nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng enzyme endochitinase và βhexosaminidase tái tổ hợp

2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH ñến hoạt ñộng của endochitinase 15 3.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện gene mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase bằng phương pháp ñiện di SDS-PAGE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-oOo -

GIANG TRUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN

THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME ENDOCHITINASE VÀ β-HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

HÀ NỘI, NĂM 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-oOo -

GIANG TRUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN

THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME ENDOCHITINASE VÀ β-HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN HOÀNG ANH PGS.TS LÊ THANH HÀ

HÀ NỘI, NĂM 2014

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà nội, ngày 25 tháng 9 năm 2014

Học viên

Giang Trung Dũng

Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo TS Hoàng Hải Hà, khoa Công nghệ thực phẩm và bạn ðỗ Hải Quỳnh, học viên K22, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô giáo, cán bộ trong khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm Trung tâm khoa Thú Y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp

Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh ñạo Huyện ủy – UBND huyện Mường Khương, lãnh ñạo và công chức phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Mường Khương, tỉnh Lào Cai ñã tạo ñiều kiện, hỗ trợ giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Tôi xin trân trọng cảm ơn bạn bè ñã luôn bên, ñộng viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu

ðặc biệt, tôi xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất ñến bố, mẹ và vợ của tôi cùng những người thân trong trong gia ñình ñã luôn quan tâm ñộng viên trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 25 tháng 9 năm 2014

Học viên

Giang Trung Dũng

2.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 3

2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH ñến hoạt ñộng của endochitinase 15

3.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện gene mã hóa cho endochitinase và

β-hexosaminidase bằng phương pháp ñiện di SDS-PAGE 24 3.3.3 Tinh sạch enzyme bằng hệ thống sắc ký lỏng FPLC 25 3.3.4 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng muối (NH4)2SO4 26

3.3.7 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính của β-hexosaminidase 28 3.3.8 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 29 3.3.9 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích và ñộ bền nhiệt của endochitinase và β-

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái hợp và xác ñịnh mức ñộ biểu hiện của

gen mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase 32

4.1.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện của gene mã hóa cho endochitinase và

4.3 Xác ñịnh một số ñặc tính thủy phân colloidal chitin của endochitinase

4.3.1 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu và ñộ bền nhiệt của endochitinase 38 4.3.2 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu và ñộ bền nhiệt của β-hexosaminidase 40 4.3.3 Xác ñịnh pH tối ưu và ñộ bền pH của endochitinase 42 4.3.4 Xác ñịnh pH tối ưu và ñộ bền pH của β-hexosaminidase 45 4.4 Phân tích thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNS Dinitrosaicylic acid

GlcNAc N-acetyl-β-D-glucosamine

FPLC Fast protein liquid chromatography

RPM Revolutions per minute

PAGE Polyarylamide gel electrophoresis

pNP-GlcNAc p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide

IPTG Isopropyl -thio-β-D-galactopyranoside

TEMED N,N,N’,N’-tetramethylethynediamine

TLC Thin layer chromatography

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Hoạt tính của enzyme endochitinase tái tổ hợp thu ñược khi tinh

sạch bằng sắc ký FPLC tính theo 1 lít dịch nuôi cấy 34 Bảng 4.2: Hoạt tính của endochitinase tái tổ hợp thu ñược khi tinh sạch ở các nồng

ñộ muối amonisunfat khác nhau tính theo 1 lít dịch nuôi cấy 35 Bảng 4.3:Hoạt tính của β-hexosaminidase tái tổ hợp thu ñược khi tinh sạch

Bảng 4.4: Hoạt tính của β-hexosaminidase tái tổ hợp thu ñược khi tinh sạch ở

các nồng ñộ muối amonisunfat khác nhau tính cho 1 lít dịch nuôi

Bảng phụ lục 1: Phản ứng DNS với các nồng ñộ GlcNAc khác nhau 58

Bảng phụ lục 3.1: Phản ứng của CBB G-250 với abumin 60

Bảng phụ lục 4: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của endochitinase 61 Bảng phụ lục 5: ðộ bền nhiệt của endochitinase ở 37 0C và 50 0C 61 Bảng phụ lục 6: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính β-hexosaminidase 62

Bảng phụ lục 8: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của endochitinase 63

Bảng phụ lục 10: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính β-hexosaminidase 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.4: Vị trí thủy phân liên kết của β-hexosaminidase 17Hình 4.1: ðịnh tính khả năng sinh endochitinase của vi khuẩn tái Bacillus

licheniformis DSM13 tổ hợp bằng ñiện di SDS-PAGE 32Hình 4.2: ðịnh tính khả năng sinh β-hexosaminidase của vi khuẩn Lactococcus

lactis ssp.lactis IL1403 tái tổ hợp bằng ñiện di SDS-PAG 33Hình 4.3: Sắc ký ñồ tinh sạch endochitinase tái tổ hợp 34Hình 4.4: Sắc ký ñồ tinh sạch β-hexosaminidase tái tổ hợp 36Hình 4.5: ðồ thị ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của endochitinase 39Hình 4.6: ðộ bền của endochitinase ở 37oC và 50oC 40Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của β-hexosaminidase 41Hình 4.8: ðồ thị xác ñịnh ñộ bền nhiệt của β-hexosaminidase ở 30oC và 37oC 42Hình 4.9: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của endochitinase 43Hình 4.10: ðồ thị biểu diễn ñộ bền pH của endochitinase 44Hình 4.11: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính β-hexosaminidase 45Hình 4.12: ðồ thị biểu diễn ñộ bền pH của β-hexosaminidase 46Hình 4.13: Sắc ký bản mỏng sản phẩm phân giải colloidal chitin 2% (A) và 20

% (B) bởi endochitinase ở các thời gian thủy phân khác nhau M

Hình 4.14: Sắc ký bản mỏng sản phẩm phân giải 50 mM diacetyl chitobiose

(A) và 50mM diacetyl chitotriose (B) bởi β-hexosaminiase 48Hình 4.15: Quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin, sử dụng enzyme

PHẦN 1 đẶT VẤN đỀ

N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc) ựã ựược biết ựến là một hoạt chất sinh học quý, có tác dụng chữa các loại bệnh về khớp, viêm ruột và ứng dụng sản xuất

mỹ phẩm đã có nhiều nghiên cứu với những thử nghiệm lâm sàng chứng minh

G l cN A c có tác dụng ựiều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp [27] Hiện nay, các dược phẩm có GlcNAc ựã ựược sản xuất và thương mại hóa với giá trị rất cao Các sản phẩm có gốc glucosamine như glucosamine sunfat, glucosamine hydroclorid có tác dụng tương tự như GlcNAc, tuy nhiên khả năng cơ thể con người hấp thụ khó hơn GlcNAc Nguồn nguyên liệu chắnh ựể sản xuất GlcNAc là chitin Với lợi thế chăn nuôi và chế biến thủy sản phát triển, Việt Nam có nguồn nguyên liệu sản xuất chitin rất dồi dào [1]

Chitin chiếm từ 14-35% trọng lượng khô của vỏ giáp xác [4] Ở Việt Nam, giáp xác chiếm trên 30% nguồn nguyên liệu thủy sản Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, lượng phế phụ phẩm từ chế biến giáp xác khoảng 70.000 tấn/năm [1] Việc nghiên cứu, sản xuất GlcNAc từ nguồn cơ chất chitin này sẽ góp phần làm tăng giá trị kinh tế ngành chế biến thủy sản và làm sạch môi trường Ngày nay, GlcNAc có thể ựược sản xuất bằng phương pháp hóa học, hoặc phương pháp sinh học sử dụng phức hệ enzyme endochitinase và β-hexosaminidase Tuy nhiên, phương pháp sử dụng enzyme thủy phân chitin thành GlcNAc ựang ựược quan tâm nghiên cứu do phương pháp này cho ựộ tinh khiết của sản phẩm cao, không gây ăn mòn thiết bị và thân thiện với môi trường [19]

Kỹ thuật DNA tái tổ hợp ựóng vai trò then chốt của lĩnh vực Công nghệ sinh học Kỹ thuật này góp phần cải thiện hoạt tắnh và khả năng sinh tổng hợp enzyme

