Xác định và đặc trưng phân tử của một số virus thuộc chi begomovirus (họ geminiviridae)

Xác định và đặc trưng phân tử của một số virus thuộc chi begomovirus (họ geminiviridae)

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới, các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những người đã tạo

điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực

hiện đề tài tốt nghiệp này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 5 tháng 8 năm 2010

Sinh viên

Trần Ngọc Tiệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG .v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

TÓM TẮT viii

Phần I MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 Đặc điểm của họ Geminiviridae 3

2 Đặc điểm của chi Begomovirus 3

2.1 Lịch sử phát hiện, phân bố và đa dạng của Begomovirus 3

2.2 Phân loại chi Begomovirus 4

2.3 Triệu chứng bệnh do Begomovirus gây ra 6

2.4 Vector truyền bệnh và sự lan truyền Begomovirus 7

2.5 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra 8

2.6 Biện pháp phòng trừ 9

2.7 Đặc điểm hình thái và cấu trúc bộ gen của Begomovirus 10

2.7.1 Hình thái của Begomovirus 10

2.7.2 Cấu trúc DNA-A 11

2.7.3 Cấu trúc DNA-B 12

2.7.4 Đặc điểm của vùng IR 13

2.7.5 Cấu trúc của DNA-β 13

2.7.6 Cấu trúc của Nanovirus-like DNA-1 15

2.8 Quá trình tái bản của Begomovirus 16

2.9 Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus 16

Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

3.1 Đối tượng, vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 19

3.1.4 Thời gian nghiên cứu 19

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Tiến hành thu mẫu nghiên cứu 19

3.2.2 Chiết tách DNA tổng số từ mẫu mô thực vật 19

3.2.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phNm PCR 20

3.2.4 Phương pháp tinh chiết sản phNm PCR 20

3.2.5 Nhân dòng bằng InsTAclone™ PCR Cloning Kit (của Fermentas) 20

3.2.6 Tinh chiết plasmid 21

3.2.7 Phương pháp giải trình tự Gen 21

3.2.8 Phương pháp và phần mềm phân tích chuỗi DNA 21

Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Nhân dòng và giải trình tự toàn bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 22

4.1.1 Thiết kế mồi nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus 22

4.1.2 Nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus bằng PCR 24

4.1.3 Nhân dòng bộ gen của 3 mẫu virus trong vi khuNn E.coli 25

4.1.4 Kiểm tra kết quả biến nạp vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn 26

4.1.5 Kết quả giải trình tự gen 28

4.2 Đặc trưng phân tử của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 30

4.2.1 Tổ chức bộ gen 30

4.2.2 Phân tích các motif chức năng trên bộ gen của 3 mẫu virus 33

4.2.2.1 Phân tích vùng liên gen IR của 3 mẫu virus 33

4.2.2.2 Phân tích protein Rep của 3 mẫu virus 35

4.2.2.3 Phân tích protein CP của 3 mẫu virus 37

4.2.3 So sánh trình tự và phân tích phả hệ của 3 mẫu virus 40

4.2.3.1 Tìm kiếm chuỗi tương đồng trên GenBank 40

4.2.3.2 So sánh trình tự 3 virus với các begomovirus đã công bố 40

4.2.3.3 So sánh iteron và IRD của 3 virus với các begomovirus đã công bố 44

4.2.3.4 Phân tích phả hệ 46

4.2.3.5 Phân tích tái tổ hợp 49

4.2.4 Phân loại 3 mẫu virus Dudu31, Cachua89, Cachua100 52

4.2.4.1 Hai mẫu Dudu31 và Cachua89 52

4.2.4.2 Mẫu Cachua100 53

4.3 Phát hiện các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua trên đồng ruộng 55

4.3.1 Thu thập và xử lý mẫu 55

4.3.2 Xác định begomovirus bằng PCR và giải trình tự 56

4.3.2.1 Kiểm tra sự có mặt của begomovirus bằng cặp mồi chung (degenerate primers) 56

4.3.2.2 Kiểm tra sự có mặt của ToLCVV và TYLCVNV bằng mồi đặc hiệu 56

Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Nguồn gốc 3 mẫu virus được nghiên cứu trong báo cáo này 22

Bảng 4.2: Các mồi liền kề nhân toàn bộ bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 23

Bảng 4.3 Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI và E.coRI 27

Bảng 4.4 Đặc điểm bộ gen của 3 mẫu begomovirus 31

Bảng 4.5: Virus được công bố sẵn có trên GenBank gần gũi nhất với 3 mẫu virus .40

Bảng 4.6 So sánh trình tự của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với một số begomovirus 41

Bảng 4.7: So sánh iteron và IRD của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với một số begomovirus 45

Bảng 4.8 Các virus sẵn có trên GenBank dùng trong phân tích phả hệ 47

Bảng 4.9 Mức đồng nhất nucleotide (%) tại các đoạn tái tổ hợp của Cachua100 51

Bảng 4.10 Các begomovirus hại cây trồng được phát hiện cho tới nay tại Việt Nam 54

Bảng 4.11 Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, TYLCVNV và ToLCVV trên các mẫu cà chua 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên cà chua 7

Hình 2.2 Hình thái của Begomovirus 10

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus 12

Hình 3.1: Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1………18

Hình 4.1 Vùng bảo thủ dùng để thiết kế mồi chung liền kề nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus Dudu31, Cachua 89 và Cachua100 Vùng thiết kế mồi được bôi đen 23

Hình 4.2 Vị trí tương đối của cặp mồi chung liền kề Hai50F/Hai50R trên bộ gen của begomovirus 24

Hình 4.3 PCR nhân toàn bộ DNA-A của ba mẫu virus .24

Hình 4.4 Các mẫu vi khuN n XL1-blue biến nạp được cấy trải và ủ qua đêm trên môi trường chọn lọc trắng xanh .26

Hình 4.5: Kết quả điện di sản phN m miniprep đã được cắt bằng BamHI và E.coRI 28

Hình 4.6: Sơ đồ giải trình tự bộ gen của 3 mẫu virus được dòng hóa trên vector pTZ57R/T 29

Hình 4.7: Tổ chức bộ gen của 3 mẫu virus .32

Hình 4.8 (A) Sơ đồ vùng ori của begomovirus (Fontes và cộng sự, 1994)……… 34

Hình 4.9.(A) Sơ đồ các vùng chức năng của begomovirus (Hanley-Bowdoin và cộng sự, 1999)……… 36

Hình 4.10 Protein CP của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với các motif hoặc gốc aa chủ chốt liên quan đến các chức năng lắp ráp virion, lan truyền qua vector và nhập nhân được in màu và đánh dấu 39

Hình 4.11: Cây phả hệ dựa trên toàn bộ bộ gen của begomovirus……….48

Hình 4.12 Nguồn gốc tái tổ hợp của ToLCHV theo Zhang và cộng sự (2010) 50

Hình 4.13: Tái tổ hợp của Cachua100 .51

Hình 4.14: Triệu chứng của các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá 55

Hình 4.15 Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, ToLCVVV và TYLCVNV trên 8 mẫu cà chua 57

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

TYLCD Tomato yellow leaf curl disease

TYLCV Tomato yellow leaf curl virus

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nhân dòng và giải trình tự toàn bộ bộ gen của 3 mẫu begomovirus, được cho là chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây đu đủ và cà chua, đã được Lê Văn Hải phân lập năm 2009 Kết quả là toàn bộ bộ

gen của 3 mẫu begomovirus đã được nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng

XL1-Blue Chúng tôi cũng đã giải trình tự và thu được toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus với kích thước khoảng 2.7 kb

