Bước đầu tìm hiểu sự đề kháng kháng sinh từ các vi khuẩn trong môi trường

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, chúng có mặt khắp mọi nơi: trong đất, trong nước, trong không khí, trên cơ thể động thực vật và còn ở dạng cộng sinh

MỤC LỤC

Trang Trang tựa Error! Bookmark not defined Nhận xét của giáo viên hướng dẫn Error! Bookmark not defined

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt luận văn Error! Bookmark not defined Mục lục i

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

Danh sách các sơ đồ xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Vi khuẩn trong môi trường 3

2.1.1 Vai trò của vi khuẩn trong môi trường 3

2.1.2 Giới thiệu một số vi khuẩn trong môi trường 4

2.1.2.1 Acinetobacter spp 4

2.1.2.2 Aeromonas spp 5

2.1.2.3 Pseudomonas spp 8

2.1.2.4 Stenotrophomonas maltophilia 12

2.2 Giới thiệu sơ lược về kháng sinh 13

2.2.1 Khái niệm 13

2.2.2 Các nhóm thuốc kháng sinh 14

2.2.2.1 Nhóm beta - lactam 14

2.2.2.2 Nhóm aminoglycoside 15

2.2.2.3 Nhóm polypeptide 15

2.2.2.5 Nhóm phenicol 16

2.2.2.6 Nhóm macrolide 17

2.2.2.7 Nhóm sulfonamide 17

2.2.2.8 Nhóm diaminopyrimidine 17

2.2.2.9 Nhóm quinolone 18

2.2.2.10 Các nhóm khác 18

2.3 Sự đề kháng kháng sinh 18

2.3.1 Nguyên nhân của sự đề kháng kháng sinh 19

2.3.1.1 Đề kháng tự nhiên 19

2.3.1.2 Đề kháng thu nhận 19

2.3.2 Các cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 20

2.3.2.1 Sản xuất ra enzyme làm bất hoạt kháng sinh 20

2.3.2.2 Ngăn chặn kháng sinh không thể xâm nhập qua thành tế bào 20

2.3.2.3 Thay đổi tại điểm tác động 20

2.3.2.4 Phát sinh đường chuyển hóa mới 21

2.3.2.5 Sản xuất ra nhiều chất cạnh tranh với kháng sinh 21

2.3.2.6 Đề kháng chéo 21

2.4 Các phương pháp xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh 21

2.4.1 Phương pháp định tính 21

2.4.1.1 Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng 21

2.4.1.2 Chọn lựa đĩa kháng sinh 23

2.4.1.3 Quy trình kiểm tra chất lượng 23

2.4.2 Phương pháp định lượng 26

2.5 Những nghiên cứu liên quan đến sự đề kháng kháng sinh trong môi trường 27

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

3.1 Thời gian và địa điểm 29

3.1.1 Thời gian 29

3.1.2 Địa điểm 29

3.2 Nội dung nghiên cứu và chỉ tiêu theo dõi 29

3.3.1 Đối tượng khảo sát 30

3.3.2 Thiết bị và dụng cụ 30

3.3.3 Môi trường 30

3.3.4 Các hóa chất 31

3.3.5 Đĩa giấy tẩm kháng sinh 31

3.4 Phương pháp tiến hành 31

3.4.1 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 31

3.4.1.1 Mẫu nước 31

3.4.1.2 Mẫu đất 32

3.4.2 Phân lập các chủng vi khuẩn từ môi trường 33

3.4.2.1 Qui trình phân lập Aeromonas spp và Pseudomonas spp 33

3.4.2.2 Qui trình phân lập Pseudomonas spp và Acinetobacter spp .37

3.4.2.3 Qui trình phân lập Stenotrophomonas maltophilia 39

3.4.3 Thực hiện kháng sinh đồ 41

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 42

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

4.1 Kết quả phân lập và định danh Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia từ các mẫu nước và mẫu đất 43 4.1.1 Tỉ lệ phát hiện Aeromonas spp trong môi trường nước 43

4.1.2 Tỉ lệ phát hiện Acinetobacter spp trong môi trường nước và đất 44

4.1.3 Tỉ lệ phát hiện Pseudomonas spp trong môi trường nước và đất 46

4.1.4 Tỷ lệ phát hiện Stenotrophomonas maltophilia trong môi trường đất 48

4.1.5 Sự tương thích giữa kết quả phân lập của đề tài với kết quả kiểm chứng tại Đại học Tufts, Hoa Kỳ 49

4.2 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ 49

4.2.1 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ đối với các gốc Aeromonas spp 50

4.2.2 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ đối với các gốc Acinetobacter spp 51

4.2.3 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ đối với các gốc Pseudomonas spp 52 4.2.4 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ đối với các gốc Stenotrophomonas

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Đề nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Phụ lục 61

YSA – CN : Yersinia - cefsulodin và novobiocin

APUA : Alliance for Prudent Use of Antibiotic MHA : Muller – Hinton Agar

PBG : Peptone Beef extract Glycogen

MIC : Minimal inhibitory concentration

MRVP : Methy Red Voges Proskauer

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Phân biệt những loài Aeromonas 7

Bảng 2.2 Một số đặc điểm của nhóm Aeromonas di động 7

Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas 10

Bảng 2.4 Các bệnh cảm nhiễm do Pseudomonas ở động vật 11

Bảng 2.5 Đường kính vòng vô khuẩn 24

Bảng 3.1 Bảng phân bố lấy mẫu nước và số lượng mẫu 32

Bảng 3.2 Bảng phân bố lấy mẫu đất 33

Bảng 4.1 Tỉ lệ phát hiện Aeromonas spp trong các loại môi trường nước 44

Bảng 4.2 Tỉ lệ phát hiện Acinetobacter spp trong các loại môi trường nước 45

Bảng 4.3 Tỉ lệ phát hiện Acinetobacter spp trong môi trường đất 44

Bảng 4.4 Tỉ lệ phát hiện Pseudomonas spp trong các loại môi trường nước 47

Bảng 4.5 Tỷ lệ phát hiện Pseudomonas spp trong môi trường đất 48

Bảng 4.6 Tỉ lệ phát hiện S maltphilia trong môi trường đất 48

Bảng 4.7 Sự tương thích giữa kết quả phân lập của đề tài với kết quả kiểm chứng tại Đại học Tufts, Hoa Kỳ 49

Bảng 4.8 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ với chủng Aeromonas spp phân lập 50

Bảng 4.9 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ với chủng Acinetobacter spp phân lập 51 Bảng 4.10 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ với chủng Pseudomonas spp phân lập522 Bảng 4.11 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ với chủng Stenotrophomonas maltophilia phân lập 53

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Hình thái vi khuẩn Aeromonas dưới kính hiển vi 35

Hình 3.2 Các phản ứng sinh hóa để phân lập Aeromonas 35

Hình 3.3 Phản ứng di động và không di động trên thạch 35

Hình 3.4 Hình thái vi khuẩn Pseudomonas dưới kính hiển vi 36

Hình 3.5 Các phản ứng sinh hóa phân lập Pseudomonas 36

Hình 3.6 Hình thái vi khuẩn Acinetobacter dưới kính hiển vi 38

Hình 3.7 Các phản ứng sinh hóa phân lập Acinetobacter 39

Hình 3.8 Vi khuẩn S maltophilia mọc gần đĩa kháng sinh 40

Hình 3.9 Phản ứng sinh ure (-) và gelatin (+) 41

Hình 4.10 Kết quả thực hiện kháng sinh đồ 42

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập Aeromonas và Pseudomonas từ môi trường 33

Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập Pseudomonas spp và Acinetobacter spp từ môi trường 37

