PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA TRÌNH TỰ 16S RNA, CYTOCHROME B TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH LOÀI CỦA HEO RỪNG VIỆT NAM

41 Hình 17: Cây phát sinh loài NJ Neighbor‒Joining mô tả mối quan hệ giữa các cá thể heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha, Trung Quốc và Rumani dựa trên trình tự 1140

LÊ NGỌC CHÂU

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA TRÌNH TỰ 16S RNA,

CYTOCHROME B TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ PHÁT SINH

LOÀI CỦA HEO RỪNG VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số chuyên ngành: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS HOÀNG NGHĨA SƠN

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2012

và dưỡng dục con nên người Ba Mẹ là chỗ dựa vững chắc, nguồn động viên, cho con nghị lực mạnh mẽ vượt qua những khó khăn, thử thách trong cuộc sống

Và với tất cả lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến:

Thầy Hoàng Nghĩa Sơn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tinh thần và vật chất tốt nhất cho em học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Anh Lê Thành Long đã chỉ dạy tận tình, cho em những lời khuyên bổ ích và giúp

đỡ em tháo gỡ khó khăn trong suốt thời gian làm luận văn

Cô Vân, chị Phương Thảo, anh Phúc Chiến và bạn Khánh Thanh thuộc phòng Công nghệ sinh học động vật, viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn

Mục lục

Phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ii

Danh mục bảng iii

Danh mục hình iv

Mở đầu 1

Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Giới thiệu về heo rừng 3

1.2 Tiến hóa phân tử và phát sinh loài phân tử 7

1.3 Khái niệm loài 8

1.4 Các khái niệm về phát sinh loài 9

1.5 Một số marker phân tử 15

1.6 Các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài phân tử của heo rừng 21

Chương 2: Vật liệu – Phương pháp 2.1 Vật liệu 24

2.2 Phương pháp 27

Chương 3: Kết quả ‒ Biện luận 3.1 Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên trình tự gen cytochrome b 35

3.2 Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên trình tự 16S 44

3.3 Xây dựng cây phát sinh loài dựa trên mối quan hệ với gen cytochrome b và gen 16S 53

Kết luận 57

Danh mục công trình của tác giả 58

Tài liệu tham khảo 59 Phụ lục

Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt

CSB Conserved Sequence Block

DNA Deoxyribonucleic Acid

mRNA messenger Ribonucleic Acid

NCBI National Center for Biotechnology Information

NIH National Institutes of Health

PCR Polymerase Chain Reaction

PKCi Protein Kinase C iota

rRNA ribosomal Ribonucleic Acid

SNP Single-Nucleotide Polymorphism

TAS Termination Associated Sequence

tRNA transfer Ribonucleic Acid

UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic mean

Danh mục bảng

Bảng 1: Một số thiết bị sử dụng trong đề tài 24

Bảng 2: Một số dụng cụ sử dụng trong đề tài 25

Bảng 3: Một số hóa chất sử dụng trong đề tài 26

Bảng 4: Địa điểm thu nhận mẫu heo rừng 28

Bảng 5: Trình tự mồi sử dụng trong PCR và giải trình tự 32

Bảng 6: Nhiệt độ phản ứng của các đoạn mồi 33

Bảng 7: Vùng phân bố các cá thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên dùng trong phân tích trình tự cytochrome b 36

Bảng 8: Thông tin trình tự cytochrome b của cá thể heo rừng nước ngoài dùng trong phân tích 37

Bảng 9: Mức độ tương đồng vùng trình tự gen cytochrome b và chuỗi polypeptide cytochrome b ở một số loài động vật 41

Bảng 10: Vùng phân bố các cá thể heo rừng Việt Nam dùng trong phân tích trình tự 16S 45

Bảng 11: Thông tin trình tự 16S của cá thể heo rừng nước ngoài dùng trong phân tích 46

Bảng 12: Mức độ tương đồng vùng trình tự gen 16S ở một số loài động vật 50

Bảng 13: Mã số các cá thể heo rừng nước ngoài được sử dụng trong so sánh trình tự kết hợp gen cytochrome b và 16S 53

Bảng 14: Khoảng cách di truyền giữa các nhóm heo rừng 54

Bảng 15: Khoảng cách di truyền trung bình giữa các cá thể trong các nhóm heo rừng 55