Tiến hành so sánh trình tự thu được, phân tích các đặc trưng phân tử của bộ gen, phân tích tái tổ hợp và phả hệ đã chứng minh 2 mẫu virus Dudu31 và Cachua89 là thành

viên của loài Tomato leaf curl Hainan virus mới được phát hiện gần đây (năm 2010) từ

Trung Quốc Những phân tích và phả hệ cũng cho thấy mẫu virus Cachua100 là một virus

thuộc một loài mới của chi Begomovirus Virus này được chúng tôi đặt tên là Tomato leaf

curl Hanoi virus (ToLCHanV)

Chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra 8 mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thu thập tại Thanh Hóa và Bắc Ninh bằng PCR thấy tất cả chúng đều nhiễm begommovirus Dùng mồi đặc hiệu để kiểm tra PCR thấy 5/8 mẫu nhiễm Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), 3/8 mẫu nhiễm Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), trong đó

có 1 mẫu nhiễm hỗn hợp cả 2 virus Giải trình tự trực tiếp một mẫu (thu tại Thanh Hóa) nhiễm begomovirus nhưng PCR âm tính với ToLCVV và TYLCVNV thấy mẫu này có thể nhiễm ToLCHV

Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua khá phức tạp Bệnh được xem là một

bệnh phức, có nghĩa là một bệnh nhưng do nhiều loài virus thuộc chi Begomovirus, họ

Geminiviridae gây ra (Moriones và Navas-Castillo, 2000) Các begomovirus có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chuỳ) và có bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,6 - 2,8 kb (Stanley và cộng sự, 2005) Các begomovirus không truyền qua hạt

giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Pico và cộng sự, 1996)

Có khoảng 40 loài begomovirus hại cà chua đã được công bố trên thế giới (Stanley

và cộng sự, 2005) Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể biết được dựa vào các phân tích phân tử (Moriones và Navas-Castillo, 2000)

Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100 % Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80 Một số nghiên cứu về tạo kháng huyết thanh chN n đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiện trong thời gian này nhưng bản chất thật sự của virus vẫn chưa rõ Gần đây, dựa vào các phân tích phân tử, có

ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam gồm

Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) (Green và cộng sự, 2001), Tomato yellow leaf

curl Vietnam virus (TYLCVNV) (Ha và cộng sự, 2008) và Tomato yellow leaf curl

Kanchanaburi (TYLCKaV) (Ha và cộng sự, 2008) Trong số 3 loài trên, 2 loài được phân lập trên mẫu cà chua bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVV và TLCVNV

Cũng dựa trên các phân tích phân tử, Việt Nam dường như là trung tâm đa dạng

của các begomovirus (Ha va cộng sự, 2006, 2008) Mặc dù vậy số lượng loài begomovirus xác định được trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó nhiều loài là cây dại (Green và cộng sự, 2001; Revill

và cộng sự, 2003, 2004; Ha và cộng sự, 2006, 2008)

Năm 2009, Lê Văn Hải phân lập được 3 begomovirus chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây đu đủ và cà chua Tuy nhiên các phát hiện trên chỉ được xác định dựa trên việc giải trình tự một đoạn của DNA-A với chiều dài 819 nts Việc xác đinh

rõ danh tính của các loài virus trên chỉ được kết luận khi giải trình tự toàn bộ DNA-A Kết quả trên cũng gợi ý rằng nhiều loài begomovirus nữa đang gây hại trên cà chua và các cây trồng khác ở Việt Nam và cần phải được xác định

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xác định và đặc trưng phân tử của một số virus thuộc chi Begomovirus (họ

- Thiết kế mồi để giải trình tự toàn bộ DNA-A của một số mẫu begomovirus

- PCR để nhân toàn bộ DNA-A

- Nhân dòng sản phN m PCR trong vector nhân dòng

- Giải trình tự sản phN m nhân dòng

- Phân tích trình tự có được sau khi giải trình tự

- Thu mẫu và xử lý mẫu bệnh virus với triệu chứng điển hình do nhóm begomovirus gây ra trên cây cà chua

- Xác định sự có mặt của các begomovirus bằng PCR dùng mồi chung DNA-A BegoAFor1 & BegoAReV1

- Xác định thành phần loài đã tìm ra ở miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) và TYLCVNV (TYLCVNV-sp-F1 & TYLCVNV-sp-R1)

- Giải trình tự sản phN m PCR của một số begomovirus gây bệnh trên cây trồng

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Đặc điểm của họ Geminiviridae

Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất với 209 thành viên đã được xác định

(Fauquet và Stanley, 2005) Các Geminivirus đặc trưng bởi bộ gen DNA vòng đơn

(ssDNA) dài khoảng 2.7 kb và được gói trong hạt cầu kép 20 mặt Geminivirus có thể có

bộ gen đơn với một phân tử DNA, hoặc bộ gen kép chứa hai phân tử DNA (Stanley và cộng sự, 2005) Geminivirus gây ra nhiều bệnh gây thiệt hại về kinh tế lớn trên cả cây một

lá mầm và hai lá mầm trong đó có các cây trồng quan trọng như cây sắn, cây bông, cây đậu và cà chua

Các geminivirus được phân thành bốn nhóm, mastrevirus, curtovirus, begomovirus

và topocuvirus dựa trên cấu trúc genome, phổ ký chủ và vector truyền bệnh Các

geminivirus khác nhau về tổ chức genome, phản ánh sự đa dạng của các geminivirus Tuy nhiên, các geminivirus các đặc trưng chung sau:

- Các gen đều được mã hóa trên cả hai sợi DNA của virus

- Dịch mã xảy ra theo hai hướng ngược chiều nhau

- Tồn tại một vùng liên gen (intergenic region – IGR) giữa ORF đầu tiên của sợi DNA virus và sợi bổ sung Trình tự nonanucleotide (TAATATTAC) trong IGR là bảo thủ ở các phân nhóm của geminvirus và nằm ở cấu trúc thòng lọng (loop region)

- Gen mã hóa protein vỏ - CP nằm trên sợi virus và protein tái bản (repliacation protein) được mã hóa trên sợi bổ sung (Lazarowitz, 1992)

2 Đặc điểm của chi Begomovirus

2.1 Lịch sử phát hiện, phân bố và đa dạng của Begomovirus

Một vài giả thuyết đã được đề xuất về nguồn gốc của begomovirus có bộ gen đơn

như TYLCV Phân tích các trình tự của tất cả các TYLCV đã gợi ý rằng các chủng phân

lập từ Israel và Iran có thể có bộ gen khảm (chimeric genomes) xuất hiện do tái tổ hợp giữa tổ tiên của virus TYLCD và ToLCD, cả hai bệnh này có nguồn gốc từ các nước

Trung Đông (NavasCastillo và cộng sự, 2000) Các begomovirus gây bệnh TLCD có mối quan hệ chặt chẽ hơn trong khi các begomovirus gây ToLCD đa dạng hơn (Varma và Malathi, 2003)

TYLCD được ghi nhận đầu tiên trên thế giới từ những năm 1939-1940 tại Israel và

sự xuất hiện của bệnh xảy ra đồng thời với sự tăng quần thể bọ phấn Cuối thập niên 80,

có những báo cáo đầu tiên về TYLCD ở châu Mỹ và châu Âu (Accotto và cộng sự, 2000) Gần đây, bệnh còn lan truyền tới phía tây Địa Trung Hải (Ý), Nhật, Iran và các nước cộng hoà nằm trong khu vực Châu Á thuộc Liên Xô cũ như Azerbaidan, Turmenistan, Uzbekistan

