NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG BƯỞI BẰNG KĨ THUẬT RAPD

Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữuhiệu, đã được ứng dụng rất rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng nhưxác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau.. Việc ứng

MỞ ĐẦU

Bưởi (Citrus grandis L.) là cây ăn quả có tác dụng bổ dưỡng và có nhiều

giá trị về mặt y học Bưởi được trồng rộng rãi ở Việt Nam, tuy nhiên, mỗi vùng

có một số giống bưởi khác nhau do kết quả của quá trình chọn lọc cũng như ảnhhưởng của điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng Trên đất nước ta từ lâu đã hìnhthành những vùng trồng bưởi và những giống bưởi nổi tiếng như bưởi ĐoanHùng (Phú Thọ), bưởi Đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi PhúcTrạch (Hương Khê, Hà Tĩnh), bưởi Thanh trà (Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai),bưởi Năm roi, bưởi Da xanh (Vĩnh Long)… [1] Các giống bưởi này về mặt hìnhthái khác nhau không đáng kể, từ lá, hoa cho đến hình dạng trái Sự khác nhauthể hiện ở màu sắc của cùi quả, cách sắp xếp múi, màu sắc và mùi vị của tép

Hiện nay, ở nước ta bưởi được trồng phổ biến và đem lại thu nhập cao cho

bà con nông dân Bưởi có rất nhiều giống do được trồng từ lâu và có nhiều giống

du nhập từ miền Bắc và miền Nam Để đánh giá mức độ di truyền thì việc dựavào những chỉ thị hình thái là chưa đủ mà cần có những đánh giá sâu hơn về cấutrúc di truyền, cụ thể là hệ gen Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữuhiệu, đã được ứng dụng rất rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng nhưxác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài với nhau Trong những năm gần đây,việc sử dụng các chỉ thị phân tử giúp phát hiện các biến dị trong các giống bưởihay các cây có múi đã trở nên phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới Cácchỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết kiệm thời gian do các đặcđiểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái

Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là kỹ thuật sinhhọc phân tử dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn(khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiênnhững đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyêntắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD ởđiều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn

tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặpngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cáthể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhậndiện những chỉ thị phân tử trội Việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đadạng di truyền đã được rất nhiều tác giả quan tâm và thực hiện trên nhiều đốitượng vi sinh vật, thực vật và động vật [63].

Để có thể phân biệt các giống bưởi dựa trên các đặc điểm di truyền, chúng

tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đa đạng di truyền của một số giống bưởi bằng kỹ thuật RAPD” nhằm khảo sát sự sai khác của các band điện di thu được

Mục tiêu đề tài

Sử dụng chỉ thị RAPD để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một sốgiống bưởi thu thập được ở các vùng khác nhau

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu lá của các giống bưởi và tách chiết, tinh sạch DNA tổngsố

- Phân tích đa dạng di truyền của các giống bưởi nghiên cứu bằng kỹthuật RAPD

- Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống bưởi nghiên cứu dựatrên giản đồ phả hệ DNA

Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BƯỞI VÀ GIÁ TRỊ CỦA BƯỞI

1 Giới thiệu chung về bưởi

Những ghi nhận lịch sử và phân tích di truyền có thể kết luận chỉ có 3 loài

thực sự trong chi Citrus (thanh yên, quýt và bưởi) và nhiều dạng sinh học dưới

loài Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm mặc dù được thừa nhận rộng rãi nhưngchúng rất giống nhau về mặt di truyền, được tạo ra do chọn lọc, nhân giống bằngchiết ghép hay bằng hạt Sự khác nhau giữa các dạng này có nguồn gốc từ cácđột biến soma Hơn nữa, nhiều thế hệ cây lai được tạo ra và được con người chọnlọc từ các dạng ăn được hay theo các tiêu chí công nghiệp tạo nên sự đa dạng

trong chi Citrus như hiện nay [52].

Bưởi thuộc họ cam chanh (Rutaceae), dưới họ Aurantioidae, tộc Citreaea,dưới tộc Citrinae (Webber, 1967) Họ Rutaceae gồm 2 tộc và 33 chi Mỗi tộcClauseneae và Citreae được tạo thành từ 3 dưới tộc: Clauseneae bao gồmMicromelinae, Clauseninae và Merillinae; Citrinae gồm có Triphasiinae, Citrinae

và Balsamocitrinae Citrinae gồm 3 nhóm là Citrus nguyên thủy, gần giống

Citrus và Citrus thật Citrus thật gồm 6 chi: Clymenia, Eremocitrus, Microcitrus, Poncitrus, Fortunella và Citrus (Swingle and Reece, 1967) Hai hệ thống phân

loại của chi Citrus được dùng phổ biến nhất là của Swingle và Tanaka Swingle (1967) cho rằng chi Citrus có 16 loài, trong khi đó Tanaka (1977) lại cho rằng có đến 162 loài Tuy nhiên, Scora (1975) cho rằng chỉ có 3 loài là thanh yên (C.

medica), quýt (C reticulata), và bưởi (C grandis hoặc C maxima) và Papeda là

một nhóm của chi Citrus [62], [39]

Bưởi thuộc cây đại mộc, cao khoảng 10 m Lá có phiến to, dày, gân phụ

5-6 cặp, cuống có cánh rộng và có đốt vào phiến Hoa có chùm ngắn, trục có lông,cánh hoa trắng, dài 3,5 cm, tiểu nhụy nhiều, dính nhau Trái to, gần như tròn, to

25-30 cm, quả bì dày, nạc quanh hột trong, ngà hay hường Bộ nhiễm sắc thể2n=18 [8].

Bưởi là một loài cây ăn quả thân gỗ, sống lâu năm, lá thường xanh quanhnăm, thân cây cao, tán cây có dạng hình tròn tự nhiên, hình dẹt hoặc nón Cànhthường to hơn cam, quýt, cành lá phát triển mạnh Các bộ phận lá, cành, quả khicòn non thường phủ một lớp lông tơ mỏng Nhìn chung, cây có múi có bộ rễ ăncạn, các rễ lông mọc yếu nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng thấp [4],[16]

Bưởi có thể sinh sản hữu tính bằng hạt hay nhân giống bằng giâm, chiếtcành Thông thường bưởi được nhân giống bằng hạt và thường ít được chú ýchăm sóc, chọn lọc nên có xu hướng ngày càng đa dạng so với các loài cây kinh

tế khác trong chi Citrus Bưởi được xem là cây trồng có khả năng thích nghi rộng

với khí hậu mặc dù điều kiện sống tự nhiên của chúng là ở vùng nhiệt đới ẩm[55]

