại Các dòng tế bào được thành lập từ những bộ phận hoặc những mô khác nhau như mô phôi, buồng trứng, tế bào mỡ, tế bào mầm trưởng thành, v.v ở các giai đoạn phát triển khác nhau của côn trùng thuộc bộ Lepidoptera Số lượng lớn nhất mà các dòng tế bào được phân lập là từ mô phôi phân lập từ buồng trứng (Lynn, 2001)

Ở Ấn Độ, phần lớn các dòng tế bào Lepidoptera đã được thành lập từ

mô buồng trứng tiếp theo là mô phôi Theo tổng kết của Sudeep và Cs (2005), đến năm 2005 Ấn Độ đã phát triển được 8 dòng tế bào từ muỗi và 9 dòng tế bào từ các loài thuộc bộ Lepidoptera Nhưng đến 2009, Ấn Độ đã phát triển được 15 dòng tế bào từ bộ Lepidoptera phục vụ cho các mục tiêu nghiên cứu và phát triển chế phẩm (Elanchezyan, 2009)

Riêng đối với loài sâu khoang (Spodoptera litura), qua các tài liệu thu

thập được cho thấy có 4 công trình công bố đã phát triển được dòng tế bào phục vụ cho nghiên cứu và nhân nuôi sinh khối

Kết quả công bố của Shih và Cs (1997) thì dòng tế bào sâu khoang SLO1A được phát triển từ mô phôi phân lập từ nhộng Còn Pant và Cs (2000) phát triển dòng tế bào từ hồng cầu sâu khoang Theo tổng hợp của Zhang và Cs.(2008) thì dòng tế bào sâu khoang mang mã hiệu Sl-Zsu-1 do Xie và Cs (1988) phát triển từ trứng sâu khoang và được nhân nuôi tiếp tục từ năm 2002, nhưng mãi đến năm 2005 mới đi sâu nghiên cứu một cách chi tiết và đã chọn lọc, tạo được dòng tế bào sâu khoang chính thức mang mã hiệu SI-HP (Zhang

IBL-và Cs., 2008)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

1.2.1.2 Điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào

Theo Lynn (1996) để phát triển dòng tế bào côn trùng thường gặp phải hai vấn đề đặc biệt khó khăn Đầu tiên là kích thước côn trùng đa số rất nhỏ dẫn đến việc mổ và tách lấy được mô bào mong muốn rất khó khăn Vấn đề thứ hai đó là đa số các loài côn trùng đều sống trong môi trường bẩn vì vậy mẫu đưa vào nuôi cấy nếu không được khử trùng sạch sẽ dễ bị nhiễm khuẩn, nấm, mycoplasma hoặc các loại vi rút dẫn đến mẻ nuôi cấy dễ bị thất bại hoàn toàn Theo tổng kết của Elanchezyan K (2009), Granados R.R., Li và Bonning (2007), Lynn D.E (2002) và Sudeep A.B., Mourya D.T và Mishra A.C (2005), trong những năm đầu của thế kỷ 20 khoa học nghiên cứu về côn trùng trong một số lĩnh vực nghiên cứu đã có những ý tưởng đầu tiên về việc

sử dụng tế bào côn trùng trong nuôi cấy in vitro như là một công cụ thí

nghiệm cho các nghiên cứu cơ bản khác Theo tài liệu tổng hợp của Granados

R.R., Li và Bonning (2007), thí nghiệm nhân nuôi tế bào côn trùng in vitro

đầu tiên do Goldsmidt tiến hành vào năm 1915, ông đã nuôi cấy các phần mô

tách ra từ loài tằm Hyalophora cecropia Sau đó, vào cuối những năm 1930,

W Trager thực hiện một bước đột phá lớn bởi đã phát triển được một môi trường nuôi cấy dựa trên những hiểu biết về tính chất vật lý và hóa học của tế bào máu côn trùng (Trager, 1953)

Sau đó Wyatt (1956) đã phát triển một môi trường dựa trên phân tích sinh hóa chi tiết của tế bào máu tằm và chứng minh môi trường này gây ra sự

tăng trưởng của tế bào từ mô buồng trứng của loài tằm Bombyx mori và đóng

góp vào sự tăng trưởng và duy trì sự sống sót của tế bào trong phòng thí nghiệm trong thời gian dài đến ba tuần Và gần 50 năm sau nghiên cứu đầu tiên của Goldschmidt (1915), Grace (1962) đã nghiên cứu ra môi trường nuôi cấy cùng với việc phân lập, nhân nuôi thành công dòng tế bào đầu tiên từ bộ Lepidoptera do vậy dòng tế bào côn trùng đầu tiên được thành lập là bởi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

Grace (1967), kể từ đó nhiều dòng tế bào khác nhau đã được thành lập, chủ yếu là ở các bộ Diptera, Lepidoptera, Hemiptera và Orthoptera

Khi bắt đầu nuôi cấy tế bào côn trùng, một phương pháp chung giống như phương pháp duy trì nuôi cấy tế bào động vật đã được áp dụng cho nuôi cấy tế bào côn trùng Tuy nhiên, điều kiện cụ thể cần phải được thay đổi và có tiêu chuẩn riêng đối với từng loài tùy thuộc vào mô chọn để nuôi cấy ban đầu, môi trường nuôi cấy, chất dinh dưỡng bổ sung, pH, nhiệt độ nuôi, v.v (Freshney, 1987) Trong thời gian 30 năm từ năm 1962 đến 1990, các nhà khoa học đã phát triển thành công khoảng 350 - 400 dòng tế bào côn trùng Cho đến năm 2000, đã phân lập thành công trên 500 dòng tế bào từ các loài côn trùng khác nhau (Lynn, 2001)

Trong số 500 dòng tế bào được phân lập, có khoảng 80% các dòng tế bào được phân lập từ các loài côn trùng thuộc bộ Lepidoptera và Diptera, chỉ

có khoảng 20% số dòng tế bào được phân lập từ các loài động vật không xương sống khác Việc phát triển dòng tế bào (chủng tế bào) để phục vụ cho nhân nuôi sinh khối thường được tiến hành qua các bước: 1/ Lựa chọn và phân lập; 2/ Nhân nuôi sơ cấp và làm thuần; 3/ Nhân nuôi thứ cấp phát triển thực liệu dòng tế bào và đưa vào bảo quản để phục vụ cho việc nhân nuôi sinh khối tế bào số lượng lớn

Hiện nay, trong số 500 dòng tế bào được phân lập, thì các dòng tế bào

bộ Lepidoptera được sử dụng phổ biến nhất cho nghiên cứu với các mục đích khác nhau là Sf9, Sf21 và BTI-Tn5B1-4 Dòng tế bào Sf9 và Sf21 được phân

lập từ mô bào buồng trứng của loài sâu xanh da láng Spodoptera frugiferda,

còn BTI-Tn5B1-4 được phân lập từ mô phôi của loài sâu đo xanh

Trichoplusia ni.