Ngày nay, với sự trợ giúp của các ngành công nghệ mới số lượng begomovirus được xác định khắp nơi trên thế giới ngày càng nhiều Số lượng begomovirus đã được xác định không ngừng gia tăng loài từ 185 loài năm 2005 (Fauques và Stanley, 2005) và 266 loài năm 2008 (Fauquet và cộng sự, 2008C)

Tại Việt Nam, bệnh do begomovirus cụ thể là bệnh xoăn vàng lá cà chua được phát hiện lần đầu tiên năm 1970 Bệnh phát sinh và gây hại hầu hết ở các vùng trong cả nước như: Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hải Phòng… (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001)

Hiện nay, dựa vào phân tích phân tử đã phát hiện được 19 loài begomovirus ở Việt

Nam Tuy nhiên chỉ có 5 loài là được phát hiện trên cây trồng là: Tomato leaf curl Việt

Nam virus (ToLCVV) (Green và cộng sự, 2001); Papaya leaf curl China virus (PaLCuCNV) trên cây thuốc lá; Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKV) trên cây cà chua, cà pháo; Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (ToLCVNV) trên cây cà chua; ( Hà Viết Cường và cộng sự, 2008); Tomato leaf curl Dan Xa virus (ToLCDXV)

trên cây cà chua (Badwil và cộng sự, 2008)

2.2 Phân loại chi Begomovirus

Nghiên cứu hệ thống phát sinh có thể chia begomovirus ra làm hai nhóm chính là nhóm tân thế giới (New world) bao gồm khu bao gồm Châu Mỹ và nhóm cựu thế giới

(Old world) là khu vực bán cầu đông bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam và cộng sự, 1999; Rybicky, 1994)

Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki, 1994; Stanley và cộng sự, 2005) Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này không có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison và cộng sự, 2005)

Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế

Gần đây dựa trên phân tích hệ thống phát sinh phát hiện ra rằng CoYVV ở Việt Nam không có ORF AV2 và có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong protein vỏ (CP), virus này giống với cụm Tân thế giới hơn là cụm Cựu thế giới Sự có mặt của CoYVV ở Việt Nam đã đưa ra giả thuyết rằng virus giống với cụm Tân thế giới có thể đã có mặt ở Cựu thế giới trước khi bị phân chia ở kỷ Gondwana (Hà Viết Cường và cộng sự, 2008)

Hiện nay, việc phân loại begomovirus chủ yếu dựa trên so sánh trình tự của chuỗi phân tử DNA-A Theo Fauquet và cộng sự 2008, việc phân loại loài trong chi begomovirus tuân thủ một số tiêu chuN n sau:

- Thành phần của genome có hay không có DNA-B

- Tổ chức bộ gen có hay không có gen AV2

- Mức độ tương đồng khi so sánh trình tự toàn bộ chuỗi DNA-A <89% thì ghi nhận loài mới

- Protein Rep không có khả năng tái bản trans trong thành phần bộ gen thì có thể

ghi nhận loài mới Tuy nhiên cần lưu ý rằng chỉ một thay đổi nhỏ ở vị trí liên kết với Rep

có thể ngăn cản sự tương tác chức năng và sự tái tổ hợp của virus

- Có khả năng là tái tổ hợp giả hay không

- Đặc điểm của protein vỏ Mức độ tương đồng của trình tự aminoacid <90% thì ghi nhận là loài mới, tuy nhiên mức độ tương đồng nucleotide của toàn bộ bộ gen vẫn là cần thiết cho việc xác nhận phân loại virus

- Vật chủ ngoài tự nhiên và kiểu hình của triệu trứng

Tên của các loài virus mới được đặt sử dụng tiêu chuN n được đưa ra ICTV Uỷ ban Phân loại Virus Quốc tế (International Committee on Taxonomy of Viruses) nhóm nghiên

cứu Geminiviridae (Fauquet và cộng sự, 2003)

2.3 Triệu chứng bệnh do Begomovirus gây ra

Một trong những đặc điểm gây bệnh của begomovirus là các bệnh trên một loài cây trồng thường do nhiều loài begomovirus gây ra với triệu chứng không thể phân biệt được Chẳng hạn, trên cà chua, hiện nay có khoảng 40 loài begomovirus gây bệnh xoăn

vàng lá (ngọn) (Stanley và cộng sự, 2005)

Bệnh xoăn vàng lá cà chua xuất hiện triệu chứng trong vòng 2 – 4 tuần sau khi nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng Triệu chứng có thể thay đổi theo điệu kiện môi trường, giai đoạn sinh trưởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm bệnh (Pico và cộng sự, 1996)

Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới và phía trong Về sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân, lá cuốn cong lên phía trên thành hình thìa lìa, lá non biến vàng nhỏ hẹp, giòn và nhỏ hẹp Cuống lá có thể xoắn vặn Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Pico và cộng sự, 1996)

Ở Việt Nam, bệnh trên ruộng cà chua có thể xuất hiện với những triệu chứng hỗn hợp

do nhiều loại virus gây ra, trên một cây có thể có hai loại virus trở lên, có trường hợp 4 – 5 loại virus Trong những ruộng nặng rất khó tìm thấy ở một cây nhiễm riêng một loại virus, tuy vậy thiệt hại nặng nhất vẫn là bệnh xoăn vàng lá cà chua do virus TYLCV (Vũ Triệu Mân

& Lê Lương Tề, 1999)

Dưới đây là một số triệu chứng do Begomovirus gây ra trên cà chua:

Hình 2.1 Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên cà chua

(httpwww.avrdc.org)

2.4 Vector truyền bệnh và sự lan truyền Begomovirus

Bemisia tabaci hay còn gọi là bọ phấn khoai lang được mô tả lần đầu tiên và năm

1889 ở Hy Lạp (Gennadius, 1899) B.tabaci thuộc bộ Hemiptera, họ Aleyrodidae và phân

họ Aleyrodinae Trung tân khởi nguyên của B.tabaci được cho là ở Ấn độ vì số lượng và

mức độ dạng phát hiện được ở đây

Bọ phấn B.tabaci là côn trùng gây hại quan trọng trên nhiều loài cây trồng

B.tabaci là vector truyền bệnh cho 111 loài virus gây ra hơn 114 bệnh trên cây rau và cây lấy sợi (Markham và cộng sự, 1995; Jones, 2003)

Bọ phấn là vector truyền bệnh duy nhất của begomovirus DNA của TYLCV đã được tìm ra sử dụng PCR và bằng phương pháp lai Southern blot trong thế hệ sau của bọ phấn (trứng, bọ phấn tuổi 1 và tuổi 2, trong bọ phấn trưởng thành) của sợi đơn virus trong

bọ phấn, chúng phát triển trên cây cà tím và cây bông (không phải là cây ký chủ) TYLCV có thể truyền qua bọ phấn tối thiểu là hai thế hệ Nếu thiếu đi cây ký chủ thì bọ

phấn chính là nguốn lưu giữ virus giữa hai mùa sản xuất (Murad Ghanim và cộng sự,

1997)

Begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn Bemisia tabaci theo kiểu bền

vững tuần hoàn (Cohen và cộng sự, 1989).Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt

Sau thời gian chích nạp khoảng 1- 2 ngày, virus có thể được duy trì trong cơ thể bọ phấn nhiều tuần (3 tuần đối với TYLCSV) hoặc cả đời như đối với TYLCV (Czosnek cộng sự, 2002)