Bưởi được trồng trên khắp thế giới, ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,những nơi mà mùa đông có nhiệt độ ôn hòa, cây có thể sống sót và có đủ nước đểsinh trưởng, phát triển (Gmitter và cs, 1992) Chất lượng quả bưởi tốt nhất là ở

các vùng cận nhiệt đới Các vùng trồng Citrus phổ biến nhất là châu Mỹ (Brazil,

Mỹ, Argentina và Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, BắcPhi), châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản) và Nam Phi Theo FAO (2006),sản lượng bưởi và bưởi chùm trên thế giới là 4 triệu tấn, được trồng ở 74 quốcgia với diện tích là 264.000 ha Mỹ là nước có sản lượng bưởi và bưởi chùm lớnnhất thế giới Vùng Đông Nam Á, đặc biệt là Đông Ấn Độ, Bắc Burma và Tây

Nam Trung Quốc được xem là trung tâm phát sinh và đa dạng của chi Citrus và những chi có quan hệ gần gũi với nó Tổng sản lượng quả của chi Citrus trên

toàn cầu trong thời gian 2004-2005 là 105,4 triệu tấn [36]

2 Giá trị của bưởi

Bưởi có nhiều giá trị về mặt y học đồng thời là thực phẩm ăn kiêng tốt chonhiều loại bệnh Bưởi có thể được sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều món

ăn khác nhau như các loại mứt, bánh kẹo, gỏi và nước uống [22]

Theo Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ, các thành phần dinh dưỡng của bưởi đượcxác định ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của bưởi

Thành phần Hàm lượng (100 g phần ăn được)

Nguồn: United States Department of Agriculture (USDA), 2004

Trong dung dịch nước ép múi bưởi có khoảng 9% citric acid, 14% đường.Ngoài ra còn có lycopin, các enzyme amylase, peroxidase, vitamin C (50 mg trong

100 g dịch ép), vitamin A và B [11]

Phần vỏ quả bưởi có thể được sử dụng để làm mứt hoặc dùng làm nguyênliệu của các hộp và thùng chứa Hoa, quả và hạt bưởi có thể được ứng dụng trongcác mục đích y tế Hoa bưởi còn có thể được sử dụng để tách chiết các chất trongquá trình chế tạo nước hoa và pectin có thể được tách từ vỏ quả [55].

Bưởi được xem là nguồn vitamin C và các hợp chất giúp tăng cường sứckhỏe như carotenoids, flavonoids, linonoids và chất xơ (Yu và cs, 2005) Các chấtnày có khả năng chống chất sinh ung thư và kháng đột biến, giúp con người chốnglại bệnh tật Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa của bưởi còn liên quan đến sự hiệndiện của nhiều loại polyphenols và acid ascorbic [56]

Bưởi chứa nhiều loại flavonoid có cấu trúc khác nhau, bao gồm flavanone và flavone O- và C-glycosides, ngoài ra còn có methoxylated flavone Mỗi nhóm

hợp chất này đều biểu hiện hoạt tính cao trong chống viêm và trị ung thư Có

bằng chứng cho rằng các tác dụng sinh học của các flavonoid ở bưởi là có liên

quan đến những tương tác của chúng với các enzyme điều hòa chủ chốt tác độngđến kích hoạt tế bào và gắn kết thụ thể Các flavonoid bưởi biểu hiện hoạt tínhthấp trên các tế bào khỏe mạnh, bình thường, và vì thế biểu hiện đặc tính gây độcthấp rõ rệt ở các loài động vật Những chất này mở rộng ảnh hưởng của chúngtrong cơ thể thông qua sự cảm ứng của các enzyme gan I và II, và thông qua hoạtđộng sinh học của các chất chuyển hóa của chúng Như vậy, có bằng chứng rõràng về những đặc tính tiềm năng của các hợp chất này trong việc tăng cường sứckhỏe ở con người [50]

Carotenoid được xem như là tiền chất của vitamin A – chất rất quan trọngtrong chế độ ăn của con người và động vật; ngoài ra nó còn đóng vai trò là chấtchống oxy hóa, giúp giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư (Olson, 1989) Bưởi lànguồn phức hệ carotenoid với số lượng carotenoid lớn nhất được tìm thấy trongbất kỳ loại trái cây nào Nồng độ và thành phần carotenoid thay đổi rất lớn giữacác loài bưởi và phụ thuộc vào điều kiện phát triển (Gross, 1987) [46]

Ngày nay, khoa học còn khám phá thêm những đặc tính trị liệu mới củabưởi Trong bưởi chứa nhiều pectin, là chất sợi hòa tan chứa polysaccharide giúp

hấp thu cholesterol của thức ăn và muối mật nên làm giảm cholesterol trong máu[11]

II ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CHI CITRUS

Trong xu hướng hiện nay, để chọn giống cây trồng hay xác định nguồngốc của các loài cây trồng người ta thường sử dụng các chỉ thị phân tử (marker).Việc sử dụng các chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết kiệmthời gian do các đặc điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái,không chịu tác động của môi trường và chủ động trong nghiên cứu Việc sử dụngcác kỹ thuật sinh học phân tử là một công cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng ditruyền của rất nhiều loài

Gần đây, các phân tích phân tử như phân tích trình tự các đoạn nucleotidelặp lại đơn giản (SSR-Simple sequence repeat), hay microsatellite các đoạn giữahai SSR (ISSR-Inter-simple sequence repeat), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạnchế (RFLP-Restriction fragment length polymorphism), đa hình các đoạn khuếchđại ngẫu nhiên (RAPD-Random amplified polymorphic DNA), đa hình các đoạnkhuếch đại với các primer đặc hiệu (SCAR-Sequence characterized amplifiedregion), phản ứng RAPD cho gen ctv (CAPS)… đã được sử dụng để kiểm tra

mối quan hệ họ hàng trong số các nhóm phân loại chi Citrus [52] So sánh với

phương pháp truyền thống thì phân loại và nghiên cứu đa hình bằng các chỉ thịphân tử cho kết quả có độ tin cậy cao [3]

Trong số các chỉ thị trên thì RAPD được sử dụng phổ biến nhất để phânbiệt giữa các loài khác nhau hay để xác định bản đồ gen ở các loài thực vật Kỹthuật này đã được sử dụng thành công trong việc xác định sự đa hình ở cà chua,cây mâm xôi, táo và cây mơ (Bogani và cs, 1994; Davis và cs, 1995; Dubouzet

và cs, 1997; Mariniello và cs, 2002; Tartarini, 1996; Warburton và cs, 1996) [51]

1 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong phân tích đa dạng di truyền