Danh mục hình

Hình 1: Heo rừng trong môi trường tự nhiên 5

Hình 2: Heo rừng khi còn non 7

Hình 3: Phân loại cây phát sinh loài theo Page và Holmes (1998) 10

Hình 4: Những mối quan hệ giữa loài tổ tiên và loài hiện tại 12

Hình 5: Cấu trúc DNA ty thể của người 16

Hình 6: Cấu trúc của protein cytochrome b 18

Hình 7: Cấu trúc vùng kiểm soát của ty thể ở động vật có vú 19

Hình 8: Một số thiết bị sử dụng 24

Hình 9: Một số dụng cụ sử dụng 25

Hình 10: Kit PureLink TM Spin Column 26

Hình 11: Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm 27

Hình 12: Một cá thể heo rừng lai thu nhận ở khu vực Lâm Đồng 29

Hình 13: Sơ đồ tóm tắt quy trình tách chiết 30

Hình 14: Hình đại diện kết quả khuếch đại vùng gen CY2 ở các mẫu heo rừng 35

Hình 15: Vị trí các điểm đột biến và điểm đa hình trong vùng trình tự cytochrome b (1140 bp) ở các cá thể heo rừng 39

Hình 16: Vùng trình tự polypeptide cytochrome b gồm 336 amino acid được dịch mã từ đoạn gen cytochrome b dài 1140 bp 41

Hình 17: Cây phát sinh loài NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ giữa các cá thể heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha, Trung Quốc và Rumani dựa trên trình tự 1140 bp của gen cytochrome b 43

Hình 18: Hình đại diện kết quả khuếch đại vùng gen S1 ở các mẫu heo rừng 44

Hình 19: Vị trí các điểm đột biến và điểm đa hình trong vùng trình tự 16S (997 bp) ở các cá thể heo rừng 48

Hình 20: Cây phát sinh loài NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ giữa các cá thể heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha và Đài Loan dựa trên trình

tự 997 bp của gen 16S 52 Hình 21: Cây phát sinh loài NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ giữa các cá thể heo rừng Việt Nam, heo lai Việt Nam, heo rừng Châu Âu, và heo rừng Châu Á dựa trên trình tự 2100 bp của gen cytochrome b và 16S 56

Mở đầu

Heo không những là vật nuôi quan trọng mang lại hiệu quả kinh tế cao mà còn

là mô hình thí nghiệm trên người ở những nghiên cứu sinh hóa và y sinh Trong đó,

heo rừng (Sus scrofa) với nhiều tiềm năng mà con người vẫn chưa khám phá hết được

Việc nghiên cứu loài heo này còn ít được quan tâm và còn nhiều bỏ ngỏ

Định danh loài chính xác có vai trò quan trọng trong khoa học pháp y, an toàn thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác Ý tưởng sử dụng các trình tự DNA đặc hiệu loài để định danh loài đã được đưa ra trong những năm đầu thập niên 70 Việc giải toàn bộ trình tự DNA ty thể hoặc giải trình tự một số vùng trên DNA ty thể như vùng kiểm soát

(J Koji Lum, 2006), cytochrome b (Y N Jiang, 2008),… giúp xác định những biến dị

cũng như cây phát sinh loài giữa các loài heo bản địa trên thế giới, từ đó xác định được mức độ đa dạng cũng nguồn gốc của loài heo trên thế giới (E Giuffra, 2000)

Hiện nay một số nghiên cứu trên heo rừng thuần Việt Nam đã được tiến hành Vùng D‒loop của DNA heo rừng của Việt Nam ở một số tỉnh miền Bắc đã được giải trình tự và xác định các biến dị giữa các loài heo bản địa cũng như so sánh loài heo Việt Nam với loài heo của Nhật Bản (Naotaka Ishiguro, 2008) hay việc sử dụng microsatellites để đánh giá so sánh tính đa hình cũng như mức độ đa dạng di truyền của một số loài heo rừng miền Bắc với châu Âu (N.T.D Thuy, 2006) Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng heo rừng khu vực miền Trung, miền Nam cũng như trình tự

cytochrome b và 16S trong đánh giá biến dị và đa dạng di truyền vẫn chưa được quan

tâm nghiên cứu đầy đủ

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng cytochrome b và 16S của

DNA ty thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên và phân tích điểm đa hình cũng như những khác biệt di truyền của heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên so với một

số loài heo rừng các nước khác Kết quả nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo như bảo tồn hay sử dụng nguồn gen heo rừng Tây Nguyên trong công tác lai tạo giống