ựang ựược ứng dụng rộng rãi Enzyme tái tổ hợp sẽ hạn chế ựược nhược ựiểm của

enzyme thu nhận từ các chủng vi sinh vật tự nhiên như: mức ựộ biểu hiện của enzyme tự nhiên thường thấp, hoạt tắnh không cao đến nay, trên thế giới ựã có một

số nghiên cứu nhất ựịnh về ứng dụng chitinase ựể sản xuất GlcNAc Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào ứng dụng endochitinase và β-hexosaminidase tái

tài: “Nghiên cứu ñiều kiện thủy phân chitin, thu nhận N-acetyl-D-glucoamine sử dụng enzyme endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp”

- Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái tổ hợp và xác ñịnh ñược mức ñộ biểu hiện của

gen mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase

- Tinh sạch và xác ñịnh ñược ñặc tính thủy phân chitin của enzyme

endochitinase từ chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho endochitinase của Bacillus licheniformis DSM13

- Tinh sạch và xác ñịnh ñược ñặc tính thủy phân

pNP-N-acetyl-glucosaminide của chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho hexosaminidase của Lactococus lactis ssp.lactis IL1403

β Phân tích ñược thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm thủy phân

- Bước ñầu xây dựng ñược quy trình thủy phân chitin thu GlcNAc bằng cách kết hợp hai enzyme

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tìm hiểu chung về chitin

2.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên

Chitin ñược mô tả lần ñầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên

cứu loài nấm Agaricus volvacecus, ông thu ñược sản phẩm và ñặt tên là chitin

Năm 1823, Odier phân lập ñược một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin Odier và Braconnot ñều ñi ñến kết luận chitin có dạng công thức tương tự như cellulose [51]

Chitin là một polysacharide phổ biến trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (nhiều thứ hai sau cellulose), là một polymer sinh học ñược tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật Trong ñộng vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số ñộng vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác

và giun tròn Trong ñộng vật bậc cao chitin là một thành phần chủ yếu trong mô

da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm, sinh khối nấm mốc, một số loại tảo Trong thủy sản, hàm lượng chitin chiếm khá cao so với khối lượng chất khô: mực 3 – 20%, tôm 33%, cua 70% [1]

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, ñó là cấu trúc gồm nhiều phân tử ñược nối với nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi Trong tự nhiên, hiếm khi chitin tồn tại ở trạng thái tự do mà luôn liên kết dưới dạng phức hợp chitin – protein [4]

2.1.2 Tính chất lý hóa của chitin

2.1.2.1 Tính chất vật lý

Chitin có màu trắng hoặc trắng ngà, vô ñịnh hình Chitin ở thể rắn, xốp nhẹ, không màu, không mùi, không vị Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng từ 884-890 nm Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và các dung môi thông thường Nó chỉ tan ñược trong một số acid

vô cơ ñặc như HCl, H2SO4 Chitin tương ñối ổn ñịnh với các chất oxi hóa khử như

thuốc tím (KMnO4), oxi già (H2O2), nước javen (NaOCl - NaCl)… do vậy người ta

ñã sử dụng các chất này ñể khử màu cho chitin [1]

2.1.2.2 Tính chất hóa học

- Cấu trúc hóa học của chitin:

Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n

Tên gọi: Poly(1-4)-2acetamido-2deoxy-β-D-glucose;

Poly(1-4)-2acetamido-2deoxy-β-D-glucopyranose

Hình 2.1: Cấu trúc của phân tử chitin [51]

Chitin có cấu trúc gần giống với cellulose, chỉ có vị trí của nhóm hydroxyl thứ hai trên nguyên tử cacbon ñược thay thế bởi nhóm amino-acetyl Chitin là polysaccharide có khối lượng phân tử lớn Chitin có công thức phân tử: (C8H13NO5)n, ñược hình thành từ các ñơn phân GlcNAc liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4glycoside [4] Trong ñó: n thay ñổi tùy theo nguồn thu nhận chitin, tôm thẻ (n = 400-500), tôm hùm (n = 700-800), cua (n = 500 – 600)

Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và ñều ñặn Bằng phương pháp nhiễu

xạ tia X Người ta ñã chứng minh ñược chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình là α, β, γ-chitin Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích trong mạch Có thể biểu diễn mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần ñầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần ñuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc

α, β, γ- chitin ñược mô tả như sau [2]:

α chitin β chitin γ chitin

α - chitin có cấu trúc các mạch ñược sắp xếp ngược chiều nhau ñều ñặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp ñảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng ðây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên [4]

β, γ-chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β-chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn [4]

- Một số tính chất hóa học ñiển hình:

Thủy phân chitin bằng HCl ñậm ñặc ở nhiệt ñộ cao cho sản phẩm gồm 88,5% D-glucosamine và 11,5% acid acetic, quá trình thủy phân bắt ñầu xảy ra ở liên kết glucoside, sau ñó là loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3) [1]

Thủy phân chitin bằng dung dịch NaOH ñậm ñặc ở nhiệt ñộ cao thì chitin sẽ

bị mất gốc acetyl, sản phẩm tạo thành là chitosan và muối CH3COONa [1]

2.2 Tìm hiểu chung về GlcNAc

2.2.1 Công thức cấu tạo

Công thức cấu tạo phân tử của GlcNAc: C8H15NO6

Tên IUPAC: N-[(3R, 4R, 5S, 6R)-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl) oxan-3-yl]

2.2.2 Tính chất của GlcNAc

GlcNAc là một dẫn xuất monosaccharide của glucose Nó là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không màu, không mùi, ñiểm nóng chảy 210 0C, khối lượng phân tử 221,21 g/mol, ñộ hòa tan nước 167 mg/ml, không tan trong ether và chloroform Giống như glucose, GlcNAc cho phản ứng tráng bạc, phản ứng với Cu(OH)2 cho màu xanh nhạt [54]

Các phân tử GlcNAc với dẫn xuất của chúng ñược sử dụng ñể bảo vệ mặt ngoài của tế bào hoặc trực tiếp tham gia vào tương tác tế bào, làm tăng ñộ ñặc và lực tương tác giữa các tế bào [50]

GlcNAc là một thành phần của polysaccharide không ñồng nhất như murein (là một polysaccharide, thành phần cơ bản của tế bào vi khuẩn) và acid hyaluronic (là yếu tố chính ảnh hưởng tới sự hình thành mạch, sự vận ñộng của sụn, khớp, ñộ bám dính và chữa lành vết thương) [14], [6]

Ở người, GlcNAc thường thấy trong các glycoprotein như mô plasinogen [42], tuyến giáp kích thích hocrmon, gonadotropin màng ñệm ở người giúp cho khớp vận ñộng dễ dàng hơn Ở ñộng vật, GlcNAc cũng thấy trong các loài ñộng vật

có vú Trong thực vật, GlcNAc ñã thấy trong bromelin, ricin, agglutinin và abrus agglutinin [27]

Do những tác dụng của nó ñối với sức khỏe con người, từ ñầu thế kỷ XXI, GlcNAc ñược sử dụng trong thực phẩm chức năng và ứng dụng trong y học

2.2.3 Vai trò của GlcNAc

Nhiều nghiên cứu về GlcNAc ñược thực hiện trên ñộng vật như thử nghiệm ñộc tính, cấp tính trên các tế bào tủy xương, nhiễm sắc thể tinh hoàn chuột, thử nghiệm lâm sàng trên người…[26] cho thấy GlcNAc là một chất an toàn, sử dụng

ñể bổ sung dinh dưỡng, ứng dụng trong ñiều trị bệnh cho con người

Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp GlcNAc của cơ thể bị giảm sút, dễ mắc các bệnh về viêm xương khớp, người ta đã bổ sung vào cơ thể GlcNAc dưới dạng thuốc, cĩ tác dụng chống viêm và kích thích phát triển mơ sụn

Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện để điều trị bệnh nhân rối loạn khớp bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn, tổn thương khớp, thối hĩa khớp Các kết quả thử nghiệm trên chỉ ra rằng GlcNAc cĩ vai trị quan trọng trong việc phịng chống tổn thương khớp [28]

2.2.3.2 GlcNAc điều trị viêm ruột

Bệnh viêm ruột (IBD) là bệnh mãn tính gây viêm ở một số phần của ruột Các thành ruột trở nên sưng, viêm và phát triển gây loét, gây khĩ chịu và ảnh hưởng tới tiêu hĩa IBD là một phần chẩn đốn chung bao gồm một số bệnh về đường ruột như: viêm loét đại tràng, viêm niêm mạc trực tràng mãn tính và bệnh Crohn Khi bệnh Crohn tấn cơng vào ruột non, cơ thể khĩ hấp thụ các chất dinh dưỡng Kém hấp thụ và cảm giác chán ăn cĩ thể dẫn đến suy dinh dưỡng [23]