Kỹ thuật RAPD dựa trên nguyên tắc của PCR, sử dụng các primer ngắnkhông đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA trong genome một cách ngẫu nhiên[9] Sự đa hình RAPD tạo thành từ sự thay đổi của 1 nucleotide, ví dụ như chènđoạn hay mất đoạn dẫn đến thay đổi vị trí kết hợp primer (Williams và cs, 1993).Những sản phẩm của sự khuếch đại có thể là đa hình và được sử dụng như là cácchỉ thị di truyền (Tingey and del Tufo, 1993) [65] RAPD là một kỹ thuật dễ thựchiện và có giá thành rẻ, với những ưu điểm nổi bật là chỉ cần một lượng nhỏDNA khuôn mẫu, không tạo thành phóng xạ và cho kết quả phân tích nhanh màkhông đòi hỏi các thông tin về tình tự DNA của một loài (Williams et al., 1990;Martin et al., 1997) Mặc dù trong một số trường hợp, kỹ thuật RAPD có khảnăng lặp lại thấp nhưng vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách tối ưu hóacác điều kiện phản ứng (Weising et al., 1995) Nhìn chung, RAPD có thể cungcấp các dữ liệu có giá trị về sự đa dạng di truyền bên trong hoặc giữa các quầnthể của một loài (Lynch and Milligan, 1994; Collignon et al., 2002) [47]

Trong kỹ thuật RAPD thì các primer ngẫu nhiên chứa 10 nucleotide là chokết quả khuếch đại tốt nhất (Coletta Filho và cs, 1998; Elisiario và cs, 1999)

Trong chi Citrus, RAPD đã được sử dụng để xác định các đột biến ở loài chanh

(Deng và cs, 1995), xây dựng bản đồ gen (Cai và cs, 1994), xác định các chỉ thịliên quan với các đặc điểm nông học (Cheng và Roose, 1995; Gmitter và cs,1996) và cho các nghiên cứu về phân loại học (Luro và cs, 1992) [33]

Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đãđược Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái

và phân tử Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao, KiênGiang chia làm 5 nhóm bao gồm: bưởi, cam, quýt, chanh và hạnh Sử dụng 4primer là OPA02, OPA04, OPA11 và OPA13 (Operon Technologies, CA) trongphân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật RAPD cho kết quả 49 chỉ thị phân tửđược ghi nhận Giản đồ phả hệ cho thấy cây có múi của Gò Quao, Kiên Giangchia thành 4 nhóm: bưởi, cam-quýt, chanh và hạnh Kết quả phân tích cho thấy

khoảng cách di truyền giữa các nhóm biến động từ 0-43% Trong 49 chỉ thị có 11chỉ thị xuất hiện ở 100% số cá thể, 26 chỉ thị trên 90%, 4 chỉ thị trên 80%, 2 chỉthị trên 70%, 6 chỉ thị dưới 70% và có 1 chỉ thị là 45% [7].

Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng để phân biệt các cây con có nguồn gốc

từ phôi tâm và hợp tử tạo thành từ phép lai giữa các giống quýt Montenegrina

(Citrus deliciosa Tenore) và King (C nobilis Loureiro) Phôi được tách ra từ những hạt giống, nhân giống in vitro và thích nghi trong điều kiện nhà kính Bốn

primer ngẫu nhiên đã được sử dụng để nhận biết 54 cây có cùng nguồn gốc hữutính từ tổng số 202 cá thể Mức độ đa hình của mỗi primer được phản ánh qua sốlượng của các cây có nguồn gốc hợp tử thu được trên mỗi primer Thuật toánphân tích nhóm của cây bố mẹ và con cái đã sắp xếp các cá thể vào các nhómriêng biệt với khoảng cách di truyền lớn nhất là 20% [23]

Abkenar và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RAPD khi nghiên cứu các đặc

điểm phân tử và khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật Đối tượng nghiên cứu gồm 31 loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài

‘Yuzu’ và 21 loài họ hàng Trong số 60 primer sử dụng có 27 primer được lựachọn với 108 chỉ thị tạo thành, 76 chỉ thị trong số đó là đa hình, trung bình là 2,8chỉ thị trên mỗi primer Số lượng của các chỉ thị đa hình trên mỗi primer nằmtrong khoảng từ 1 đến 8 và kích thước của các chỉ thị là từ 400 bp (OPA18) đến3.200 bp (OPA01) Trong nghiên cứu này, một số chỉ thị RAPD có thể giúp phânbiệt giữa các loài cây trồng rất gần gũi: OPA17 (1.100) và OPE20 (675) chỉ có ở

‘Kabosu’ mà không có ở ‘Aka kabosu’; tương tự OPA20 (1.400), OPB05 (990)

và OPE16 (1.000) chỉ có ở ‘Aka kabosu’ mà không có ở ‘Kabosu’ Cây phát sinhloài được tạo thành dựa trên khoảng cách di truyền cho thấy các loài cam chua rấtkhác với các loài ‘Yuzu’ và họ hàng của chúng Các loài ‘Yuzu’ có mối quan hệgần gũi với nhau, tuy nhiên sự đa hình di truyền của các loài nghiên cứu khác cóthể được xác định dễ dàng bằng kỹ thuật RAPD và sự đa dạng di truyền giữa cácloài là khá cao, biểu lộ các nguồn gốc khác nhau của chúng [18]

Trong nghiên cứu nhằm xác định 10 giống chanh ở vùng Campania, miềnNam nước Ý, Mariniello và cs (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 44 primerngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide Tất cả các primer đều được sử dụng trongphản ứng RAPD với DNA khuôn mẫu của các giống chanh nghiên cứu nhằm xácđịnh sự đa hình Mọi primer đều tạo ra các sản phẩm khuếch đại trong đó có 5primer tạo ra các band có thể dùng để xác định các giống cây trồng Sản phẩmkhuếch đại của giống Sorrento khi thực hiện phản ứng với primer OPL02 chothấy sự hiện diện 2 band (1.000-1.200bp) mà không có ở các giống khác Giốngchanh này còn tạo ra chỉ một sản phẩm khuếch đại duy nhất khi được khuếch đạivới primer OPL16 Ngoài ra, primer OPL14 còn rất hữu ích trong xác định giốngAmalfi với hình ảnh điện di biểu thị sự vắng mặt của các band có khối lượngphân tử cao và thấp Giống Procida được nhận dạng bởi primer OPL19 với cácband khuếch đại đặc biệt có khối lượng phân tử thấp Cuối cùng, với việc sửdụng primer OPL31, giống Gloria d’Amalfi cho kết quả điện di không có cácband khối lượng phân tử cao Kết quả còn cho thấy mức độ tương đồng giữa cácgiống chanh nghiên cứu là khá cao, lớn hơn 80%, và có thể xếp chúng vào 4nhóm Nhóm thứ nhất bao gồm giống Napoli và S Agnello; nhóm thứ hai gồmGloria d’Amalfi, Sorrento, Procida, Sfusato d’Amalfi, Variegato, and Cannellino;nhóm thứ ba và nhóm thứ tư chỉ chứa 1 giống là Massa Lubrense và Amalfi [51].