Theo Sardud-Din và Cs (1996), trong nhân nuôi sinh khối tế bào từ các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

tế bào gốc thì tế bào sẽ phân chia liên tục trong thời gian dài ở môi trường thích hợp Nếu mô tế bào phân lập không chứa tế bào gốc thì tế bào sẽ phát triển chậm hoặc phát triển với tốc độ giảm dần và cuối cùng chúng không phân chia tiếp mà sẽ tự chết dần (Granados và Cs., 2007)

Hình 1.2: Số dòng tế bào được phát triển từ năm 1962 đến năm 2000

(Theo Lynn, 2001)

Qua 25 năm nghiên cứu, Lynn (2001, 2002) đã mô tả các phương pháp có hiệu quả để duy trì nhiều dòng tế bào côn trùng khác nhau Các phương pháp này giúp phân biệt giữa dòng tế bào bám dính một cách lỏng lẻo hoặc không bám dính với các dòng tế bào bám dính và bám dính mạnh

Từ đó đã tổng kết thành qui trình chung cho việc nhân sinh khối tế bào côn trùng qua 11 công đoạn với các yêu cầu cụ thể khác nhau cho từng công đoạn nhân nuôi

Đến năm 2007, Granados và Cs đã đưa ra một qui trình chung nhân nuôi tế bào qui mô công nghiệp một cách khá chi tiết và đầy đủ Qui trình chỉ

rõ từ khâu chuẩn bị các trang thiết bị cần thiết, chuẩn bị môi trường nhân nuôi, điều khiển điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH và không khí, v.v.), kỹ thuật bảo quản, v.v Các tác giả này cũng nêu rõ 2 chỉ tiêu đánh giá chất lượng nhân nuôi dựa trên kết quả tính tổng số tế bào có trong dịch thể,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

mức độ biến động của tế bào dựa trên xác định số tế bào sống có được

Như vậy, khi nhân nuôi đối với mỗi dòng tế bào của 1 loài côn trùng cần thiết phải có sự nghiên cứu chi tiết để xác định rõ các yếu tố thích hợp cho sự phát triển của tế bào, gồm: chủng loại môi trường, chất bổ sung, nhiệt

độ và pH môi trường nhân nuôi

Theo Lynn (2001, 2002), một vấn đề quan trọng cần lưu ý trong nuôi cấy tế bào động vật nói chung cũng như nuôi cấy tế bào côn trùng nói riêng

đó là việc kiểm soát lây nhiễm trong quá trình nhân nuôi in vitro tạo vật liệu

Theo Lynn (1996) cách đơn giản để tránh nhiễm khuẩn là không sử dụng kháng sinh trong nuôi cấy duy trì dòng tế bào Trong khi điều này nghe

có vẻ mâu thuẫn thì lí do thật đơn giản Nếu không có kháng sinh trong môi trường, nếu nuôi cấy bị nhiễm khuẩn thì sự nhiễm vi khuẩn đó sẽ nhận biết được ngay trong môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng chỉ trong ít ngày nuôi cấy Điều này giúp kĩ thuật viên phát hiện sớm nhất có thể và nuôi cấy trở lại

để phục hồi tế bào bị nhiễm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

Ngược lại, nếu nuôi cấy duy trì tế bào có kháng sinh có thể cấy chuyển

tế bào trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng với mật độ nhiễm thấp mà không phát hiện được Điều đó có thể giải thích là do chất kháng sinh được sử dụng liên tục sẽ làm chậm sự phát triển của vi khuẩn trong tế bào bị nhiễm mà mắt thường không nhận biết được nhưng thực tế nuôi cấy đó đã bị nhiễm khuẩn Bằng cách đó, tất cả các tế bào nuôi cấy sẽ bị nhiễm khuẩn lan rộng và khi đó cũng sẽ có ít hi vọng phục hồi

Vì lý do nêu trên, Lynn (1996) cho rằng chỉ nên sử dụng kháng sinh trong những thí nghiệm ngắn (những thí nghiệm mà tế bào không được sử dụng lâu dài trong nuôi cấy duy trì) và nuôi cấy sơ cấp Trong trường hợp nuôi cấy sơ cấp, sau mỗi lần nhân sinh khối tế bào môi trường nuôi cấy cũ được thay thế bằng môi trường mới có chất kháng sinh (thường sau lần cấy chuyển thứ 5) Như thế tránh được hầu hết mọi sự nhiễm khuẩn

Theo Lynn (1996) thì mối lo ngại chính khi nuôi cấy tế bào côn trùng lại là việc tế bào bị nhiễm vi rút và mycoplasma Để tránh nhiễm vi rút và mycoplasma thì giải pháp tốt nhất đó là không bao giờ được sử dụng pipet hút bằng miệng và môi trường, huyết thanh không chính hãng Bên cạnh đó, ông cũng khẳng định một lợi thế khi làm việc với tế bào côn trùng là rất nhiều các chất gây nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật có xương sống phải đối mặt thì lại không phải là một vấn đề với các tế bào côn trùng

Ví dụ như, phần lớn mycoplasma trong phòng thí nghiệm thích nghi ở

370C nhưng nhiệt độ nuôi cấy tế bào côn trùng lại không thích hợp cho sự tăng trưởng của mycoplasma (260C - 280C) Trong trường hợp nhiễm vi rút thì nguồn gây nhiễm lớn nhất là huyết thanh Vì đây thường là nguồn huyết thanh từ trâu, bò, những huyết thanh thường sẽ không tái tạo trong côn trùng Tuy nhiên đây là ý tưởng hay để sàng lọc các nguồn gây nhiễm này Trong trường hợp là mycoplasma, một số thử nghiệm được tiến hành Chúng bao

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

gồm các xét nghiệm tăng trưởng sử dụng mycoplasma môi trường nuôi cấy; Hiện hình bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (Hoechst 33258) hoặc đồng nuôi cấy với 6-methylpurine - chất mà chuyển hóa mycoplasma để tạo thành các thành phần độc hại

Trong những phương pháp này phương pháp sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33258 dường như hiệu quả nhất nhưng đòi hỏi phải có kính hiển vi huỳnh quang để quan sát các DNA trong mycoplasma phát sáng sau khi nhuộm Việc phát hiện vi rút có thể được thực hiện có hiệu quả chỉ khi sử dụng kính hiển vi điện tử, vì đây là những chất gây ô nhiễm bên trong tế bào

và mới quan sát được dưới kính hiển vi điện tử

Để loại bỏ tất cả các nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào côn trùng cần phải kiểm tra vô trùng ở tất cả các giai đoạn nuôi cấy, mỗi tháng cho nuôi cấy các dòng tế bào liên tục, mỗi tuần trong trường hợp phòng thí nghiệm bị nhiễm, trước mỗi lần bảo quản và trong trường hợp gặp cùng một vấn đề với những kết quả bị lặp đi lặp lại Khi phát hiện nhiễm cần cô lập nuôi cấy bị nhiễm ngay lập tức, ngay lập tức kiểm tra tế bào bảo quản và cô lập tất cả các mẫu bảo quản liên quan đến mẫu nhiễm, khử trùng phòng thí nghiệm theo qui trình tiêu chuẩn và loại bỏ ngay lập tức những tế bào không thể phục hồi thay thế