GlcNAc cĩ khả năng tăng cường việc tiết acid mucopolysaccharides bởi các nguyên bào sợi và khơi phục lại sự hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hĩa Ngồi

ra, GlcNAc làm tăng tính đàn hồi của các mơ quanh mạch, dẫn đến sự gia tăng lưu lượng máu qua mao mạch động mạch GlcNAc hoạt động như một tác nhân bảo vệ

giúp khơi phục lại chức năng bình thường của niêm mạc ruột ở người [23]

Một thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện để xác định hiệu quả điều trị bệnh IBD của GlcNAc Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau khi dùng GlcNAc qua đường uống hay hậu mơn Trong 12 trẻ em tham gia thử nghiệm cĩ 8 trẻ em cải thiện rõ rệt khi được uống GlcNAc như là một liệu pháp song song với liệu pháp hiện hành, trong khi đĩ 4 trẻ cịn lại khơng thấy chuyển biến Ngồi ra, 7 trẻ em bị IBD khác cũng dùng GlcNAc qua đường hậu mơn, kết quả cho thấy cĩ 5 trẻ en cho thấy kết quả rõ rệt, cịn lại 2 trẻ cịn lại khơng thấy chuyển biến và điều đáng quan tâm là 2 trẻ em này trước đĩ đã đề kháng lại các liệu pháp điều trị khác [40]

Từ những thử nghiệm trên, GlcNAc cĩ triển vọng là một phương pháp điều

2.2.3.3 GlcNAc là nguyên liệu sản xuất acid sialic

Acid N-acetylneuraminic (Neu5Ac) là acid sialic phổ biến nhất tồn tại trong cấu trúc của các lồi động vật cĩ vú và gia cầm Neu5Ac là một phần tử quan trọng trong hệ thống nhận dạng sinh học, là thuốc thử dùng để chuẩn đốn bệnh virus cúm, chúng như là một phương thuốc hiệu quả trong việc điều trị bệnh cúm [29], [15] Sản xuất Neu5Ac từ GlcNAc đơn giản, dễ thực hiện, thu được số lượng lớn Theo nghiên cứu của Maru và cộng sự (1998) từ 27 kg GlcNAc thu được 29 kg Neu5Ac [30] Như vậy, GlcNAc là một nguyên liệu quan trọng để sản xuất acid Neu5Ac

2.2.3.4 GlcNAc là nguyên liệu sản xuất mỹ phẩm

Da người gồm hai lớp là lớp sừng (lớp ngồi cùng) và lớp hạ bì (lớp bên trong) để bảo vệ cơ thể khỏi các tác động khắc nghiệt của mơi trường Tầng lớp sừng đĩng một vai trị quan trọng trong việc duy trì độ ẩm, độ săn chắc cho da Lớp

hạ bì bao gồm collagen, elastin… được tạo ra bởi các nguyên bào sợi giúp làm tăng khả năng phục hồi, độ bền, độ đàn hồi giúp da luơn khỏe mạnh Một trong những nhĩm carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic và proteoglycan cĩ khả năng giữ nước cao và là thành phần quan trọng trong việc duy trì độ ẩm cho da [9]

Lượng carbonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và phục hồi của da giảm và do đĩ làm cho da khơ, xuất hiện các nếp nhăn Bổ sung GlcNAc giúp tăng cường sự phát triển của collagen của nguyên bào sợi, thúc đẩy sự gia tăng của tế bào sừng cĩ tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất hiện các sắc tố da trên khuơn mặt, giảm nếp nhăn trên da [9] Vì vậy GlcNAc được coi là một thành phần cĩ giá trị trong mỹ phẩm, ngồi ra GlcNAc cịn được sử dụng trong việc giúp cho các vết thương nhanh hồi phục [13]

2.2.4 Phương pháp sản xuất

2.2.4.1 Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp hĩa học

GlcNAc trong lịch sử đã được thương mại thơng qua quá trình thủy phân chitin thơ bằng acid mạnh như HCl Nhiệt độ xử lý và nồng độ acid phải được lựa chọn cẩn thận Các thơng số này phải đủ cao để thủy phân chitin nhưng khơng quá cao để tránh các sản phẩm GlcNAc bị phá hủy ðiều kiện phản ứng thích hợp gồm

15-36% HCl, nhiệt ựộ 40 Ờ 80 0C Trong ựiều kiện này có thể sản xuất ựược 6,42 gam/lắt GlcNAc trong 1 giờ [7]

Ưu ựiểm của phương pháp này là kinh tế Nhược ựiểm của phương pháp này

là năng suất thấp dưới 65%, chất thải có tắnh acid, sản phẩm không ựược coi là tự nhiên và tinh khiết do có sự biến ựổi hóa học [41] Mặt khác, GlcNAc sản xuất hóa học thường có vị ựắng do những chất còn tồn dư như dung môi, tributylamine Nhiều công trình ựã ựược thực hiện ựể cải thiện ựộ tinh khiết của GlcNAc sản xuất bằng phương pháp hóa học Ryosuke và cộng sự (2002) kết hợp quá trình thủy phân acid của chitin và trao ựổi ion màng ựể ựiều chế GlcNAc tự nhiên [39] Zhan (2007) ựã kết tinh ựể ựiều chế GlcNAc với ựộ tinh khiết cao 99,95% [51] Do

ựó, có thể nghiên cứu sử dụng kết hợp các phương pháp hóa học ựể sản xuất GlcNAc với giá rẻ trong tương lai

2.2.4.2 Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp chuyển hóa sinh học

để tăng hiệu quả sản xuất GlcNAc phương pháp chuyển hóa sinh học ựã

ựược nghiên cứu và ựề xuất Một loại vi khuẩn thủy phân chitin là Chitinibacter

tainanensis ựược phân lập từ mẫu ựất ở miền nam đài Loan ựã ựược chứng minh ựể

sản xuất GlcNAc [12] Hiệu suất sản phẩm thu ựược là 75% khi sử dụng α-chitin và 98% khi sử dụng β-chitin Hạn chế của phương pháp này là vi khuẩn có thể bị chết trong môi trường acid

GlcNAc ựược sản xuất bằng phương pháp biến ựổi gene của vi sinh vật sử

dụng cơ chất glucose Theo Deng và cộng sự (2005), chủng E.coli biến ựổi gene ựã

sử dụng glucose ựể tạo ra GlcNAc Trong nghiên cứu này, ựã thu ựược trên 120 g/l GlcNAc sau khi lên men trong 60 giờ [12]

Mặc dù hiệu quả sản xuất GlcNAc cao, tuy nhiên phương pháp chuyển hóa sinh học không sử dụng ựược nguồn phế liệu có sẵn trong tự nhiên, quá trình tinh sạch từ các chủng khó khăn, chi phắ rất cao [12]

2.2.4.3 Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp enzyme

GlcNAc sản xuất bằng phương pháp hóa học và biến ựổi sinh học không ựược thương mại rộng rãi không chỉ vì lý do kỹ thuật mà còn ảnh hưởng tới môi

thân thiện với môi trường Vì vậy, phương pháp sử dụng hệ enzyme chitinase của vi sinh vật ñã ñược quan tâm [19]

Phương pháp này sử dụng endochitinase cắt các liên kết của chitin một cách ngẫu nhiên tạo ra các olygosaccharide, sau ñó enzyme β-hexosaminidase tiếp tục thủy phân liên kết glucoside của các olygosaccharide tạo ra GlcNAc [19], [38] Một

số enzyme thô ñược phân lập từ Tricoderma viride, Aspergillus niger, Carcica

papaya, Penicillium oxalicum và Aeromonium sản xuất GlcNAc hiệu quả cao [41]

Theo Sashiwa và cộng sự (2002) nghiên cứu sản xuất GlcNAc từ α-chitin bởi

các enzyme thô từ Aeromonas hydrophila H2330 [43], hiệu suất GlcNAc thu ñược

77% trong thời gian 10 ngày Một nghiên cứu khác của Pichangkura và cộng sự

(2002) sử dụng chitinase thô từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis SK-1 thủy phân

α-chitin ñể sản xuất GlcNAc, hiệu suất thu sản phẩm GlcNAc ñạt 41% [18]