Bastianel và cs (2001) đã sử dụng các chỉ thị RAPD để phân tích sự tương

đồng về mặt di truyền của 15 giống thuộc chi Citrus (Citrus spp.) ở Brazil, bao gồm 4 giống cam ngọt (C sinensis Osbeck), 4 giống quýt (C reticulata Blanco,

C nobilis Loureiro, C sunki Loureiro và C deliciosa Tenore), cam chua (C aurantium L.), bưởi chùm (C paradisi Marcf.), bưởi (C grandis Osbeck), thanh

yên (C medica L.), chanh cốm (C latifolia) và 2 dạng lai [C clementina T × (C.

tangerina T × C paradisi Macf.)] Sự tương đồng di truyền của 15 giống này

được quan sát từ 12 primer ngẫu nhiên, độ tương đồng di truyền giữa các giống

quýt thấp nhất là 81% Độ tương đồng thấp hơn thấy ở các loài ít quan hệ là C.

medica, C grandis và C latifolia Bốn giống cam ngọt (C sinensis Osbeck)

không có sự khác nhau dựa vào chỉ thị RAPD, chúng có độ tương đồng cao nhất[22].

Năm dòng khác nhau của loài cam chua (Citrus aurantium L.) biểu hiện

những khác biệt có ý nghĩa về hình thái học đã được xác định bằng các chỉ thịphân tử phát triển từ kỹ thuật PCR là ISSR và RAPD De Pasquale và cs (2006)

đã phân tích các mẫu nghiên cứu với 11 primer ISSR và 6 primer RAPD(OPH04, OPAT14, OPH15, OPM04, OPO14 và OPN14) Dòng AACNR32 biểuhiện một kiểu band đặc trưng với tất cả các primer sử dụng, trong mỗi trườnghợp đều có từ 1 đến 3 band đa hình mà có thể phân biệt được nó với các dòngkhác Các dòng còn lại có các kiểu band khuếch đại rất giống nhau, ngoại trừ cácsản phẩm khuếch đại thu được bởi primer ISSR (CA)8RG, (AC)8YG và primerRAPD OPH04 Với primer ISSR (CA)8RG, dòng AACNR32 được phân biệt vớicác dòng khác bởi một đoạn khuếch đại đơn hình 1.800 bp và không có đoạnkhuếch đại 800 bp mà hiện diện ở tất cả các dòng còn lại Dòng AACNR9A đượcxác định bởi sự vắng mặt của đoạn khuếch đại 500 bp Ngoài ra, dòngAACNR26A không thể phân biệt được với các dòng còn lại khi sử dụng cácprimer trên [33]

Machado và cs (1996) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự đa hình

và sự tương đồng di truyền giữa 39 loài quýt Địa Trung Hải Kết quả đã xác địnhđược 111 sản phẩm khuếch đại từ 21 primer ngẫu nhiên Trung bình mỗi primer

có 2,2 chỉ thị RAPD, tương ứng với 42% của các sản phẩm khuếch đại Các chỉthị RAPD đặc hiệu kiểu gen đã được xác định, phần lớn là của các cây lai Thuậttoán phân tích nhóm UPGMA thể hiện sự khác biệt di truyền thấp giữa các loài

quýt Địa Trung Hải, trong khi các dạng lai của chúng với những loài Citrus khác

thể hiện sự khác biệt di truyền lớn hơn Sự đa hình về mặt di truyền xác địnhbằng kỹ thuật RAPD cho thấy sự khác nhau giữa các mẫu là khá thấp, như vậy cóthể chúng là một dòng đơn Với số lượng dạng lai lớn cùng với sự đa hình giữacác mẫu thấp có thể khẳng định giả thuyết rằng tất cả quýt Địa Trung Hải là dạng

lai của loài quýt phổ biến Citrus reticulata Blanco [49].

Năm mươi mốt cây đại diện cho 8 loài Citrus được thu thập từ Viện

nghiên cứu Nông nghiệp, Lefcosia, Cyprus (ARI) đã được phân tích bởi 10microsatellite và 6 primer RAPD Cả 2 phép phân tích microsatellite và RAPDđều cho phép phân biệt các cây nghiên cứu ở mức độ loài Mức độ đa hình thấphơn đã thu được giữa các cây trong cùng loài Trong nhóm cam (gồm 6 giống vàcác dòng của chúng) chỉ có 1 trong 10 primer SSR là có thể phân biệt giữa 2nhóm cây trồng: một là giữa giống thương mại Shamouti và 2 giống địa phương,Jaffa và Aematousiki; hai là giữa giống cam Valencia và giống cam địa phươngShekeriko Trong nhóm chanh (gồm 3 giống và các dòng của chúng), sự đa dạngcủa tất cả các giống nghiên cứu (giống địa phương Polyphori, Lapithou và giốngthương mại Lisbon) đã được phân biệt bởi 1 primer SSR và 2 primer RAPD.Giống quýt địa phương Arakapas và Willowleaf thể hiện sự tương đồng di truyềnhoàn toàn khi sử dụng cả chỉ thị microsatellite và RAPD Kết quả này cho thấyrằng giống địa phương Arakapas có thể là một dòng của Willowleaf, có nguồngốc từ một đột biến soma mà không được xác định bởi các chỉ thị phân tử được

sử dụng Các marker SSR không cho thấy sự đa hình giữa các dòng của cácgiống nghiên cứu Các marker RAPD đặc hiệu dòng đã được xác định cho 1dòng của Frappa và 1 dòng của Bergamot Chỉ thị PB4-1000 tương ứng với sảnphẩm khuếch đại 1 kbp được tạo ra bởi primer OPB04 chỉ có ở cây Frappa dòng

4 mà không có ở các dòng Frappa khác So sánh kết quả phản ứng RAPD của 5dòng Bergamot được khuếch đại bởi primer OPB04 cho thấy sự hiện diện củaband 580 bp ở dòng 2 mà không thu được ở các dòng còn lại [40]

Năm quần thể loài chanh khác nhau thu được từ các noãn chưa phát triểnthông qua các quá trình nuôi cấy mô khác nhau đã được kiểm tra cho sự biến dị

di truyền dòng soma và biến dị do cảm ứng ánh sáng Mẫu DNA từ 360 cây (72cây của mỗi nhóm) đã được kiểm tra sự đa hình bằng kỹ thuật RAPD với 10primer Số lượng các sản phẩm khuếch đại được tạo ra bởi mỗi primer thay đổi từ