Sơ đồ 3.3 Qui trình phân lập S maltophilia trong đất 39

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, chúng có mặt khắp mọi nơi: trong đất, trong nước, trong không khí, trên cơ thể động thực vật và còn ở dạng cộng sinh với các sinh vật khác Bên cạnh những vi khuẩn gây bệnh chiếm tỉ lệ nhỏ so với tổng số

vi khuẩn có trong môi trường thì vi khuẩn không gây bệnh và có ích chiếm tỉ lệ khá lớn

Hiện nay, tình hình lạm dụng kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn trong nhân

y và thú y đang rất được quan tâm Kháng sinh được sử dụng một cách bừa bãi: dùng không đúng liều lượng, không đúng khoảng cách giữa các lần, dùng khi không cần thiết, chọn kháng sinh không phù hợp, v.v… Ngoài việc dùng kháng sinh để phòng trị bệnh cho gia súc, các nhà chăn nuôi còn dùng nó như những chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Kháng sinh được trộn vào trong thức ăn với nồng độ thấp nhằm giúp thú mau lớn, tăng trọng nhanh nhưng sẽ gây ra sự tích lũy kháng sinh trong cơ thể và bài thải ra môi trường bên ngoài Điều

đó đã tạo nên những chủng vi khuẩn mang gen kháng thuốc sống sót, nhân lên và lan tràn trong môi trường Hơn nữa, những vi khuẩn không gây bệnh hay gây bệnh

cơ hội cũng từ đó tồn trữ tính kháng thuốc và truyền lại cho những vi khuẩn khác Chính vì thế, hiện nay đã có nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc tăng lên trong cộng

đồng như: Aeromonas spp có nguồn gốc từ môi trường thủy sản, là tác nhân lây nhiễm mà ngày càng mang tính đa kháng thuốc; Staphylococcus aureus đề kháng với penicillin, methicillin, penicillin thế hệ thứ 3; Acinetobacter baumanii kháng

gentamicin, polymixin; Pseudomonas aeruginosa kháng ceftazidime, fluoroquinolone, imipenem (Marshall và ctv, 2009)

Với mục đích bước đầu tìm hiểu sự đề kháng kháng sinh với một số gốc vi khuẩn phân lập được từ môi trường (đất và nước), điển hình là các vi khuẩn:

Aeromonas spp., Acinotobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia và từ đó có thể đưa ra những nhận xét về tình hình đề kháng kháng sinh

của các gốc vi khuẩn đó Chúng tôi đã thực hiện đề tài “Bước đầu tìm hiểu sự đề kháng kháng sinh từ các vi khuẩn trong môi trường” với sự đồng ý của khoa

Chăn Nuôi Thú Y – Trường Đại học Nông Lâm và dưới sự hướng dẫn của TS Hồ Thị Kim Hoa, BSTY Lê Hữu Ngọc Nghiên cứu này là một phần trong nghiên cứu của APUA (the Alliance for Prudent Use of Antibiotic - một tổ chức nghiên cứu vấn

đề đề kháng kháng sinh) về xây dựng và phát triển các dữ liệu mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh – nơi tồn trữ các gen kháng kháng sinh

1.2 Mục đích

Phân lập một số vi khuẩn (Aeromonas spp., Acinetobacter spp.,

Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia) trong môi trường và xác định

mức độ đề kháng kháng sinh của các gốc vi khuẩn phân lập được theo phương pháp khuếch tán trên thạch

1.3 Yêu cầu

Thu thập mẫu nước thải chăn nuôi, nước ao nuôi cá, nước sông, mẫu đất trồng rau và cỏ gần khu vực chăn nuôi từ các tỉnh Tp Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Long An, Bình Dương, Tiền Giang, Tây Ninh

Phân lập và giữ các gốc vi khuẩn: Aeromonas spp., Acinetobacter spp.,

Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia

Thử kháng sinh đồ với các gốc vi khuẩn phân lập được

Chương 2

TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn trong môi trường

2.1.1 Vai trò của vi khuẩn trong môi trường

Vi khuẩn trong môi trường tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau, có thể là vi khuẩn gây bệnh, hoặc vi khuẩn có lợi và cũng có thể là vi khuẩn cơ hội

Vi khuẩn gây bệnh chiếm tỷ lệ nhỏ nhưng nó đóng vai trò quan trọng và gây nhiều chú ý trong cộng đồng Do việc sử dụng kháng sinh để phòng và điều trị bệnh nhiễm khuẩn một cách bừa bãi mà đã gây xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh và tạo nên một nguy hiểm cho toàn cầu Từ đó đã gây ra khó khăn trong công tác điều trị của nhân y cũng như thú y Vi khuẩn cũng được phát tán và lan truyền gen đề kháng vào trong môi trường bằng nhiều cách Như nguồn nước thải ô nhiễm từ các trại chăn nuôi không được xử lý; nó ngấm vào trong đất, trong mạch nước ngầm, thải vào ao nuôi cá, thải ra sông Hoặc phân bón động vật là một nguồn hỗn hợp các chất dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ cho nông nghiệp như nitơ, phospho; tuy nhiên phân động vật cũng có thể chứa các thành phần hóa học khác như kim loại nặng, kích thích tố, các hợp chất kháng khuẩn mà có được là từ thức ăn chăn nuôi và cách sử dụng thuốc thú y Từ đó dẫn đến việc gia tăng số lượng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong môi trường

Bên cạnh đó, các vi khuẩn sống trong đất và nước còn tham gia tích cực vào quá trình phân giải các xác hữu cơ biến chúng thành CO2 và các hợp chất vô cơ dùng làm thức ăn cho cây trồng Các vi khuẩn cố định nitơ thực hiện việc biến khí nitơ (N2) trong không khí thành hợp chất nitơ (NH3, NH4) cung cấp cho cây trồng

Vi khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất khó tan chứa P, K, S và tạo ra các vòng tuần hoàn trong tự nhiên như: chu trình cacbon, nitơ, phospho và lưu huỳnh Chúng còn tham gia vào việc phân giải các chế phẩm công nghiệp, phế thải đô thị

cho nên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường Ví dụ: Pseudomonas có

khả năng phân giải lưu huỳnh hữu cơ, những hợp chất lân vô cơ khó tan Ca3(PO4)2

Vi khuẩn có khả năng phân giải dầu trong môi trường biển: Achromobacter,

Acinetobacter, Alcaligenes, Bacillus,.v.v (Lương Đức Phẩm, 2009) Một số loài Acinetobacter cũng được biết là tham gia vào việc phân hủy sinh học của một số

chất gây ô nhiễm khác nhau như: biphenyl, clo biphenyl, phenol, dầu thô, loại bỏ phospho và kim loại nặng (Haleem, 2003)

2.1.2 Giới thiệu một số vi khuẩn trong môi trường

(c) Đặc điểm nuôi cấy

Acinetobacter spp là vi khuẩn hiếu khí Tất cả các chủng đều phát triển từ 20

– 300C nhưng nhiệt độ tối ưu là 33 – 350C

Acinetobacter có thể phát triển mạnh trên môi trường thạch thường và thạch

MacConkey Trên môi trường Nutrient Agar khuẩn lạc nhỏ, tròn, trơn, màu trắng đục hoặc trong Trên môi trường thạch máu: khuẩn lạc nhỏ, màu xám, trơn láng,

không dung huyết Hầu hết các loài Acinetobacter, ngoại trừ một số chủng A

lwoffii, phát triển tốt trên MacConkey (không muối) Khuẩn lạc trên môi trường này

không màu do không lên men đường lactose (Collins và Lyne, 1989) Trên môi

trường CHROMagar™ Acinetobacter agar khuẩn lạc có màu đỏ, nhỏ gọn và lồi

(d) Đặc điểm sinh hóa

Catalase (+), oxidase (-), TSI (Đ/Đ hoặc Đ/NC), nitrate (-), indol (-), urease (-), citrate (+) (APUA, 2009)