Một nghiên cứu của Kuk và cộng sự (2005) chủng vi khuẩn ñược phân lập từ

ñất ven biển là Aeromonas sp GJ-18 có khả năng thủy phân chitin tạo GlcNAc

Bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy ở ñiều kiện 45 0C sản phẩm chính của phản ứng thủy phân là GlcNAc và một lượng nhỏ (GlcNAc)2 và (GlcNAc)3, trên 500C sản phẩm chính là (GlcNAc)2 Tại nhiệt ñộ tối

ưu 45 0C và pH 5 trong 9 ngày hiệu suất thủy phân của enzyme là 94,9% [11] Theo nghiên cứu của Paramenswaran Binod và cộng sự (2007), sử dụng endochitinase và chitobiase từ nấm ñể sản xuất GlcNAc Trong 15 chủng nấm ñược

lựa chọn, chủng Penicillium aceleatum NRRL 2129 cho endochitinase hoạt ñộ cao nhất, chủng Trichoderuma harzianum TUBF927 cho hoạt ñộ chitobiase cao nhất

Sự kết hợp hai enzyme từ chủng nấm ñược lựa chọn, tạo ra sản phẩm GlcNAc với một lượng lớn [37]

Tiếp theo nghiên cứu của Phakapob Settthaketset và cộng sự (2008), sử

dụng chitinase từ chủng nấm mốc Aspergillus sp kết hợp với β-chitin từ vỏ mực ñể

ứng dụng cho thu nhận GlcNAc Sau 2 ngày thủy phân, pH4, nhiệt ñộ 45 0C lượng GlcNAc tạo ra là 65% [38]

Phương pháp sử dụng hệ enzyme từ vi sinh vật trong sản xuất GlcNAc từ chitin ngày càng ñược sử dụng phổ biến và rộng rãi do có hiệu suất thu GlcNAc

cao, khắc phục ñược nhiều hạn chế của phương pháp hóa học và chuyển hóa sinh học [11], [37], [18]

2.3 Vi khuẩn Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis khả năng ứng dụng

ñể sản xuất enzyme

2.3.1 ðặc ñiểm hình thái Bacillus licheniformis và Lactoccus lactis

2.3.1.1 ðặc ñiểm hình thái Bacillus licheniformis

Vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử hình ô van

không phình, thuộc nhóm hai theo phân loại của Pries và cộng sự [52] Các tế bào vi khuẩn này ñứng riêng rẽ hoặc có thể sắp xếp với nhau tạo thành chuỗi Tế bào vi khuẩn ngắn, nhỏ có thể thay ñổi tùy theo chuỗi từ 1 – 5µm, ñuờng kính từ 0.5 – 1µm

2.3.1.2 ðặc ñiểm hình thái Lactococcus lactis

Theo phân loại của Bergay (1994) vi khuẩn lactococcus lactis: Lớp

lactobacillaceae – Họ Streptococeae – Giống: Lactococcus – Loài: Lactococcus lactis Dưới loài của Lactococcus lactis gồm: Lc.lactis ssp.cremoris, Lc lactis ssp.hordniae, Lc lactis ssp lactis và Lc lactis ssp.Lactis biovar diacetylactis [17]

Tế bào lactococcus lactis hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước 1,2 x

0,5-1,5µm Trong môi trường dịch thể, tế bào thường tồn tại ở dạng kết ñôi hoặc chuỗi ngắn Tế bào gram dương, không hình thành nội bào tử, không di ñộng, không có vỏ bọc, hiếu khí, phản ứng catalase âm tính, phản ứng oxidase âm tính [17]

2.3.2 ðặc ñiểm sinh lý Bacillus licheniformis và Lactococus lactis

2.3.2.1 ðặc ñiểm sinh lý Bacillus licheniformis

Trong tự nhiên có thể phân lập Bacillus licheniformis ở khắp nơi từ ñất,

nước, cây trồng Nhiệt ñộ tăng trưởng tối ưu của nó là 50 0C, nhưng nó cũng có thể tồn tại ở nhiệt ñộ cao hơn nhiều Tuy nhiên, nhiệt ñộ tốt nhất ñể tiết một số enzyme

là 37 0C [52] Khi ñiều kiện môi trường khắc nghiệt nó sẽ chuyển sang dạng bào tử

ñể chống chịu tốt hơn và quay về trạng thái sinh dưỡng khi gặp ñiều kiện thuận lợi

Hiện nay hầu hết các quá trình lên men vi khuẩn ñều ñược thực hiện bằng các phương pháp nuôi cấy chìm có sục khí, khả năng sinh sinh khối và sinh tổng hợp enzyme chitinase của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào ñiều kiện môi trường

2.3.2.2 ðặc ñiểm sinh lý Lactococcus lactis

Lactococcus lactis lên men lactic một số nguồn carbon, tạo sản phẩm chủ

yếu là L(+) lactic acid Lactococcus lactis có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng

cần nhiều nguồn cơ chất khác nhau trong môi trường ñể sinh trưởng

Nhiệt ñộ tăng trưởng tối ưu của Lactococcus lactis là 30 0C, có thể tồn tại ở

10 0C nhưng không sống ñược ở 45 0C Ngoài ra, Lactococcus lactis có khả năng

tăng trưởng trong môi trường pH 3,5- pH 9,2 nhưng chết ở pH 9,6 và tồn tại ñược trong môi trường có nồng ñộ NaCl thấp hơn 6,5%

Bộ gen của Lactococcus lactis có một nhiễm sắc thể vòng, kích thước từ 3,1Mbp Hầu hết các chủng Lactococcus lactis ñều có nhiều plasmid (số lượng từ 2-

2,0-11), phổ biến là từ 4-7 plasmid trong tế bào [17]

2.3.3 Ứng dụng của Bacillus licheniformis và Lactococus lactis

2.3.3.1 Ứng dụng của Bacillus licheniformis

Hiện nay, vi khuẩn này ñang ñược chú ý và sử dụng cho mục ñích công nghiệp như sản xuất enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa Nó có khả năng sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào có liên quan tới các chu trình dinh dưỡng trong

tự nhiên

Bacillus licheniformis cũng ñược ứng dụng là một thành phần quan trọng

trong chất giặt tẩy Do nó có khả năng phát triển trong môi trường kiềm và sản sinh

ra một protease có thể tồn tại ở pH cao Protease có pH tối ưu ở khoảng pH 9 và pH10, do vậy nó có thể loại bỏ protein bao gồm bụi bẩn trong quần áo [51]

Bacillus licheniformis ñược sử dụng ñể sản xuất kháng sinh Bacitracin

Bacitracin bao gồm một hỗn hợp của các polypeptide tuần hoàn do Bacillus

licheniformis tạo ra nhưng nó lại ñược tạo ra ñể ức chế sự tăng trưởng của Bacillus licheniformis Ngoài ra, Bacillus licheniformis cũng ñược sử dụng ñể sản xuất

penicillinase, pentosanases, proticin, citric acid

Hiện nay ñã có rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới thu nhận chitosanase

từ Bacillus sp như: Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus alvei, và Bacillus licheniformis

Theo Yasushi Uchida et al (1994), Bacillus licheniformis UTK ñược phân lập từ ñất

cho thấy khả năng sinh chitosanase ngoại bào Sau khi nuôi cấy và thu dịch thô enzyme, thực hiện các bước làm sạch ñã thu ñược hai enzyme chitosanase C1, C2

có khối lượng khoảng 31 và 26kDa Nhiệt ñộ tối ưu khoảng 40 - 450C và pH tối ưu 4.6 - 4.9 [43]

Nghiên cứu gần ñây của Ekowati và cộng sự (2006) cũng ñược thực hiện thu

nhận chitosanase từ Bacillus licheniformis MB2 ñược phân lập từ suối nước nóng ở

Manado, Indonesia Cũng sau quá trình làm sạch thu ñược hai enzyme chitosanase chitosanase thứ hai thu ñược có khối lượng phân tử khoảng 75kDa, nhiệt ñộ hoạt ñộng tối ưu là 700C và khoảng pH tối ưu là pH 6 – pH 7 [8]

2.3.3.2 Ứng dụng của Lactococcus lactis

Trong môi trường có nguồn carbonhydrate phong phú, Lactococcus lên men

carbonhydrate bằng cơ chế lên men lactic ñồng hình, chủ yếu tạo ra L (+) -lactic acid Lactic acid ñược tạo ra làm giảm pH môi trường, vì vậy ức chế sự tăng trưởng

của nhiều vi khuẩn khác Một số chủng Lc.lactis có khả năng ñồng hóa các phân tử

ñường ñơn giản thành các polysaccharide phức tạp, ñược xuất bào và kết hợp với bề mặt tế bào Những hợp chất này cung cấp kết cấu vững chắc cho một số sản phẩm lên men và có thể ñóng vai trò như những tác nhân ổn ñịnh [43], [52]