Mục tiêu đề tài

1 Giải trình tự gen cytochrom b và gen 16S Xác định các SNP (single nucleotide

polymorphism) và thiết lập bộ đa hình đặc trưng của heo rừng Việt Nam khu vực

Tây Nguyên

2 Xác định cây phát sinh loài giữa heo rừng thuần Việt Nam với một số loài heo rừng trên thế giới

Tóm tắt nội dung đề tài

Gen cytochrome b và 16S được sử dụng nhiều trong nghiên cứu mối quan hệ

phát sinh loài Sau khi thu nhận DNA tổng từ mẫu mô tai heo rừng, chúng tôi khuếch đại trình tự gen mục tiêu bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu Kết quả điện di trên gel 1% agarose cho thấy có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại gen

cytochrome b và 16S ở 20 mẫu mô Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự, loại bỏ

những đoạn trùng lắp và những đoạn nhiễu ở hai đầu 5’ và 3’ Các trình tự vùng gen

cytochrome b và 16S của heo rừng Việt Nam được phân tích các điểm đa hình và so

sánh với trình tự tương ứng của heo rừng nước ngoài trên GenBank Kết quả phân tích riêng từng gen cho thấy heo rừng thuần Việt Nam khu vực Tây Nguyên có bộ đa hình đặc trưng, phân biệt với heo rừng lai và heo rừng các nước Kết quả phân tích dựa trên trình tự kết hợp của hai gen càng củng cố những đặc điểm riêng của heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên Ngoài ra, trình tự nucleotide của 2 gen và chuỗi

polypeptide (chỉ ở gen cytochrome b) của heo rừng thuần Việt Nam được so sánh với

trình tự tương ứng của một số loài khác đã khẳng định tính bảo tồn cao ở động vật có

vú Như vậy, bằng phương pháp PCR và giải trình tự, chúng tôi bước đầu xác định được bộ đa hình đặc trưng cho heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên; phân biệt

giữa heo rừng lai và heo rừng thuần Việt Nam dựa trên nguồn trình tự cytochrome b và 16S

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về heo rừng

Heo rừng còn gọi là lợn lòi, tên khoa học là Sus scrofa (Linnaeus, 1758) thuộc

họ heo (Suidae), bộ guốc chẵn (Artiodaclyta) Heo rừng có rất nhiều loài phụ Các loài

phụ khác nhau có thể được phân biệt dựa trên chiều dài, hình dáng của xương hốc mắt

ví dụ như S.scrofa cristatus và S.scrofa vittatis có xương hốc mắt ngắn hơn các loài

Châu Âu (Kingdon, 1997) Dưới đây là một số phụ loài heo rừng đã được nhận biết (Groves, 2008):

 Nòi Viễn Tây (nhóm scrofa)

a Heo rừng phổ biến nhất: sus scrofa scrofa: phân bố chính từ Pháp tới vùng

phía tây Châu Âu (Nga)

b Heo rừng Iberia: sus scrofa baeticus: một phụ loài nhỏ trên bán đảo Iberia

c Heo rừng Castilia: sus scrofa castilia: lớn hơn S s baeticus, phía bắc Tây

Ban Nha (Wilson, 2005)

d Heo rừng Sandinia: sus scrofa meridionalis: một loài heo rừng nhỏ từ Corsica, Sadinia và Andalisua Heo rừng Italia: sus scrofa majori: loài heo rừng này nhỏ hơn S s scrofa

e Sus scrofa Attila: loài heo rừng rất lớn sống ở phía tây Châu Âu từ

Kazakhstan, tới bắc Caucausus và Iran (Groves, 2008)

f Heo rừng Barbary: sus scrofa algria: sống ở vùng Maghreb phía tây bắc

Châu Phi

g Sus scrofa lybica: một loài heo rừng nhỏ sinh sống ở khu vực Caucasus,

đồng bằng sông Nile, Thổ Nhĩ Kì và khu vực Balkan (Groves, 2008)

h Sus scrofa sennaarensis: phân bố ở Ai Cập, và phía bắc Sudan

i Sus scrofa nigripes: loài heo rừng chân đen sinh sống ở dãy núi Tianshan,

khu vực Trung Á

 Nòi heo Ấn Độ

a Heo rừng Ấn Độ: sus scrofa cristatus: sinh sống ở vùng phía nam núi

Hymalaya tới trung Ấn Độ và phía tây Indonesia

b Sus scrofa affinis: phân bố vùng phía nam Ấn độ và Srilanka

c Sus scrofa davidi: phân bố phía đông Iran tới phía bắc Tajikistan

 Nòi heo Đông Á

a Heo rừng Manchuria: sus scrofa ussuricus, loài heo rừng lớn nhất, phân bố

từ Manchuria tới Hàn Quốc

b Heo rừng Nhật Bản: sus scrofa leucomystax: là loài heo nhỏ phân bố ở Nhật

Bản (trừ đảo Hokkaido)