Bọ phấn cái được chứng minh là vector truyền TYLCV hiệu quả hơn bọ phấn đực 6 lần (Martin, 1987) Trước năm 1998 TYLCV được cho là không truyền qua con cái, chỉ có

bọ phấn trưởng thành và ấu trùng là có virus Tuy nhiên TYLCV-Mld được khẳng định là truyền thông qua trứng ít nhất qua hai thế hệ (Ghanim và cộng sự, 1998) Virus cũng có thể truyền qua giao phối từ bọ phấn đực sang bọ phấn cái và ngược lại (Ghanim và cộng sự, 2000) Một nghiên cứu khác trên chủng TYLCV của Israel cũng cho thấy không có DNA của virus và cũng không nhiễm bệnh khi truyền qua con cái (Bosco và cộng sự, 2004)

2.5 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây

ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones và Navas-Castillo, 2000) Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn (Legg và Fauquet, 2004), bệnh cuốn lá bông (Briddon, 2003) Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua

Bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế giới, đặc biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Pico và cộng sự, 1996)

Ở Trung Quốc, bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua phổ biến và gây hại nghiêm trọng trên những vùng trồng cà chua ở tỉnh Guangdong, Yunnan, Guangxi, Tilin Năm 1998, bệnh đã làm giảm 12% sản lượng cà chua ở hai tỉnh tây nam Trung Quốc là Yunnan, Guangxi (Yin và cộng sự, 2001)

Ở Israel và phía bắc Tây Ban Nha begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua (TYLCVV) còn gây giảm năng suất trên cây đậu (phaseolus vulgaris) (Brun và cộng

sự, 1996)

Năm 1980, Nguyễn Thơ đã nhận xét trên đồng ruộng bệnh virus xoăn vàng lá ngọn gây thiệt hại đến 80 – 90% năng suất Cây cà chua bị bệnh virus xoăn vàng lá ngọn sẽ làm cho hoa và nụ bị rụng nhiều, quả xốp, khô nước phN m chất kém, năng suất thấp (Vũ Văn Hải, 2007)

Theo tác giả Nguyễn Văn Viên (1999) bệnh làm giảm năng suất 37,8% khi nhiễm

ở giai đoạn sau ra hoa và giảm tới 83,2% khi cây nhiễm ở thời kỳ trước ra hoa, thậm chí gây thất thu ở nhiều vùng sản xuất cục bộ

2.6 Biện pháp phòng trừ

Cho tới nay, người ta chưa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên cây cà chua trồng (Lycopersicon esculentum) Tuy nhiên một số gen kháng chống lại begomovirus đã được phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại Như gen Ty1 được phân lập từ cây cà chua dại (Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn toàn (Hà Viết Cường, 2008)

Những năm gần đây công nghệ gen bước đầu được ứng dụng trong việc sản xuất giống kháng bệnh bằng biện pháp bắn gen, chuyển gen Chương trình sản xuất giống cà chua kháng bệnh đã được bắt đầu từ cuối năm 1960 và được phát triển mạnh sau đó Cơ

sở của chương trình này là việc lai để chuyển gen kháng bệnh từ các loài cà chua dại sang loài cà chua trồng Có từ 1-5 gen kháng bao gồm cả gen trội và gen lặn đã được công bố bởi Zakay và cộng sự (1991), Pico và cộng sự (1996), Nakhla & Maxwell (1998) Năm 1998, Vidavski & Czosnek cho biết tính chịu được quyết định chủ yếu bởi gen trội còn tính kháng được quyết định bởi từ 2-3 gen lặn

Cơ chế RNA slencing cũng đã được ứng dụng để tạo ra giống kháng được begomovirus Ở Việt Nam hiện nay Viện Di truyền Nông nghiệp đang tiến hành đề tài nghiên cứu về vấn đề này Tuy nhiên, có một vấn đề gặp phải là RNA silencing là một cơ chế của cây chống lại virus thì virus cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây

Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng AC4 của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế bào chất

Biện pháp đang đươc áp dụng hiện tại để phòng bệnh do begomovirus gây ra là diệt trừ

bọ phấn, biện pháp canh tác và sản xuất giống kháng bệnh

Sử dụng thuốc hoá học để trừ bọ phấn là một biện pháp đã được tiến hành và cho hiệu quả cao Tuy nhiên việc sử dụng thuốc không chỉ gây ô nhiễm môi trường sống mà còn làm tăng tính kháng thuốc của bọ phấn (Cahin và cộng sự, 1995)

Tác giả Phạm Thị Nhất (2000) cho biết bệnh xoăn lá cà chua rất phổ biến ở nước ta, bệnh xoăn lá cà chua không truyền qua hạt giống, nguồn bệnh lây lan chủ yếu do virus được giữa lại trong cơ thể của bọ phấn trắng là môi giới truyền bệnh và đề xuất biện pháp dùng bẫy dính màu vàng để thu hút bọ phấn trắng

2.7 Đặc điểm hình thái và cấu trúc bộ gen của Begomovirus

2.7.1 Hình thái của Begomovirus

Cũng như các geminivirus khác begomovirus có cấu trúc phân tử (virion) bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là một tam giác đều với số đơn vị tam giác trên mỗi mặt (T = 1), nối với nhau để tạo ra phân tử hình đa diện kép (gemini) Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không hoàn chỉnh dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được sắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric

capsome) Kết quả là toàn bộ phần tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni, 2003)

Hình 2.2 Hình thái của Begomovirus

(http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk)

2.7.2 Cấu trúc DNA-A

DNA-A điển hình gồm có 6 ORF được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau (AV1, AV2, AC1, AC2, AC3, AC4) trong hai đơn vị phiên mã và được phân cách với nhau bởi vùng liên gen (IR) (Rybiciki và cộng sự, 2000) Các gen này mã hóa cho các protein sau:

- Protein vỏ (CP): do gen AV1 mã hóa có chức năng bao bọc genome và cũng cần thiết cho sự lan truyền của virus (Briddon và cộng sự, 1989) CP và Pre-CP hay AV2 đều cần thiết cho di truyển hệ thống và di truyển nội bộ ra vào bên trong nhân tế bào của vật chủ (Gafni và Epel, 2002) AV1 cũng liên kết và bảo vệ ssDNA, màng nhân và tự liên kết AV1 cũng cần thiết cho lan truyền virus qua vector

- Protein tái bản (Rep): Gen AC1(rep) mã hóa protein tái bản (Rep protein) có chức năng tái sinh và tương tác với Protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào (Desbiez và cộng sự, 1995)

- Protein hoạt hóa phiên mã (TrAP): Do gen AC2 mã hóa, có chức năng hoạt hóa phiên mã từ promoter CP Gen AC2 cũng được tìm thấy trong nhân (van Wezel và cộng

sự, 2001)

- Gen AC3 mã hóa cho protein Ren (replication enhancer protein): AC3 tương tác với protein Rep và tăng cường sự tích lũy DNA của virus (HanleyBowdoin và cộng sự, 2000) Sunter và cộng sự (1990) cũng đã quan sát thấy rằng đột biến gen AC4 của TGMV đã giảm bớt một lượng lớn ss- và dsDNA

- Gen AC4 có chức năng cảm ứng triệu trứng và liên quan tới sự phân chia tế bào (Latham và cộng sự, 1997; Krake và cộng sự, 1998) AC4 có thể tương tác với Rep/AC1 ORF và chống lại phản ứng phòng thủ hóa học của cây trồng (van Wezel và cộng sự, 2004)

- Protein được mã hóa bởi AV2 (pre-coat hay MP) và AC4 gần đây cũng được giả thuyết là liên quân tới sự di truyển giữa tế bào với tế bào của DNA virus (Rojas và cộng

sự, 2001)

