2.1.4 Tình hình nghiên cứu và phát triển của cây lúa 52.2.4 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới 122.2.5 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt N
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
- -
CHU THỊ KHÁNH NY
KHẢO SÁT, ðÁNH GIÁ CÁC DÒNG, GIỐNG LÚA TẺ MỚI CHỌN TẠO CÓ NĂNG SUẤT, CHẤT LƯỢNG CAO, KHÁNG BỆNH BẠC LÁ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 06.42.02.01
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS PHAN HỮU TÔN
HÀ NỘI - 2014
Trang 2LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác
Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc
Học viên
Chu Thị Khánh Ny
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Luận văn này, tôi hoàn thành ñược nhờ sự phấn ñấu nỗ lực hết mình của bản thân và sự quan tâm, giúp ñỡ tận tình của nhà trường, các thầy, các cô, gia ñình, bạn bè
Lời ñầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn ñến các Thầy, các Cô trong khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã truyền ñạt kiến thức, kinh nghiệm và luôn tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn
ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn cùng các Thầy, Cô trong bộ môn Sinh học phân tử ñã tận tình giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia ñình, người thân, bạn bè và các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử ñã giúp ñỡ tôi trong thời gian qua
Hà nội, ngày 19 tháng 09 năm 2014
Sinh viên
Chu Thị Khánh Ny
Trang 42.1.4 Tình hình nghiên cứu và phát triển của cây lúa 5
2.2.4 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới 122.2.5 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam 182.2.6 Những ñịnh hướng về nghiên cứu, chọn tạo giống lúa kháng bạc lá 22PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
Trang 53.3 Phương pháp xử lý số liệu 37
4.1 Thời gian qua các giai ựoạn sinh trưởng của một số dòng, giống lúa 384.2 đặc ựiểm nông sinh học của một số dòng, giống lúa 394.3 Năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng, giống lúa 414.4 đánh giá mức ựộ nhiễm sâu bệnh của một số dòng, giống lúa 444.5 đánh giá chất lượng gạo của một số dòng, giống lúa 464.6 đánh giá chất lượng cơm của một số dòng, giống lúa 494.7 Phản ứng PCR phát hiện gen kháng bạc lá của một số dòng, giống 514.7.1 Kết quả phát hiện gen Xa4, xa5, Xa7 bằng kỹ thuật PCR 514.7.2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn bạc lá trên một số dòng,
Trang 6DANH MỤC BẢNG
2.1 Thống kê diện tích và sản lượng lúa của một số nước trên thế giới 72.2 Diện tích và sản lượng lúa của Việt Nam 93.1 Thang ñánh giá ñộ bạc bụng của hạt gạo 30
3.4 Các mồi sử dụng ñể hiện ra gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7 343.5 Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, xa5, xa7 35
4.1 Thời gian qua các giai ñoạn sinh trưởng của một số dòng, giống lúa tẻ 384.2 ðặc ñiểm nông sinh học của một số dòng, giống lúa tẻ 404.3 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng, giống
4.4 Kết quả ñánh giá mức ñộ nhiễm sâu bệnh hại của một số dòng, giống
4.5 Kết quả ñánh giá chất lượng gạo của một số dòng, giống lúa tẻ 47
4.6 Kết quả ñánh giá chất lượng cơm của một số dòng, giống lúa tẻ 504.7 Kết quả ñiện di các dòng, giống lúa tẻ (vụ mùa 2013) 534.8 Kết quả phản ứng của một số dòng, giống lúa tẻ với các chủng vi khuẩn 554.9 ðặc ñiểm của các dòng triển vọng ñược tuyển chọn của vụ mùa 2013 58
Trang 7DANH MỤC HÌNH
2.1 Sơ ñồ thể hiện sản lượng và diện tích lúa trên toàn thế giới 62.2 Sơ ñồ thể hiện số lượng gạo xuất khẩu năm 2013, 2014 8
Trang 8DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
X Xanthomonas
O Oryzae Xoo Xanthomonas Oryzae
TB Trung bình
R Resistance
M Moderatea Susseptible
S Susseptible
Trang 9PHẦN I MỞ đẦU
1.1 đặt vấn ựề
Lúa là cây trồng chủ lực có diện tắch thu hoạch năm 2012 ựạt 7,75 triệu
ha với năng suất bình quân 5,63 tấn/ha, sản lượng 43,66 triệu tấn (GSO, 2013) Vấn ựề chọn tạo giống lúa là khâu trọng yếu, ựột phá trong chuỗi liên kết nâng cao giá trị xuất khẩu gạo Vậy phải chọn tạo những giống lúa như thế nào ựể ựạt ựược yêu cầu của sản xuất? đó là câu hỏi mà các nhà chọn tạo giống luôn ựặt lên hàng ựầu
Những giống năng suất thấp dần ựược thay thế bằng những giống cho năng suất cao hơn, những giống kém chất lượng dần ựược thay thế bằng những giống có chất lượng tốt hơn Và ựến nay những giống lúa cho năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh ựang dần chiếm lĩnh thị trường
Mục tiêu chọn tạo ựược các giống lúa tẻ cho năng suất cao chất lượng tốt và kháng bệnh bạc lá ựang là rất cần thiết hiện nay Nhiều gen kháng bạc
lá ựã ựược nghiên cứu ứng dụng trong chọn tạo giống lúa kháng bạc lá Một
số gen ựã xác ựịnh bằng chỉ thị phân tử như: Xa4, xa5, Xa7 Những giống lúa
mang một trong các gen này có mức ựộ kháng cao và phổ kháng rộng
Nhằm tìm ra nguồn vật liệu mang gen kháng bạc lá phục vụ công tác chọn tạo giống lúa đồng thời lựa chọn các dòng, giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt, mang gen kháng bạc lá trong tập ựoàn giống lúa mới chọn tạo
ựể ựưa vào mạng lưới khảo nghiệm cho các tỉnh phắa Bắc phát triển sản xuất chúng tôi tiến hành thực hiện ựề tài:
ỘKhảo sát ựánh giá các dòng, giống lúa tẻ mới chọn tạo có năng suất, chất lượng cao và kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNAỢ
Trang 11PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây lúa
2.1.1 Nguồn gốc phát sinh
Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu lục ựịa Gondwana cách ựây ắt nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục ựịa Hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa ựã ựược thuần hoá là lúa châu Á
(Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima)
Lúa châu Phi ựã ựược gieo trồng trong khoảng 3.500 năm Trong
khoảng thời gian từ 1500 TCN ựến 800 TCN thì O glaberrima ựã lan rộng từ
trung tâm xuất phát của nó là lưu vực châu thổ sông Niger và mở rộng tới Sénégal Tuy nhiên, nó không bao giờ phát triển xa khỏi khu vực nguồn gốc của nó Việc gieo trồng loài lúa này thậm chắ còn suy giảm do các giống châu