(e) Sự phân bố và tính gây bệnh

Acinetobacter spp phân bố rộng rãi trong thiên nhiên Những vi khuẩn này

có thể tồn tại trong những điều kiện môi trường khác nhau Chúng được phân lập trong nước, đất, thực phẩm, chất thải, thực vật, và trên cơ thể người như: từ da, ruột,

âm đạo, mũi, khí quản Một số loài Acinetobacter có thể tồn tại trong thời gian dài

trên những bề mặt khác nhau, tốt nhất là môi trường khô ráo Điều này rất quan trọng đối với bệnh viện, bởi vì những chủng này có thể gây nhiễm trùng nghiêm trọng ở những bệnh nhân bị tổn thương, thường gây tử vong Nói chung,

Acinetobacter không có tính gây bệnh nhưng khi người và động vật giảm sức đề

kháng thì vi khuẩn phát huy tính gây bệnh, tạo nên bệnh cảm nhiễm cơ hội (Idomir

M và ctv, 2009)

Vi khuẩn thuộc họ này còn được biết là được tham gia vào quá trình phân hủy sinh học, lọc và loại bỏ một số chất hữu cơ và vô cơ do con người thải ra chất

thải nguy hại (Haleem, 2003) Người ta đã xác nhận rằng Acinetobacter chủ yếu

chịu trách nhiệm loại bỏ phosphate sinh học (Auling, 1991; Wagner, 1994) Những

chủng Acinetobacter cũng đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ các kim loại

Loài: gồm 2 nhóm tách biệt nhau: (1) nhóm ưa lạnh không di động: A

salmonicida và (2) nhóm ưa ấm di động: A hydrophila, A caviae, A sobria

(b) Hình thái (Bergey, 1994)

Vi khuẩn Gram âm có dạng trực thẳng hai đầu tròn với kích thước 0,3×1,0µm đường kính và 1,0×3,5µm chiều dài Tồn tại dưới dạng đơn, bắt cặp hoặc chuỗi ngắn Thường di động với tiên mao đơn cực

(c) Đặc điểm nuôi cấy

Aeromonas spp là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Nhiệt độ tối ưu

để phát triển là 22 - 280

C nhưng tốt nhất tại 370C, tuy nhiên có một số chủng thì không phát triển được

Trên thạch MacConkey: khuẩn lạc Aeromonas điển hình sẽ có kích thước lớn

(đường kính 2 – 3mm), tròn, không màu (không lên men lactose) Trên thạch PBG (peptone – beef – extract – glycogen): với đĩa có phủ lớp thạch 2% thì khuẩn lạc điển hình có kích thước nhỏ (đường kính 0,3 – 0,5mm), hình tròn, màu vàng và được viền bởi một vòng sáng màu vàng; đĩa không có phủ lớp thạch, khuẩn lạc

Aeromonas điển hình sẽ có kích thước lớn hơn (đường kính 2 – 3mm), hình tròn,

màu vàng – xanh, tâm hơi đen và có mặt bao quanh trong mờ Trên thạch Yersinia

(YSA) có bổ sung cefsulodin và novobiocin (YSA – CN): khuẩn lạc Aeromonas

điển hình sẽ có kích thước lớn (đường kính 2 – 4 mm), bề mặt ghồ ghề, xung quanh khuẩn lạc có sợi và tâm khuẩn lạc màu đỏ tối, mép khuẩn lạc màu hồng phớt với mặt bao quanh trong mờ Ở một số khuẩn lạc có thể có vùng sáng giữa tâm màu tối

và mặt bao quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Aeromonas Agar (AA) là một môi trường chọn lọc cao cho phân lập Aeromonas spp từ thực phẩm, bệnh phẩm, và môi trường AA chứa các thành phần

chọn lọc như: brilliant green, irgasan; mà những chất này làm phát triển những

Aeromonas nhạy cảm với ampicillin Khuẩn lạc trên môi trường AA có dạng tròn

lớn với kích thước 0,5 – 3mm, đục, hơi hồng (Lab M, 2009)

(d) Đặc điểm sinh hóa (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Catalase (+), Oxidase (+), TSI (Đ/V), arginine dihydrolase (+), ornithine decarboxylase (-), urease (-), gelatinase và DNase (+)

Lên men các loại đường: glucose, manitol, succrose, arabinose

Bảng 2.1 Phân biệt những loài Aeromonas (Collins và Lyne, 1989)

Di động Phát triển ở 370C Sắc tố nâu

(+: dương tính, -: âm tính, v: có thể thay đổi)

Bảng 2.2 Một số đặc điểm của nhóm Aeromonas di động (Collins và Lyne, 1989)

Aesculin hydrolysis

Sinh acid từ Khí từ p/ư

glucosa

Lysin VP Đĩa cephalothin

30µg Arabinose Salicin

A hydrophila + + + + + + R

A caviae + + + - - - R

A sobria - - - + + + S

(R: đề kháng, S: nhạy cảm)

(e) Sự phân bố và tính gây bệnh

Sự phân bố của các loài Aeromonas liên quan đáng kể đến nồng độ ô nhiễm cặn trong nước A caviae chiếm ưu thế trong nước thải và nước với mức độ ô

nhiễm cặn cao Trong vùng nước với nồng độ ô nhiễm cặn thấp hoặc không thì tỷ lệ

A sobria và các loài khác tăng lên đáng kể A hydrophila được phân bố rộng rãi

trong nước ngọt, nước muối và có thể được tìm thấy trong thực phẩm, nước uống,

hệ thống nước ở bệnh viện (Abulhamd, 2009)

Vi khuẩn Aeromonas spp phổ biến trong môi trường nước ngọt như: ao

nuôi cá, nước sông, nước thải, v.v… Chúng còn cư ngụ chủ yếu trong ruột cá Một vài loài gây bệnh cho cá, ếch, ít gây bệnh cho động vật có vú Ở Việt Nam các loài

cá nuôi lồng, bè và ao nuôi nước ngọt thường gặp bệnh đốm đỏ, nhiễm trùng huyết như: trắm cỏ, cá trôi, cá chép, cá mè, cá ba sa, cá bống tượng, cá tai tượng, cá trê

Vi khuẩn có thể gây bệnh ở cá ba sa, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30 – 70%, riêng ở cá giống

(ba sa, trê) có thể chết 100% (Bùi Quang Tề, 2009) A salmonicida là một kí sinh

trùng bắt buộc của cá salmonid

Ở người A hydrophila đã có lúc được xem là vi khuẩn gây bệnh cơ hội

(opportunistic pathogen) ở mức thấp Mặc dù thế, hiện nay chúng được coi là tác

nhân gây bệnh chủ yếu A hydrophila đôi khi có thể gây nhiễm trùng trong cơ thể

người mà từ nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng máu, có thể gây tiêu chảy ở trẻ

Loài: P aeruginosa, P fluorescens, P putida, P mallei, P pseudomallei, P

maltophilia, P cepacia, P stutzeri, P mendocina, P alcaligenes, P pseudoalcaligenes

(b) Hình thái (Bergey, 1998)

Là những trực thẳng hay mảnh, hơi cong nhưng không xoắn; Gram âm; tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn; kích thước trung bình 0,5 ×1,0 × 1,5 × 5,0 µm; không bào tử và giáp mô Có khả năng di động với 1 hoặc vài tiên mao đơn cực