8 đến 15 với kích thước các band từ 100-3.000 bp Trong số các cây thí nghiệm,

sự biến dị di truyền chỉ được xác định bên trong nhóm cây tái sinh từ các callus

phát sinh phôi được chiếu sáng Trong số 72 cây của nhóm này, ba cây có chỉ thịRAPD khác biệt so với những cây còn lại trong quần thể Sự đa hình của các cây

13, 35 và 36 thu được theo thứ tự bởi các primer: OPA07, OPW15 và OPN09.Trong cả 3 trường hợp này, sự khác biệt được thể hiện bởi sự vắng mặt của mộtsản phẩm khuếch đại cụ thể là đoạn 500 bp ở cây 13, đoạn 3.000 bp ở cây 35 vàđoạn 300 bp ở cây 36 [54]

Sự đa dạng di truyền của các cây cam ngọt (Citrus sinensis Navel) được

trồng ở tỉnh Mazandaran, Iran đã được Dehesdtani và cs (2007) đánh giá bằngchỉ thị RAPD Năm mươi hai mẫu lá của các cây có ba hình thái quả khác biệt(vỏ nhẵn, vỏ nhám và vỏ nửa nhám) đã được thu thập để tiến hành thí nghiệm.Hai mươi mốt primer ngẫu nhiên đã được sử dụng trong phản ứng RAPD Bốntrong số 21 primer sử dụng đã tạo các band đa hình có tính lặp lại Trong số cácband có kích thước từ 150 đến 2.100 bp tạo thành bởi 4 primer, có 70,13% làband đa hình Ma trận tương đồng sử dụng hệ số Nei đã được tạo ra và các kiểugen đã được sắp nhóm bằng phương pháp UPGMA Sự đa hình di truyền caonhất đã thu được trong các nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám [34]

Ngoài chi Citrus, kỹ thuật RAPD cũng đã được nhiều tác giả sử dụng

trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số đối tượng thực vật khác như đu đủ(Nguyễn Trịnh Nhất Hằng, 2005) [5], đậu xanh (Điêu Thị Mai Hoa và cs, 2005)[9], tảo (Hồ Sỹ Hạnh và cs, 2006) [6], dưa leo (Nguyễn Thị Lang, 2007) [10], lúacạn (Nguyễn Thị Tâm và cs, 2005) [15], vải thiều (Lê Trần Bình và cs, 2004)[2] nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền và chọn lọc các loại cây trồng có chấtlượng tốt

Chu Hoàng Mậu và cs (2007) đã sử dụng kỹ thuật RAPD khi nghiên cứu

sự đa dạng di truyền và mức độ sai khác trong cấu trúc DNA hệ gen của năm

giống lạc (Aachis hypogaea L.) có khả năng chịu hạn là L14, L18, LVT, MD7,

ĐBG Các tác giả đã sàng lọc 20 primer ngẫu nhiên (10 nucleotide) và xác địnhđược 5 primer RA31, RA40, RA45, RA46 và RA159 thể hiện sự đa hình Kếtquả điện di PCR-RAPD cho thấy số đoạn DNA nhận được ở mỗi phản ứng rất

khác nhau, dao động từ 3 đến 11 đoạn Primer xuất hiện nhiều band điện di nhất

là RA40 (52 band), primer có ít band nhất là RA45 (17 band) Như vậy, với 5primer ngẫu nhiên các tác giả đã thu được tổng số 168 band DNA từ các giốnglạc nghiên cứu Kết quả phân tích cho thấy hệ số tương đồng di truyền dao động

từ 0,659 đến 0,954 Hai giống lạc ĐBG và LVT có hệ số tương đồng cao nhất là0,954, còn hai giống lạc L18 và MD7 có hệ số tương đồng di truyền thấp nhất là0,659 Trên sơ đồ cây thu được, 5 giống lạc được phân bố ở 2 nhóm tương ứngvới 2 mức độ chịu hạn khác nhau: nhóm 1 gồm 4 giống là ĐBG, L14, LVT vàMD7, có hệ số giống nhau từ hơn 0,90 đến 0,98; nhóm 2 chỉ gồm giống L18 cókhả năng chịu hạn kém nhất với khoảng cách di truyền với các giống còn lại làlớn nhất (0,31) [12]

Nguyễn Thị Tâm và cs (2003) đã ứng dụng kỹ thuật PCR-RAPD vào việcđánh giá sự thay đổi ở mức độ phân tử của các dòng lúa chọn lọc HR31,HR3128, HR3494, HR3499 tái sinh từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao ở thế hệ 3 củacác giống lúa CR203, CS4 và ML107 Mười primer ngẫu nhiên đã được sử dụngtrong nghiên cứu này, trong đó 5 primer RA31, RA 36, RA46, RA142, RA159 cóthể hiện sự đa hình đối với dòng chọn lọc HR31 có nguồn gốc từ mô sẹo chịunhiệt độ cao của giống CR203 và dòng chọn lọc HR3218 có nguồn gốc từ mô sẹochịu nhiệt độ cao của giống CS4 Các primer RA31, RA32, RA36, RA142,RA159 tạo ra các band đa hình đối với các dòng chọn lọc HR3493 và HR3499 cónguồn gốc từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao của ML107 Kết quả xác định hệ số đồngdạng di truyền của các dòng chọn lọc so với giống gốc cho thấy, dòng HR31 có

hệ số di truyền sai khác so với giống gốc là 31%, dòng HR3128 là 54%, dòngHR3494 là 10%, dòng HR3499 là 41% Những kết quả này chứng tỏ các dòngchọn lọc tạo ra từ các giống đã có những thay đổi đáng kể ở mức phân tử trong

bộ gen [14]

Tình trạng di truyền của các phôi soma có nguồn gốc từ các cây con của

Cymbopogon flexuosus đã được Bhattacharya và cs (2008) đánh giá bằng kỹ

thuật RAPD Mẫu DNA từ cây mẹ và 18 cây con tái sinh từ callus đơn chọn ngẫu

nhiên đã được thu thập để tiến hành phản ứng RAPD với 6 primer để chọn cácdòng thuần Tổng cộng 64 band đã được tạo thành với 19 band trong số đó là đahình Hệ số đồng dạng di truyền dựa trên kết quả phản ứng RAPD cho thấy phầnlớn các dòng nghiên cứu là đồng nhất hay giống đến hơn 92% so với cây mẹ,ngoại trừ CL2 và CL9 (66%) đã thể hiện mức độ thay đổi di truyền lớn nhất với

sự có mặt của 2 band RAPD mà không có ở cây mẹ [25]