Á, có thể ựã ựược những người Ả Rập từ bờ biển phắa ựông ựem tới châu Phi ựại lục trong thời gian khoảng từ thế kỷ 7 ựến thế kỷ 11
Tổ tiên của lúa châu Á O sativa là một loại lúa hoang phổ biến (Oryza rufipogon) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng đông Nam Á Hiện
nay ựây là giống lúa chắnh ựược gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới Hơn 10000 năm trước, cư dân nơi ựây dã trồng loại lúa nước, và nó ựược xem như là quê hương của loại cây lương thực này vì nơi ựây có ựủ mọi ựiều kiện ựể phát triển giống lúa này, và ựó cũng là nơi ựã xuất hiện nền văn minh lúa nước, nơi ựây còn có thể xem là 1 trong những trung tâm nông nghiệp ựầu
tiên trên thế giới (Các giả thuyết về nguồn gốc thuần hoá cây lúa)
O sativa ựã thắch nghi với việc gieo trồng tại Trung đông và địa
Trung Hải của châu Âu vào khoảng năm 800 TCN Người Moor ựã ựem nó tới bán ựảo Iberia khi họ xâm chiếm vùng này vào năm 711 Thời gian nửa sau của thế kỷ 15, thì lúa ựã trải rộng tới Ý và sau ựó là Pháp và sau ựó là tất
Trang 12cả các châu lục khác trong thời kỳ khám phá và chinh phục lớn của người châu Âu Năm 1694, lúa ñã ñến Nam Carolina, có lẽ có nguồn gốc từ Madagascar Người Tây Ban Nha ñem các giống lúa tới Nam Mỹ vào ñầu thế kỷ 18
2.1.2 Phân loại thực vật
Cây lúa (Oryza spp.) thuộc:
- Giới (kingdom/regnum): Thực vật (Plantae)
- Ngành (phyla): Thực vật có hoa (Angiospermae)
- Lớp (class): Thực vật một lá mầm (Monocots)
- Bộ (ordo): Hòa thảo (Poales)
- Họ (familia): Hòa thảo (Poaceae)
- Chi (genus): Lúa (Oryza)
- Loài (species): Lúa Châu Á: Oryza sativa
Lúa Châu Phi: Oryza glaberima
- Phân loài/thứ(subspecies): Lúa nhiệt ñới: Oryza sativa var indica
Lúa ôn ñới: Oryza sativa var japonica
Lúa rẩy: Oryza sativa var javanica
2.1.3 Bộ gen của cây lúa
a) Nghiên cứu về genome cây lúa trên thế giới
Nhóm nghiên cứu Viện nghiên cứu Di truyền Bắc Kinh (Beijing gemnomic Institute, viết tắc là BGI) và công ty sinh học (San Diego, Mỹ), công bố rằng họ ñã hoàn tất công trình tìm hiểu cơ cấu tổ chức của hệ thống
di truyền trong cây lúa Nhóm Bắc Kinh cộng tác cùng một nhóm gồm các nhà khoa học thuộc Trung tâm nghiên cứu Di truyền Trường ðại học
Washington nghiên cứu giống lúa có tên Indica, trong khi công ty Syngente thì tập trung vào nghiên cứu một giống lúa Japonica có hình dạng ngắn hơi giống Indica J.YU and coworker (2002) ðây là một công trình nghiên cứu
quan trọng trong khoa học, vì là lần ñầu tiên trong lịch sử nhân loại con người
Trang 13có thể khám phá ra toàn bộ cấu trúc di truyền của cây lúa Một số ñặc ñiểm nổi bật trong công trình của hai nhóm nghiên cứu này có thể ñược tóm gọn như sau: Số lượng gen trong cây lúa còn nhiều hơn cả con người Theo nhóm
nghiên cứu BGI, giống lúa Indica (còn có tên là bulu ở Nam Dương) có
khoảng 45000 ñến 56000 genes, còn nhóm Syngenta thì ước lượng rằng giống
lúa Japonica có khoảng 32000 ñến 50000 genes
b) Nghiên cứu genome cây lúa tại Việt Nam
Tại Hội thảo khoa học Việt- Anh “Kết quả nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa bản ñịa của ñịa phương” ñược tổ chức tại Hà Nội,
ngày 28 tháng 08 năm 2013 Với sự hợp tác của các nhà khoa học Anh, lần ñầu tiên Việt Nam giải mã hoàn chỉnh hệ gen ñầy ñủ của một loại thực vật bậc cao nhất là cây lúa
ðây là lần ñầu tiên tại Việt Nam ñã giải mã thành công hệ gen ñầy ñủ của một loại thực vật cao nhất rất quan trọng là cây lúa, mở ra hướng nghiên cứu về genome học và ứng dụng (tin sinh học) bioinformatics ñể khai thác trình tự hệ gen phục vụ công tác nghiên cứu và chọn tạo giống lúa Cơ sở dữ liệu của 36 giống lúa ñã giải mã là nguồn vật liệu vô cùng quý giá ñể tầm soát các gen chức năng như kháng rầy nâu, ñạo ôn, bạc lá, chịu hạn, chịu mặn, gen chất lượng, gen thơm; ñịnh vị chính xác các gen ñích trên bản ñồ, giúp chọn lọc cá thể mang gen ñích một cách chính xác phục vụ công tác lai tạo giống
Bộ KH&CN phối hợp với Bộ NN&PTNT sẽ tiếp tục hỗ trợ cho nhóm các nhà khoa học Việt Nam hợp tác với các nhà khoa học của Anh tiếp tục giải mã các giống lúa có ñặc tính quan trọng, xây dựng cơ sở dữ liệu phục vụ cho công tác nghiên cứu và chọn tạo giống lúa, tiến ñến tương lai Vương quốc Anh sẽ giúp Việt Nam xây dựng Phòng thí nghiệm quốc gia về phân tích genome cho lúa và các cây trồng khác của Việt Nam
2.1.4 Tình hình nghiên cứu và phát triển của cây lúa
2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới
Trang 14Trên thế giới có 37 cụm nước và khoảng 1/2 dân số sản xuất lúa gạo (theo bản tin thị trường lúa gạo FAO, ROMA, tháng 7/2010) Trong ñó có: 12 nước châu Á, 9 cụm nước châu Phi, 1 nước Bắc Mỹ, 3 nước ở Nam Mỹ, cụm nước ở châu Phi EEC 12 nước
Hình 2.1: Sơ ñồ thể hiện sản lượng và diện tích lúa trên toàn thế giới
(từ 2004 ñến 2013)
Qua hình 2.1 chúng ta có thể thấy rằng, diện tích và sản lượng lúa gạo trên thế giới tổng quan vẫn ñang trên ñà tăng trưởng mạnh Ước tính trong năm 2013 diện tích sản xuất lúa trên thế giới ñạt gần 170 triệu hecta, và sản lượng ñạt gần 700 triệu tấn
Với chiến lược ñảm bảo an ninh lương thực toàn cầu, sản lượng lúa gạo trên thế giới phải giữ vững mức tăng trưởng qua từng thời kỳ ðể ñạt ñược cần phải có sự nỗ lực của các nước tham gia vào sản xuất lương thực lúa gạo Một số nước diện tích lúa có giảm ñi, nhưng sản lượng lúa gạo vẫn tăng trưởng tốt, ñó
Trang 15là nhờ các chính sách chọn tạo giống và sản xuất bền vững của từng quốc gia
Bảng 2.1: Thống kê diện tích, sản lượng lúa của một số nước trên thế giới
Diện tích sản suất lúa của một số nước trên thế giới (triệu ha)
Chỉ tiêu
Năm 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Bangladesh 10,73 10,25 10,52 10,58 10,58 11,28 11,35 11,53 12,00 11,55
Trang 16Theo dõi diện tích sản xuất lúa gạo và sản lượng lúa gạo của một số nước trên thế giới trong 10 năm từ 2003 ñến 2012 chúng ta thấy rằng, có những nước diện tích sản xuất lúa gạo ñã sụt giảm như Brazil, Nhật Bản, Mỹ nhưng sản lượng lúa gạo vẫn trên ñà tăng trưởng Bên cạnh ñó có những nước
mở rộng diện tích sản xuất lúa gạo như Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, và sản lượng lúa gạo cũng tăng theo xu hướng tăng chung của toàn thế giới
Hình 2.2: Sơ ñồ thể hiện số lượng gạo xuất khẩu năm 2013, 2014