1.2.2 Kỹ thuật bảo quản tế bào

Qua nghiên cứu, Lynn (2002) đã đề xuất một qui trình kỹ thuật để duy trì thực liệu dòng tế bào côn trùng qua 17 bước tiến hành Tác giả đã chỉ dẫn các thao tác và các yêu cầu về môi trường, dụng cụ, nhiệt độ và cách làm một cách khá chi tiết Cũng theo tác giả này, thì nguồn thực liệu dòng tế bào có thể bảo quản theo 3 cách khác nhau:

1/ Bảo quản ở nhiệt độ thấp: duy trì ổn định ở nhiệt độ bảo quản là 40C

- 50C và định kỳ hàng tháng phải tiến hành nhân nuôi phục hồi

2/ Bảo quản trong nitơ lỏng: là phương pháp bảo quản lâu dài và rất ổn định, nhưng trước khi bảo quản cần bổ sung vào môi trường bảo quản một số thành phần trợ giúp như Glyceron hoặc DMSO để duy trì sức sống của tế bào

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

và hạn chế tế bào bị chết trong quá trình bảo quản

3/ Bảo quản theo phương pháp lạnh đông trong nhiệt độ -700C bằng cách: Tế bào 5 - 6 ngày tuổi được ly tâm để loại bỏ dịch môi trường nuôi cấy Sau đó, cho vào môi trường bảo quản chứa 10% Glycerol hoặc DMSO và đưa vào các ống tuýp nhỏ 1 – 2 ml Rồi đưa vào hộp bảo quản, tốt nhất là sử dụng các hộp nhôm

Qui trình KTCN nhân nuôi, bảo quản và duy trì lâu bền các dòng tế bào cũng được nhiều tài liệu đề cập tới Thậm chí, một số tài liệu trình bày một cách chi tiết và đầy đủ các khâu KTCN cần thiết, kể cả phương pháp xử lý cho những sai sót có thể xảy ra trong quá trình nhân nuôi, bảo quản và khi

đưa ra sử dụng sau bảo quản

Trong lĩnh vực sinh học, theo Lynn (2002) thì nuôi cấy tế bào côn trùng hiện nay thường được sử dụng trong sinh lý học côn trùng, sinh học phát triển, bệnh lý, và sinh học phân tử Vì những lĩnh vực này đã phát triển thành một phương pháp chuẩn mực, do các kết quả nghiên cứu đa dạng của nhiều nhà khoa học trong việc sử dụng các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy tế bào của các loài côn trùng khác nhau Theo Elanchezyan K (2009); Granados R.R., Li và Bonning (2007), thì động vật chân đốt đã trở thành trung tâm thu hút các nhà khoa học do tầm quan trọng của chúng trong nông nghiệp và y học, chúng đóng một vai trò quan trọng như vật chủ trung gian hay vector của tác nhân gây bệnh gây ra cho con người và động vật nuôi

Nuôi cấy tế bào động vật không xương sống, đặc biệt dòng tế bào côn trùng là một trong những công cụ giá trị nhất trong sinh học, trong công nghệ sinh học, trong sinh học dược phẩm và nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học Việc phân lập các mô bào và nhân nuôi phát triển thành các dòng tế bào có ý nghĩa to lớn để phục vụ cho nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng và thương mại Điều này hoàn toàn đúng với dòng tế bào côn trùng thuộc bộ Lepidoptera Chúng được sử dụng để nghiên cứu khả năng tái tổ hợp của vi rút và đã được sử dụng để sản xuất chế phẩm vi rút cho từng loài thuộc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

bộ Lepidoptera, để tạo ra thuốc trừ sâu sinh học hoặc sử dụng cho protein tái

tổ hợp Việc nghiên cứu và sử dụng tế bào côn trùng ngày càng được quan tâm tại nhiều nước trên thế giới

Sản phẩm tế bào nhân nuôi phục vụ việc nghiên cứu sinh lý học và tính biệt hóa tế bào; hiển thị các gen lạ trong công nghệ tái tổ hợp gen; phát hiện tác nhân gây bệnh; sản xuất qui mô thương mại các vacxin chữa bệnh và các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật sử dụng vi rút côn trùng; sản xuất khối lượng lớn các protein tái tổ hợp trong một thời gian ngắn sau khi đã có chuyển dịch (cắt, bổ sung) thích hợp về gen

Theo Granados R.R., Li và Bonning (2007) thì định hướng thời gian tới

sẽ là thời kỳ phát triển nhân nuôi tế bào côn trùng qui mô lớn và thúc đẩy sản xuất cũng như thương mại sản phẩm từ nhân nuôi tế bào trên thị trường

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển sinh khối của tế bào

Freshney (1987) chỉ rõ kỹ thuật nhân nuôi phát triển sinh khối tế bào phải được điều chỉnh cho phù hợp tùy theo mô tế bào thu nhận, cũng như đối với từng loài côn trùng cụ thể, môi trường nuôi cấy, môi trường bổ trợ, pH, nhiệt độ của môi trường nhân nuôi và cơ chế phát triển, phân chia của tế bào (bám dính hay huyền phù)

1.2.3.1 Môi trường thích hợp cho nhân nuôi tế bào

Theo sách được viết bởi Juan D Claus và Cs., hầu như tất cả các môi trường được sử dụng cho nuôi cấy các tế bào côn trùng có thành phần hóa học xác định một thành phần Thành phần cơ bản bao gồm hỗn hợp được xác định

về mặt hóa học của carbohydrate, axit amin, vitamin, muối và các axit hữu cơ Ngoài ra, các môi trường phải được bổ sung với các hợp chất hóa học xác định khác để góp phần thúc đẩy phát triển và phân chia của tế bào, chẳng hạn như huyết thanh bào thai bê, chiết xuất vi khuẩn hoặc protein thủy phân Theo Lynn (1996) điểm quan trọng nhất cần xem xét để phát triển sinh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

khối một dòng tế bào mới là môi trường nhân nuôi Nhiều môi trường được sản xuất đặc biệt dành cho nuôi cấy tế bào các loài thuộc bộ Lepidoptera Các môi trường này được cải biến từ môi trường Grace như ExCell 401, SF-900

và Insect-Xpress hoặc môi trường cải biến từ môi trường BML/TC-10 đó là môi trường TC-100 có bổ sung thêm peptit (như 1.25% phytone peptone, 1.25% peptone #P0521, 0.075% peptone P7750 và 5-10% fetal bovine serum (Sigma)) Ngoài ra, những điểm chính cần cân nhắc trong việc lựa chọn một môi trường cho phát triển sinh khối một loài côn trùng là pH, độ thẩm thấu, số lượng và tỷ lệ các chất muối vô cơ có trong môi trường

Theo Guy Smagghe (2009) môi trường nuôi cấy để sử dụng nuôi cấy tế bào côn trùng với nhiều công thức là môi trường tiêu chuẩn cũ của Grace, Schneider và Mitsuhashi hay Maramorosch Môi trường được sử dụng phổ biến bao gồm: Hink’s TNM-FH, môi trường được cải biến từ môi trường Grace bằng cách bổ sung yeastolate lactalbumin hydrolysates và fetal bovine serum (FBS); TC-100 (aka BML/TC-100), môi trường được cải biến từ môi trường Grace với việc giảm một vài amino acids