DNA của những loài có bộ gen kép tương đồng với bộ gen của các loài begomovirus có bộ gen đơn Tuy nhiên những loài begomovirus có bộ gen kép ở tân thể

giới, DNA-A thiếu gen AV2

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus

BV1 tương tác với BC1 trong việc di chuyển giữa các tế bào: Bắt đầu từ nhân BV1 tạo một phức hợp với ssDNA, phức hợp này đi ra tế bào chất và kết hợp với BC1 tạo thành phức hợp BV1 : ssDNA : BC1sau đó di chuyển đến sợi liên bào và chuyển sang tế bào khác

(Gafni and Epel, 2002) Vùng C cuối của BV1 Squash leaf curl virus (SqLCV) được xác

định là yếu tố cần thiết cho sự tương tác với BC1

BC1 là một protein vận chuyển Chức năng của BV1 giống như là một protein vận chuyển (Rojas và cộng sự, 1998; Ward và cộng sự, 1997) Như đã được đề cập ở trên, BC1 tương tác với BV1 thông qua phức hợp BV1:BC1:ssDNA để vận chuyển virus giữa các tế bào (Gafni and Epel, 2002)

BC1 có liên quan trong tính gây bệnh Sự kết hợp của BC1 trong tính gây bệnh đã được chứng minh thông qua thí nghiệm chuyển gen Thuốc lá và cà chua đã được chuyển

gen BC1 của Tomato mottle virus (TMoV) và BDMV, lần lượt những đặc điểm điển hình

của virus xâm nhiễm đã được nhận thấy

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus

có chung motif ở vùng IR có khả năng tái tổ hợp với nhau Mỗi một motif sẽ tương ứng với một trình tự đặc trưng trên đầu N (Interon related domain – IRD) của protein REP

2.7.5 Cấu trúc của DNA-β

Phân tử DNA-β đã thi hút được sự chú ý kể từ khi Saunders và cộng sự (2000); Briddon và cộng sự (2001) chứng minh rằng triệu chứng điển hình trên cây ageratum (bệnh

vàng gân trên cây ageratum) và cây bông (bệnh cuốn lá bông) chỉ có thể hình thành khi

Ageratum yellow vein virus (AYVV) và Cotton leaf curl virus (CLCV) cũng được lây

nhiễm với một phân tử DNA – β tương ứng Phân tử DNA-β có bộ gen sợi vòng đơn với kích thước xấp xỉ 1350 nucleotide mang 3 vùng đặc trưng (Briddon và cộng sự, 2003)

Vùng bảo thủ của vệ tinh (Satellite conserved region (SCR): Vùng này khoảng 200 nucleotide bao quanh cấu trúc stem-loop có mang một chuỗi trình tự ngắn TAT/ATATTAC đặc trưng của nanovuruses và geminiviruses và một vùng bảo thủ cao với trên 100 nucleotide đã được xác định nằm ở phía bên phải của đầu 5’ của stem-loop Vùng bảo tồn này có rất nhiều GC xấp xỉ khoảng 70% (Briddon và cộng sự, 2003)

Vùng giàu A (A rich region): Phân tử DNA-β chứa một vùng giàu A (đặc trưng

160-180 nucleotide có khoảng 60 % A) (Briddon và cộng sự, 2003) Vị trí được xác định nằm nằm giữa nucleotide ±700 và ±1000 (Zhou và cộng sự, 2003) Có ý kiến rằng vùng giàu A này đã được thêm vào nhằm tăng thêm kích thước của chúng để trở thành có kích thước

xấp xỉ kích thước ½ kích thước của bộ gen virus (Mansoor và cộng sự, 2003) Bằng cách

này phân tử DNA-β có thể lắp ráp được thông qua cơ chế chọn lọc kích thước nghiêm

ngặt trong phân tử virus (Etessami và cộng sự, 1989; Rojas và cộng sự, 1998)

Vùng ngược nghĩa mã hóa: Phân tử DNA-β mang một khung đọc mở βC1 trên sợi phía bên phải của genome, mã hóa 1 protein với kích thước 118 amino acids Sản phN m của βC1 đã được chứng minh là có chức năng trong biểu hiện triệu chứng và được cho là

có khả năng ngăn chặn phản ứng phòng thủ của cây (Zhou và cộng sự (2003); Cui và cộng sự, 2005)

SCR=Satellite Conserved Region

Hình 2.5: Cấu trúc của phân tử DNA-β

(http://wcrc.confex.com)

2.7.6 Cấu trúc của Nanovirus-like DNA-1

Phân tử Nanovirus like-DNA 1 lần đầu tiên được phát hiện cùng với một Geminiviruses được phân lập từ cây bông bị bệnh cuốn lá bông (Cotton leaf curl virus

(CLCuV)) tại Pakistan (Man Soor và cộng sự, 1999) Tiếp theo đó sau đó những phân tử

tương tự cũng đã được tìm thấy trên một số cây trồng khác bị nhiễm bởi begomovirus có bộ

gen đơn từ các nước thuộc cựu thế giới (Briddon và cộng sự, 1994) Những phân tử này được

gọi là Nanoviruslike DNA-1 vì chúng có đặc điểm giống nanovirus Chiều dài đầy đủ trung bình của chúng khoảng 1375 nucleotide Về cấu trúc các phân tử bao gồm: (1) Một cấu trúc stem-loop gồm một vòng thòng lọng (loop) với một chuỗi bảo thủ ngắn TAGTAATAT (2) Một khung đọc mở trên mạch chính mã hóa cho một protein có kích thước khảng 315 aa và tương đương với protein rep của các nanovirus (3) Một vùng giàu A nắm ở phía dưới của

vùng mã hóa (đặc trưng 100-200 nucleotide) (Briddon và cộng sự, 2004) Trình tự Rep của

nanovirus-like DNA-1 có tính bảo thủ cao (hơn 86% trình tự amino axit giống nhau)

(Briddon và cộng sự, 2004) Các phân tử DNA-1 có thể tái bản độc lập, nhưng chúng vẫn phụ

thuộc vào sự giúp đỡ của virus cho việc di chuyển hệ thống vì chúng có thể lắp ráp được trong phân tử begomovirus Tuy nhiên, trái với DNA-β, các phân tử Nanovirus like-DNA 1 không có vai trò trong tính gây bệnh

Hình 2.6: Cấu trúc của phân tử vệ tinh Nanovirus-like DNA-1

(http://wcrc.confex.com)

2.8 Quá trình tái bản của Begomovirus

Begomovirus, giống như các geminivirus khác, tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism) Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ (Gutierrez và cộng sự, 2004; Pico và cộng sự, 1996)

Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gien có trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép khi bộ gien virus được chuyển vào nhân tế bào Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus Pha này vẫn chưa được hiểu rõ

Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng Protein Rep sau đó sẽ nối

2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gien virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh

Ngoài đường hướng tái bản vòng lăn người ta còn phát hiện ra đường hướng tái tổ hợp phụ thuộc vào tái bản (recombination dependent replication (RDR)) Đến nay đường hướng này vẫn chưa làm rõ

2.9 Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus

Cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thường bị nhiễm hai hoặc nhiều geminivirus (Toress-Pahceco và cộng sự, 1996; Harrison, 1997; Sanz và cộng sự, 2000; Pita và cộng sự 2001b; Ribeiro và cộng sự, 2003) Trong cây virus tượng tác với nhau tạo

ra phức hợp bệnh (complex disease) (Fondong và cộng sự, 2000; Chatchawankanphanich

và Maxwell, 2002; Monci và cộng sự, 2002) Kiểu tương tác đồng nhiễm bệnh của các virus (co-infection virus) tạo ra triệu trứng rõ rệt hơn khi quan sát ở cây bị từng loại virus riêng (Kamei, 1969; Pruss và cộng sự,1997)