(c) Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, dễ dàng nuôi cấy trên các môi trường thông

thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang nhưng P.aeruginosa có thể

phát triển trên môi trường kị khí nếu có NO-3 làm chất nhận điện tử Tăng trưởng được trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn cacbon thích hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose, 2-ketogluconate, L-

valine, β-alanine, DL-arginine Trong môi trường ít chất dinh dưỡng thì P

aeruginosa vẫn có thể sống được Vì vậy người ta còn có thể tìm thấy chúng trong

nước tinh khiết, nước uống đóng chai (Trần Linh Thước, 2004)

Nhiệt độ thích hợp 30 – 370C nhưng có thể phát triển được ở 420C Nhưng tốt ở nhiệt độ 20 – 250C (đối với thức ăn), hoặc 35 – 370C (đối với bệnh phẩm ở động vật) Có pH thích hợp từ 7,2 – 7,5

Mọc tốt trên các môi trường như: NA (nutrient agar), MacConkey agar, NA

có chứa 0,1% cetrimide, King’ Medium A và Aeromonas agar Khuẩn lạc trên NA

thường lớn (2 – 4 mm), bằng phẳng, lan rộng ra và có sắc tố Sắc tố phát huỳnh quang màu xanh vàng có thể khuếch tán vào trong môi trường Trên môi trường BA (Blood agar): tiêu huyết β, khóm vi khuẩn lớn, phẳng hay hơi lồi, rìa không đều Trên môi trường MacConkey: không lên men đường lactose, khóm vi khuẩn không màu (Collins and Lyne, 1989) Trên môi trường AA khuẩn lạc đục, hồng nhạt, có kích thước 0,5 – 1 mm (APUA, 2009) Trên môi trường canh: đục đều, có màu vàng sau đổi màu xanh Canh trùng già trở nên nhớt và sợi (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

(d) Đặc điểm sinh hóa (Collins và Lyne, 1989)

Không lên men đường lactose, lên men không sinh hơi glucose

Oxidase (+), catalase (+), TSI (Đ/Đ), indol (-), H2S (-), MR (-), VP (-), nitrate (+), citrate (+), di động (+), có khả năng tan chảy gelatinase

(e) Sắc tố

Một số chủng sinh sắc tố hòa tan và chất thơm Có 2 loại sắc tố chính:

Pyoverdin: là sắc tố phát huỳnh quang màu xanh vàng khi được kích thích bởi bước sóng thấp hơn 260nm Sắc tố này được tạo ra trong môi trường có nồng độ sắt thấp, dễ khuếch tán và có chức năng trong cơ chế trao đổi sắt của vi khuẩn Sắc

tố này do P fluorescens sản sinh ra

Pyocyanine: là sắc tố có màu xanh ở pH trung tính hay kiềm, màu đỏ trong môi trường acid Sắc tố này là yếu tố tạo màu xanh trong mủ xanh là đặc tính gây

bệnh bởi P aeruginosa (Trần Linh Thước, 2003)

Chất thơm do trực khuẩn mủ xanh sinh ra là kimetylamin

Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas (Collins và Lyne, 1989)

Phát triển tại Nitrate Lên men đường Urease Tan chảy

Vi khuẩn có kháng nguyên lông H không bền với nhiệt và kháng nguyên O

chịu nhiệt Đối với P aeruginosa, dựa vào kháng nguyên O, người ta chia thành 16

type huyết thanh

Cũng như các trực khuẩn đường ruột, kháng nguyên O của P aeruginosa

mang nội độc tố bản chất glucid – lipid – protein Nhưng trong cơ chế sinh bệnh quan trọng hơn là ngoại độc tố Ngoại độ tố này tác động lên hồng cầu chó, thỏ,

người và chuột lang (nội độc tố pyoxyanolyzin) và pyoxyanaze làm tan cơ huyết

(g) Sự phân bố và tính gây bệnh

Pseudomonas spp hiện diện phổ biến trong đất, nước, nhất là những nơi ẩm

thấp Chúng còn được phát hiện sống bám bên ngoài của thực vật, động vật, kể cả

trong các thiết bị bệnh viện Nhiều loài Pseudomonas spp hầu hết là thực vật hoại sinh, nhưng có hai loài quan trọng ở động vật là P aeruginosa, P pseudomallei Họ ngựa nhiễm bệnh là nguồn chứa P mallei, P aeruginosa, P pseudomallei có mặt trong đất và nước P aeruginosa tìm thấy khắp nơi, còn P pseudomallei tìm thấy

chủ yếu ở vùng nhiệt đới (Quinn và ctv, 1998)

Pseudomonas spp là vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người, khi cơ thể bị suy

giảm miễn dịch, bị mắc bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng kháng sinh tùy tiện,… Chúng có thể gây ra nhiều bệnh khác nhau: viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, viêm màng não

mủ, áp xe, gây bệnh sừng hóa ở mắt, gây nhiễm trùng da, mô mềm (Trần Linh Thước, 2003)

P aerruginosa sản sinh elastase, ngoại độc tố A, protease, bacteriocin

(pyocin), v.v Các protein độc tố này liên quan đến việc hình thành các ổ hoại tử tổ chức ở phổi cũng như ở da Ở các ổ bệnh, mủ hoặc các chất tiết xuất sẽ có màu xanh lục (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

Loài vi khuẩn này kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh và có khả năng kháng thuốc tự nhiên do có hàng rào ngăn cản tính thấm ở màng ngoài lypopolysaccharid Tính kháng thuốc còn được quy định bởi các plasmid và các yếu

tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng tải nạp

và giao nạp, tạo ra những đột biến kháng thuốc mới (Trần Linh Thước, 2003)

Bảng 2.4 Các bệnh cảm nhiễm do Pseudomonas ở động vật (Phạm Hồng Sơn,

vật khác

Hình thành hạch dạng tỵ thư ở hạch lympho ngựa Bệnh trực khuẩn

mủ xanh ở heo

P aeruginosa heo Bại huyết heo con,

viêm hóa mủ thường màu xanh Bệnh viêm phổi

Cá

Da và mang xuất huyết, loét (bệnh đóng dấu ở cá) Bệnh trắng đuôi ở

do vi khuẩn

2.1.2.4 Stenotrophomonas maltophilia

(a) Phân loại

Stenotrophomonas maltophilia tên cũ là Pseudomonas maltophilia rồi đổi

thành Xanthomonas maltophilia năm 1983, sau đó 10 năm được phân loại lại thành

1 loài của giống Stenotrophomonas, có họ là Xanthomonadaceae (Võ Thị Chi Mai

và Ngô Thị Quỳnh Hoa, 2004)

(b) Hình thái

Là trực khuẩn Gram âm, thẳng hay hơi cong với kích thước 0,5 – 1 µm, vi khuẩn tồn tại ở dạng đơn hoặc bắt cặp

(c) Đặc điểm nuôi cấy

Stenotrophomonas maltophilia là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, tăng trưởng

không xảy ra ở nhiệt độ dưới 50C hoặc cao hơn 400C, nhiệt độ tối ưu để phát triển là

350C (Denton và Kerr, 1998)

Trên môi trường CHROMagar™ Acinetobacter agar khuẩn lạc nhỏ, lồi, đục,

màu đỏ, rìa mờ, có đốm vàng như kim loại sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ 300C Nếu để lâu hơn ở nhiệt độ 300C hoặc nhiệt độ phòng thì khuẩn lạc sẽ trở nên có màu tối, tím

xanh và những đốm kim loại sẽ nổi rõ hơn S maltophilia phát triển tốt trên môi

trường MCK với khuẩn lạc nhỏ, tròn, không màu và cũng phát triển trên thạch máu sau khi ủ ở 350C trong 18 – 24 giờ (APUA, 2009)