Guy Smagghe (2009) đã chỉ ra rằng môi trường tối ưu hóa được tìm ra bởi Goodwin và Cs (1980); Vaughn và Fan (1989); Vaughn và Weiss (1991)

có đóng góp trong sự phát triển môi trường nuôi cấy không huyết thanh với ILP-41 đã trở thành môi trường cơ bản chung nhất được sử dụng Hiện nay, nhiều môi trường không huyết thanh được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới,

ví dụ như: dòng môi trường Ex-Cell 400, insect-EXPRESS, Sf-9000 II, SFXInsect, Drosophila-SFM

Lynn (2005) đã xác định môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng cần phải được thay thế hoặc bổ sung liên tục trong khoảng thời gian thích hợp thì tế bào mới sinh trưởng phát triển tốt, trong đó tác giả thường bổ sung thêm môi trường mới vào nuôi cấy trong vài tuần đầu tiên Ông sử dụng đĩa petri 35mm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

để nuôi cấy tế bào, lượng môi trường nuôi cấy ban đầu thường là 150 - 200µl được bổ sung lên 1ml trong vài ngày đầu Sau đó, 0,5 ml môi trường mới được bổ sung vào trong khoảng thời gian 7 - 10 ngày nuôi cấy cho đến khi đạt được 2,5ml Tại thời điểm đó, 0,5 ml môi trường được hút ra (thường là chuyển sang một bình nuôi cấy khác) và 0,5 ml môi trường mới được thêm lại vào môi trường cũ Thường xuyên bổ sung hoặc thay thế này được tiếp tục cho đến khi các tế bào có thể được cấy chuyển Trong khi đó, với nhà nghiên cứu Cindy lại sử dụng một phương pháp thay thế môi trường khác, trong đó một nửa lượng thể tích của môi trường nuôi cấy được thay thế thường xuyên định kỳ

Elanchezyan (2009) cho rằng các loại môi trường nuôi cấy dòng tế bào khác nhau được thương mại hóa ở dạng bột hoặc dạng lỏng và hiện nay có rất nhiều môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng thương mại hóa có pha sẵn

Những môi trường chung hay sử dụng là TNM-FH – Trichoplusia ni Medium

Fred Hing, IPL 41 – Insect Pathology Laboratory, TC 100 – Tissue Culture

100, MM – Mitsuhashi Maramorosch medium, Grace Antheraea medium, v.v Agathos (1994) chỉ rõ để nhân nuôi có hiệu quả phải xác định loại môi trường thích hợp tùy thuộc từng dòng tế bào

Cũng theo Granados và Cs (2007) thì hiện nay có nhiều loại môi trường nhân nuôi tế bào khác nhau và thường bao gồm 30 thành phần khác nhau Tuy nhiên, theo tác giả này thì không hẳn tất cả các thành phần đó đều cần thiết cho sinh trưởng của tế bào Vì theo tác giả này lý giải dựa trên kết quả nghiên cứu của Gaw và Cs (1958) thì chỉ cần môi trường có 6 thành phần được pha thêm huyết tương loại không có hoạt tính là đủ và cho rằng huyết tương bổ sung có tác dụng thúc đẩy phát triển của tế bào Hurton (2005) đã thí nghiệm với 6 loại môi trường khác nhau để nhân nuôi sơ cấp tế bào sâu

Limulus polyphemus đã cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu tìm chọn môi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

trường và thành phần bổ sung thích hợp cho tế bào của từng loài sâu cụ thể Còn đối với Lynn (2002), để xác định số lượng tế bào sau khi đã đưa vào môi trường nhân nuôi thì cứ 0,2ml dịch tế bào cần trộn thêm 0,3ml PBS và 0,5ml Trypan là tốt nhất

Segura Nidya A và Felio Bello J (2012) đã tiến hành phân lập, nhân

nuôi và xác định các đặc điểm của dòng tế bào mô phôi loài muỗi vằn Culex

quinquefasciatus (Diptera) Mô phôi được nuôi cấy thử nghiệm trong các môi trường khác nhau L-15, Grace’s, Grace’s/L-15, MM/VP12, Schneider’s và DMEM để tìm ra môi trường nhân nuôi thích hợp, với pH 6,7 - 6,9 và ủ ở

280C Kết quả là môi trường Grace’s/L-15 là thích hợp cho nuôi cấy tế bào bám dính và tăng sinh khối

Theo tài liệu của Invitrogen Life Technologies (2002) thì hiện nay các công ty hóa sinh đã giới thiệu ra thị trường nhiều loại môi trường và các thành phần bổ trợ khác nhau Các sản phẩm đó chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nên vừa có hiệu quả cao trong việc nhân nuôi tế bào côn trùng, vừa có tính ổn định và tiện sử dụng Song vẫn phải đánh giá lựa chọn chủng loại môi trường và xác định tỷ lệ chất bổ trợ phù hợp với từng loại tế bào và từng loài côn trùng cụ thể

1.2.3.2 Nhiệt độ thích hợp trong quá trình nhân nuôi tế bào

Theo Lynn (1996), nhiệt độ cũng là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng

đến khả năng thành công của nhân nuôi in vitro tế bào côn trùng Hầu hết các

dòng tế bào côn trùng nhân nuôi ở nhiệt độ từ 250C – 290C, khoảng nhiệt độ này có lẽ là tốt nhất cho hầu hết các tế bào côn trùng vì chúng phù hợp với nhiệt độ mà tại đó các côn trùng sinh sống được

Chang Shao-Hua (1998) cũng tổng kết rằng phạm vi nhiệt độ từ 25 đến

300C là thuận lợi cho sự tăng trưởng tế bào côn trùng, và phạm vi tối ưu là

270C – 280C Hầu hết các nghiên cứu hiện tại của nuôi cấy tế bào côn trùng sử

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

dụng một mức nhiệt độ ổn định trong quá trình nuôi cấy Ông đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ dao động đến sự phát triển tế bào côn trùng Các tế bào được nuôi cấy ở 280C trong 2 ngày và sau đó chuyển sang điều kiện nhiệt

độ dao động khác nhau Giới hạn nhiệt độ trên đã được giữ ở 280C, và giới hạn dưới là 20, 22, 24, hoặc 260C Kết quả cho thấy rằng nhiệt độ dao động có thể kéo dài giai đoạn tăng trưởng tế bào của các tế bào không bị nhiễm bệnh Dao động tối ưu cho việc thúc đẩy một giai đoạn tăng trưởng tế bào dài mà không làm giảm mật độ tế bào tối đa là từ 24 đến 280C Ở nhiệt độ dưới 220C,

tế bào phát triển quá chậm và đã không đạt được một mật độ tế bào cao như đạt trong nuôi cấy ở 280C