Tương tác có thể là sự bổ trợ (complementation) (Berie và cộng sự, 2001) hoặc tái

tổ hợp (Sabz và cộng sự, 200; Pita và cộng sự, 2001b; Saunders và cộng sự, 2001; Mendez Lozano và cộng sự, 2003)

Tác dụng phối hợp giữa hai geminivirus tái tổ hợp mới có thể xảy ra, và tạo ra nhiều triệu trứng hơn Ví dụ như ở Cameroon, tái tổ hợp kép (double recombinant) được

tạo thành khi đồng xâm nhiễm các isolate của African cassava mosaic virus, đã tạo ra

nhiều triệu trứng hơn so với cây bị nhiễm từng isolate riêng (Fondong và cộng sự, 2000) Một ví dụ khác là sự tái tổ hợp tự nhiên giữa hai begomovirus là TYLCSV và TYLCV ( Tây Ba Nha), đã tạo ra virus khỏe hơn hai virus ban đầu (Monci và cộng sự, 2002)

Tái tổ hợp được cho là đóng vai trò quyết định tới sự tiến hóa của virus (Umaharan

và cộng sự, 1998), đặc biệt là ở quần thể geminivirus, góp phần tạo nên sự đa dạng di truyền (Moffat, 1999; Sanz và cộng sự, 1999; Sanz và cộng sự, 2000) Tái tổ hợp của begomovirus có thể xảy ra ở mức độ chủng (Fondong và cộng sự, 2000), loài (Briddon và cộng sự, 1996; Martin và cộng sự 2001; Saunders và cộng sự, 2002), chi (Klute và cộng

sự, 1996; Saunders và Stanley, 1999), và ngay trong cùng một họ (Jones, 2003)

Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Đối tượng, vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Virus Begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu bệnh trên cây cà chua thu ở Thanh Hóa và Bắc Ninh

- Mẫu DNA của begomovirus bảo quản ở -200C tại TT Bệnh cây nhiệt đới trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

o Cặp mồi đặc hiệu ToLCVV ( sản phN m = 454 bp)

Mồi xuôi dòng là ToLCVV-sp-F2 có trình tự:

(vị trí 1254) 5’ GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 3’ (vị trí 1276)

AV1 AV2

AC3 AC2

AC1

AC4

DNA-A

Hình 3.1: Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus

và vị trí tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1 Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí

và hướng của các ORF Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1

Mồi ngược dòng là ToLCVV-sp-R2 có trình tự:

(vị trí 1683) 5’ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 3’ (vị trí 1708)

o Cặp mồi đặc hiệu TYLCVNV (sản phN m = 1386 bp)

Mồi xuôi dòng là TYLCVNV-sp-F1 có trình tự:

(vị trí 1094) 5’ TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 3’ (vị trí 1117)

Mồi ngược dòng là TYLCVNV-sp-R1 có trình tự:

(vị trí 2456) 5’ AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC 3’ (vị trí 2480)

- Các máy móc thiết bị và hoá chất cần thiết

o Cặp mồi đặc hiệu DNA-β của begomovirus BetaFor2 & BetaRev2

BetaFor2 : 5’- TAGCTACGCCGGAGCTTAGCTCG-3’

BetaRev2 : 5’- AAGGCTGCTGCGTAGCGTAGTGG-3’

Cặp mồi này khuếch đại cả phân tử DNA-β có kích thước 1300-1400 bp

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

- Từ 01/12/2009 đến 17/05/2010

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Tiến hành thu mẫu nghiên cứu

Phương pháp thu mẫu: mẫu được thu theo phương pháp lấy điểm trung bình, ghi đầy đủ thông tin như: tên mẫu, địa điểm, thời gian lấy mẫu, triệu chứng…Sau đó, mẫu được bảo quản bằng hạt Silicagel cho đến khi mẫu khô giòn

3.2.2 Chiết tách DNA tổng số từ mẫu mô thực vật

Nghiền khoảng 0.1g mẫu tươi trong 500µl đệm CTAB (đã bổ xung Beta- mercaptalthanol) (theo Sambrock và cộng sự, 1998) Sau đó, dung dịch mẫu được chiết 2 lần bằng hỗn hợp Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1 AND tổng số được tủa bằng Propanol 100%, rửa cặn AND 2 lần bằng 700µl Etanol 70% và để khô cặn AND trong không khí ít nhất 30 phút Hoà cặn AND trong 100µl nước cất hai lần đã hấp vô trùng, bảo quản AND

ở -200C

3.2.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản ph6m PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích là 25µl chứa: 0,5µl mỗi mồi có nồng độ 20µM; 0,5µl dung dịch dNTPs 10mM; 2,5µl đệm Dream taq 10X; 20,5µl và 0,5µl Taq polymerase (Fermentas) Chu trình phản ứng PCR như sau: 94oC trong 5 phút, sau đó là 35 chu kì: 94oC -30 giây, 50oC-35 giây, 72oC-1 phút 35 giây, cuối cùng là

72oC-5 phút Sản phN m PCR được điện di trên gel agarose 1 % và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide

3.2.4 Phương pháp tinh chiết sản ph6m PCR

Sử dụng PureLinhTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) để tiến hành tinh chiết sản phN m PCR từ gel agarose Các bước tinh chiết thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.2.5 Nhân dòng bằng InsTAclone™ PCR Cloning Kit (của Fermentas)

Sử dụng 1,5 µl Vector pTZ57R/T cho 15 µl thể tích nối với 10 µl sản phN m PCR;

3.0 µl đệm 5X ligation và 0.5 µl T4 DNA ligase Ủ hỗn hợp nối ở nhiệt độ phòng (220C) trong 1h hoặc qua đêm ở nhiệt độ 40C

Để thực hiện việc nhân dòng, chúng tôi sử dụng tế bào vi khuN n E coli chủng

XL-1 Blue có để làm nguồn tế bào khả biến bằng cách nuôi vi khuN n trong môi trường CM và

xử lý tế bào với đệm T sẵn có trong kit InsTAclone™ PCR Cloning Vector tái tổ hợp ở trên được biến nạp vào tế bào vi khuN n khả biến bằng cách hỗn hợp chúng với nhau và ủ trên đá trong 15 phút (không cần sốc nhiệt) Sau khi biến nạp, cây trải đều dung dịch vi khuN n lên môi trường LB agar + Ampicyline 100 µg/ml + X-gal 12.5 µg/ml + IPTG 100 µg/ml đã được ủ ấm Nuôi cấy qua đêm ở 370C Kiểm tra, chọn lọc trắng xanh và nuôi lắc trong môi trường LB lỏng + Ampicillin 100 µg/ml để nhân sinh khối (thành phần môi trường LB được trình bày ở phụ lục 1)

3.2.6 Tinh chiết plasmid

Để thu plasmid đã được nhân dòng từ sinh khối tế bào vi khuN n E.coli, chúng tôi

sử dụng quy trình chiết của CuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer) Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất ADN plasmid được bảo quản trong tủ lạnh -200 C

3.2.7 Phương pháp giải trình tự Gen

- Phản ứng Sequencing sử dụng BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem)

- Tinh chiết sản phN m Sequencing: Thêm 55 µl Ethanol 100% và 2 µl sodium acetate 3M, pH = 5.2 nhằm kết tủa sản phN m Sau đó rửa lại sản phN m bằng cồn 70%

3.2.8 Phương pháp và phần mềm phân tích chuỗi DNA

- Sử dụng một số chương trình tin sinh học:

Chương trình BLAST ( NCBI ) Chương trình BioEdit 7.0.9 Chương trình DNAstar 7.1 (Lasergene) Chương trình Vecter NTI 9.0 (Invitrogene) Chương trình ClustalX 2.0 và Mega 4.0

Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nhân dòng và giải trình tự toàn bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua

89 và Dudu 31

Trong năm 2009, Lê Văn Hải (CNSH50) đã phân lập được 3 begomovirus chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại trên cây đu đủ và cà chua Tác giả đã giải trình tự trực tiếp khoảng 1.2 kb (~ 40 % kích thước bộ gien trung bình của begomovirus) của cả 3 virus này

Vì danh tính và vị trí phân loại của begomovirus chỉ có thể được xác định chính xác dựa trên toàn bộ trình tự phân tử DNA của begomovirus nên mục tiêu của phần 4.1 của chúng tôi là giải trình tự toàn bộ bộ gen của 3 virus này Ba mẫu virus được chúng tôi

ký hiệu là Dudu31, Cachua 89 và Cachua100 dựa trên cây ký chủ và mã mẫu cây bệnh (Bảng 4.1)

Bảng 4.1 Nguồn gốc 3 mẫu virus được nghiên cứu trong báo cáo này Mẫu virus

Mã mẫu cây

Cây ký chủ

Thời gian

Cachua89 89 Cà chua 9/2008 Đa tốn-Gia Lâm-Hà Nôi Xoăn vàng lá Cachua100 100 Cà chua 9/2008 Yên Mỹ - Thanh Trì - Hà Nội Xăn vàng lá

Ghi chú: DNA tổng số đã được chiết từ trước (năm 2009) và bảo quản ở -20 OC

4.1.1 Thiết kế mồi nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus

Begomovirus là các virus có bộ gen DNA dạng vòng, kích thước khoảng 2.7 – 2.8

kb Để nhân toàn bộ bộ gen của begomovirus, người ta thường sử dụng 1 cặp mồi liền kề nhưng ngược chiều nhau gọi là mồi “back-to-back”, được thiết kế trên một trình tự đã biết Dựa trên 3 trình tự thu được khi giải trình tự trực tiếp mẫu virus của Lê Văn Hải (mỗi trình có kích thước 819 nt), chúng tôi thiết kế mồi để nhân toàn bộ DNA của ba mẫu virus Nhìn chung, đối với mỗi một virus, người ta sẽ sử dụng một cặp mồi liền kề riêng

Tuy nhiên, khi căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm Seqman (gói phần mềm Lasergen, hãng DNASTAR), chúng tôi thấy có nhiều vùng bảo thủ của cả 3 chuỗi virus Dựa trên 1 vùng bảo thủ dài 43 nt (vị trí 559 tới vị trí 601, Hình 4.1), chúng tôi đã thiết kế 1 cặp mồi chung liền kề ký hiêu là Hai50F (xuôi dòng) và Hai50R (ngược dòng) để nhân toàn bộ genome của 3 virus (Bảng 4.2) Vị trí tương đối của cặp mồi chung liền kề trên genome của begomovirus được trình bày ở Hình 4.2

Hình 4.1 Vùng bảo thủ dùng để thiết kế mồi chung liền kề nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus

Dudu31, Cachua 89 và Cachua100 Vùng thiết kế mồi được bôi đen

Bảng 4.2: Các mồi liền kề nhân toàn bộ bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89

Tm: 51.2 °C Trình tự: 5’CCAATTCAATTACAACCTGAGG3’

Chiều dài: 22nt Hàm lượng GC: 41 % Mồi Hai50R

Tm: 50.7 °C

Ghi chú: Hai nucleotid gối nhau của 2 mồi được đóng hộp Tm của mồi được tính theo phần mềm Oligo Calc (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)

Hình 4.2 Vị trí tương đối của cặp mồi chung liền kề Hai50F/Hai50R trên

bộ gen của begomovirus

4.1.2 Nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus bằng PCR

Do đặc điểm bộ gen của virus lớn (khoảng 2.7 kb) và để đảm bảo trình tự DNA thu được không bị lỗi cũng như tăng tính đặc hiệu, chúng tôi sử dụng kit Expand Long Template PCR System (hãng Roche) với đệm phản ứng số 3 (chứa thêm chất tN y rửa) để thực hiện phản ứng Phản ứng PCR nhân toàn bộ bộ gen của 3 virus đã được thực hiện với cặp mồi liền kề chung Hai50F/Hai50R với DNA tổng số chiết từ mẫu cây nhiễm bệnh năm 2009 và bảo quản từ trước ở -20 OC Kết quả điện di sản phN m PCR cho thấy cả 3 mẫu đều tạo băng sản phN m PCR kích thước xấp xỉ 2.7 kb chứng tỏ toàn bộ bộ gen của ba mẫu virus đã được nhân dòng thành công (Hình 4.3)

M Dudu 31 Cachua 89 C achua10

Hình 4.3 PCR nhân toàn bộ DNA-A của ba mẫu virus M là thang DNA 1 kb (Fermentas)

~2.7 kb

Hai50F Hai50R

3.0 kb

2.5 kb

Sản phN m PCR của 3 mẫu được cắt khỏi agarose gel và được được tinh sạch bằng kít thôi gel Pure LinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) cho các thí nghiệm tiếp theo

4.1.3 Nhân dòng bộ gen của 3 mẫu virus trong vi khu6n E.coli

Để nhân dòng bộ gen của ba mẫu virus, chúng tôi sử dụng bộ kít nhân dòng

InsTAclone™ PCR Cloning Kit của hãng Fermentas và nguồn tế bào E coli dòng

XL1-Blue của hãng Stratagen Toàn bộ qui trình nhân dòng được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Đầu tiên, sản phN m PCR tinh chiết ở trên được nối vào vector nhân dòng pTZ57R/T sẵn có trong kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tiếp theo chúng tôi sử dụng

tế bào vi khuN n E coli chủng XL-1 Blue có để làm nguồn tế bào khả biến bằng cách nuôi

vi khuN n trong môi trường CM và xử lý tế bào với đệm T sẵn có trong kit InsTAclone™ PCR Cloning Vector tái tổ hợp ở trên được biến nạp vào tế bào vi khuN n khả biến bằng cách hỗn hợp chúng với nhau và ủ trên đá trong 15 phút (không cần sốc nhiệt) Ngoài ra, chúng tôi cũng biến nạp vector pTZ57R/T dạng vòng sẵn có trong kít (DNA1 control) làm đối chứng hiệu quả biến nạp

Để chọn lọc dòng vi khuN n mang vector tái tổ hợp, các tế bào vi khuN n sau khi biến nạp được cấy trải trên môi trường chọn lọc (môi trường LB agar chứa tetracycline, ampicilline, IPTG và Xgal) và ủ qua đêm ở 37 0C

Quan sát các đĩa nuôi cấy qua đêm (Hình 4.4) cho thấy:

Ở đĩa đối chứng, xuất hiện rất nhiều khuN n lạc (> 200) khuN n lạc trắng đặc trưng E

coli chứng tỏ điều kiện và hiệu quả biến nạp tốt

Ở cả ba đĩa thí nghiệm Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 xuất hiện cả 2 loại khuN n lạc trắng và xanh nhạt với số lương ít hơn nhiều so với đối chứng (<100) Kết quả trên chứng tỏ quá trình biến nạp các vector tái tổ hợp đã thành công

Hình 4.4 Các mẫu vi khuN n XL1-blue biến nạp được cấy trải và ủ qua đêm trên môi trường chọn

lọc trắng xanh

(1): Mẫu đối chứng (với DNA1 control); (2): Mẫu biến nạp Cachua 89; (3): Mẫu biến nạp