Qua hình 2.2 chúng ta có thể thấy rằng những nước xuất khẩu gạo hàng ñầu thế giới là Ấn ðộ, Thái Lan, Việt Nam Trong năm 2014 này, dự báo cho thấy rằng lượng gạo xuất khẩu của các nước có sự chênh lệch so với ước tính của năm 2013 Tại Ấn ðộ lượng gạo xuất khẩu dự báo giảm mạnh trong khi
ñó tại Thái Lan lượng gạo xuất khẩu dự báo tăng cao hơn so với 2013 ðiều này cho chúng ta thấy tình hình sản xuất lúa gạo của các nước vẫn có sự bấp bênh và phụ thuộc nhiều vào ñiều kiện ngoại cảnh, thời tiết, và chưa thể hoàn toàn theo ý muốn của con người
Trang 172.1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trong nước
Việt Nam là một trong những trung tâm hình thành cây lúa nước Cây lúa là cây lương thực chủ yếu, có vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Trong những năm qua sản xuất lúa của nước ta ñã có những thành tích ñáng khích lệ, ñưa nước ta từ một nước nhập khẩu gạo ñến năm 2003 ñã xuất khẩu ñược 3,7 triệu tấn - ñứng thứ 2 về xuất khẩu gạo, sau Thái Lan
Bảng 2.2: Diện tích và sản lượng lúa của Việt Nam
giai ñoạn từ 2003 ñến 2012 Chỉ tiêu
Từ năm 2003 ñến năm 2010 diện tích sản xuất lúa ñã tăng 37,2 nghìn ha kéo theo sản lượng lúa cũng tăng từ 34568,8 nghìn tấn lên 40005,6 nghìn tấn; nhưng từ năm 2011 ñến nay diện tích này ñang có xu hướng giảm và ñiểm vượt trội là sản lượng lúa trong thời ñiểm từ 2011 ñến nay lại tăng rõ rệt, trung bình mỗi năm tăng khoảng 1,5 triệu tấn ñiều ñó chứng tỏ, những giống
Trang 18lúa ñược sử dụng trong gieo trồng ñã cho năng suất cao hơn
2.2 Nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa
2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh bạc lá ñược phát hiện ñầu tiên ở Fukuoku (Nhật Bản) năm 1884 Lúc ñầu người ta tưởng ñây là một hiện tượng sinh lý, về sau Takaishi (1908) rồi ñến Bokura (1911) ñã phân lập ñược vi khuẩn trên lá bệnh và dùng chúng
ñể lây bệnh nhân tạo có kết quả S.H.OU (1983) ðến năm 1965 các nhà khoa học mới xác ñịnh ñược ñúng nguyên nhân gây bệnh là do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae (Uyeda và Ishiyama) Theo Vũ Triệu Mẫn, Lê Lương Tề
(1999) thì Vi khuẩn gây ra bệnh chủ yếu bằng hình thức xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn nhờ thẩm thấu các chất dinh dưỡng trong dung dịch qua vách
nhất là trên các giống lúa lai có nguồn gốc từ Trung Quốc (Bùi Trọng Thuỷ
và Phan Hữu Tôn, 2004)
Con ñường xâm nhập chủ yếu của vi khuẩn gây bệnh bạc lá là qua các vết thương xây xát ở trên lá do mưa bão gây ra Ngoài ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thủy khổng ở mép lá, ñầu mút lá Ở một số nước thì thói quen mạ thường ñược xén ñầu lá trước khi cấy tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập và gây hại Sau khi xâm nhập vào lỗ thủy khổng vi khuẩn nhân
Trang 19nhanh trong biểu mô, là nơi thông với mạch dẫn lá, khi ñó một số vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống này, còn một số khác thoát ra ngoài qua lỗ thủy khổng (Taoei và Muko, 1960) Ishitama (1922) cho rằng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa có hình gậy ngắn, hai ñầu hơi tròn, kích thước từ 1- 2 x 0, 5- 0, 9 µm, có một tiêm mao dài 6 - 8µm, vi khuẩn Gram âm không hình thành bào tử, các tế bào vi khuẩn có màng nhầy bao bọc và ñược nối với nhau thành một khối vững chắc
2.2.2 Triệu chứng
Bệnh bạc lá phát sinh và gây hại trong suốt thời kỳ mạ ñến thời kỳ lúa chín nhưng triệu chứng bệnh ñiển hình thường xuất hiện từ thời kỳ ñẻ nhánh tối ña ñến thời kỳ lúa trỗ và chín sữa
Vào năm 1946, Goto chỉ ra rằng bệnh bạc lá trên thế giới có 3 triệu chứng ñiển hình: Bạc lá, vàng nhạt nhiệt ñới và héo xanh
Còn theo SH,OU (1983) mô tả bệnh bạc lá lúa như sau: Bệnh thường xuất hiện từ giai ñoạn ñẻ nhánh ñến khi lúa trỗ, trường hợp nghiêm trọng bệnh thường xuất hiện trên mạ
- Trên mạ: ðầu tiên xuất hiện những ñốm nhỏ mộng nước ở rìa ngoài mép lá, các ñốm này to dần, lá chuyển sang màu vàng khô nhanh rồi chết
- Trên lúa: Vết bệnh thường bắt ñầu từ rìa lá, cách ngọn lá khoảng vài
cm, vết bệnh phát triển dọc theo phiến lá cả về chiều dài lẫn chiều rộng, quanh vết bệnh thường có ñường viền gợn sóng phân biệt giữa phần bị bệnh
và phần không bị bệnh
- Trên hạt: Lúa bị nhiễm trên hạt có những vết bệnh thường không màu, xung quanh có viền nước, các vết bệnh thường ñược nhìn thấy rõ khi hạt lúa còn non và xanh, khi chín vết bệnh chuyển sang màu vàng, xám hoặc màu vàng nhạt
Kết quả nghiên cứu của Bộ môn Bệnh cây - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội cho thấy có hai loại hình triệu chứng của bệnh bạc lá lúa: Bạc
Trang 20lá gợn vàng và bạc lá tái xanh Loại hình bạc lá gợn vàng phổ biến trên hầu hết các giống và các vụ mùa, còn loại hình bạc lá tái xanh chỉ xuất hiện trên một số giống lúa, ñặc biệt với một số giống lúa ngắn ngày, chịu phân, phiến lá
to, lá ñứng
Furuya & ctv (2002) ñã xác ñịnh miền Bắc Việt Nam tồn tại ít nhất 10
chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh Kết quả nghiên cứu bước ñầu
trong 3 năm 2001 - 2003 nhóm nghiên cứu bạc lá ðHNNI (HAU - RLBGray)
ñã thu thập và bảo quản ñược 154 Isolate ở 11 tỉnh phía Bắc trên 27 giống lúa
ở 4 lưu vực sông lớn Bằng phương pháp lây nhiễm các dòng ñẳng gen với các chủng vi khuẩn nhóm nghiên cứu ñã ñưa ra kết luận: Tổ hợp hai gen không làm thay ñổi tính kháng nhiễm của từng gen thành phần Nghiên cứu
tìm hiểu các gen kháng bệnh bạc lá các nhà khoa học kết luận gen Xa4, xa5, Xa7, Xa21 chống ñược hầu hết các các chủng vi khuẩn bạc lá ðiều này có ý
nghĩa quan trọng trong công tác lai tạo giống kháng bệnh, thay vì phải tổ hợp
nhiều gen vào một giống chúng ta chỉ cần có một trong các gen Xa4, xa5, xa7, Xa21 thì có thể tạo giống kháng bệnh bền vững,
2.2.3 Tác hại của bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá phổ biến ở hầu hết các vùng trồng lúa Hiện nay nó ñược xem là bệnh hại nguy hiểm nhất làm giảm năng suất và chất lượng lúa Theo Sriva Satava (1967) bệnh làm giảm năng suất lúa từ 6 - 60%
Theo Lê Lương Tề thì mức ñộ tác hại của bệnh phụ thuộc vào thời kỳ
bị bệnh của cây lúa Nếu cây lúa bị bệnh ở thời kỳ ñẻ nhánh thì mức ñộ bệnh