Theo tổng hợp tài liệu của Juan D Claus và Cs., việc nuôi cấy tế bào

côn trùng in vitro ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 25 đến 300C Nhiệt độ tối ưu cho hầu hết các dòng tế bào bộ Cánh phấn (Lepidoptera) là 280C Tế bào nuôi trong môi trường không có huyết thanh ít chịu thay đổi của nhiệt độ hơn các

tế bào phát triển trong môi trường có bổ sung huyết thanh (Mitsuhashi & Goodwin, 1989)

Agathos (1994) chỉ rõ nếu nhân nuôi tế bào côn trùng theo phương pháp lớp mỏng tốt nhất phải tuân thủ qua 7 bước và trong quá trình nhân tế bào phải duy trì điều kiện nhiệt độ 27 ± 0,50C trong thời gian 4 - 6 ngày Còn nhân nuôi tế bào theo phương pháp rung lắc thì cần nhiệt độ là 270C - 290C Tuy vậy, các nghiên cứu cũng cho thấy đa số các loại tế bào côn trùng sinh trưởng tốt nhất ở 280C như dòng tế bào từ mô phôi loài muỗi Anopheles

albimanus được Felio J Bello (1997) phân lập thành công ở 280C; Wang (1997) đã phân lập dòng tế bào sâu khoang từ trứng nhộng sâu khoang hại cây thuốc lá nuôi cấy ở 280C

Kết quả nghiên cứu của Rey và Cs (2000) nhân nuôi ở nhiệt độ 280C là

thích hợp nhất đối với dòng tế bào loài muỗi Lutzomya longipalpis (Diptera:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

Psychodidae) Một số tài liệu khác đã khuyến cáo trong quá trình nhân nuôi nên duy trì ở nhiệt độ 27± 0,50C Cũng theo Felio J Bello (2001) đã phân lập

thành công dòng tế bào từ trứng của phôi loài muỗi rừng Psorophora

Confinnis nuôi ở 280C; trước đó Pant và Cs (2000) phát triển dòng tế bào từ hồng cầu sâu khoang nuôi cấy được duy trì ổn định ở nhiệt độ 280C

Theo Yeh (2007), nhân nuôi tế bào sâu đục quả đậu đỗ Maruca vitrata

ở nhiệt độ 280C; Sudeep A B và Cs (2009) đã nuôi cấy ấu trùng muỗi hổ

châu Á Aedes aegypti ở 280C

Gần đây nhất năm 2012, Segura Nidya A và Felio Bello J đã tiến hành phân lập, nhân nuôi và xác định các đặc điểm của dòng tế bào mô phôi loài

muỗi vằn Culex quinquefasciatus (Diptera) cũng ở 280C

Lynn (1998), đã sử dụng môi trường TC-100 ở nhiệt độ 260C để nhân

nuôi phát triển dòng tế bào sâu xanh Heliothis virescens để đảm bảo duy trì tế

bào nhân nuôi Tác giả cũng cho biết để không bị nhiễm khuẩn thì trong các công đoạn nhân đều cần bổ sung kháng sinh với lượng 100 đơn vị Penicilin và 0,1mg Streptomycin cho 1,0 ml môi trường nhân nuôi tế bào

Mitsuhashi (1976) nhân nuôi sơ cấp tế bào sâu xanh hại bắp cải

Mamestra brassicae L (Lepidoptera: Noctuidae) phân lập từ phôi lại sử dụng môi trường MGM-401 có chứa 1 số kháng sinh (gồm 10 mg Dihydrostreptomycin sulfate, 100 đơn vị Penicilin G potassium, 10 mg Karamycin Sulfate và 1 mg Novobiocin cho 100 ml môi trường), ở nhiệt độ nhân nuôi là 250C

Lucas Philippe, Meillour P N (1997) cũng đã nuôi cấy tế bào từ sợi

râu của loài Mamestra brassicae trong môi trường Grace có bổ sung

lactalbumine hydrolysate và yeastolate ở 220C Trong nhân nuôi sơ cấp có bổ sung hỗn hợp kháng sinh penicilin hoặc streptomicin theo tỷ lệ 100IU penicilin/ml và 100µg streptomicin/ml

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

1.2.3.3 Điều kiện pH môi trường nhân nuôi tế bào

Điều kiện nữa ảnh hưởng đến nhân nuôi tế bào côn trùng mà cần lưu ý

là việc lựa chọn một mức pH thích hợp cho môi trường nhân nuôi Mặc dù hơi lỗi thời nhưng một tài liệu tham khảo hữu ích cho các nghiên cứu là tài liệu của Altman (1961) - bài viết này cung cấp thông tin như nồng độ các chất

vô cơ muối, độ thẩm thấu, nồng độ acid amin và độ pH của tế bào hemolymph từ nhiều loại côn trùng khác nhau Dựa trên thông tin này và thông tin về các công thức môi trường mà có thể lựa chọn các môi trường thích hợp nhất cho loài côn trùng nhân nuôi

Theo tổng hợp tài liệu của Juan D Claus và Cs., thì độ pH của môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng được xác định bởi thành phần hóa học của

nó, phụ thuộc chủ yếu vào các hoạt động của bộ đệm muối, mặc dù hỗn hợp các axit amin có thể cũng đóng một vai trò trong việc điều chỉnh pH PH tối

ưu cho tất cả các môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng bướm là axit, giữa 6,2

và 6,4 Trong khi độ pH có thể được thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy tế bào côn trùng, những thay đổi đó có xu hướng hạn chế và thường làm nguy hại đến sinh lý của tế bào

Môi trường Grace có pH 6,5 - 6,6 thích hợp nhân nuôi tế bào sợi râu

của loài Mamestra brassicae (theo Lucas Philippe, Meillour P N (1997))

Lery và Cs (1995) phát triển dòng tế bào thu nhận từ phôi sâu đục củ khoai

tây Phthorimaea operculelia (Zeller)

Petcharawan và Cs (2006) đã sử dụng môi trường TNM-FH có pH là 6,8 thích hợp phát triển dòng tế bào sâu tơ KMITL-PX-E1 từ trứng 2 - 3 ngày tuổi; Wang và Cs (1997) đã phân lập dòng tế bào sâu khoang từ trứng nhộng sâu khoang hại cây thuốc lá trong môi trường TNM-FH

Còn Rey và Cs (2000) sử dụng môi trường MM/VP 12 có pH là 6,7 để

phát triển và nhân nuôi dòng tế bào của loài ruồi ký sinh Lutzomyia longipalis

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

(Diptera: Psychodidae)

Felio J Bello (1997) đã phân lập thành công dòng tế bào từ mô phôi

loài muỗi Anopheles albimanus trong môi trường MK/VP12 có pH 6,8 - 7,0;

Cũng theo Felio J Bello (2001) đã phân lập thành công dòng tế bào từ trứng

của phôi loài muỗi rừng Psorophora Confinnis trong môi trường MM/VP12;

kết quả nghiên cứu của Rey và Cs (2000) thì môi trường MM/VP12 có pH từ

6,7 - 6,9 là thích hợp nhất đối với dòng tế bào loài muỗi Lutzomya longipalpis

(Diptera: Psychodidae)