Trong chủng dưới loài Lc.lactis, chỉ Lc.lactis ssp lactis biovar diacetylactis

có khả năng sử dụng citrate trong sữa Sản phẩm tạo thành gồm diacetyl, acetoin, 2,3-butanediol, acetic acid và CO2, những hợp chất này góp phần tạo hương thơm trong các sản phẩm lên men [8]

Enzyme lipase hoặc esterase của Lc.lactis có hoạt tính phân giải lipid thấp,

chủ yếu ñóng vai trò ñảm bảo chức năng sinh lý của tế bào [43]

Lc.lactis cần nhiều hợp chất protein, peptide, aminoacid ñể sinh trưởng

Trong môi trường sữa có các amino acid isoleucine, leucine, valine, histidine và

methionine, cần thiết cho sự sinh trưởng của Lactoccos Những amino acid tự do

này cung cấp nguồn nitơ cho tế bào Casein, chứa khoảng 80% protein trong sữa sẽ trở thành nguồn nitơ chủ yếu cho tế bào sau khi nguồn nitơ không phải protein bị phân giải [52]

Lc.lactis là vi khuẩn vi hiếu khí, tế bào của chúng không có chu trình

tricarboncylic acid và thiếu hệ thống vận chuyển ñiện tử Tuy nhiên, chúng vẫn có khả năng tồn tại khi có sự hiện diện của oxy nhờ các enzyme chuyển hóa oxy Với

các enzyme oxidase và superoxide dismutase, tế bào Lc.lactis có thể chuyển O2

thành H2O2 hoặc nước H2O2 ñược tạo ra, sẽ tích lũy trong môi trường tăng trưởng

do Lc.lactis không có enzyme catalase hoặc NADH peroxidase ñể loại bỏ nó H2O2tích lũy trong môi trường có tác ñộng ức chế những vi khuẩn khác vì vậy có hiệu quả bảo quản sản phẩm lên men [43]

2.4 Giới thiệu về enzyme endochitinase

Chitinase (còn gọi là poly

β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosidglucanohydrolase) là hệ enzyme thủy phân chitin, có khả năng thủy giải

liên kết β-1,4 glycoside giữa C1 và C4 của hai monomer N-acetyl-D- glucosamine trong mạch chitin Enzyme này có ở nhiều loài sinh vật: vi khuẩn, nguyên sinh ñộng vật, nấm, thực vật và ñộng vật [16]

Dựa vào khả năng phân cắt, chitinase ñược chia thành 4 loại: endochitinase (mã số EC 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.30), chitobiosidase, và chitobiase [49]

2.4.1 Khối lượng phân tử và cơ chế xúc tác của endochitinase

Endochitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa (kilodalton) Ở loài thân mềm, chân ñốt, ñộng vật có xương sống, một số endochitinase có trọng lượng phân tử 40 – 90 kDa hoặc cao hơn là khoảng

120 kDa Trọng lượng phân tử của endochitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến ñộng rộng, từ 30 ñến 120 kDa [16]

Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch phân tử chitin một cách ngẫu nhiên, tạo ra các ñoạn oligosaccharides có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm ña số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 Cơ chế xúc tác của endochitinase

ñã ñược nghiên cứu từ dịch chiết nấm Trichoderma harzianum và Gliochadium

virens [49]

Hình 2.3: vị trí phân thủy phân của endochitinase

2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH ñến hoạt ñộng của endochitinase

Theo nhiều nghiên cứu, endochitinase hoạt ñộng ở giới hạn nhiệt ñộ từ 20 – 50

0

C Nhìn chung nhiệt ñộ tối ưu cho endochitinase ở sinh vật hoạt ñộng là 400C, ngoại

trừ Aspergillus niger tổng hợp endochitinase có nhiệt ñộ tối thích là 500C [49]

Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà endochitinase có thể có những nhiệt ñộ tối

thích khác nhau, endochitinase thu nhận từ Bacillus lichenifomis cho thấy khả năng

chịu ñựng nhiệt ñộ cao ñến 800C Theo Bendt (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân

chitin mạnh nhất của từ Vibrio sp từ 30–40 0C, và endochitinase chịu nhiệt từ

chủng Bacillus sp BG 11 có hoạt tính cao nhất ở 40-600C Lorito (1998) ñã khảo

sát hoạt tính endochitinase từ chủng Trichoderma harzianum nhận thấy enzyme này

có thể hoạt ñộng trong khoảng nhiệt ñộ rộng từ 20-60 0C, nhiệt ñộ tối thích là 40 0C Ngược lại, endochitinase từ côn trùng thường không ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 400C [21]

Giá trị pH tối thích của endochitinase từ 4-9 ñối với các endochitinase ở thực vật bậc cao và tảo; endochitinase ở ñộng vật là từ 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là

từ 3-8,0 [49]

2.4.3 Nguồn thu nhận endochitinase

Trong tự nhiên endochitinase có thể ñược thu nhận từ nhiều nguồn sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm, ñộng vật, thực vật Nguồn vi khuẩn chính ñể thu

endochitinase là nhóm Streptomycetes, ngoài ra còn có các nhóm khác như:

Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio… Vi khuẩn tổng

hợp chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường ñể tạo nguồn carbon cho vi

khuẩn sinh trưởng và phát triển [21]

Endochitinase cũng ñược tạo ra bởi các loại nấm sợi thuộc chủng

Trichoderma, Gliocladium, Calvatia và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus [5]

Chitinase tồn tại trong thực vật có vai trò kháng khuẩn, kháng nấm, ký sinh

và côn trùng Chitinase thực vật thường là endochitinse phân cắt ngẫu nhiên, một số chitinase thực vật có hoạt tính lysozyme cắt liên kết β-1,4 giữa acid N-acetylmuramic và các gốc glucosamine trong peptidoglycan Các loại thực vật bậc cao có khả năng tạo endochitinase như: cao su, thuốc lá, lúa, lúa mỳ, lúa mạch, lúa mạch ñen, cải bắp, ngô, cà rốt, khoai tây, ñậu Hà Lan, ñậu nành… và một số loại tảo biển cũng là nguồn cung cấp endochitinase [21]

Trong ñộng vật endochitinase có thế ñược thu nhận từ một số loài ñộng vật nguyên sinh, các loài không xương sống: ruột khoang, than mềm, giun tròn, than ñốt…(lấy từ các mô, các tuyến khác nhau hệ tiêu hóa) Với loài có xương sống thì nguồn endochitinase là tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim thú ăn sâu bọ… Ngoài ra, endochitinase còn thu ñược thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân ñốt vào thời ñiểm thay vỏ, lột xác [21]

2.5 Tìm hiểu về enzyme β-hexosaminidase

2.5.1 Cơ chế xúc tác của β-hexosaminidase

β-hexosaminidase (EC 3.2.1.52) là enzyme phân cắt chitooligosaccharide từ ñầu không khử cho sản phẩm chính là các phân tử GlcNAc Enzyme này ngoài phản ứng thủy phân chitooligosaccharide, nó còn phản ứng với cơ chất khác như oligo-N-acetylgalactosamines [31] [46]

Hình 2.4: Vị trí thủy phân liên kết của β-hexosaminidase

2.5.2 Một số ñặc tính của β-hexosaminidase

β-hexosaminidase ñã ñược công bố sinh tổng hợp bởi chủng nấm mốc

Verticillum lecanii khi nuôi cấy trên môi trường vỏ tôm phế thải [31] Theo Katta và

cộng sự (2013) β-hexosaminidase từ Stenotrophomonas maltophilia có kích thước

phân tử 83 kDa hoạt ñộng tối ưu ở 40 0C, pH tối ưu 5,0 [46] Nhung và cộng sự

(2014) ñã nghiên cứu β-hexosaminidase từ vi khuẩn ñất Streptomyces coelicolor A3

và chứng minh rằng enzyme này có ái lực mạnh với chitooligosaccharide và thủy phân chúng tạo sản phẩm duy nhất là GlcNAc [35] β-hexosaminidase từ vi khuẩn

biển Vibrio harveyi 650 gồm hai loại VhNag 1 có trọng lượng phân tử 89 kDa, pH tối ưu 7,5 và VhNag 2 có trọng lượng phân tử 73 kDa, pH tối ưu 7,0 và có ái lực