(d) Đặc điểm sinh hóa

Oxidase (-), catalase (+), esculin hydrolysis (+), gelatin hydrolysis (+), DNase (+), ONPG (+), urease (-)

S maltophilia đề kháng với imipenem và cần có methionine cho sự phát

triển (APUA, 2009)

(e) Sự phân bố và tính gây bệnh

Stenotrophomonas maltophilia là loại vi khuẩn phổ biến sống tự do trong

môi trường Nó cũng có thể phân lập được từ nước nhưng thường tìm thấy hơn trong đất và đặc biệt là trong rễ cây có nốt sần Debette và Blondeau (1980) đã chỉ

ra sự quan hệ này được thúc đẩy bởi lượng lớn sulfurated amino acid có trong dịch

tiết của rễ cây, đó là yếu tố phát triển cho S maltophilia

Ở người, S maltophilia là một tác nhân gây bệnh cơ hội Vi khuẩn có thể

gây bệnh nguy hiểm cho bệnh nhân bị tổn thương miễn dịch hoặc suy nhược cơ thể Nằm lâu dài trong bệnh viện, nhiễm nấm, áp lực kháng khuẩn, đặt ống thông cũng

là yếu tố góp phần gia tăng tỷ lệ nhiễm S maltophilia (Berg và ctv, 1999)

Những chủng S maltophilia từ môi trường đề kháng cao với kháng sinh, và

sự đề kháng này không phụ thuộc vào những nguồn phân lập ra chúng (Berg và ctv, 1999) Trong những năm qua, kháng sinh imipenem sử dụng rộng rãi trong việc

chống lại P aeruginosa và những vi khuẩn gram âm khác Tuy nhiên, S

maltophilia đề kháng tự nhiên với imipenem bởi vì nó sản xuất imipenemase S maltophilia cũng kháng hầu hết với các kháng sinh β – lactam vì nó tiết enzyme β –

Với định nghĩa này, nhiều thuốc trước đây xếp vào nhóm chất kháng khuẩn tổng hợp (sulfonamide, quinolone) bây giờ cũng được xếp loại là kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2007)

2.2.2 Các nhóm thuốc kháng sinh

2.2.2.1 Nhóm beta-lactam

Các thuốc này trong công thức hóa học có chứa vòng beta - lactam bao gồm các penicilline và các cephalosporine Nhóm kháng sinh này ức chế sự hình thành tế bào vi khuẩn

A Các penicillin

Các penicillin dùng trong điều trị thuộc 3 nhóm chính:

+ Nhóm G: penicillin G (benzylpenicillin), penicillin V (phenoxymethyl penicillin)

Đây là các kháng sinh có hoạt lực cao đối với vi khuẩn G+ nhưng chúng bị

thủy giải bởi penicillinase Do đó chúng không có hiệu quả với hầu hết các chủng

Staphylococcus aureus

+ Nhóm A: ampicillin, amoxicillin

Các kháng sinh này có phổ kháng khuẩn mở rộng trên vi khuẩn G+ và G-

(Haemophilus influenza, E.coli và Pseudomonas mirabilis) nhưng vẫn không kháng được penicillinase Do đó chúng thường phối hợp với các chất ức chế β-lactamse

như acid clavulanic, sulbactam

+ Nhóm M: methicillin, oxacillin, cloxacillin, floxacillin

Các penicillin bán tổng hợp này có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn G+

và G-, bên trong môi trường acid và kháng penicillinase Tuy nhiên, sự lan tràn của chủng vi khuẩn S aureus, S epidermic kháng methicillin đang là một báo động

trong nhân y trên toàn thế giới

+ Cephalosporin thế hệ 2 Ví dụ: cefamandol, cefaclor, cefoxitin, cefuroxime

Các kháng sinh loại này tác động trên vi khuẩn G+ kém hơn thế hệ 1, có hoạt

tính trên vi khuẩn G- đường ruột và kháng cephalosprinase

+ Cephalosporin thế hệ 3 Ví dụ: ceftriazon, ceftiofur, cefotaxime, ceftazidime

Phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn G+, G- kị khí, Pseudomonas và kháng

cephalosprinase

2.2.2.2 Nhóm aminoglycoside

Kháng sinh nhóm aminoglycoside sau khi vào trong tế bào sẽ gắn kết chủ yếu với tiểu đơn vị 30S của ribosome, chúng có thể ngừng tiến trình tổng hợp protein hoặc gây nên việc đọc sai mã ở 30S và tạo những protein không hoàn chỉnh hoặc protein không có chức năng

Nhóm kháng sinh aminoglycoside thông dụng trong thú y gồm: streptomycin, neomycin, gentamicin, tobramycin, amikacin, kanamycin

Gentamicin, kanamycin, neomycin tác động trên cả vi khuẩn G- và G+

(Streptococcus spp.), riêng gentamicin còn có hiệu quả trên Proteus spp và

Pseudomonas spp

Streptomycin có phổ kháng khuẩn hẹp, tác động trên vi khuẩn G- (trực

khuẩn hiếu khí như Brucella canis, Haemophilus, Salmonella spp., Klebsiella

pneumonia), Leptospira spp., Mycobacteria Ít tác dụng trên vi khuẩn kị khí do sự

thấm phụ thuộc O2 và cần năng lượng Tác động của streptomycin chống

Mycobacteria cao nhất so với các kháng sinh khác trong nhóm này nhưng kém nhất

trong việc chống các vi khuẩn khác

2.2.2.3 Nhóm polypeptide

Kháng sinh nhóm này bao gồm: colistin, bacitracin, polymyxin

Các polymyxin kết hợp lên các phospholipid của màng bào tương vi khuẩn làm rối loạn sự sắp xếp lớp lipoprotein của màng bào tương, dẫn đến thay đổi tính thấm chọn lọc qua màng, khi đó các thành phần tế bào thoát ra ngoài và vi khuẩn bị tiêu diệt

Kháng sinh nhóm polypeptide chủ yếu là polymyxin có phổ tác dụng chủ

yếu diệt khuẩn với vi khuẩn G- kể cả Pseudomonas Trong khi đó, bacitracin có tác

dụng đối với vi khuẩn G+

Các tetracycline có phổ kháng khuẩn rộng trên cả vi khuẩn G+, kị khí G+,

G-, và cả vi khuẩn nội bào như: Mycoplasma spp.G-, Ricketsia spp.G-, Chlamydia spp.G-,

Leptospira spp Tuy nhiên Mycobacterium, Proteus, Pseudomonas thì đề kháng tự

nhiên với các tetracycline

chế enzyme peptidyl transferase không cho acid amin gắn vào chuỗi polypeptide

Chloramphenicol có ái lực với cả ribosome của động vật hữu nhũ

Kháng sinh nhóm này có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn G+ và G-, một

số vi khuẩn nôi bào (Ricketsia spp., Chlamydia spp.), vi khuẩn kị khí (Clostridium spp., Bacteroides spp.) Đối với Haemophilus thì chloramphenicol có tác dụng sát khuẩn Mycoplasma và Nocardia spp ít nhạy cảm với kháng sinh nhóm này Tuy

nhiên hiện nay, ở Việt Nam, chloramphenicol đã cấm sử dụng trong thú y khoa từ năm 2002 do phát hiện ra những độc tính liên quan đến cơ quan tạo máu Do đó, chloramphenicol không được phép tồn dư trong thực phẩm, chỉ giới hạn sử dụng trong các trường hợp điều trị bệnh cho thú không sản xuất thực phẩm cho người như: chó, mèo, ngựa Thay vào đó hai kháng sinh thiamphenicol và florfenicol được

sử dụng rộng rãi vì ít độc hơn, có hoat tính thấp hơn nhưng lại có phổ tác dụng tương tự chloramphenicol

2.2.2.6 Nhóm macrolide

Nhóm macrolide bao gồm các kháng sinh: erythromycin, spiramycin, oleandomycin, josamycin, tylosin, tulathromycin Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolide: lincomycin, virginiamycin

Các kháng sinh này ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn kết

với tiểu đơn vị 50S của ribosome và ức chế hoạt động của peptidyl transferase Các

macrolide có tính sát khuẩn ở liều cao hơn

Phổ kháng khuẩn của macrolide chủ yếu trên vi khuẩn G+, một số vi khuẩn

G- (Actinobacillus spp., Brucella spp., Campylobacter spp.)