về sau thường rất nặng, ảnh hưởng rõ rệt tới năng suất và có thể là giảm năng suất tới 41% trở lên Bệnh bạc lá làm cho lá ñòng và lá công năng bị cháy, sớm tàn, nhanh chóng trở nên khô rồi chết, làm bộ lá xơ xác ảnh hưởng tới khả năng quang hợp của cây, làm tăng tỷ lệ hạt lép, giảm năng suất rõ rệt
2.2.4 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới
Trang 21Năm 1961, Nishimura nghiên cứu về gen kháng bệnh, trong nghiên cứu Nishimura ñã tìm ra tính kháng bạc lá do một gen trội kiểm soát Năm 1965, Kuhara và cộng sự ñã nhận xét gen kháng bệnh bạc lá ñược kiểm soát bởi một gen trội không hoàn toàn Ezuka và Horino 1974 ñã cho rằng gen kháng bạc
lá ñược kiểm soát bởi một gen lặn và ñối với giống DZ192 gen kháng bệnh ñược kiểm soát bởi 2 gen lặn
Sidhu và cộng sự (1978) ñã phân tích 74 giống lúa trồng và tìm ra 3
giống DV85, DV86 và DZ275 mang một gen lặn là xa5 có tính kháng tốt như
các gen trội Quy mô rộng lớn và lâu dài của các giống lúa trồng với một gen ñơn có thể phát sinh mầm bệnh gây bệnh trở lại và làm cho tính kháng của ñơn gen kháng giảm dần Như vậy nhóm gen kháng có thể làm cản trở sự xâm
nhiễm của vi khuẩn bằng nhóm gen kháng ñặc hiệu xa5, xa13 và Xa21 trong
lúa Ở quần thể vi khuẩn có khả năng phát sinh những biến ñổi chất ñộc từ hai hoặc nhiều nhóm nòi mới ñã làm ảnh hưởng ñến nhóm gen kháng ñặc hiệu Khi chúng ta sử dụng một gen ñơn trội, nhóm gen kháng ñặc hiệu ñã ñược sử dụng trong phương pháp chọn giống từ sử dụng ñơn gen trội ñến một nhóm gen kháng ñặc hiệu Như vậy khi sử dụng nhiều gen kháng trong một giống lúa sẽ tạo nên tính kháng ngang ổn ñịnh, trên qui mô rộng hơn so với khi chúng ta sử dụng một gen kháng ñơn lẻ
Những năm 80 của thế kỷ XX, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế ñã xác ñịnh bản chất di truyền tính chống bệnh là do gen quy ñịnh ðiều này ñược khẳng ñịnh chắc chắn nhờ vào những nghiên cứu của các nhà khoa học cùng những kỹ thuật hiện ñại Tính kháng của cây trồng là khả năng của cây làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của ký sinh sau khi có sự tiếp xúc của ký sinh với ký chủ ñược khởi phát Trong tính kháng của cây trồng có tính kháng dọc (kháng chuyên nòi) do ñơn gen kiểm soát và tính kháng ngang (kháng nhiều nòi) do một hoặc ña gen quyết ñịnh
Trang 22Cho ñến nay, các nhà khoa học ñã tìm ra ñược 30 gen kháng bệnh bạc
lá ở cây lúa trồng và lúa hoang Tính kháng có thể quy ñịnh bởi một gen ñơn
trội như: Xa21, Xa1 , Xa26 , Xa27 , Xa3 ; một gen ñơn lặn như: xa5 và xa13; hoặc do hai gen kết hợp với nhau như Xa1/Xa4, Xa4/Xa7 Các gen kháng nằm trên các nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: gen Xa1, Xa2, Xa12 nằm trên NST
số 4, gen lặn xa5 nằm trên NST số 5, gen Xa7 nằm trên NST số 6, gen Xa15 nằm trên NST số 8, gen Xa9 nằm trên NST số 10 và các gen Xa10, Xa21, Xa23, Xa3, Xa4 nằm trên NST số 11
Hiện nay trong nghiên cứu ñã sử dụng tới 10 dòng ñẳng gen (dòng chỉ
thị) là: IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB11, IRBB14, IRBB21 chứa lần lượt các gen ñơn chống bệnh Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa11, Xa14, Xa21 Tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa21 ở loài lúa dại Oryzae longistaminata Khác với sự nhận diện của một gen khác, gen trội Xa21 kháng toàn bộ các
chủng bạc lá tại Ấn ðộ và Philippin khi thử kiểm tra tính kháng bệnh
Ngày nay, chỉ thị phân tử ñược sử dụng rộng rãi như một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu di truyền và cho phép ñánh giá một số lượng lớn locus trải khắp bộ gen của nhiều loài cây trồng cũng như nhận dạng các giống lúa kháng bệnh bạc lá như RFLP, AFLP, RAPD, SSR Trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc lá Zeng và cs (1996) ñã sử dụng chỉ thị RFLP và
RAPD ñể lập bản ñồ phân tử gen xa13 kháng bạc lá trên cây lúa Còn ñối với
chỉ thị SSR, hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR ñã ñược thiết lập, phủ kín trên bản ñồ liên kết di truyền của lúa Trong những năm gần ñây, nhiều công trình
sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu ña dạng di truyền và ADN fingerprinting ñể nhận dạng giống ở lúa ñã ñược công bố Sử dụng chỉ thị phân tử ñể xác ñịnh
gen kháng bạc lá, Yanchang và cs (2004) ñã tiến hành kiểm tra gen Xa21 trên
200 cá thể F2 bằng chỉ thị pTA248 Kết quả cho thấy có 47 cá thể mang gen kháng ñồng hợp tử, 98 cá thể mang gen kháng dị hợp tử Tất cả các cá thể này
Trang 23có mức ñộ kháng trung bình với chủng X-03 Siriporn Korinsak (2009) sử
dụng chỉ thị SSR-RM5509 ñể phát hiện gen Xa7 trên quần thể F2 Cả 2 gen Xa7 và Xa21 ñều là gen trội có phổ kháng rộng liên kết chặt chẽ với mục tiêu
và ở trạng thái ñồng hợp tử có khả năng kháng tốt hơn trạng thái dị hợp tử
Chuyển gen kháng vào một dòng lúa bố, mẹ triển vọng Xu hướng hiện nay là tạo ra các dòng ñẳng gen (Near Isogenic Line) có mang gen kháng sau
ñó lai quy tụ gen kháng ñó vào một nguồn vật liệu Chọn lọc cá thể mang gen kháng bằng chỉ thị phân tử dòng ñẳng gen mang gen kháng và lai quy tụ gen kháng (Pyramid) Nhiều bản ñồ phân tử cùng các vị trí gen ñiều khiển hầu hết các tính trạng khác nhau ñã ñược ñịnh vị thay thế cho những phương pháp ñánh giá theo hình thái cổ ñiển thông thường Thiết lập bản ñồ liên kết gen trên cây lúa ñầu tiên với RFLP bao gồm 135 loci Bản ñồ phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài tổng cộng 1.389 cM trên hệ gen cây lúa từ cặp lai
IR34583 (Indica) và Bulu Dalam (Javanica) Ba năm sau ñó, bản ñồ thứ hai ñược thiết lập từ quần thể IRAT117 (Japonica) và Apura (Indica) Một nhóm
tác giả là Saito và cs (1991) thiết lập một bản ñồ di truyền dựa trên cặp lai
Kasalath (Indica) và Fl134 (Japonica) với 347 chỉ thị RFLP, phủ trên 12
nhiễm sắc thể, với chiều dài tổng cộng 1.836 cM trên hệ gen cây lúa Causse
và ctv (1994) thiết lập một bản ñồ khác dùng chỉ thị RFLP ñể xây dựng bản
ñồ di truyền từ quần thể hồi giao (backcross) giữa O.sativa (dạng hình Indica)
và O.longistaminata Chúng bao gồm những chỉ thị từ hệ gen cây lúa với ký
hiệu RG và RZ, từ lúa mì với ký hiệu CDO và lúa mạch với ký hiệu BCD Tổng số 600 chỉ thị phủ trên 12 nhiễm sắc thể Nori Kurata và ctv (1994)