Năm 2005, Chadha và Gopalakrishna đã nghiên cứu tính đa dạng ditruyền của nấm đạo ôn gây bệnh trên lúa ở Ấn Độ bằng phương pháp RADP.Nghiên cứu nhằm xác định mối quan hệ di truyền và khả năng biến đổi di truyềntrong những chủng nấm đạo ôn Tổng cộng có171 band đa hình được tạo ra khikhuếch đại với 33 primer chọn lọc ngẫu nhiên trên 20 chủng nấm đạo ôn (chiếmkhoảng 64%) Kích thước của sản phẩm khuếch đại thay đổi từ 0,2-3,0 kb Sốlượng sản phẩm khuếch đại thu được là đặc trưng cho từng primer và thay đổi từ

3 (OPF03) đến 14 (OPG10 và OPG17), trung bình 8,2 Hệ số tương đồng trongcác chủng từ 0,76-0,92 Sự đa hình cao có thể được giải thích do kết quả của sựtiến hóa từ tự nhiên, sự hoán vị gen do stress gây ra và sự chuyển gen ngang giữanấm đạo ôn và vật chủ của nó Sự hiểu biết về nguyên nhân của đa dạng nguồnbệnh sẽ giúp cải thiện những phương pháp quản lý lúa bị bệnh [29]

Trà là loại thức uống không cồn tốt cho sức khỏe phổ biến nhất trên thế

giới Cây trà (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) thuộc nhóm (section) Thea, chi

Camellia, họ Theaceace, có nguồn gốc từ Tây Nam Trung Quốc Sự đa dạng di

truyền, mối quan hệ và đặc điểm phân tử của 15 nguồn vật liệu di truyền phổbiến ở tỉnh Zhejiang, Trung Quốc đã được Chen và cs (2005) xác định bằng kỹthuật RAPD Các tác giả đã sử dụng 100 primer khác nhau, trong đó 20 primertạo ra các sản phẩm đa hình và có tính lặp lại đã được chọn lọc Có tổng cộng1.050 band được tạo thành, trung bình là 52,5 band trên mỗi primer hay 70 bandđối với mỗi nguồn vật liệu di truyền được nghiên cứu Kích thước của các sảnphẩm khuếch đại thay đổi từ 0,4 đến 3,0 kb Trong số 137 sản phẩm khuếch đại

có 129 band là đa hình, tương ứng với 92,4% Khoảng cách di truyền giữa các

giống nghiên cứu thay đổi từ 0,16 đến 0,62; giá trị trung bình là 0,37 Mười lămmẫu nghiên cứu đã được xếp vào 3 nhóm theo thuật toán UPGMA dựa trên các

dữ liệu RAPD Ngoài ra, tất cả 15 mẫu có thể được phân biệt dễ dàng bởi sự cómặt của 20 chỉ thị RAPD và sự vắng mặt của 11 chỉ thị [30]

Chuối được xem là một loài cây ăn quả có giá trị kinh tế và là một loạithực phẩm ăn kiêng rất tốt Jain và cs (2007) đã phân tích mối quan hệ di truyềncủa 4 giống chuối khác nhau được trồng ở miền Nam Ấn Độ (Grand Naine, RedBanana, Nendran và Rasthali) bằng kỹ thuật RAPD với 3 primer (OPA19,OPB18, OPD16) Kết quả có 43,47% sản phẩm khuếch đại là band đơn hình,chung cho tất cả các kiểu gen, trong khi đó có 30,43% là band duy nhất, nhưngchỉ có 26,08% thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gene này Trong sốcác primer đã chọn, primer OPB18 tạo ra số lượng band đa hình cao nhất (4band), tiếp theo là primer OPA19 và primer OPD16 (1 band) Các ma trận khácnhau đã được tính toán bằng cách sử dụng chỉ số SED (squard euclideandistance) để ước đoán sự khác nhau của tất cả các cặp trong sản phẩm khuếchđại, chương trình được xây dựng bởi phương pháp của Ward sử dụng thuật toánphương sai nhỏ nhất Sự phân tích cụm thể hiện 4 kiểu gen được xác định bằngchương trình của Grandnaine và Rasthali Giá trị sai khác về mặt di truyền từ2,82%-3,6%, sự sai khác lớn nhất là 3,6% được phát hiện giữa hai giống Redbanana và Rasthali, và thấp nhất là ở hai giống Nendran và Rashali (2,23%) [43]

Santos và cs (2010) đã sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm xác định đặc điểmphân tử của 7 mẫu chuối (Borneo, Grand Naine, 1304-06, 4249-05, 0337-02,

0323-03 và 4279-06) với khả năng kháng giun tròn Radopholus similis Có tổng

cộng 521 chỉ thị RAPD tạo thành từ 36 primer, tương ứng với 14,5 chỉ thị trênmỗi primer, trong đó 420 (81%) là đa hình, bao gồm cả 140 (27%) chỉ thị có tiềmnăng cho ứng dụng trong các nghiên cứu lập bản đồ di truyền về khả năng đề

kháng R similis Trong số các primer sử dụng, chỉ có 2 primer (OPH-04 và

OPF-20) không tạo ra các band có ở các mẫu đề kháng và vắng mặt ở tất cả các mẫumẫn cảm Do đó, có đến 96% primer có khả năng tạo thành ít nhất 1 band triển

vọng cho việc lập bản đồ di truyền OPE-15, OPH-17 và OPG- 09 là nhữngprimer tạo ra số band tiềm năng lớn nhất (theo thứ tự là 12, 8 và 8) Khoảng cách

di truyền giữa những mẫu nghiên cứu thay đổi từ 0,106 đến 0,455 với khoảngcách lớn nhất là giữa mẫu Borneo và kiểu gen 4279-06, được đánh giá tương ứngvới mẫu nhạy cảm nhất và mẫu đề kháng cao nhất đối với giun tròn tùy thuộc yếu

tố sinh sản Thuật toán sắp nhóm dựa trên khoảng cách di truyền đã xếp 7 mẫunghiên cứu vào ít nhất 3 nhóm, trong đó các kiểu gen có khả năng đề kháng caonhất được xếp vào cùng một nhóm [59]

Đối với quả lê Nhật (Pyrus pyrifolia Nakai), màu sắc của vỏ quả là một

đặc điểm rất quan trọng đối với cây trồng bởi vì vỏ màu nâu đỏ giúp bảo vệ quảchống lại những tác động từ bên ngoài như dịch bệnh, côn trùng, ảnh hưởng củathời tiết Inoue và cs (2006) đã sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm xác định chỉ thị

có liên quan đến các gen có vai trò quyết định màu sắc của vỏ quả Các dạng câycon F1 của hai phép lai của ‘Kousui’ - ‘Kinchaku’ (KK) và ‘Niitaka’ - ‘Chikusui’(NC) được phân biệt bởi màu sắc vỏ quả đã được sử dụng cho phép phân tích.Bốn dạng khác nhau của DNA tổng số, KK với vỏ quả màu nâu đỏ (KK-R) và