166 giờ nuôi cấy thì chủng P.monoverticillum CFR 2 sản xuất 41 U/g endochitinase

và 195,4 U/g β-hexosaminidase Chủng A flavus CFR 10 sản xuất 26,8 U/g endochitinase và 222,1 U/g β-hexosaminidase Còn chủng F oxysporum CFR 8 sản

xuất 13,3 U/g endochitinase và 168,3 U/g hexosaminidase Hoạt tính

β-hexosaminidase có nguồn gốc từ A flavus CFR 10 và F oxysporum CFR 8 tối thích

ở nhiệt ñộ 62 0C và nhưng Penicillium monoverticillum CFR 2 tối thích ở nhiệt ñộ

2.5.3 Vai trò của β-hexosaminidase

β-hexosaminidase thuộc trong nhóm enzyme thủy phân glycoside Nó xuất hiện

ở hầu hết các loại sinh vật sống và có chức năng sinh học rất ña dạng, là một enzyme tự

phân hủy trong chu kỳ tế bào của E.coli β-hexosaminidase có vai trò quan trọng trong

quá trình phân hủy chitin thành GlcNAc, trong quá trình này chúng chuyển oligosaccharides ñược giải phóng khi chitinase phân hủy chitin [33]

chito-ðối với nấm, enzyme này ñóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển

và có khả năng kháng nấm ký sinh ðối với thực vật, nó ức chế sự phát triển của nấm và kích thích sự nảy mầm và làm chín quả

β-hexosaminidase nằm trong lysosome của tế bào con người, có vai trò quan trọng với não và tủy sống, phá vỡ một chất là GM2 ganglioside Nếu thiếu hoạt ñộng của enzyme này GM2 ganglioside sẽ tích tụ và gây nên bệnh Tay-sachs [33]

Việc thu nhận β-hexosaminidase ñể sản xuất GlcNAc ngày càng ñược quan tâm nhiều hơn Tuy nhiên, β-hexosaminidase từ nhóm vi khuẩn an toàn (GRAS) như vi khuẩn lactic còn mới mẻ

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

ðể thực hiện ñề tài này, chúng tôi sử dụng hai chủng E.coli tái tổ hợp của

phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực phẩm, Bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

ñể nuôi cấy, thu nhận enzyme tái tổ hợp, ñó là: một chủng chứa gene mã hóa cho endochitinase từ Bacillus licheniformis DSM13 (nhóm nghiên cứu chưa công bố) và một chủng chứa gene mã hóa cho β-hexosaminidase từ Lactococcus lactis ssp.lactis

IL1403 [33]

3.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu

ðề tài ñược thực hiện tại các phòng thí nghiệm: Công nghệ sinh học thực phẩm, bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm; phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm Trung tâm, khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 5/2013 ñến 7/2014

3.1.4 Dụng cụ, hóa chất

Bảng 3.1: Dụng cụ sử dụng nghiên cứu

Bể ổn nhiệt (Water Bath JSWB 22T) Ổn nhiệt ñộ, dừng phản ứng enzyme Hàn Quốc Cân phân tích Cân hóa chất với ñộ chính xác cao Mỹ

Máy lắc ổn nhiệt (Eppendort

Máy li tâm (Herolab Hicen21C) Li tâm thu nhận enzyme ðức Máy li tâm (Mikro 2204 Hettich) Li tâm thu mẫu vòng quay nhỏ ðức Máy li tâm (Mini Spin plus) Li tâm eppendort tốc ñộ lớn ðức Máy khuấy từ (IKA RH basic 2) Khuấy ñều hóa chất, mẫu ðức

Máy voltex (Maxit mix II) Làm ñều mẫu nghiên cứu, hóa chất Mỹ

Nồi hấp ALP Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy

Tủ nuôi cấy (Orbital incubator

Máy quang phổ (UV 1800) Xác ñịnh ñộ hấp thụ quang của mẫu Nhật Máy ño pH (Thermo Scientific) Xác ñịnh pH của mẫu hóa chất Singapore

Tủ cấy Air stream CESCO Cấy vi sinh vật vào môi trường Singapore

Hóa chất Mục ñích sử dụng Xuất xứ

NaH2PO4 Pha dd ñệm sodium phosphate Trung Quốc Coloidal chitin Cơ chất của endochitinase Việt Nam pNP-NPG Cơ chất của N-acetyl-β-D-

hexosaminidase

Mỹ

acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) Pha dd nhuộm màu ñường khử Trung Quốc

Pha dung dịch chuẩn ñộ pH

Trung Quốc

KNa tartate.4H2O

(C4H4KNa.4H2O)

Pha dd nhuộm màu ñường khử Trung Quốc

Na-disulfit (Na2S2O5) Pha dd nhuộm màu ñường khử Trung Quốc

Ethanol 99.5% Pha dd thuốc nhuộm protein Trung Quốc Acid phosphoric Pha dd thuốc nhuộm protein Trung Quốc Coomasie brilliant blue Pha dd thuốc nhuộm protein Trung Quốc

Albumin Xây dựng ñường chuẩn protein Trung Quốc Acid acetic Pha ñệm Britton-Robinson Trung Quốc Acid boric Pha ñệm Britton-Robinson Trung Quốc Ampicillin Bổ sung vào môi trường nuôi cấy ðức

Và một số dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm: Micropipette, bình tam giác, ống ñong, cốc ñong, ống nghiệm, ống falcon, ống eppendorf, ñèn cồn

* Môi trường LB nuôi cấy hai chủng E.coli tái tổ hợp

Môi trường LB lỏng (g/l):

Cao nấm men: 10 Pepton: 5 NaCl: 5

Nước cất vừa ñủ - 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121οC/15 phút

* Dung dịch ñệm sodium phosphat 0,05M, pH 6: Trộn 87,7 ml dung dịch

NaH2PO4 0,05M với 12,3 ml dung dịch Na2HPO4 0,05M, thêm 100ml nước cất, ño lại pH bằng máy ño pH [2]

* Dung dịch DNS: Cân 10 g 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), cho vào cốc

1000ml, thêm khoảng 400ml nước cất, ñặt cốc lên máy khuấy từ Thêm dung dịch NaOH (16 g NaOH trong 150ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, duy trì khuấy

ở 60 0C Tiếp tục thêm 300 g muối K-Na tactrat vào cốc, sau ñó thêm 2 g phenol, tiếp tục khuấy ñến khi dung dịch ñồng nhất hoàn toàn Làm lạnh dung dịch DNS ñến nhiệt ñộ phòng Chuyển dung dịch vào bình ñịnh mức 1000ml, thêm nước cất ñến vạch và lắc ñều Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp [2]

* Dung dịch ñệm Britton-Robinson: Pha 300 ml dung dịch ñệm Britton-Robinson

gồm: 100 ml dung dịch H3BO3 0,04 M, 100 ml dung dịch CH3COOH 0,04 M, 100 ml dung dịch H3PO4 0,04 M ðiều chỉnh pH của dung dịch từ pH 2 ñến pH10 bằng dung dịch NaOH 1M [33]

* Hóa chất dùng trong chạy ñiện di SDS-PAGE

Dung dịch A: ðệm Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8

Dung dịch B: ðệm Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8

Dung dịch C: Acrylamide 30%, bis-acrylamide 0,8%

Dung dịch APS: Ammonium persulfate 10%

Dung dịch nhuộm PAGE: Coomassie brilliant blue 0,1%, methanol 30% (v/v),

acid acetic 10%

Dung dịch tẩy PAGE: Methanol 30% (v/v), acid acetic 10% (v/v)

ðệm ñiện di protein: Tris-HCl 20 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%, pH 8,8

ðệm 5x tra mẫu protein: Brommophenol blue 0,05%, glycerol 50% pha trong

ñệm Tris-HCl 1 M, pH 6,8

3.2 Nội dung nghiên cứu

ðể thực hiện ñược mục tiêu của ñề tài ñặt ra, trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện những nội dung chính sau:

- Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái tổ hợp và xác ñịnh mức ñộ biểu hiện của gen

mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase

- Tinh sạch và xác ñịnh hoạt tính riêng của endochitinase và hexosaminidase tái tổ hợp

β Nghiên cứu một số ñặc tính thủy phân colloidal chitin của endochitinase và thủy phân pNP-N-acetyl-glucosaminide của β-hexosaminidase:

+ Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của endochitinase và hexosaminidase: Nhiệt ñộ tối ưu, ñộ bền nhiệt