dùng quần thể F2 của Nipponbare (Japonica) và Kasalath (Indica) ñể thiết lập
bản ñồ di truyền Bản ñồ ñược bao phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng
chiều dài 1.575 cM Việc thiết lập bản ñồ trên tâm ñộng (centromere) cũng
ñược thực hiện với 170 chỉ thị RFLP ðối với bệnh bạc lá lúa, việc dùng chỉ thị trên cơ sở kỹ thuật PCR, ñể lập bản ñồ gen rất phức tạp và khó khăn
Trang 24Causse và cs (1994) ñã thiết lập và lập bản ñồ phân tử gen xa1 nằm trên NST
số 4 Tiếp theo ñó Li và cs (1999) ñã thiết lập bản ñồ RFLP và xác ñịnh gen
xa4 kháng bệnh bạc lá nằm trên NST 11
Shiping Wang, Phòng thí nghiệm trọng ñiểm quốc gia, Wuhan, Trung
Quốc, nghiên cứu gen lặn xa-13 theo phương pháp dòng hóa gen trên bản ñồ (map- based cloning) Alen trội Xa-13 cho thể hiện thông qua chiến lược
nghiên cứu RNAi Tiến hành chuyển nạp gen ñược dòng hóa vào cây lúa bình thường Tất cả cây lúa biến ñổi gen ñều có hiện tượng ức chế thể hiện alen
trội Xa-13 và nó thể hiện tính kháng bệnh bạc lá Các tác giả cũng ức chế gen lặn xa-13 bằng RNAi, cây chuyển gen kháng bệnh hơn cây bình thường Phân tích so sánh chuỗi trình tự gen cho thấy có sự khác biệt rất lớn giữa xa-13 và Xa-13 tại vùng “promoter” Kết quả khẳng ñịnh rằng Xa-13 là một regulator
âm tính của tính kháng bệnh bạc lá
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp chỉ thị phân tử, một quy trình công nghệ chọn giống ñã ñược ra ñời, ñó là quy trình chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker- Assisted Selection) (MAS) Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta ñưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào một giống khác bằng phương pháp hồi giao qua 5 - 6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 ñến thế hệ tiếp theo Mỗi gen chính thường chỉ kháng ñược với một chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào ñó, do vậy nếu quy tụ ñược vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra ñược một dòng lúa kháng ñược nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại Như vậy muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững ñối với dịch hại, người ta phải ñưa một vài gen kháng hiệu quả cao vào
genome ñích ðối với bệnh bạc lá, các gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 ñược các
nhà chọn tạo giống quan tâm nhất vì các gen này có phổ kháng rộng Tại Ấn
ðộ, việc quy tụ nhiều gen kháng vào cùng một tổ hợp gen ñã ñược quan tâm
và tạo ra ñược các dòng mang nhiều gen kháng làm nguồn vật liệu tốt ñể
Trang 25chuyển tổ hợp gen này vào các giống lúa thương mại tăng sức kháng bạc lá
của các giống, dòng NH56 mang 4 gen (Xa4, xa5, Xa7 và Xa21) Trong
chương trình lúa lai tại Trung Quốc, việc quy tụ các gen kháng bệnh vào các dòng phục hồi ñể tăng tính kháng của lúa lai cũng ñược quan tâm ñặc biệt các
gen Xa7, Xa21 ñã ñược quy tụ vào giống lúa Minhhue 63
Trong nghiên cứu về trình tự genome của các chủng vi khuẩn bạc lá,
hiện ñã có một số nghiên cứu về trình tự genome của các chủng vi khuẩn Xoo, trong ñó phải kể ñến là công trình nghiên cứu về cấu trúc genome của hai
chủng phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn Quốc), ñược công bố trên website: http://microbe.dna.affrc.go.jp Theo
ñó genome của Xoo chủng MAFF 311018 gồm một nhiễm sắc thể vòng dài
4.940.217bp, với hàm lượng G + C trung bình chiếm 63,7% Bên trong không phát hiện thấy có chứa một thể plasmid nào Trong ñó phát hiện thấy có hai
bản copy của operon rrn và thứ tự liền kề một số gen như sau: 16S-tRNAAla tRNAIle -23S-5S Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành các tRNAs ñại diện cho 43 loại tRNA khác nhau
-Trong tổng số 4.372 khung ñọc mở ñược phát hiện (ORFs) trong genome chủng MAFF311018 thì có 2.799 (64%) gen ñã xác ñịnh ñược chức năng, 1.383 (chiếm 32%) protein ñược xác ñịnh tương ñồng với nhiều protein
ñiển hình của vi khuẩn Xoo nhưng chưa biết rõ chức năng Có 190 gen (4%)
ñược xác ñịnh là không tương ñồng rõ rệt với những gen ñã ñược xác ñịnh và công bố trước ñó của vi khuẩn
Theo Byoung- Moo Lee và cộng sự (2005) thì genome vi khuẩn Xoo
chủng KACC10331 có cấu trúc như sau: Tổng genome nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439bp, với hàm lượng C + G chiếm 63,7% Genome có 4637 khung ñọc mở, trong ñó có 3340 (72 %) có thể xác ñịnh ñược chức năng Khoảng 80% số gen trong ñó ñược phát hiện thấy trong các loài vi khuẩn
X.axonopodis pv citri (Xac) và X.campestris pv campestris (Xcc) Tuy nhiên,
Trang 26245 gen ñược xác ñịnh là chỉ ñặc thù ñối với Xoo, trong ñó có 8 gen gây ñộc
ðồng thời nhóm tác giả còn xác ñịnh ñược vị trí của cả những gen tạo phản
ứng siêu mẫn (hrp), những gen sinh ra vỏ polysacarit, gen mã hóa tạo enzym
phân rã màng tế bào thực vật ðiều này giúp chúng ta hiểu rõ ñược cơ chế
tương tác giữa vi khuẩn Xoo gây bệnh ñối với ký chủ họ hòa thảo
Bên cạnh các ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống bạc lá, ngày nay một công nghệ hiện ñại cũng ñược ứng dụng mạnh mẽ trong việc chọn tạo giống lúa kháng bạc lá ñó là công nghệ gen Trong gần một thập kỉ trở lại ñây, nhiều giống lúa kháng bệnh bạc lá ñã ñược chọn tạo bằng các phương pháp hiện ñại khác nhau như dùng súng bắn gen (bombardment), chuyển gen thông
qua vi khuẩn Agrobacterium Hai tác giả Rashid (1996) và Zhang (1999) ñã công bố việc chuyển gen Xa21 vào phôi ở dạng huyền phù nhờ súng bắn gen giúp tạo ra tính kháng cho lúa ñối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá Zhang và cộng sự (2006) ñã thành công trong việc chuyển gen Xa21 vào giống lúa IR64, IR72 thuộc nhóm Indica bằng phương pháp sử dụng súng
bắn gen và ñã tạo ñược các dòng Minghui 63 và BG90-2 có khả năng kháng cao với bệnh bạc lá Cũng bằng phương pháp súng bắn gen, Terada và
Shimamoto (2004) cũng ñã chọn lọc ñược các dòng lúa mang gen Xa21 kháng
bệnh bạc lá với việc sử dụng protein AP1 làm promotor Trong số 30 dòng chọn lọc, có 27 dòng lúa có khả năng kháng cao với bệnh bạc lá Gần ñây
Khan và cs (2007) ñã thành công trong việc chuyển gen xa21 vào cây lúa kháng bệnh bạc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium
2.2.5 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam
Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2004) ñã phân lập và xác ñịnh ñược ở miền Bắc Việt Nam có 10 chủng ñang tồn tại Gần ñây, trong nghiên cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc Phan Hữu Tôn (2004) ñã nhận
thấy các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện ñan xen, ở một ñịa phương có thể
xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều
Trang 27ñịa phương Trên một vết bệnh ñôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng
vi khuẩn nhất ñịnh
Hiện nay, ñã có 30 gen kháng ñược phát hiện, trong ñó có 21 gen trội và
9 gen lặn Từ các kết quả nghiên cứu trong nước, bước ñầu có thể khẳng ñịnh
các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa ñịa phương ở Việt Nam Các gen kháng xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo giống lúa kháng
bệnh, bởi chúng có khả năng kháng ñược hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến của Việt Nam
Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Trọng Thuỷ (2004) các gen ñơn trội
Xa7, Xa21 và gen lặn xa5 có phản ứng kháng (R), kháng vừa (M) với tất cả
10 chủng vi khuẩn X oryzae gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam ðây là ba gen Xa - gen kháng rất có ý nghĩa trong việc sử dụng lai tạo, chọn lọc các giống lúa chống bệnh bạc lá Gen Xa4 kháng ñược các chủng Y3, Y4, Y5 và Y7 Gen Xa3 có phản ứng kháng (R) chủng Y1 Gen Xa10 kháng ñược chủng
Y2 và kháng vừa (M) chủng Y3
Sự khác biệt lớn của các nhóm gen kháng bao gồm IRBB7, IRBB5, IRBB4 và IRBB21 IRBB7 kháng ñược các chủng nổi bật, IRBB5 kháng ñược hầu hết các chủng ñại diện Kết quả nghiên cứu các dòng ñẳng gen thu
ñược các dòng chứa gen Xa7, xa5 chống ñược hầu hết các chủng phân lập, tiếp ñến Xa21, Xa4 Kết quả cho thấy vai trò quan trọng của việc sử dụng các
gen này trong chương trình chọn giống lúa chống bệnh bạc lá cho miền Bắc
Việt Nam Như vậy khi chúng ta cần sử dụng gen trội Xa7, Xa21 có mặt trong
dòng bố hoặc mẹ, con lai F1 sẽ ñược thừa hưởng tính kháng bệnh 100%
Trường hợp sử dụng gẹn lặn xa5 sẽ dùng trong chọn tạo giống lúa thuần Những nghiên cứu về ña dạng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam cho
ñến nay vẫn thường chỉ sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng lúa ñẳng ñơn gen (gen kháng bệnh bạc lá) Kết quả là có thể thiết lập
Trang 28ựược một phổ kháng nhiễm và dựa vào ựây, các tác giả phân tắch sự ựa hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những nhóm chủng có biểu hiện kháng nhiễm khác nhau ựối với các dòng ựẳng ựơn gen Còn những nghiên
cứu về ựa dạng vi khuẩn Xoo ứng dụng chỉ thị phân tử ADN thực thụ thì gần
như chưa ựược tiến hành hoặc mới chỉ sử dụng chỉ thị phân tử ựể xác ựịnh vi
khuẩn Xoo
đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các giống lúa Việt Nam, Lại Văn E và cs., 1999 ựã thu thập 40 dòng vi khẩn kháng bệnh bạc lá khác nhau của Việt Nam Dựa trên tắnh gây bệnh cho bộ chỉ thị IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB8, IRBB10, IRBB11, IR24, IR20, Kinmaze, TN1 và BJ1 Các dòng chỉ thị ựược chia ra thành 7 nhóm khác nhau Trong 3
giống chỉ thị IRBB5, IRBB7 và BJ1 có phản ứng kháng ựối với tất cả các dòng vi khuẩn IRBB8 kháng ựối với 37 dòng vi khuẩn IRBB3 kháng với 36
dòng vi khuẩn IRBB2, IRBB11, Kimaze và TN1 có phản ứng nhiễm ựối với tất cả các dòng Những giống chỉ thị còn lại kháng ựối với một số dòng, những dòng thuộc vào nhóm gây bệnh chắnh hiện diện trên hầu hết các vùng trồng lúa của Việt Nam Phần lớn các giống lúa triển vọng cho thấy có phản ứng nhiễm với tất cả các dòng khuẩn thu thập Tuy nhiên một vài giống lúa của ựồng bằng sông Cửu Long lại kháng ựối với các dòng vi khuẩn ở phắa Bắc Việt Nam
Nghiên cứu ựa dạng tập ựoàn giống lúa có tắnh kháng khác nhau với bệnh bạc lá bằng kĩ thuật RAPD, tác giả đinh Thị Phòng ựã sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên với 36 giống lúa thu ựược tổng số 392 phân ựoạn ADN ựược nhân lên Tất cả 21 mồi RAPD ựều cho tắnh ựa hình Sự sai khác về hệ số tương ựồng di truyền giữa các giống khoảng 22%- 64 % Có tổng số 36 giống lúa có tắnh kháng bệnh bạc lá khác nhau có thể sử dụng như là những nguyên liệu ựể xác ựịnh nhóm gen kháng của từng giống lúa làm cơ sở trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá có năng suất, chất lượng cao
Trang 29Nghiên cứu của Hoàng đình đình và cs (2008) về việc ựánh giá sơ bộ
kiểu kắ sinh các mẫu li trắch vi khuẩn Xanthomonas oryzae vùng đồng Bằng
Sông Cửu Long kết quả cho thấy 41 mẫu vi khuẩn thuần cho phản ứng gây bệnh trên bộ chỉ thị gồm 10 dòng ựẳng gen chứa 10 gen kháng bệnh khác nhau Kết quả phản ứng của các mẫu vi khuẩn này trên 10 gen kháng cho ra
tắnh kháng nhiễm rất khác biệt Gen xa5 có hiệu lực kháng bệnh cao nhất, kế ựến là Xa7, Xa21 và xa13 Sáu nòi sinh lý ựã ựược xác ựịnh và cho thấy
chúng phân bố khác nhau trên các tỉnh vùng đBSCL Nòi A, E và F phổ biến nhất và có xuất hiện gây hại ở 6 ựến 8 tỉnh trong toàn vùng, trong khi nòi B, C
và D xuất hiện ở 3 ựến 5 tỉnh trong vùng
Nguyễn Thị Pha và cs (2004) sử dụng các chỉ thị STS (RG556, RG136, pTA248 ), SSR (RM21, RM114, RM122, RM164, RM190) ựể phát hiện các
gen Xa21, xa5, xa13 trên các giống lúa ựịa phương và bố mẹ lai Lã Vinh Hoa
và cs (2010) ựã sử dụng các chỉ thị Npb 181, P3 và RG 556 ựể phát hiện ra
các gen Xa4, Xa7, xa5 tương ứng với 150 mẫu giống thu ựược từ các ựịa
phương ở miền Bắc Việt Nam
Vũ Hồng Quảng và cs (2011) ựã thành công sử dụng các chỉ thị RM5509
và pTA248 ựể phát hiện gen kháng bạc lá tương ứng ở xa7, xa21 ở các dòng bố
mẹ 9311BB, D42BB, R308BB Chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen Xa21, Xa7: pTA248, RM5509 tương ứng ựã ựược sử dụng ựể phát hiện các gen này
trên 3 dòng bố 9311BB, D42BB, R308BB Kết quả kiểm tra cho thấy: dòng bố
R308BB có 90% số cá thể mang gen kháng Xa21 ựồng hợp tử, 10% số cá thể
mang gen dị hợp tử; dòng bố D42BB có 10% số cá thể mang gen kháng dị hợp
tử, dòng bố 9311BB có 100% số cá thể mang gen Xa7