1.2.3.4 Vai trò của huyết thanh bổ sung trong môi trường nhân nuôi

Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ FBS (Fetal Bovine Serum) được sử dụng trong quá trình nhân nuôi ở các giai đoạn nhân nuôi khác nhau là không giống nhau Thường phải sử dụng với tỷ lệ giảm dần để tăng độ bám dính của

tế bào nhân nuôi

Theo Guy Smagghe (2009) thì FBS là chất bổ sung hiệu quả nhưng những nhân tố đặc biệt của côn trùng lại khá khác so với ở động vật có xương sống Trong điều kiện với FBS, những chất bổ sung không xác định khác đã được sử dụng bao gồm protein hydrolysates, huyết thanh lòng trắng trứng,

Tryptose broth và các điều kiện khác của môi trường

Theo Lery và Cs (1995) sử dụng môi trường Grace cải tiến và có chứa 20% FBS trong giai đoạn nhân nuôi sơ cấp để phát triển dòng tế bào thu nhận

từ phôi của sâu đục củ khoai tây Phthorimaea operculelia (Zeller), còn ở giai

đoạn nhân thứ cấp cũng tiến hành như ở giai đoạn sơ cấp nhưng chỉ bổ sung 10% FBS Felio và Cs (1995) cũng áp dụng kỹ thuật tương tự để phát triển và

nhân nuôi sinh khối dòng tế bào phát triển từ mô phôi của muỗi Aedes

taeniorhynchus (Diptera: Culicidae)

Theo Felio J Bello (2001) đã phân lập thành công dòng tế bào từ trứng

của phôi loài muỗi rừng Psorophora Confinnis, trải qua 62 lần cấy chuyển

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

liên tục tế bào sinh trưởng đầu tiên trong môi trường MM/VP12 với 20% FBS và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin) và kháng nấm trộn lẫn (anphoterycin B) Tuy nhiên, ở giai đoạn nhân nuôi thứ cấp tế bào lại có khả năng bám dính trong môi trường Grace có bổ sung 10% FBS; Petcharawan và

Cs (2006) đã sử dụng môi trường TNM-FH có chứa 20% FBS trong giai đoạn nhân nuôi sơ cấp để phát triển dòng tế bào sâu tơ KMITL-PX-E1 từ trứng 2 - 3 ngày tuổi Trong giai đoạn nhân thứ cấp từ chu kỳ 17 - 18 trở đi thì vẫn dùng môi trường TNM-FH nhưng chỉ chứa 10% FBS; Sudeep A B và

Cs (2009) đã nuôi cấy ấu trùng muỗi hổ châu Á Aedes aegypti với 20% FBS,

trong nhân nuôi thứ cấp FBS giảm xuống 10% ở chu kỳ cấy chuyển thứ 19

Zhang và Cs (2011) đã nuôi cấy dòng tế bào từ phôi loài cào cào

Gampsocleis gratiosa trong môi trường Grace có bổ sung 0,2% trehalose, 0,2% TC-yeastolate và 25% FBS Trong giai đoạn nhân thứ cấp từ chu kỳ thứ 30 lượng FBS bổ sung giảm từ 25% xuống 20% và xuống 15% ở chu

kỳ nhân thứ 50

Cùng một dòng tế bào nhưng cũng có khả năng sinh trưởng tốt ở cả hai nồng độ FBS khác nhau, hoặc nhân nuôi ở các môi trường khác nhau thì sử dụng nồng độ FBS cũng khác nhau

Mitshuhashi (1995) đã nuôi cấy dòng tế bào phân lập từ buồng trứng nhộng sâu khoang, nuôi cấy sơ cấp trong môi trường MGM-450 có bổ sung

5% FBS và 3% hemolymph Antheraea pernyi (APH) Tuy nhiên dòng tế bào

này cũng sinh trưởng được trong môi trường MGM-450 với 10% FBS hoặc môi trường MM với 3% FBS

Wang và Cs (1997) đã phân lập dòng tế bào sâu khoang từ trứng nhộng sâu khoang hại cây thuốc lá trong môi trường TNM-FH có bổ sung 10% FBS Pant và Cs (2000) phát triển dòng tế bào từ hồng cầu sâu khoang trong môi trường Grace có bổ sung 20% FBS, kháng sinh penicilin 50g/ml,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

streptomicin 100g/ml, gentamicin 40g/ml

Bên cạnh việc sử dụng FBS (huyết thanh bò) là chất bổ trợ cho sinh trưởng tế bào, một số nghiên cứu còn sử dụng huyết thanh của các loài động vật khác với tỷ lệ khác nhau để nhân nuôi tế bào côn trùng như Vaughn J L

và Cs (1977) đã nuôi cấy các mảnh mô từ nhộng loài sâu xanh da láng

Spodoptera frugiperda phát triển thành công 2 dòng tế bào Dòng tế bào IPLB-Sf 21 được nuôi cấy với môi trường có bổ sung huyết thanh và được duy trì liên tục trong môi trường Còn dòng tế bào IPL-SF 1254 được nuôi cấy trong môi trường chứa huyết thanh của động vật có xương sống và có khả năng bám dính trong môi trường không có huyết thanh ở lần cấy chuyển thứ

6 Hai dòng tế bào này được nhân nuôi trong hai môi trường khác nhau và bổ sung hai loại huyết thanh khác nhau tương ứng là IPL-40 và IPL-45, có bổ sung 4,2% huyết thanh gà tây và 4,2% huyết thanh gà ta và được bổ sung hỗn hợp kháng sinh như nhau penicilin/streptomicin (100IU penicilin/ml và 100µg streptomicin/ml);

Theo Yeh (2007), nhân nuôi tế bào sâu đục quả đậu đỗ Maruca vitrata

có thêm 8% và 16% huyết tương dạng không hoạt động thì tốc độ sinh trưởng của tế bào là nhanh nhất

1.3 Kết quả nghiên cứu ở trong nước

Trong điều kiện ở Việt Nam thời gian qua chủ yếu tập trung vào phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây trồng, còn việc nghiên cứu nhân nuôi tế bào côn trùng nói chung và ứng dụng kỹ thuật công nghệ nhân nuôi tế bào côn trùng để phát triển chế phẩm sinh học vi rút NPV nói riêng, để phục vụ phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng đến nay vẫn còn là vấn đề rất mới

Việc nhân nuôi tế bào chủ yếu thực hiện trong ngành y trong sản xuất vắc xin, nhân nuôi biệt hóa tạo mô để chữa bệnh Ngoài ra, trong nông nghiệp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

đã có một số cơ sở nghiên cứu chăn nuôi gia súc đã tiến hành nuôi cấy mô phôi bò, gà để duy trì qũy gen và phục vụ sinh sản hoặc để sản xuất vắc xin phòng chống bệnh của gia súc

Trong thủy sản cũng bắt đầu các hoạt động nghiên cứu nhân nuôi tế bào

để làm thực liệu phục vụ giám định bệnh lý trong chăn nuôi cá Gần đây nhất, công trình hợp tác của các nhà nghiên cứu thuộc Viện sinh học nhiệt đới, Viện Nuôi trồng thuỷ sản II và Viện Hoá sinh hữu cơ Paolo Alto – Mỹ đã sử dụng tế bào côn trùng Sf9 để nghiên cứu và chẩn đoán nhanh các Baculovirus gây bệnh cho tôm và đã thành công