β-+ Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của endochitinase và β-hexosaminidase:

pH tối ưu, ñộ bền pH

- Phân tích thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm thủy phân

- Dựa trên các kết quả ñạt ñược chúng tôi bước ñầu ñề xuất quy trình sản

xuất GlcNAc sử dụng hai enzyme tái tổ hợp endochitinase và β-hexosaminidase

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nuôi cấy thu sinh khối tế bào

Nuôi cấy thu sinh khối tế bào thu sinh khối theo phương pháp của Nguyễn và

cộng sự (2012) 02 chủng tái tổ hợp E.coli chứa gene mã hóa cho endochitinase và

β-hexosaminidase ñược nuôi cấy trong môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh ampicilin với nồng ñộ cuối cùng trong môi trường nuôi cấy là 100µg/ml

ðầu tiên, chủng vi sinh vật E.coli ñược hoạt hóa trong môi trường LB có bổ

sung ampicillin 100µg/ml ở 37oC trong 16 giờ, sau ñó 1% dịch vi khuẩn ñã hoạt hóa ñược ñưa vào các bình tam giác có thể tích 1000 ml có chứa 250ml LB + Ampicillin 100µg/ml, tế bào ñược nuôi ở 37oC, lắc 150 rpm Khi giá trị OD ñạt khoảng 0,4- 0,5, tiến hành bổ sung chất cảm ứng IPTG vào môi trường nuôi cấy với nồng ñộ cuối cùng là 0,4 mM ðể cảm ứng gene biểu hiện enzyme, tế bào tiếp tục ñược nuôi

ở 4oC trong 15 phút ñể thu sinh khối tế bào, rửa sinh khối 2 lần bằng ñệm sodium phosphate 50 mM, pH 6 (50 mM NaH2PO4, pH 6) Sinh khối tế bào ñược dùng ñể phá vỡ, kiểm tra hoạt tính và tinh sạch enzyme, hoặc bảo quản ở -200C cho các lần

sử dụng tiếp theo [32] [33]

3.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện gene mã hóa cho endochitinase và hexosaminidase bằng phương pháp ñiện di SDS-PAGE

β Nguyên tắc: Gel polyacrylamide ñược sử dụng ñể ñiện di protein với nồng ñộ

12,5% theo phương pháp ñiện di biến tính Nguyên lý của phương pháp là các phân tử protein trong môi trường có SDS bị duỗi thẳng và tích ñiện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong ñiện trường với tốc ñộ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng

- Tiến hành: Bản gel ñược ñổ hai lớp, lớp dưới là lớp gel tách ñược ñổ cách

mặt trên 1,5 cm, ñể ñông trong 30 phút, ñổ tiếp lớp gel cô ở trên rồi cài lược, ñể 30 phút cho gel ñông hoàn toàn và ổn ñịnh Thành phần gel ñược mô tả trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Thành phần gel cô và gel tách

Bản ñiện di ñược lắp vào hệ thống ñiện di và chạy với cường ñộ dòng ñiện

20 mA cho lớp gel cô và 30 mA cho lớp gel tách trong khoảng 2 giờ Sau ñiện di bản gel ñược tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ và bản gel ñược tẩy bằng dung dịch tẩy Các protein xuất hiện các vạch băng

ðể xác ñịnh mức ñộ biểu hiện gene mã hóa cho enzyme endochitinase và hexosaminidase chúng tôi tiến hành ñịnh tính khả năng sinh enzyme của các chủng

β-vi khuẩn E.coli tái tổ hợp bằng phương pháp quan sát ñộ ñậm của các vạch protein

sau khi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue [34]

3.3.3 Tinh sạch enzyme bằng hệ thống sắc ký lỏng FPLC

3.3.3.1 Nguyên tắc

Trong phương pháp này các chất mang trên cột chứa các nhóm hoá học có ái lực ñặc biệt với sản phẩm Vì vậy khi cho một hỗn hợp các chất trong ñó có chứa sản phẩm ñi qua cột, sản phẩm mục tiêu ñược gắn một cách chuyên biệt vào chất mang và tất cả các thành phần khác không có ái lực với chất mang sẽ ñi qua cột nhờ một ñệm rửa Sau ñó, sản phẩm sẽ ñược thu nhờ dung dịch ñẩy [16]

3.3.3.2 Tiến hành

Cột his-tag (dung tích cột V = 5 ml), rửa bằng nước cất 2 lần ñể loại cồn Cân

bằng cột bằng dung dịch ñệm gắn kết (binding buffer) với tốc ñộ dòng là 0,5 ml/phút Tiến hành bơm mẫu V = 5 ml với tốc ñộ dòng 0,3 ml/ phút vào cột Sau khi mẫu ñược nạp vào cột hết thì tiếp tục chạy ñệm elution loại bỏ tạp chất (protein tạp, DNA, RNA ) Tiến hành ñẩy phần protein bám ra khỏi cột bằng dung dịch gradient NaCl 1M Dịch ra khỏi cột ñược thu 5 ml/ñoạn, tốc ñộ dòng 1ml/phút

Sinh khối tế bào ñược hòa trong 25 ml ñệm NaH2PO4 50 mM, pH 6, sau ñó phá vỡ tế bào bằng máy siêu âm (sonicator) chu kì 1 phút/lần phá và phá trong 3 lần, giữa mỗi lần nghỉ 30s, trong suốt quá trình dịch enzyme ñược ñặt trong ñá ñể tránh sự biến tính protein do nhiệt Dịch thu ñược ñem ly tâm 16000 rpm ở 4oC trong 30 phút ñể loại xác tế bào và thu dịch enzyme thô

Chúng tôi tiến hành tinh sạch endochitinase bằng sắc ký trên hệ thống sắc ký lỏng FPLC Sử dụng cột his-tag 5 ml Trước khi tinh sạch cột his-tag ñược rửa 2 lần bằng H2O lần ñể loại bỏ cồn Cân bằng cột bằng dung dịch ñệm Na2HPO4 50 mM, pH

6 với tốc ñộ dòng là 0,5 ml/phút Tiến hành bơm mẫu V = 5 ml với tốc ñộ dòng 0,3 ml/phút vào cột Sau khi mẫu ñược nạp vào cột hết thì tiếp tục chạy ñệm NaH2PO4 50

mM, pH 6 loại bỏ tạp chất (protein tạp, DNA, RNA ) Tiến hành ñẩy phần protein

cột ñược thu 5 ml/ñoạn, tốc ñộ dòng 1ml/phút Enzyme sau khi tinh sạch ñược lọc qua màng lọc protein ñể loại imidazol và hòa tan trong ñệm NaH2PO4 50 mM, pH 6 với thể tích 5 ml ñể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo [32], [33]

3.3.4 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4

Enzyme endochitinase và β-hexosaminnidase ñược tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4 Ưu ñiểm của phương pháp này là (NH4)2SO4 là một muối trung tính, các muối trung tính vừa làm trung hòa ñiện (do các ion tác ñộng tương hỗ với các nhóm ñiện tích trái dấu) vừa loại bỏ lớp vỏ hydrate của phân tử keo làm các phân tử protein kết tụ lại (NH4)2SO4 có tác dụng làm bền hầu hết các loại protein enzyme Nồng ñộ (NH4)2SO4 bão hòa cần thiết ñể kết tủa protein enzyme khác nhau cho hiệu quả kết tủa khác nhau [47]

Sinh khối tế bào ñược hòa trong 25 ml ñệm NaH2PO4 50 mM, pH 6, sau ñó phá vỡ tế bào bằng máy siêu âm (sonicator) chu kì 1 phút/lần phá và phá trong 3 lần, giữa mỗi lần nghỉ 30s, trong suốt quá trình dịch enzyme ñược ñặt trong ñá ñể tránh sự biến tính protein do nhiệt Dịch thu ñược ñem ly tâm 6000 rpm ở 4oC trong