KK với vỏ quả màu xanh (KK-G), tương tự là NC-R và NC-G, đã được sử dụngcho phân tích RAPD với 200 primer ngẫu nhiên Sau hai phép phân tích độc lập,

có tổng cộng 893 band đã được xác định, số lượng band trung bình trên mỗiprimer là 4,5 Kết quả thu được cho thấy, các band đặc hiệu có liên quan đến đặctính vỏ màu nâu đỏ đã không thu được trong thí nghiệm này, chỉ có duy nhấtband OPH19425 có liên quan với tính trạng vỏ quả màu xanh (KK-G và NC-G).Mặc dù chỉ có 86,4% DNA các cây có vỏ quả màu xanh tạo ra band này khi thựchiện phản ứng RAPD nhưng có đến 94,3% các cây có vỏ quả màu nâu đỏ khôngtạo ra sản phẩm khuếch đại này Chỉ thị RAPD OPH19425 có thể phân biệt đượccác cây có vỏ quả màu xanh với tỉ lệ lên đến 92% [41]

2 Các kỹ thuật khác

Bên cạnh kỹ thuật RAPD, có rất nhiều loại chỉ thị phân tử khác được sử

dụng để xác định sự khác nhau giữa các dạng thuộc chi Citrus, bắt đầu từ những

nghiên cứu isozyme vào cuối những năm 1970 (Torres và cs, 1978), đa hìnhchiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP) vào những năm 1980 và đầu những năm

1990, và gần đây nhất là các marker AFLP, SSR, ISSR (Fang và Roose,1997;Bretó và cs, 2001; Sankar và Moore, 2001) Bức tranh tổng thể được dựng lên từnhững nghiên cứu này là sự đa dạng rất lớn từ các nhóm loài tổ tiên thuộc chi

Citrus, đặc biệt là quýt và bưởi [58].

RFLP (Restriction fragment length polymorphism-đa hình chiều dài cácđoạn cắt giới hạn) thể hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo rakhi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA

bộ nhân hoặc trong các bào quan khác RFLP có ưu điểm là marker đồng trội chophép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp, do kích thước DNA khảo sáttrong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiêncứu Phân tích RFLP đã được sử dụng thành công khi nghiên cứu đa dạng di

truyền ở rất nhiều loài cây ăn quả như Prunus (Badenes và Parfitt, 1995),

Diospyros (Yonemori và cs, 1998) và Mangifera (Eiadthong và cs, 1999) [19].

SSR (simple sequence repeat) là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCRvới mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình

tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự củaDNA và thiết kế primer Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nênSSR SSR primer sau đó được sử dụng tương tự như các RAPD primer SSR làmột marker đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy vì vậy đã được sử dụng

để nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây trồng như cam chanh(Nunes và cs, 2002; Golein và cs, 2005), táo (Guilford và cs, 1997) và nho(Tomas và Scott, 1993) [37], [38]

Mười lăm cặp primer SSR đã được sử dụng để đánh giá mức độ đa hình

trong 23 kiểu gen Citrus và 4 dạng lai tự nhiên hay đột biến chồi mà đã được

chọn lọc từ Kotra Germplasm Bank (Iran) Tất cả 15 locus thí nghiệm ở thực vật

có múi đều có mức độ đa hình cao, với số lượng allele trên mỗi locus thay đổi từ

4 ở TAA41 đến 12 ở CAT01, ATC09, AG14 (trung bình 8,27 allele trên mỗilocus) Thuật toán phân tích nhóm với chỉ thị SSR đã xếp các mẫu nghiên cứu

vào trong 2 nhóm: nhóm A gồm Yuzo và Poncirus; nhóm B bao gồm 3 phân nhóm riêng biệt: (i) giống Fortunella sp; (ii) phân nhóm quýt: Citrus reticulate

(C clemantin), C sinensis (Pineapple, Washington Navel), các dạng tự nhiên

(Siahvaraz, Shalmahaleh, Moallemkoh và 4 dạng lai Kotra), và (iii) C limon (Amol lemon - pear, Eureka, Rough Lemon), C aurantifolia, C aurantium, C.

medica và C grandis [44].

Sự đa dạng di truyền của 122 mẫu bưởi (Citrus grandis Osbeck) và các

giống họ hàng của chúng đã được xác định bằng chỉ thị SSR Yong và cs (2006)

đã sử dụng 31 cặp primer SSR, kết quả tạo thành tổng cộng 34 locus và 335 band(90-335 bp), trong đó 332 band là đa hình, trung bình 10,81 band trên mỗi primer

và 9,85 allele trên mỗi locus Tỷ lệ của các locus đa hình là 99,1% Trong tất cả

các locus xác định, giá trị thông tin đa hình allele (PIC) thay đổi từ 0,1939 đến

0,9073; trung bình 0,7085 trên mỗi primer Phân tích cây phả hệ UPGMA chothấy các mẫu nghiên cứu có thể được xếp vào 7 nhóm trong đó nhóm 1 bao gồm

các mẫu bưởi chùm (110 mẫu); nhóm 2 là C hongheensis (3 mẫu); nhóm 3 là C.

macroptera (1 mẫu); nhóm 4 tạo thành từ C yichangensis (2 mẫu); nhóm 5 bao

gồm C reticulate, C daoxianensis 1, C daoxianensis 2 and C tachibana; nhóm

6 là C indica và nhóm 7 có C mangshanensis Trong số đó, các mẫu bưởi chùm

có thể được chia vào 7 phân nhóm với hệ số tương đồng là 0,712 [48]

ISSR (inter-simple sequence repeats) là kỹ thuật đã được sử dụng trongnhiều nghiên cứu đa dạng di truyền (Kantety và cs, 1995; Charters và cs, 1996),

và đã được dùng để phân biệt giữa các giống cây Citrus khó thực hiện bởi các

marker phân tử khác (Fang và Rose, 1997) Mối quan hệ di truyền giữa các giống

chanh thương mại (C limon) đã được Capparelli và cs (2004) phân tích bằng kỹ

thuật ISSR và phân tích dòng chuỗi (flow cytometry) Hai giống với các đặc

điểm khá giống nhau đã được phân biệt bằng cách sàng lọc với 10 SSR primers

và xác định hàm lượng DNA trong nhân trước khi nhuộm [27]

Shahsavar và cs (2007) đã sử dụng chỉ thị ISSR để nghiên

cứu mối quan hệ phát sinh loài giữa 33 cây thuộc chi Citrus ở

tỉnh Fars, Iran Cây phát sinh loài đã được xây dựng dựa trên 234đoạn ISSR (209 đoạn đa hình) bằng thuật toán phân tích nhómUPGMA Ba mươi ba cây trên đã được phân vào sáu nhóm chính

với giá trị tương đồng trong nhóm ≥ 0,65 Nhóm 1 gồm C.