Qua các kết quả nghiên cứu khoa học đã được công bố đã cho thấy việc nghiên cứu phát triển dòng tế bào côn trùng ở các nước trên thế giới đã phát triển mạnh mẽ và đạt nhiều thành công to lớn Việc nghiên cứu nhân nuôi tế bào đã phục vụ đắc lực cho hoạt động nghiên cứu cơ bản về sinh học, sinh lý

tế bào côn trùng, cũng như phục vụ việc sản xuất các chế phẩm sinh học vi rút với qui mô công nghiệp Còn tại Việt Nam, việc nghiên cứu tế bào động vật nói chung và tế bào côn trùng nói riêng còn rất hạn chế

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, đối tượng và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu

+ Nguồn thực liệu sâu hại: sâu khoang được nuôi bằng thức ăn sạch là

lá thầu dầu Bắt những con trưởng thành khỏe mạnh, chọn lọc những con trưởng thành cái khỏe mạnh làm nguồn phân lập để thu vật liệu mô bào

+ Các loại môi trường: ExcellTM 420 serum free (Sigma), Schneider (Sigma), TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), IPL-41 (Sigma), Grace (Gibco), v.v Huyết thanh Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), photphatse buffer saline pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), dimethyl sulfoxide 10% (DMSO) (Gibco), trypan blue 0,4%, trypsin-EDTA 10X (Gibco), v.v Kháng sinh Gentamicine (50mg/ml) (Gibco), Streptomycin (1gram), Penicilin (1.000.000 IU), kháng nấm Fungizone (250µg/ml) (Gibco), dung dịch KCl 0,001% Các hóa chất có liên quan như: cồn 70%

+ Bình nuôi cấy tế bào, gồm bình cổ vếch loại 25cm2, 75 cm2 nắp thông khí (Corning SPL-Hàn Quốc), ống nghiệm thủy tinh Hộp nhân nuôi, đánh giá

tế bào Multiple Well Plates loại 12 giếng (Corning- Mỹ) Ống bảo quản mẫu

tế bào 2ml đáy tròn và hộp đựng ống bảo quản (Corning SPL-Hàn Quốc) Panh gắp, dao mổ, kéo mổ, kim cắm côn trùng và dao nạo tế bào các loại

+ Thiết bị thí nghiệm như: Buồng cấy vô trùng, máy lắc để bàn Biotek (Hàn Quốc), máy li tâm 3.000 vòng/phút, tủ nuôi tế bào Binder (Mỹ),

N-tủ lạnh sâu -800C, tủ lạnh thường, micropipette các loại 200µl, 1ml, 2ml, 5ml, kính hiển vi soi nổi Zeiss (Đức), kính hiển vi soi ngược Nikon Ti-U (Nhật Bản), kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu v.v

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

- Đối tượng nghiên cứu

Gồm các mô bào sâu khoang được phân lập từ sâu khoang trưởng thành vừa vũ hóa

- Phạm vi nghiên cứu

Tập trung vào nghiên cứu khả năng phát triển sinh khối tế bào và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển sinh khối tế bào

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm sinh học, Viện Bảo vệ thực vật, phường Đức Thắng, Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu xác định mô bào và điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào khởi đầu

+ Nghiên cứu xác định mô bào nhân nuôi (trứng, phôi và tiền phôi) + Xác định điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào khởi đầu (môi trường, huyết thanh bổ sung, nhiệt độ, pH môi trường)

+ Xác định kỹ thuật bảo quản tế bào trong điều kiện lạnh đông -800C

2.2.2 Nghiên cứu xác định mức độ ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nhân nuôi đến khả năng phát triển sinh khối tế bào

+ Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi

+ Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân nuôi

+ Ảnh hưởng của pH môi trường nhân nuôi

+ Ảnh hưởng của tỷ lệ huyết thanh bổ sung

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Các thí nghiệm thu thập và phân lập tế bào sâu khoang

2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Tách phôi và nhân nuôi sơ cấp

Thí nghiệm phân lập mô trứng được tiến hành theo phương pháp của Lynn, 1996; còn việc phân lập mô phôi và tiền phôi dựa theo phương pháp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27

của Sudeep, Mourya và Mishra, 2005 giới thiệu

Cắt bỏ phần ngực và đầu của trưởng thành sâu khoang, thu nhận phần thân sâu và khử trùng bằng cách ngâm trong Ethanol 70% trong 1 phút Sau

đó, rửa sạch lại hai lần với nước cất vô trùng Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

có chứa kháng sinh trong một đĩa petri vô trùng Tách mô buồng trứng dưới kính lúp soi nổi bằng dao và kéo mổ côn trùng Dùng dụng cụ mổ tách bỏ các

mô không mong muốn ra khỏi mô mong muốn Tách lấy phần mô sinh sản có màu trắng đục đưa vào dung dịch xử lý vô trùng (PBS có kháng sinh gentamicine 50µg/ml, 2 - 3 lần)

Sau đó, nghiền thành nhiều mẩu tế bào nhỏ bằng chày nghiền và cho vào nuôi trong bình 25cm2 chứa 4ml môi trường và 10% FBS Bọc kín xung quanh miệng bình nuôi cấy bằng parafilm và đưa vào tủ nuôi ở 280C Sau 24 giờ, mở nắp bình nuôi và nhanh chóng thêm vào 2,0 ml môi trường nuôi cấy mới trong tủ vô trùng Sau 48 giờ, li tâm loại bỏ hoàn toàn dịch cũ, rồi cho 4,0

ml môi trường mới chứa 10% FBS và 10% kháng sinh tổng hợp để chống tạp nhiễm Sau 2 ngày tiếp theo (48 giờ) tiến hành phân lập, lựa chọn tế bào có dạng phổ biến nhất chuyển sang bình nuôi mới

Sau đó cứ 2 ngày (48 giờ), bổ sung 4 ml môi trường chứa 10% FBS và lắc với tốc độ 300 vòng/phút trong 5 phút Sau 6 ngày (144 giờ), loại bỏ dịch môi trường cũ và thay môi trường mới Sau 3 - 5 lần bổ sung môi trường như vậy, đưa bình nuôi cấy kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược, khi các tế bào bám thành một lớp ở đáy bình và có 90% tế bào có hình dạng đồng nhất giống nhau thì cấy chuyển sang nhân nuôi thứ cấp

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nhân nuôi thứ cấp

Các thí nghiệm nhân nuôi thứ cấp được tiến hành theo phương pháp của Lynn (1996) và sử dụng các môi trường nhân nuôi tế bào theo khuyến cáo

của Công ty Invitrogen Life Technologies 2010

Tế bào trong dịch tế bào nhân nuôi sơ cấp được tách bằng phương pháp trypsin hóa: Môi trường được loại ra khỏi bình nuôi cấy 25 cm2 và lớp tế bào