Trong công tác chọn tạo giống, chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở Miền Bắc của Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng công nghệ sinh học ựể phân lập, nuôi cấy và phân biệt gen kháng bệnh bằng PCR ựã xác ựịnh 16 chủng vi
Trang 30khuẩn Xanthomonas oryzea gây bệnh khác nhau Các dòng chỉ thị IRBB5 (Xa5), IRBB7 (Xa7), IRBB21 (Xa21) có tính kháng ña số các chủng vi khuẩn
gây bệnh
Áp dụng chỉ thị phân tử ñể chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá của Viện nghiên cứu lúa ðồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp chỉ thị marker kết hợp với chọn giống truyền thống, thanh lọc và ñánh giá kiểu hình, kiểu
gen các giống lúa mùa ñịa phương xác ñịnh gen kháng bạc lá Xa5, Xa13 trên
nhiễm sắc thể số 5, số 8 và việc liên kết các gen mục tiêu làm tăng tính kháng rộng của giống lúa
Phan Thanh Tùng và nhóm tác giả Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, sử dụng 11 mẫu vi khuẩn ở miền Bắc Việt Nam, ñược phân lập bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và 9 isolate mới ñược thu thập vào vụ mùa
2007 ở một số vùng tại miền Bắc Việt Nam (ký hiệu 2, 4, 5 ); 11 dòng lúa ñẳng ñơn gen (gen kháng bệnh bạc lá), 1 giống ñối chứng mẫn cảm là IR24 Ngoài phương pháp nghiên cứu và phân lập, tác giả còn sử dụng phương pháp
nuôi cấy vi khuẩn; chiết tách ADN tổng số và xác ñịnh Xoo bằng PCR; xác ñịnh ña dạng di truyền Xoo, lây nhiễm nhân tạo Gần ñây nhất, các nhà chọn
tạo giống của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã thành công trong việc
chuyển gen Xa21 vào giống lúa Bác ưu 903 nhập từ Trung Quốc, có năng suất
cao và ñặc biệt có khả năng kháng bệnh bạc lá rất tốt
Tại Viện Di truyền Nông Nghiệp, tác giả Vũ ðức Quang và nhóm tác giả ñã thu thập ñược một số giống nhận gen trong các tổ hợp lai, dòng NILs
mang ñơn gen kháng Xa21; Xa4; Xa5; Xa7, chọn ñược 15 nòi vi khuẩn có
ñộc tính cao và ñánh giá ñược một số ñặc tính nông học của các mẫu giống
2.2.6 Những ñịnh hướng về nghiên cứu, chọn tạo giống lúa kháng bạc lá
Chọn tạo các dòng/giống lúa kháng bệnh bạc lá bền vững ñược xem là biện pháp ñem lại hiệu quả cao trước nguy cơ hình thành và bùng phát dịch
Trang 31bệnh Thông qua các nghiên cứu trước ñây, chúng ta ñã có ñược nguồn dữ liệu
và vật liệu phục vụ công tác nghiên cứu và chọn tạo giống Tuy nhiên, ñể có ñủ
cơ sở dữ liệu và nguồn vật liệu cần thiết phục vụ cho công tác chọn tạo các giống lúa kháng bệnh bạc lá ñáp ứng ñược yêu cầu của thực tế sản xuất chúng
ta cần phải tiến hành nghiên cứu một cách toàn diện hơn nữa trong giai ñoạn hiện nay
(1) Xây dựng cơ sở dữ liệu về các chủng, loài vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam
(2) Xây dựng nguồn vật liệu là các dòng, các giống lúa có chứa gen kháng hữu hiệu
(3) Xây dựng phương pháp chọn tạo giống kháng bạc lá
Trong các phương pháp chỉ thị phân tử khác nhau ñược sử dụng thì phương pháp PCR ñược sử dụng phổ biến hơn trong công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá vì tính ưu việt của nó cao hơn hẳn những phương pháp khác Nội dung: Khi ñã xác ñịnh ñược kết quả nghiên cứu của một gen nào
ñó với RFLP mẫu dò (ñộ liên kết càng nhỏ càng chính xác) người ta tiến hành sắp xếp trình tự các nu trên mẫu ñoạn RFLP sau ñó chọn một ñoạn ñặc hiệu rồi thiết kế hai ñoạn mồi ñầu 5’ và ñầu 3’, dùng PCR nhân ñoạn ñó lên, sản phẩm nhân PCR ñược chạy ñiện di trên gel agarose có thể phát hiện ñược sự sai khác về kiểu hình Trong trường hợp sau khi ñiện di không phát hiện sai khác về kiểu hình người ta tiếp tục cắt sản phẩm PCR bằng enzym cắt giới hạn sẽ tạo ra tính ña hình
Nguyên tắc: Người ta thiết lập ñược bản ñồ chi tiết về các chỉ thị DNA liên kết với các gen quy ñịnh tính trạng nông sinh học khác nhau Trên cơ sở
ñó tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này bằng cách tìm
sự có mặt của một DNA ñánh dấu nào ñó liên kết chặt với gen ñó chứ không phải dựa vào kiểu hình Từ ñó giúp các nhà chọn giống phân biệt ñược những
Trang 32sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể có quan hệ họ hàng gần nhau, tăng ñược hiệu quả và ñộ chính xác của chọn lọc, ñặc biệt là những tính trạng quy ñịnh bởi gen lặn
Trang 33PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu
- ðịa ñiểm: Khu ruộng thí nghiệm và phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học phân tử, Khoa CNSH, Trường ðHNN Hà Nội
- Thời gian nghiên cứu: Từ 06/2013 ñến 12/2013
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1.Vật liệu
- Giống nghiên cứu: gồm 30 dòng, giống lúa tẻ mới chọn tạo
- Giống ñối chứng:
+ ðối chứng về năng suất: Khang Dân 18
+ ðối chứng về chất lượng: Giống T10
+ ðối chứng trong lây nhiễm bạc lá nhân tạo: giống chuẩn nhiễm IR24; các dòng chỉ thị ñẳng gen IRBB4; IRBB5; IRBB7
- Chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae: chủng 1, chủng 2, chủng 3,
chủng 4, chủng 5, chủng 6, chủng 7, chủng 8, chủng 9, chủng 10 Các chủng
vi khuẩn này ñược thu thập tại một số tỉnh phía Bắc
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Cây cách cây 12cm, cấy 1 dảnh
- Tiến hành làm ñất và bón phân theo quy trình phổ biến ñang sử dụng ñại trà
Trang 343.2.2.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp ựánh giá
Áp dụng theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh
tác và sử dụng của giống lúa QCVN 01-55:2011/BNNPTNT Các chỉ tiêu ựược theo dõi trong ựiều kiện ựồng ruộng bình thường Các chỉ tiêu ựịnh tắnh ựược ựánh giá bằng mắt, thực hiện qua quan sát toàn bộ ô thắ nghiệm, trên từng cây hoặc các bộ phận của cây và cho ựiểm Các chỉ tiêu ựịnh lượng ựược
ựo ựếm trên cây mẫu ựược lấy ngẫu nhiên, trừ cây ở hàng biên Các chỉ tiêu ựược theo dõi vào những giai ựoạn sinh trưởng thắch hợp của cây lúa
3.2.2.3 Thời gian qua các giai ựoạn sinh trưởng
- Thời gian từ gieo ựến trỗ: Xác ựịnh từ khi gieo ựến khi có 10% số cây
có bông thoát khỏi bẹ lá ựòng khoảng 5cm
- Thời gian trỗ: số ngày từ bắt ựẫu trỗ (xác ựịnh từ khi có 10% số cây
có bông thoát khỏi bẹ lá ựòng khoảng 5cm) ựến kết thúc trỗ (khi có 80% số cây trỗ)
- Thời gian sinh trưởng: Tắnh số ngày từ khi gieo ựến khi 85% số hạt trên bông chắn
3.2.2.4 đặc ựiểm nông sinh học
- độ thuần ựồng ruộng: đếm và tắnh tỷ lệ cây khác dạng trên mỗi ô thắ nghiệm đánh giá ở giai ựoạn trỗ ựến chắn:
1-Cao: Cây khác dạng <0,3%
3-Trung bình: Cây khác dạng ≥ 0,3%-0,5%
5-Thấp: Cây khác dạng >0,5%
- độ thoát cổ bông: Quan sát toàn bộ số cây trên ô ở giai ựoạn chắn sữa
ựến chắn, ựánh giá và cho ựiểm:
1-Thoát hoàn toàn
5-Thoát vừa ựúng cổ bông
9-Thoát một phần
Trang 35- ðộ cứng cây: Quan sát tư thế của cây trước thu hoạch, ñánh giá và
cho ñiểm:
1-Cứng: Cây không bị ñổ
5-Trung bình: Hầu hết các cây bị nghiêng
9-Yếu: Hầu hết cây bị ñổ rạp
- ðộ tàn lá: Quan sát sự chuyển màu của lá ở giai ñoạn chín, ñánh giá
và cho ñiểm:
1-Muộn: Lá giữ mầu xanh tự nhiên
5-Trung bình: Các lá trên biến vàng
9-Sớm: Tất cả lá biến vàng hoặc chết
- Chiều cao cây (cm): ðo từ mặt ñất ñến ñỉnh bông cao nhất (không kể
râu) Tiến hành ño ở giai ñoạn chín, trên 10 cây mẫu, ñơn vị tính centimet (cm)
3.2.2.5 Các yếu tố cấu thành năng suất
- Số bông hữu hiệu: ðếm số bông có ít nhất 10 hạt chắc của một cây, ñếm trên 5 cây mẫu ở giai ñoạn chín
- Số hạt/bông: ðếm tổng số hạt/cây, tính trung bình số hạt/bông, ñếm trên 5 cây mẫu ở giai ñoạn chín
- Tỷ lệ lép (%): Tính tỷ lệ phần trăm số hạt lép trên bông, tính trung bình trên 5 cây mẫu ở giai ñoạn chín
- Khối lượng 1000 hạt (gam): Cân 8 mẫu 100 hạt ở ñộ ẩm 14%, lấy một chữ số sau dấu phẩy, thực hiện ở giai ñoạn chín
- Năng suất hạt thực thu (tạ/ha): Cân khối lượng hạt trên mỗi ô ở ñộ ẩm hạt 14% ở giai ñoạn chín, lấy hai chữ số sau dấu phẩy
- Năng suất lý thuyết ñược tính theo công thức:
NSLT= (Số khóm/m 2 *Số bông hữu hiệu/khóm*Số hạt chắc/bông
*Khối lượng 1000 hạt)*10 -4 tạ/ha
Trang 363.2.2.6 Mức ñộ nhiễm sâu bệnh trên ñồng ruộng
- Bệnh bạc lá: Quan sát diện tích vết bệnh trên lá từ giai ñoạn làm ñòng ñến vào chắc, ñánh giá và cho ñiểm:
- Bệnh khô vằn: Quan sát ñộ cao tương ñối của vết bệnh trên lá hoặc bẹ
lá ở giai ñoạn chín sữa ñến vào chắc (việc ñánh giá biểu thị bằng % so với chiều cao cây), ñánh giá và cho ñiểm:
0: Không có triệu trứng
1: Vết bệnh thấp hơn 20% chiều cao cây
3: Vết bệnh 20%-30% chiều cao cây
5: Vết bệnh 31%-45% chiều cao cây
7: Vết bệnh 46%-65% chiều cao cây
9: Vết bệnh >65% chiều cao cây
- Sâu ñục thân: Quan sát số dảnh chết hoặc bông bạc ở giai ñoạn ñẻ nhánh ñến làm ñòng và giai ñoạn vào chắc ñến chín, ñánh giá và cho ñiểm: 0: Không bị hại
Trang 371: Hơi biến vàng trên một số cây
3: Lá biến vàng bộ phận chưa bị Ộcháy rầyỢ
5: Lá bị vàng rõ, cây lùn và héo, ắt hơn một nửa số cây bị cháy rầy, cây còn lại lùn nặng
7: Hơn một nửa số cây bị héo hoặc cháy rầy, số cây còn lại lùn nặng 9: Tất cả cây bị chết
3.2.2.7 đánh giá chất lượng gạo
- Tỷ lệ gạo xát (theo tiêu chuẩn TCVN 1643-1992): Cân 1kg mẫu thóc,
sử dụng máy xát mini, sau ựó cân phần gạo thu ựược (bao gồm cả phần gạo nguyên và tấm)
- Tỷ lệ gạo nguyên (theo tiêu chuẩn TCVN 1643-1992): Cân 25g mẫu gạo, chọn ra những hạt gạo còn nguyên vẹn, cân khối lượng những hạt gạo còn nguyên vẹn
Tỷ lệ gạo nguyên = Tổng khối lượng phần hạt gạo còn nguyên vẹn X 4
- Chiều dài hạt gạo (theo tiêu chuẩn TCVN 1643-1992): Lấy ngẫu nhiên
50 hạt gạo nguyên vẹn, dùng dụng cụ ựo chiều dài của từng hạt gạo Chiều dài trung bình của hạt gạo là trung bình cộng chiều dài của 50 hạt ựã ựo
- độ bạc bụng (theo tiêu chuẩn TCVN 8372:2010): dựa vào ựiểm trắng bạc trung bình của khối hạt gạo trắng và ựánh giá theo bảng 3.1:
Trang 38Bảng 3.1 Thang ựánh giá ựộ bạc bụng của hạt gạo
độ trắng bạc của khối hạt gạo trắng điểm trắng bạc trung bình
3.2.2.8 đánh giá chất lượng cơm
Theo tiêu chuẩn 10TCN 590-2004
Các chỉ tiêu ựược ựánh giá theo thang ựiểm 1, 2, 3, 4, 5 như sau:
Trang 39độ bóng:
1 Rất mờ, xỉn; 2 Hơi mờ, xỉn; 3 Hơi bóng; 4 Bóng; 5 Rất bóng
độ ngon:
1 Không ngon; 2 Hơi ngon; 3 Ngon vừa; 4 Ngon; 5 Rất ngon
3.2.2.7 đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo
* Môi Trường nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn Xanthomonas oryzae ựược nuôi cấy trên môi trường Wakimoto
- Thành phần môi trường gồm: Khoai tây 300g; ựường saccarose 15g; pepton 5g; agar 17g; Na2HPO4.12H2O 2g; Ca2(NO3)2.4H2O 0.5G; nước cất 100ml; pH 6,8-7,0
- Môi trường Wakimoto ựược hấp khử trùng ở nhiệt ựộ 121oC trong ống nghiệm thời gian 20 phút, tạo mặt thạch nghiêng
- Trước khi lây nhiễm nguồn vi khuẩn ựược cấy bảo quản trong môi trường sữa ở -30oC, ựược cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở 28oC sau 48- 72h tuổi, sau ựó pha loãng dung dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng ựạt ựược nồng ựộ 108CPU/ml ựể lây bệnh
* Phương pháp lây nhiễm
- Lây bệnh theo phương pháp cắt ựầu lá: Dùng kéo ựã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá (mỗi chủng vi khuẩn dùng một kéo vô trùng) cắt lên ựầu lá lúa một ựoạn dài khoảng 2- 5cm và lây nhiễm vào giai ựoạn lúa làm ựòng- trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ các
lá xanh
- Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thắ nghiệm ựể xác ựịnh khả năng duy trì ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách lây thử trên dòng mẫn cảm IR24 Sau 5 ngày thấy ựầu lá héo xanh và tái ựi chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có ựộc tắnh có thể dùng ựể lây nhiễm ựược
Trang 40+ Chiều dài vết bệnh từ 8-12cm: Nhiễm vừa (M)
+ Chiều dài vết bệnh >12cm: Nhiễm nặng (S)
3.2.2.8 Xác ñịnh gen kháng Xa4, xa5, Xa7 bằng phản ứng PCR
a) Chiết tách DNA
- Chọn những lá còn non, không bị sâu bệnh và cắt vào lúc sáng sớm ñể chiết tách DNA Cho lá lúa vào túi ñựng mẫu và ñánh số thứ tự, sau ñó ñưa mẫu lá về phòng thí nghiệm và ñặt trên ñá lạnh
- Các cối sứ dùng ñể nghiền mẫu ñược rửa sạch và hấp khử trùng Lá của mỗi giống lúa ñược cắt nhỏ, cho vào trong cối và ñặt trên ñá lạnh Các cối
sứ và ống eppendort ñược ñánh số thứ tự theo các giống
- Nhỏ 400µl dung dich chiết tách DNA vào trong cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ các mẫu lá cho ñến khi dung dịch chiết tách chuyển sang màu xanh
- Cho thêm 400µl dung dịch chiết tách DNA vào trong cối rồi lấy chày nghiền nhỏ các mẫu lá cho ñến khi dung dịch chiết tách DNA chuyển sang màu xanh
- Cho thêm 400µl dung dịch chiết tách DNA vào trong cối sứ và trộn lẫn, sau ñó chuyển dung dịch trong cối sứ vào trong ống eppendort tương ứng