c Heo rừng Ruykyu: sus scrofa riukiuanus: phân bố ở quần đảo Ryukyu

d Heo rừng Formosa: sus scrofa taivanus, phân bố ở Đài Loan

e Sus scrofa moupinensis: phân bố ở Trung Quốc và Việt Nam

f Heo rừng Siberia: Sus scrofa sibiricus, phân bố ở Mông Cổ và Transbaikalia

 Nòi Sundaic

Sus scrofa vittatus: loài heo rừng nhỏ, mặt ngắn, phân bố từ bán đảo Malaysia

và Indonesia từ đảo Sumatra và Java tới Komodo

Hình 1: Heo rừng trong môi trường tự nhiên:

(A) Sus scrofa cristatus (Nguồn: haryana-online.com)

(B) Sus scrofa scrofa (Nguồn: en.wikipedia.org)

1.1.2 Đặc điểm chung

Heo rừng phân bố khắp nơi trên thế giới Ở Việt Nam, chúng có mặt từ trung du đến miền núi Phạm vi hoạt động của heo rừng rất rộng Chúng sống được trong nhiều sinh cảnh khác nhau như rừng thứ sinh, rừng thưa (trừ núi đá) nhưng thích hợp nhất là những thung lũng ven các suối nước có độ ẩm cao, nhiều thức ăn như rừng tre nứa, gần nương rẫy Chúng sống theo bầy đàn, có những bầy đàn lớn từ 20–100 con Tuy nhiên, chúng ta thường chỉ gặp những đàn dưới 20 con Những con đực bình thường vẫn kiếm

ăn một mình, đến mùa động dục chúng mới nhập đàn, tìm bạn tình Chúng thường kiếm ăn vào ban đêm từ chập tối đến gần sáng và nghỉ ngơi trong bụi rậm vào buổi

sáng Mùa đông, chúng làm tổ để nằm Thỉnh thoảng chúng cũng ra khỏi rừng tìm đến những nương rẫy hoặc những nơi có sẵn măng tre vào sáng sớm hoặc chiều tối

Hình dáng của chúng rất giống heo nhà Phần mông nhỏ hơn, phần đầu và ngực rất phát triển Bộ lông thô, dài, cứng, màu đen xám Lông gáy dày và rậm, khi bị kích động hàng lông này dựng lên rất dữ tợn Bộ răng heo rừng rất phát triển, nanh chìa ra ngoài khá dài Đặc biệt mỗi đàn còn có con đực già, to lớn gọi là heo độc Heo độc thường rất khoẻ, có thể đánh nhau để bảo vệ đàn Trọng lượng cơ thể của heo trưởng thành từ 40‒200kg Thân dài từ 135–150 cm, cao 50–70 cm, bàn chân sau phát triển

Sọ heo rừng khá dài, khẩu cái tới 20–22cm, rất thích hợp cho việc đào bới, ủi đất tìm kiếm thức ăn

Heo rừng là loài ăn tạp, chúng có thể ăn bất cứ thứ gì từ quả cây, nấm, củ, rễ đến giun đất, rắn rết, ốc sên, chuột, xác động vật kể cả khi đã thối rữa Thức ăn khoái khẩu nhất là các loại củ quả giàu tinh bột và các loại cây nhiều chất xơ như chuối, măng

Heo rừng sinh sản quanh năm Thời gian mang thai khoảng 4 tháng, mỗi năm 1‒2 lứa, mỗi lứa 5‒6 con Tuy nhiên, thích hợp nhất vẫn là mùa xuân và mùa thu Heo

mẹ làm tổ để đẻ rất chu đáo Heo con sau khi đẻ 30 phút có thể đi lại bình thường, sau một tuần có thể theo mẹ đi kiếm ăn và sau 2 năm thì trưởng thành sinh dục (theo thiennhien.net)

1.1.3 Đặc điểm của heo rừng Việt Nam

Heo rừng Việt Nam nhỏ, thường chỉ nặng từ 35–50kg Mõm dài và nhọn, đầu nhỏ, tai nhỏ, cổ dài thắt ngẫng, không có má Lông heo rừng thường là 3 lông mọc cùng một chỗ, trong khi heo nhà thì lông mọc rời rạc Con non chậm lớn, màu lông thường là hung đen, có sọc vàng chạy dọc theo thân Heo con mới đẻ nuôi rất khó và hay bị chết do hay bị bệnh đi phân trắng Heo mẹ thường đẻ ít con (2‒3 con/lứa) nên hiệu quả kinh tế không cao Trong sản xuất, người dân thường chỉ nuôi con lai giữa heo rừng (heo bố) và heo nhà (heo mẹ)