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28

được rửa bề mặt với 2,0 ml đệm trypsin-EDTA 0,25%

Để ở nhiệt độ phòng, sau 5 phút dung dịch trypsin được hút ra và để bình nuôi thêm 5 - 10 phút Môi trường mới được thêm vào tạo thành dịch huyền phù Chuyển dịch tế bào sang ống ly tâm, ly tâm với tốc độ 1000

vòng/phút trong thời gian 10 phút Loại bỏ dịch cũ và cho vào 10ml môi

trường chứa 20% FBS và dùng pipet hút đẩy nhẹ nhàng để phân phối các tế bào đồng đều trong môi trường, sau đó chuyển một nửa đến một bình nuôi cấy 75 cm2 mới, bổ sung thêm môi trường bằng với lượng môi trường mới cho cả bình nuôi cấy gốc và bình nuôi cấy mới cấy chuyển (tế bào được cấy lại vào môi trường mới theo tỉ lệ)

Trong giai đoạn đầu thiết lập, tất cả các nuôi cấy được cấy với tỉ lệ 1:2 (tế bào/môi trường), cho đến khi nuôi cấy đạt mật độ đủ (đánh giá bằng kính hiển vi) Tỷ lệ phân chia tế bào vào bình nuôi cấy mới sau mỗi lần trypsin hóa được thay đổi tùy thuộc tốc độ tăng trưởng tế bào tăng lên trong khoảng thời gian thích ứng với các điều kiện nuôi cấy

Sau đó, định kỳ 3 ngày/lần bổ sung 2ml môi trường có chứa 20% FBS

Sau 6 - 7 lần bổ sung môi trường, đem rung lắc và ly tâm để lấy tế bào đưa

vào bảo quản

Trước khi bổ sung hoặc trước khi ly tâm để thay thế môi trường mới, thì lấy mẫu đếm số lượng tế bào và kiểm tra hình dạng tế bào dưới kính hiển

vi soi ngược Nếu tế bào hình tròn thì mới đưa vào bảo quản Trước khi bảo quản thì ghi mã số mẫu (số thứ tự mẫu, nguồn gốc tế bào, chu kỳ nhân, ngày bảo quản mẫu, v.v.) Nếu tế bào chưa thuần (hình bầu dục hơi tròn) thì tiếp tục nhân nuôi làm thuần

2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Bảo quản tế bào

Được tiến hành theo qui trình kỹ thuật do Công ty Invitrogen Life

Technologies 2010 hướng dẫn Tất cả các thao tác cần thực hiện theo đúng điều kiện vô trùng trong tủ cấy vô trùng Tiến hành bảo quản và sử dụng tế

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29

bào theo các bước sau đây:

1 Bảo quản tế bào bằng kỹ thuật đông lạnh -800C

- Chuẩn bị môi trường đông lạnh bảo quản tế bào bao gồm: môi trường nuôi cấy, FBS và DMSO Môi trường nuôi cấy không chứa sẵn FBS hay chất

bổ sung nào Tế bào 4 - 6 ngày tuổi có hàm lượng 1 - 2 x 1010 tế bào/ml và đảm bảo độ thuần về hình dạng được đưa vào bảo quản

- Đếm số lượng tế bào sử dụng buồng đếm hồng cầu trước khi đưa vào bảo quản Cần đảm bảo đủ số tế bào để đông lạnh vào 2 - 4 lọ bảo quản ở mật

độ tiêu chuẩn trong mỗi lọ

- Dán nhãn cho các lọ bảo quản và đưa các lọ bảo quản vô trùng lên đá lạnh

- Ly tâm dịch tế bào ở 400 - 600 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dịch nổi và thu hồi phần tế bào lắng đọng sau ly tâm

- Tái huyền phù tế bào đến mật độ tiêu chuẩn trong môi trường đông lạnh đã chuẩn bị sẵn

- Chuyển 2,0 ml tế bào huyền phù vào lọ bảo quản đã làm lạnh (đặt trên

đá lạnh) và chuyển vào tủ lạnh sâu -800C

Kiểm tra khả năng sống và phát triển của tế bào đông lạnh 24 giờ sau khi bảo quản

Định kỳ 2 tháng 1 lần, lấy 0,5 ml mẫu bảo quản ra đếm số lượng tế bào sống ngay sau khi ra đông và nhân nuôi trên môi trường chứa 10% FBS Sau

6 ngày nhân nuôi, lấy mẫu đếm số lượng tế bào sống có trong 1ml bằng buồng đếm hồng cầu nhằm kiểm tra khả năng duy trì phát triển của tế bào sau bảo quản

2 Giải đông tế bào và nuôi cấy khởi động tế bào sau bảo quản

Quá trình đông lạnh có thể làm hỏng tế bào dẫn đến 20% - 25% tế bào

bị chết sau giải đông Vì vậy cần tiến hành theo các bước sau:

- Đưa những lọ tế bào ra khỏi đá khô và đưa ngay vào nước ấm 370C

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30

trong một vài phút

- Đưa ra khỏi nước ấm và nhanh chóng lau bên ngoài lọ tế bào bằng cồn 70%

- Chuyển 1,0 ml tế bào huyền phù vào bình nuôi cấy 25 cm2 chứa 4,0

ml môi trường đã chuẩn bị sẵn và bọc xung quanh miệng bình bằng parafilm

- Chuyển bình nuôi cấy vào tủ nuôi 280C và để cho tế bào bám vào đáy bình trong 30 - 45 phút

Sau khi những tế bào đã bám dính, nhẹ nhàng loại bỏ môi trường Đây

là bước phải làm ngay (càng sớm càng tốt) để loại bỏ hoàn toàn DMSO của môi trường đông lạnh ra khỏi các tế bào đã bám dính Bước này cũng sẽ loại

bỏ các mảng tế bào chết và những tế bào không khỏe mạnh mà chúng không bám dính được

- Nuôi cấy tế bào với 4,0 ml môi trường mới trong bình cổ vếch 25

cm2 Sau 24 giờ thay thế môi trường mới Tiếp tục nhân nuôi cho đến khi tế bào có dạng lớp đơn đồng nhất

Xác định số tế bào sống sử dụng phương pháp nhuộm với trypan blue 0,4% và đếm mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu thông dụng

Số lượng tế bào sống thích hợp để cấy vào là 1- 2 x 1010 tế bào trong bình

25 cm2 Để nuôi cấy huyền phù, bắt đầu nuôi cấy trong bình nuôi cấy 25cm2, khi

đã nuôi cấy sau một vài lần chuyển tiếp sau đó chuyển các tế bào sang bình định mức có kích thước phù hợp ở mật độ thấp nhất là 1 x 106 tế bào/ml

2.3.2 Nghiên cứu nhân nhân nuôi in vitro tế bào sâu khoang

2.3.2.1 Thí nghiệm 4: Xác định, lựa chọn môi trường nhân nuôi tế bào thích hợp

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Lynn, 1998 Tiến hành trên khay 12 giếng với 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần Trước

và sau 6 ngày nhân nuôi thì lấy mẫu đếm số lượng tế bào có trong 1ml dịch

nuôi trên buồng đếm hồng cầu