Sulfonamide có phổ kháng khuẩn rộng, tác động trên vi khuẩn G+ và G- Nhiều vi khuẩn G- kém nhạy cảm với sulfonamide hoặc thu nhận đề kháng với

kháng sinh này như E coli, Klebsiella spp., Salmonella spp., Pasteurella spp.,

Haemophillus spp Tuy nhiên khi dùng phối hợp sulfonamide + trimethoprim thì

chúng mẫn cảm

2.2.2.8 Nhóm diaminopyrimidine

Nhóm này gồm có: trimethoprim, diaverdin Trimethoprim ức chế dihydrofolat reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate, một giai đoạn trong chuỗi phản ứng tổng hợp purin và DNA

Tác động của nhóm kháng sinh này là tĩnh khuẩn khi dùng một mình Chúng

có phổ kháng khuẩn rộng chống vi khuẩn G+, G- hiếu khí, cầu trùng Chúng rất ít khi được sử dụng một mình do gia tăng tính đề kháng Diaminopyrimidine thường được phối hợp với sulfonamide, lúc này sự phối hợp cho tác động sát khuẩn

2.2.2.9 Nhóm quinolone

Nhóm quinolone gồm có các kháng sinh: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin, ciprofloxacin Quinolone ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai

đoạn nhân đôi do ức chế DNA gyrase

Nhóm kháng sinh này có tác dụng diệt khuẩn đối với nhiều vi khuẩn G+ và

G- kể cả tụ cầu đề kháng với methicillin và Pseudomonas aeruginosa, chúng còn có tác dụng chống Mycoplasma và Chlamydia

là khi kiểm tra các chủng vi khuẩn thời tiền kháng sinh, các nhà khoa học không phát hiện ra sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kỳ gen liên quan đến tính trạng đề kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn đương thời Áp lực chọn lọc đối với sự đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho động vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng trong thức ăn gia súc

Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng cho toàn xã hội

Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết

kháng sinh dùng trong lâm sàng Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng với kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc

để truyền lại cho những vi khuẩn gây bệnh khác (Võ Thị Trà An, 2007)

2.3.1 Nguyên nhân của sự đề kháng kháng sinh

tế bào đối với streptomycin, nalidixic acid và rifampin; ở tần suất thấp hơn với erythromycin và dường như không xảy ra đối với vancomycin và polymyxin Tuy nhiên, trên thực tế lâm sàng (in vivo), các kiểu đột biến này không đáng kể do hệ thống phòng vệ của

cơ thể tiêu diệt đa số các chủng vi khuẩn đề kháng dạng này Các gen đề kháng có tính di truyền, rất nguy hiểm vì có tính chọn lọc cao tạo ra các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong cộng đồng xã hội

Đề kháng ngoài nhiễm sắc thể: do thu nhận gen plasmid, chiếm tỉ lệ cao đến

80 – 90% Đó là hiện tượng thu nhận thêm mã di truyền tạo cho vi khuẩn có thêm những tính chất mới trong đó có tính đề kháng với kháng sinh

Plasmid: là các phân tử DNA nhỏ không thuộc nhiễm sắc thể (ở ngoài nhân),

có khả năng nhân đôi độc lập, có nhiều gen và mỗi gen xác định tính đề kháng đối với một loại kháng sinh Vì vậy mỗi plasmid có khả năng đề kháng với nhiều loại kháng sinh cùng lúc Một điều nguy hiểm là plasmid có khả năng trao đổi giữa các

vi khuẩn không phân biệt loài này hay họ khi có sự tiếp xúc giữa các vi khuẩn với nhau nên gia tăng tỉ lệ và tốc độ đề kháng một cách đáng kể

Giữa các vi khuẩn với nhau, gen kháng thuốc có thể được trao đổi qua 3 cách: (1) tải nạp là quá trình DNA được thực khuẩn thể sát nhập và chuyển cho một

vi khuẩn khác; (2) biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ một vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm sắc thể; (3) tiếp hợp là quá trình tế bào vi khuẩn cho tổng hợp lông giới tính và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận

(Võ Thị Trà An, 2007)

2.3.2 Các cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.3.2.1 Sản xuất ra enzyme làm bất hoạt kháng sinh

Sản xuất ra enzyme β – lactamase (penicillinase và cephalosporinase): làm bất hoạt kháng sinh β – lactamin; enzyme phosphorylase, adenylase: bất hoạt kháng sinh nhóm aminosid; enzyme acetylase: bất hoạt chloramphenicol

2.3.2.2 Ngăn chặn kháng sinh không thể xâm nhập qua thành tế bào

Màng tế bào của vi khuẩn thay đổi cấu trúc và tính hấp thu chọn lọc làm cho kháng sinh không thể đến nơi tác động được

2.3.2.3 Thay đổi tại điểm tác động

Thường là thay đổi các thụ thể (receptor) làm kháng sinh không còn nơi tiếp xúc nữa Ví dụ: các vi khuẩn G- mất receptor P10 trên tiều đơn vị 30S của ribosome nên aminoside không còn tác động được nữa

2.3.2.4 Phát sinh đường chuyển hóa mới

Vi khuẩn thay đổi đường chuyển hóa bằng đường khác nên làm kháng sinh mất hoạt tính

Ví dụ: sulfamide bị kháng do vi khuẩn tìm được đường khác tổng hợp acid folic không cần dùng PABA nữa Một số chủng thay đổi quá trình tổng hợp vỏ nên penicillin không còn tác động lên sự tổng hợp peptidoglycan được nữa

2.3.2.5 Sản xuất ra nhiều chất cạnh tranh với kháng sinh

Sulfamid bị đề kháng có thể do vi khuẩn tự tổng hợp rất nhiều PABA

2.3.2.6 Đề kháng chéo

Có thể xảy ra giữa các kháng sinh cùng nhóm, cùng cấu trúc hóa học, cùng

cơ chế tác động (Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009)

2.4 Các phương pháp xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh 2.4.1 Phương pháp định tính

Có một vài phương pháp phòng thí nghiệm đo lường sự mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh, trong đó phương pháp khuếch tán trên thạch được

sử dụng nhiều nhất Phương pháp được đề nghị bởi National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1990, MA-A4) là phương pháp khuếch tán trên thạch Kirby-Bauer (Quinn và ctv, 1998)

2.4.1.1 Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng

Phương pháp khuếch tán trên thạch yêu cầu dàn đều vi khuẩn kiểm tra trên

bề mặt đĩa thạch và những đĩa giấy kháng sinh với nồng độ qui định lên bề mặt thạch trước khi đem ủ Nếu vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh thì một vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện xung quanh đĩa giấy sau khi ủ ấm Một trong những lí do cho việc tiêu chuẩn hóa chặt chẽ các bước tiến hành phản ứng là do có rất nhiều yếu tố

có thể ảnh hưởng đến độ lớn của vòng vô khuẩn và chung bao gồm:

(1) Độ đục của huyễn dịch vi khuẩn: Đây là yếu tố quan trọng và độ đục của huyễn dịch vi khuẩn cần kiểm tra phải tương đương với độ đục Mac Farland 0,5 Mục đích là có được những vệt dày đặc vi khuẩn phát triển liên quan đến những khuẩn lạc riêng lẻ tương ứng Bên cạnh đó, mức độ mẫn cảm của một vi khuẩn đối

với một kháng sinh có sự khác nhau trong từng loài, tùng chủng phân lập và nguồn bệnh

(2) Môi trường phản ứng: Mueller-Hinton hoặc các môi trường tương tự (Isosensitest agar, Oxoid) thường được chọn cho những phản ứng nhạy cảm thông thường Môi trường này có chứa một ít chất ức chế sulfonamide, trimethoprim và tetracycline nên hầu hết mầm bệnh phát trển tốt trên nó Hàm hượng quá mức thymidine hoặc thymine trong môi trường phản ứng có thể ức chế sulfonamide và trimethoprim, vùng vô khuẩn nhỏ hoặc không có Sự thay đổi các cation hóa trị hai, chủ yếu là canxi và magie, sẽ ảnh hưởng đến độ lớn vòng vô khuẩn của tetracycline,

polymycin và aminoglycoside trong phản ứng chống Pseudomonas aeruginosa Đối với một số vi khuẩn, như Streptococcus có thể sẽ mọc yếu trên môi trường Muller-

Hinton, thay vào đó môi trường thạch máu chứa 5 – 10% máu cừu có thể sử dụng Nhưng độ lớn vòng vô khuẩn của nafcilin, novobiocin và methicillin sẽ nhỏ hơn 2 –

3 mm so với giới hạn thông thường Độ dày của thạch và pH của môi trường cũng nên được tiêu chuẩn hóa vì nó có thể ảnh hưởng đến độ lớn của vòng vô khuẩn

(3) Chất kháng sinh và nồng độ của nó trên đĩa giấy: Khả năng khuếch tán của kháng sinh ttrên bề mặt thạch có sự khác nhau và vùng vô khuẩn của một số chất, như streptomycin thì tương đối nhỏ Nồng độ của chất kháng sinh trên đĩa giấy được chọn dựa vào sự tương quan giữa độ lớn vòng vô khuẩn với nồng đô đạt được trong máu khi điều trị Hiệu lực của chất kháng sinh trên đĩa giấy nên có phương pháp kiểm soát và duy trì

(4) Điều kiện ủ: Tiêu chuẩn chung cho các phản ứng thử độ mẫn cảm thông thường là ủ trong điều kiện đủ O2 ở 350C trong 16 – 18 giờ hoặc 24 giờ Đĩa thạch không nên ủ trong điều kiện gia tăng CO2 vì điều đó sẽ làm thay đổi có ý nghĩa vòng vô khuẩn của một số kháng sinh Vi khuẩn kị khí không nên kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch và NCCLS (1990) đã công bố phương pháp chuẩn để kiểm tra sự nhạy cảm của vi khuẩn kị khí (M11-T2) (Quinn và ctv, 1998)

2.4.1.2 Chọn lựa đĩa kháng sinh

Việc lựa chọn loại kháng sinh sử dụng trong phản ứng khuếch tán trên thạch dựa vào phổ kháng khuẩn rộng, thuốc được sử dụng thông dụng và được sử dụng rộng rãi trong thú y Tuy nhiên 1 gợi ý cho việc lựa chọn kháng sinh trong những phản ứng xác định độ mẫn cảm thông thường như sau:

Đĩa kháng sinh tetracycline được sử dụng để dự đoán kết quả cho tất cả kháng sinh khác thuộc họ tetracycline

Sulfisoxazole là một đại diện tiểu biểu cho tất cả kháng sinh họ sulfonamide Erythromycin được sử dụng để dự đoán kết quả cho tất cả kháng sinh thuộc

Penicillin: đối với Staphylococcus nên kiểm tra penicillin và oxacillin (cho

chủng đề kháng với methicillin, cephalosporin và các β – lactam khác) Còn đối với

Enteroccus faecalis kiểm tra với penicillin G hoặc ampicillin Kiểm tra với cả hai

chất là không cần thiết

Cephalosporin: Staphylococcus thường nhạy cảm với cephalosporin trừ các

chủng đề kháng với methicillin, nên báo cáo về sự đề kháng ngay nếu phát hiện

Đĩa kháng sinh cephalothin có thể chỉ ra kết quả cho cefaclor, cephapirin, cefazolin, cephradine, cephalexin và cefadroxil Cefafoxime là tiêu biểu cho ceftazidime, ceftizoxime, và ceftriaxone (Quinn và ctv, 1998)

2.4.1.3 Qui trình kiểm tra chất lượng

(1) Chủng vi khuẩn thuần: chủng vi khuẩn phải thuần, không bị tạp nhiễm bởi vi khuẩn khác

(2) Đĩa kháng sinh: Kháng sinh được thấm vào những đĩa giấy bảo đảm hiệu lực duy trì Chúng được giữ ở điều kiện khô thoáng thích hợp và được dự trữ ở -

40C Các đĩa kháng sinh nên được để cân bằng với nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Những đĩa hết hạn sử dụng phải được loại bỏ Chất lượng của những đĩa kháng sinh mới phải được kiểm tra bằng những dòng vi khuẩn chuẩn và vùng vi khuẩn phải được so sánh với bảng giới hạn chuẩn (Quinn và ctv, 1998)

(3) Môi trường phản ứng: Độ dày của đĩa thạch Muller – Hinton xấp xỉ 4mm Tương đương với 60 – 70 ml môi trường trong đĩa petri 140 mm, hoặc 25 – 30 ml môi trường trong đĩa petri 90 mm pH của môi trường cần được kiểm tra và phải nằm trong khoảng 7,2 - 7,4

Mỗi đợt môi trường sau khi đổ nên được kiểm tra có nhiễm khuẩn bằng cách đặt ở 30 – 350

C trong vòng 24 giờ hoặc lâu hơn Những đĩa bị nhiễm khuẩn thì loại

bỏ Môi trường được bảo quản ở 40C và nên sử dụng trong vòng 7 ngày sau khi pha chế

Kiểm tra môi trường phản ứng không có thymidine và thymine bằng chuẩn

vi khuẩn chuẩn Enteroccus faecalis (ATCC 292112 hoặc 33186) với đĩa kháng sinh

trimethoprim / sulfamethoxazole Môi trường tốt sẽ cho vòng vi khuẩn rõ ràng hoặc rất mờ (Quinn và ctv, 1998)

Bảng 2.5 Đường kính vòng vô khuẩn (Theo khuyến cáo từ NCCLS (1990) M2-A4)