sinensis và C reticulata; nhóm 2 gồm các loài cam chua bình

thường và cam chua ‘Peach’; nhóm 3 gồm ‘Bakraee’,Volkameriana và 3 dạng chọn lọc của chanh lá cam ‘Bakraee’ làmột dạng chưa xác định với đặc điểm hình thái học tương tự với

cả chanh lá cam ngọt và quýt Đây có thể là dạng lai giữa hai

loài này Nhóm 4 bao gồm chanh Lisbon (C limon) và hai dạng

chọn lọc chưa xác định ‘Rock lemon’ và ‘Pear-shaped lemon’.Nhóm 5 bao một kiểu gen duy nhất (D3) với sự tương đồng phân

tử thấp nhất so với những kiểu gen khác Nhóm 6 có thể được

chia thành 2 nhóm phụ, nhóm phụ 1 bao gồm thanh yên (C.

medica) và 3 dạng ‘Otroj’, ‘Bidkhoni’ từ Darab và ‘Bidkhoni’ từ

Fassa Dựa trên đặc điểm hình thái và phân tử tương tự vớithanh yên thì 3 dạng này có thể được xem là các biến thể của

thanh yên Nhóm phụ còn lại bao gồm C aurantifolia, C latifolia

và 11 kiểu gen chưa xác định với đặc điểm hình thái và phân tửgiống với chanh lá cam [61]

AFLP (Amplified fragment length polymorphism-sự đa hình các đoạn cắtkhuếch đại) là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắtgiới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phảnứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau,thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp

như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượngDNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, cácprimer sử dụng không cần đặc hiệu loài và các primer thương mại có thể dùngcho hầu hết các loài Có nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật này để phân tích đadạng di truyền trên nhiều đối tượng như bưởi chùm (Cervera và cs, 1998), dừa

(Pepera và cs, 1998), đu đủ (Kim và cs, 2002), Carya illinoinensis (Beedanagari

và cs, 2005) [24]

Quả không hạt là một tính trạng mong muốn ở những cây thuộc chi Citrus

và là mục tiêu quan trọng trong nhân giống JinPing và cs (2009) đã sử dụng kỹthuật đa hình chiều dài các đoạn khuếch đại AFLP để tìm ra các chỉ thị phân tử

cho quýt không hạt Ponkan (C reticulata Blanco) Tác giả đã chọn ra được 5 cặp

primer có liên quan trực tiếp đến tính trạng mong muốn sau khi sàng lọc 72 cặpprimer, sự bắt cặp này đã được kiểm tra bằng phân tích AFLP từ các nhóm cáthể Năm đoạn khuếch đại đã được tạo dòng, phân tích trình tự và so sánh tươngđồng, kết quả cho thấy 4 chỉ thị có sự tương đồng cao với các gen chức năng,điều này có thể giúp hiểu được cơ chế phân tử của tính trạng không hạt ở chi

Citrus Dựa trên các thông tin về trình tự, 8 primer đặc hiệu đã được thiết kế và 2

đoạn AFLP-2 và AFLP-5 đã được chuyển đổi thành công sang dạng chỉ thịSCAR (sequence characterized amplified region) Vì vậy, có thể đẩy nhanh cácchương trình chọn giống bằng cách sàng lọc các đột biến không hạt dựa trên cácchỉ thị đã được chọn lọc [45]

Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bưởi: Citrus grandis (L.) Osbeck

Thuộc chi: Citrus

Họ cam quýt: Rutaceae

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 18 giống bưởi thu thập được ở nhiềuvùng khác nhau, mỗi giống tiến hành thu 3 mẫu ở 3 cây Các giống bưởi này vềmặt hình thái khác nhau không đáng kể, từ lá, hoa cho đến hình dạng trái Sau khitách chiết, điện di kiểm tra DNA tổng số và chạy PCR-RAPD thử nghiệm vớimột số primer, chúng tôi đã lựa chọn mỗi giống một mẫu DNA tổng số có khảnăng khuếch đại tốt để làm khuôn mẫu cho các phản ứng PCR-RAPD tiếp theo.Địa điểm thu mẫu của 18 giống bưởi nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Địa điểm thu mẫu của 18 giống bưởi STT Giống bưởi Địa điểm thu mẫu

1 Bưởi Thanh Trà Thủy Biều, Huế

2 Bưởi Năm roi Ấp An Thiên, huyện Mỏ Cày Nam, Bến Tre

4 Bưởi Phúc Trạch Quảng Bình

9 Bưởi Thanh du Thủy Biều, Huế

11 Bưởi Hồng da xanh Trung tâm nghiên cứu và phát triển Nông nghiệp Huế

12 Bưởi Cốm Trung tâm nghiên cứu và phát triển Nông nghiệp Huế

13 Bưởi Trắng Lại Bằng, Huế

14 Bưởi Thái Lan Lại Bằng, Huế

16 Thanh trà Tiên Phước Quảng Nam

17 Bưởi Đường lá goắn Bến Tre

18 Bưởi Hải Phòng Quảng Bình

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đồ án của chúng tôi được tiến hành từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2011tại Phòng thí nghiệm Công nghệ gene, Viện Tài nguyên, Môi trường và Côngnghệ sinh học, Đại học Huế

1 Tách chiết genomic DNA

DNA được tách chiết từ lá của các giống bưởi theo phương pháp củaAhmed và cs (2009) [20] có cải tiến: cắt lá bưởi (200 mg) thành từng mảnh nhỏ,đồng hóa mẫu với 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA,250mM NaCl) Sau đó thêm 40 µL SDS 20%, vortex 30 giây rồi ủ ở 65oC trong

30 phút Mẫu được chiết 2 lần với cùng thể tích của hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại bỏ protein và lấy dịch trong chứa DNA hòatan ở pha trên Loại polysaccharide bằng ether hydrat hóa Kết tủa DNA bằngethanol 100% lạnh trong 30 phút ở -20oC Thu kết tủa DNA bằng ly tâm 11.000vòng/phút, ở 25oC trong 12 phút Rửa tiểu thể DNA bằng ethanol 70% Hòa tantiểu thể bằng nước cất vô trùng, thêm 1 µL RNase, bảo quản ở -20oC dùng làmnguyên liệu cho phản ứng PCR-RAPD Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng

số được xác định bằng phương pháp quang phổ trên máy NanoDrop ND-1000(Thermo, Mỹ)

2 Phân tích RAPD

DNA tổng số của lá bưởi được dùng làm khuôn mẫu để khuếch đại