20 phút ñể loại xác tế bào và thu dịch enzyme thô

Chúng tôi tiến hành tinh sạch endochitinase bằng muối (NH4)2SO4 bão hòa 40%, 50%, 60%, 70% và 80% Sau ñó ñể dịch enzyme trong tủ lạnh trong 3 giờ rồi

li tâm thu kết tủa (6000 rpm ở 4oC trong 30 phút) Enzyme sau khi tinh sạch ñược lọc qua màng lọc protein ñể loại muối (NH4)2SO4 và hòa tan trong ñệm NaH2PO4 50 mM,

pH 6 với thể tích 5 ml ñể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

3.3.5 Phương pháp tạo cơ chất colloidal chitin

Colloidal chitin ñược tạo từ nguồn chitin thương mại theo phương pháp ñược

mô tả bởi Nguyễn và cộng sự (2011) Cho 2 gam bột chitin từ từ vào 100 ml dung dịch HCl ñậm ñặc (khoảng 36,5%) ñã ñược làm lạnh và khuấy nhanh trong 18 giờ ở ñiều kiện 4 0C Cho vào hỗn hợp trên 200 ml cồn 960 lạnh, khuấy nhanh ở 4 0C trong 24 giờ Ly tâm 5500 v/phút, ở 4 0C, 20 phút ñể thu kết tủa Kết tủa ñược rửa với nước cất nhiều lần ñến pH= 7; mất nhiều thời gian ñể thực hiện việc này, nên có thể dùng sodium acetate1M ñể trung hòa về pH =6 Hòa tan kết tủa bằng nước cất, lắc mạnh (dùng máy Votex), sau ñó li tâm lại 2 lần, lấy cặn Xác ñịnh trọng lượng

của kết tủa, bổ sung nước vào ñể hòa tan kết tủa Sau ñó chia ñều ra các ống nghiệm

2 ml Ly tâm thu kết tủa, cân lại trọng lượng của kết tủa và bảo quản ở 4 0C cho các lần dùng tiếp theo [32]

3.3.6 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính endochitinase

3.3.6.1 Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng thủy phân chitin bởi chitinase thành GlcNAc và N-acetyl-chitooligosaccharide (ñường khử) ðường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ khử thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) thành acid 3-amino-5-nitrisalicylic màu ñỏ da cam

Cường ñộ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với ñộ hấp thụ quang (Abs) tại bước sóng 540nm và tỉ lệ thuận với lượng ñường khử trong mẫu Dựa vào ñồ thị chuẩn với nồng ñộ của GlcNAc tinh khiết và ∆Abs ở 540nm sẽ tính ñược lượng ñường khử của mẫu nghiên cứu, qua ñó xác ñịnh ñược hoạt tính của enzyme chitinase [32]

3.3.6.2 Xác ñịnh hoạt tính của enzyme endochitinase

Xác ñịnh hoạt tính của endochitinase theo phương phương pháp của Nguyễn

và cộng sự (2011) ðể xác ñịnh hoạt tính của endochitinase, sử dụng 350 µl enzyme tinh sạch (hoặc enzyme thô) cùng với 350 µl dịch colloidal chitin 2% pha trong ñệm NaH2PO4 50 mM pH 6, ủ ở 37°C lắc 600 rpm trong 30 phút Sau ñó dừng phản ứng bằng ñặt trong nồi cách thủy 100 0C trong 10 phút Ly tâm 4000 rpm, 10 phút thu 500

µl dịch trong, nhuộm màu bằng 500 µl thuốc nhuộm DNS, ñể nguội và ño OD ở bước sóng 540 nm Ống ñối chứng gồm 350 µl dịch colloidal chitin 2%, dung dịch ñệm ñược thay cho enzyme [32]

3.3.6.3 ðịnh nghĩa ñơn vị hoạt tính của enzyme

ðơn vị hoạt tính ñược ñịnh nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1 µmol cơ chất colloidal chitin 2% trong thời gian 1 phút ở ñiều kiện thích hợp (U/ml) [32]

Công thức tính hoạt tính endochitinase:

× k

ml

U

Hoạt tính endochitinase

Abs540 ðộ hấp thụ quang của mẫu ñường khử sinh ra khi nhuộm DNS

Absblank ðộ hấp thụ quang mẫu ñối chứng khi nhuộm DNS

V1 Thể tích chitin huyền phù (µl)

V2 Thể tích enzyme sử dụng (µl)

Slope Hệ số góc của ñường chuẩn GlcNAc

t Thời gian phản ứng enzyme cơ chất (phút)

β-∆Abs ở 400nm sẽ tính ñược lượng ñường khử của mẫu nghiên cứu, qua ñó xác ñịnh ñược hoạt tính của β-hexosaminidase [33]

bằng cách thêm vào 750µl Na2CO3 0,4M Dung dịch ñược ño ñộ hấp thụ quang sau khoảng 3 phút ở bước sóng 400nm ñể xác ñịnh hoạt tính [33]

3.3.7.3 ðịnh nghĩa ñơn vị hoạt tính của β-hexosaminidase

ðịnh nghĩa ñơn vị hoạt tính của β-hexosaminidase và công thức tính hoạt

tính ñược mô tả tương tự như mục 3.3.6.3 Thay vì ño OD ở bước sóng 540nm

3.3.8.2 Xác ñịnh nồng ñộ protein theo phương pháp Braford

Việc xác ñịnh nồng ñộ protein của mẫu thí nghiệm ñược thực hiện như sau: Ống ñối chứng: 1ml dung dịch ñệm, thêm 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein, trộn ñều

Ống thí nghiệm: 1ml dung dịch protein ñã pha loãng ở tỉ lệ thích hợp, thêm 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein, trộn ñều

ðo màu ở bước sóng 595(nm) cho ñến khi thu ñược kết quả nằm trong khoảng của ñường chuẩn protein

3.3.9 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích và ñộ bền nhiệt của endochitinase và hexosaminidase

β-Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích và ñộ bền nhiệt của enzyme theo phương pháp của Nguyễn và cộng sự (2012)

3.3.9.1 Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích của endochitinase và β-hexosaminidase

- Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích của endochitinase bằng cách cho enzyme này tác dụng với cơ chất colloidal chitin 2% pha trong ñệm NaH2PO4, pH 6 ở các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau (30 0C, 37 0C, 45 0C, 50 0C, 55 0C, 60 0C, 70 0C) rồi xác

- Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích của β-hexosaminidase bằng cách cho enzyme này tác dụng với cơ chất pNP-GlcNAc 10mM pha trong ñệm NaH2PO4, pH 6 ở các ñiều kiện nhiệt ñộ khác nhau (30 0C, 37 0C, 45 0C, 50 0C, 55 0C, 60 0C, 70 0C) rồi xác ñịnh hoạt ñộ của β-hexosaminidase

3.3.9.2 Xác ñịnh ñộ bền nhiệt của endochitinase và β-hexosaminidase

ðể xác ñịnh ñộ bền nhiệt của endochitinase và β-hexosaminidase, các enzyme này ñược ủ ở các nhiệt ñộ khác nhau (30 0C, 37 0C, 45 0C, 50 0C, 55 0C,

60 0C, 70 0C) Tại các thời gian ủ khác nhau, enzyme ñược lấy ra ñể xác ñịnh hoạt tính

3.3.10 Xác ñịnh pH tối thích và ñộ bền pH của endochitinase và hexosaminidase

β-Xác ñịnh pH tối thích và ñộ bền pH của enzyme theo phương pháp của Nguyễn và cộng sự (2012)

3.3.10.1 Xác ñịnh pH tối thích của endochitinase và β-hexosaminidase

Xác ñịnh pH thích hợp cho hoạt ñộng của endochitinase và β-hexosaminidase bằng cách cho các enzyme này tác dụng với cơ chất ñược pha ở các ñiều kiện pH khác nhau (pH 4, pH 4,5, pH 5, pH 5,5, pH 6, pH 6,5, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10) rồi xác ñịnh hoạt tính của enzyme

3.3.10.2 Xác ñịnh ñộ bền pH của endochitinase và β-hexosaminidase

ðể xác ñịnh ñộ bền pH của endochitinase và β-hexosaminidase, ủ các enzyme này ở các pH khác nhau Tại các thời gian ủ khác nhau, enzyme ñược lấy ra ñể xác ñịnh hoạt tính

3.3.11 Xác ñịnh sản phẩm thủy phân bằng sắc ký bản mỏng TLC

3.3.11.1 Nguyên tắc

Sắc ký bản mỏng là một bản mỏng có tráng một lớp pha tĩnh rắn thường là silicagel hay aluminium oxide, pha ñộng là một dung môi hay một hỗn hợp các dung môi hữu cơ Hệ sắc ký bản mỏng là một bản mỏng ñặt trong một dung môi pha ñộng, cả pha ñộng và pha tĩnh ñặt trong một hộp kín ñể hơi dung môi bão hòa Dịch mẫu ñược chấm lên bản mỏng sau ñó ñược ñặt trong pha ñộng, phần mẫu nằm gần dung môi hơn và lượng dung môi phải vừa phải ñể phần bản mỏng chứa mẫu