Cachua 100; (4) Mẫu biến nạp Dudu 31

4.1.4 Kiểm tra kết quả biến nạp vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn

Tuy nhiên, không phải tất cả các khuN n lạc trắng đều chứa sản phN m DNA đúng vì nhiều phân tử DNA có thể gẫy hoặc phân hủy từng phần trong quá trình tinh chiết vẫn nối được vào vector nhân dòng Vì vậy, để kiểm tra và chọn các dòng vi khuN n mang vector chứa sản phN m nối đúng, chúng tôi chọn 4 khuN n lạc trắng ở mỗi mẫu đĩa vi khuN n biến nạp và cấy đơn khuN n lạc vào ống nghiệm chứa môi trường LB lỏng (4 mL) chứa kháng sinh ampicilline Các ống nghiệm được nuôi ở nhiệt độ 370C, lắc 250 vòng/phút qua đêm

Tiếp theo, vector tái tổ hợp được tinh chiết từ tế bào vi khuN n dùng kít tinh chiết palasmid là Accuprep Plasmid Mini Extraction Kit (hãng Bioneer) Sự có mặt của DNA virus trong vector tái tổ hợp tinh chiết (miniprep) được kiểm tra bằng hai emzym cắt giới hạn là BamHI và E.coRI Hai enzyme này sẽ giải phóng sản phN m nối khỏi vector nhân dòng Kết quả kiểm tra được trình bày ở Bảng 4.3 và Hình 4.5

Kết quả cho thấy 11/12 dòng kiểm tra đều chứa băng vector (~2.8 kb) Trong số các dòng chứa sản phN n nối (10 dòng) có 7 dòng chứa sản phN m nối với kích thước đúng

(tổng các băng của sản phN m nối ~ 2.7-2.8 kb tương ứng với kích thước bộ gen virus) Các dòng đúng này là 31-1, 31-2, 31-3 (mẫu biến nạp Dudu31), 89-4 (mẫu biến nạp Cachua89), 100-1, 100-2, 100-4 (mẫu biến nạp Cachua100)

Chúng tôi đã chọn các dòng 31-1, 89-4, 100-4 để giải trình tự

Bảng 4.3 Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI và E.coRI

Sản ph6m nối (kb) Mẫu biến

nạp

Dòng (clone)

Hình 4.5: Kết quả điện di sản phN m miniprep đã được cắt bằng BamHI và E.coRI

Các giếng 31-1, -2,-3, -4 là của mẫu Dudu31 Các giếng 89-1, -2,-3, -4 là của mẫu Cachua89 Các

giếng 100-1, -2,-3, -4 là của mẫu Cachua100

4.1.5 Kết quả giải trình tự gen

Việc giải trình tự toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus được thực hiện trên khuôn vector tái tổ hơp tinh chiết (miniprep) Phản ứng giải trình tự được thực hiện với kit BigDye terminator (hãng A&B) Sau khi thực hiện phản ứng giải trình tự tại TT bệnh cây nhiệt đới, hỗn hợp phản ứng được làm khô và gửi đọc bằng điện di mao quản tại tại Viện CNSH-Viện Khoa Học Công Nghệ Quốc Gia

Vì bộ gen của virus khá lớn nên chúng tôi tiến hành giải trình tự hai lần theo cả 2 chiều (Hình 4.6) Lần thứ nhất chúng tôi sử dụng 2 mồi được thiết kế trên vector là SeqF

và SeqR Với trình tự thu được từ lần thứ nhất của ba mẫu virus, chúng tôi thực hiện căn trình tự và thiết kế 2 mồi giải trình tự chung cho cả 3 chuỗi để thực hiện tiếp việc giải trình tự lần 2 cho phần còn lại của bộ gen Hai mồi cho lần giải trình tự thứ 2 này được ký

(5’TTGATTGCCTCGGCATATGC3’) như trình bày trên Hình 4.6

Hình 4.6: Sơ đồ giải trình tự bộ gen của 3 mẫu virus được dòng hóa trên vector pTZ57R/T

Kết quả sau khi giải trình tự chúng tôi thu được bốn trình tự cho mỗi mẫu Tất cả các trình tự đều có chất lượng tốt (đồ thị trình tự rõ ràng, không nhiễu) với chiều dài đọc được khoảng 800 bp (Phụ lục 2)

Các trình tự này cùng với trình tự thu được khi giải trình tự trực tiếp (Lê Văn Hải, 2009) được chúng tôi lắp ráp và biên tập bằng chương trình Seqman (Lasergen, DNASTAR) Cuối cùng, chúng tôi thu được một trình tự genome duy nhất cho mỗi virus Các trình tự này (Phụ lục 3) đã được gửi trên GenBank

DNA virus

Bộ gen virus

pTZ57R/T pTZ57R/T

4.2 Đặc trưng phân tử của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31

4.2.1 Tổ chức bộ gen

Tổ chức bộ gen của ba mẫu virus được thực hiện bằng chương trình Vector NTI Suite 7 và đươc trình bày ở Bảng 4.4 và Hình 4.7

Bộ gen của cả 3 virus được giải trình tự đều có kích thước và cấu trúc tương tự như

các virus thuộc chi Begomovirus nhóm Cựu thế giới Toàn bộ bộ gen có kích thước

khoảng 2.7 kb (2740 nt - Cachua100; 2743 nt - Cachua 89; 2748 nt – Dudu31) Trình tự bắt đầu tại vị trí nucleotid thứ 8 (A) của chuỗi bảo thủ TAATATTAC (là vị trí cắt và nối bởi protein Rep trên DNA genome trong quá trình tái bản theo cơ chế vòng lăn)

Sử dụng phần mềm VectorNTI để tìm kiếm các ORF trên cả 3 phân tử genome, chúng tôi thấy trên mỗi phân tử có rất nhiều ORF khác nhau xắp xếp trên cả 2 chiều Tuy nhiên, mỗi phân tử đều chứa 6 ORF đặc trưng cho bộ gen của các begomovirus gồm 2 ORF trên sợi virus (V2, V1, cùng chiều kim đồng hồ) và 4 ORF trên sợi bổ sung với sợi virus (C4, C1, C2, C3, ngược chiều kim đồng hồ) (Hình 4.7)

Trên sợi virus, ORF V2 (mã hóa protein V2) của cả 3 virus đều có kích thước 348

nt (116 aa) Phía đầu 3’ của ORF V2 là ORF V1 (mã hóa cho protein vỏ CP) ORF V1 của cả 3 virus đều có kích thước 771 nt (257 aa) Tương tự như của các begomovirus khác, 2 ORF này gối lên nhau 187 nt

Trên sợi bổ sung, ORF lớn nhất là ORF C1 (mã hóa protein Rep), đều có kích thước bằng 1083 nt (361 aa) cho cả 3 virus ORF nhỏ nhất là ORF C4 (mã hóa protein C4) nằm gọn trong đầu 5’ của ORF C1 với kích thước giống nhau cho cả 3 virus là 291 nt (97 aa) (Hình 4.7) Hai ORF còn lại là C2 (mã hóa protein TrAP) và C3 (mã hóa protein REn) đều có kích thước bằng nhau là 402 nt (134 aa) Như một qui luật chung đối với tất

cả các beomovirus, ORF C4 và ORF C2 luôn nằm trên một khung đọc mã (c1, c2, c3 lần lượt đối với Dudu31, Cachua89 và Cachua100)

Bộ gen của 3 virus đều có một vùng liên gen không phiên mã (IR, Intergenic Region) kích thước khoảng 270 nt có vị trí tính từ đầu 5’ của ORF C1 tới đầu 5’ của ORF

V2 tương tự như IR của các begomovirus khác IR có chứa nguồn gốc tái bản (ori, origin

of replication) với nhiều dấu hiệu quan trọng như trình bày ở phần 4.2.2.1

Bảng 4.4 Đặc điểm bộ gen của 3 mẫu begomovirus