Mức độ nhạy cảm

Khi kiểm tra Staphylococci

Khi kiểm tra vi khuẩn khác

10

Ampicillin

Khi kiểm tra vi khuẩn đường ruột G-

Khi kiểm tra Staphylococci

Khi kiểm tra Enterococci

Khi kiểm tra vi khuẩn không phải

Khi kiểm tra Pseudomonas spp

Khi kiểm tra vi khuẩn G- khác

Khi kiểm tra Staphylococci

Khi kiểm tra Enterococci

Khi kiểm tra non – enteric

Khi kiểm tra Pseudomonas spp

Khi kiểm tra vi khuẩn G- khác

Khi kiểm tra Pseudomonas spp

Khi kiểm tra vi khuẩn G- khác

Khi kiểm tra Enterococci

Khi kiểm tra vi khuẩn G+ khác

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (minimal bacteriocidal concentration) là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% số lượng vi khuẩn Sự xác định MBC chỉ được thực hiện khi biết rất chính xác một kháng sinh có thể diệt được một vi khuẩn

chuyên biệt đã được cô lập như viêm màng trong tim do vi khuẩn Thường MBC =

2 – 8 lần MIC Đối với kháng sinh có MBC gần với MIC và dễ dàng đạt nồng độ bằng MBC trong huyết tương thì đó là các kháng sinh diệt khuẩn như penicillin, chloramphenicol, macrolide (Trần Thị Thu Hằng, 2003)

2.5 Những nghiên cứu liên quan đến sự đề kháng kháng sinh trong môi trường

Sự xuất hiện đề kháng kháng sinh với các kháng sinh phổ biến ở những nơi

có thuốc kháng sinh được sử dụng nhiều và vi khuẩn đề kháng này ngày càng tăng trong môi trường Hơn 90% những chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ nước biển đề kháng hơn 1 loại kháng sinh, và 20% đề kháng ít nhất 5 loại kháng sinh Nghiên cứu đề kháng kháng sinh ở vi sinh vật trong nước là quan trọng, bởi vì nó cho biết mức độ thay đổi hệ sinh thái nước bởi hoạt động của con người (Baquero, 2008)

Những chủng Aeromonas được phân lập từ cửa sông của Bồ Đào Nha ít thường xuyên mang gen β – lactamase hơn Enterobacteriaceae (10% so với 78%)

Và trong các nguồn nước thì nửa chủng Aeromonas thể hiện đa đề kháng kháng

sinh (Baquero, 2008)

Theo Urriza và cộng sự (2000) đã phân lập được 138 chủng Aeromonas spp

từ các mẫu nước sông ở Châu Âu Và đã ghi nhận sự xuất hiện đề kháng kháng sinh

của Aeromonas spp như sau: nalidixic acid 59%; tetracycline 14%; fosfomycin 8%;

tobramycin and cotrimoxazole 7%; cefotaxime 4%; chloramphenicol 2%; gentamicin 1%

Theo Abulhamd (2009) đã phân lập được 10 chủng Aeromonas hydrophilia

từ mẫu nước thủy sản Trong đó 100% nhạy cảm với gentamicin, sulphamethoxazole/ trimethoprim 80%, chloramphincol 70%, ciprofloxacin 50%, neomycin 40%, tetracycline 30%, streptomycin 20% và erythromycin 10%; tất cả các chủng đều đề kháng với novobiocin and bacitracin

Theo Gospodarek (1993) đã thực hiện kháng sinh đồ với các chủng

Acinetobacter phân lập từ môi trường: đất, nước, động vật, bệnh viện, lâm sàng

Hầu hết các chủng nhạy cảm với imipenem 99%, ciprofloxacin 95%, netilmicin 88%

Theo Berg và cộng sự (1999) đã phân lập được 40 chủng Stenotrophomonas

maltiphilia từ mẫu bệnh phẩm và từ môi trường đất, nước Trong đó, những chủng

S maltiphilia từ môi trường có tỉ lệ đề kháng kháng sinh như sau: gentamicin 84%,

doxycyclin 57%, ciprofloxacin 26%, imipenem 84%, sulfamethoxazole 0%, chloramphenicol 11%, tetracycline 53%

trimethoprim-Theo Nguyễn Hoàng Thu Trang (2007) đã khảo sát tình hình nhiễm

Pseudomonas aeruginosa trên nước uống Trong đó, tỉ lệ nhiễm Pseudomonas aeruginosa ở nước đóng chai là 16%, nước uống công ty 16%, nước uống gia đình

32%, nước uống trường học 2% Hầu hết các chủng nhạy cảm với các loại kháng sinh thử nghiệm (piperacillin, cefsulodin, ceftazidime, imipenem, aztreonam, gentamicin, tobramycin, amikacin, colistin, ofloxacin, ciprofloxacin, sulfamides, fosfomycin ) Một số chủng bị đề kháng kháng sinh nhưng với tỉ lệ thấp (cefsulodin, tobramycin, amikacin, aztreozam)

3.2 Nội dung nghiên cứu và chỉ tiêu theo dõi

Nội dung 1 Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Aeromonas spp.,

Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia trong môi

Chỉ tiêu theo dõi

- Tỉ lệ phát hiện Aeromonas spp trong môi trường nước

- Tỉ lệ phát hiện Pseudomonas spp trong môi trường nước và đất

- Tỉ lệ phát hiện Acinetobacter spp trong môi trường nước và đất

- Tỉ lệ phát hiện Stenotrophomonas maltophilia trong môi trường đất

Nội dung 2 Thử kháng sinh đồ trên các gốc vi khuẩn phân lập được với

10 loại kháng sinh

Chỉ tiêu theo dõi dựa trên việc đo đường kính vòng vô khuẩn và đối chiếu với bảng đường kính vòng vô khuẩn chuẩn để xác định khả năng nhạy, trung gian hay đề kháng với các loại kháng sinh

3.3 Vật liệu

3.3.1 Đối tượng khảo sát

Mẫu nước thải chăn nuôi, nước nuôi trồng thủy sản, nước sông tại các tỉnh, thành phố: Tp Hồ Chí Minh, Long An, Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang để phân

lập các chủng vi khuẩn Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp

Mẫu đất rau tại Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh, Đồng Nai để phân lập các chủng vi

khuẩn Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia

3.3.3 Môi trường

Môi trường tăng sinh: Baumann’s, BHI (Brain Heart Infusion), NB (Nutrient

broth) có bổ sung methionine

Môi trường phân lập: MacConkey, Aeromonas Agar, CHROMagar™

Acinetobacter agar

Môi trường thạch dinh dưỡng: NA (Nutrient agar), TSA (Tryptone Soya Agar)

Môi trường thử phản ứng sinh hóa: TSI (Triple Sugar Iron Agar), Simmons Citrate Agar, nitrate, glucose, manitol, sucrose, urease, gelatin, di động

Môi trường thực hiện kháng sinh đồ: MHA (Muller – Hinton Agar)

3.3.4 Các hóa chất

Nước muối sinh lý 0,9%, cồn 960, H2O2, giấy thử phản ứng oxidase, thuốc nhuộm Gram, thuốc thử Kovac’s, thuốc thử Methyl Red, thuốc thử VP (α– naphthol), NaOH 40%, thuốc thử Griess A - Griess B, độ đục chuẩn 0,5 Mc F

3.3.5 Đĩa giấy tẩm kháng sinh

Đĩa giấy tẩm kháng sinh gồm có 11 loại do công ty Nam Khoa sản xuất bao gồm: imipenem 30µg, ciprofloxacin 5µg, cloramphenicol 30µg, gentamicin 10µg, doxycycline 30µg, tetracycline 30µg, cephalexin 30µg, trimethoprim/ sulfamethoxazole 25 µg, ampicillin 10 µg, nitrofurantoin 300 µg, rifampin 30µg

Mẫu nước sau khi lấy phải ghi chú rõ ràng, đầy đủ thông tin cần thiết liên quan đến mẫu bao gồm: địa điểm, thời gian, người thu mẫu Bảo quản mẫu trong thùng đá lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm cần bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở ngăn mát và tiến hành phân tích ngay khi đem mẫu về (Trần Linh Thước, 2003)