Hình 2: Heo rừng khi còn non (Nguồn: fieldguides.eol.org)

1.2 Tiến hoá phân tử và phát sinh loài phân tử

Thông tin di truyền của mọi sinh vật trong sinh giới (trừ vài virus) được quy định bởi trình tự sắp xếp của bốn loại nucleotide: adenine (A), thymine (T), guanine (G), cytosine (C) Trong quá trình tồn tại và phát triển, trải qua quá trình tiến hóa, trình

tự thông tin di truyền của sinh vật xuất hiện những sai khác ở một hay một vài vị trí nucleotide so với trình tự ban đầu Vì vậy, trình tự thông tin di truyền của sinh vật này

có thể so sánh với các sinh vật khác để tìm ra mối quan hệ tiến hóa giữa chúng

Kỷ nguyên sinh học phân tử thực sự bắt đầu sau sự kiện toàn bộ trình tự bộ gen

của Haemophilus influenza được công bố vào tháng 7 năm 1995 Ngày 14–04‒2003,

toàn bộ trình tự DNA người đã được giải mã và công bố tại hội nghị thường niên của

NIH Theo đánh giá của các nhà khoa học: “đây là ngày chúng ta hoàn tất lần xuất bản đầu tiên Cuốn sách của sự sống.” Rõ ràng, trình tự DNA được công nhận là tài liệu vô giá ghi nhận lịch sử sự sống trên trái đất Những thông tin sự sống được mã hóa bằng trình tự gen như thế nào hay bằng cách nào có thể khôi phục lại nguồn thông tin này là trách nhiệm vô cùng quan trọng của tiến hóa phân tử

Những thông tin thu được từ hình thái các nhóm sinh vật còn tồn tại cũng như từ những mẫu vật hóa thạch vẫn không thể giải thích đầy đủ và chính xác nguyên nhân quá trình tiến hóa hình thành loài mới, bằng cách nào mà tỷ lệ hình thành loài mới vượt qua thời gian Những vấn đề này sẽ giúp chúng ta hiểu hơn về những mô hình cơ bản

và cả những quá trình tiến hóa hình thành loài mới và tồn tại sự sống

1.3 Khái niệm loài (Ouithavon, 2009)

Kể từ thời Linnaeus, khái niệm “loài” ngày càng được hoàn thiện nhờ những kiến thức từ sinh hóa và di truyền học Ngày nay, nhiều khái niệm “loài” được phát biểu dựa trên các quan điểm về hình thái, di truyền, nguồn gốc…vẫn tồn tại song song

 Loài hình thái

“Loài là một nhóm các cá thể hay nhóm quần thể có đặc điểm hình thái giống nhau hoặc tương tự nhau” Đây là khái niệm loài được phát biểu từ thời Linnaeus (1707–1778), khi ông cho rằng mọi sinh vật đều phải thuộc một đơn vị phân loại thấp nhất là “loài”

 Loài sinh học

“Loài là một hoặc một nhóm quần thể có khả năng giao phối với nhau trong tự nhiên, sinh ra đời con có sức sống, có khả năng sinh sản, cách ly sinh sản với các nhóm quần thể khác” Tuy nhiên, khái niệm loài sinh học chỉ có thể áp dụng cho các loài sinh sản hữu tính mà bỏ qua các loài sinh sản vô tính, trinh sản Bên cạnh đó, khái niệm này cũng không nêu được trình tự thời gian tồn tại loài, đánh giá mức độ cách ly sinh sản giữa các loài

 Loài tiến hóa

“Loài là một dòng duy nhất các cá thể hậu duệ của một tổ tiên chung, duy trì và phân biệt đặc điểm với loài khác, chịu sự tác động của lịch sử và quá trình tiến hóa”, (Wiley,1978) Theo quan điểm này, tất cả các loài trong quá khứ và loài hiện tại có chung một con đường tiến hóa; không có dòng sinh vật nào có thể được chia thành loài

tổ tiên và loài hậu duệ Mayr (1982) đã chỉ ra các khuyết điểm của khái niệm loài tiến hóa như: giảm thiểu các vấn đề của loài, quá trình tích lũy và duy trì những gián đoạn giữa các loài, làm thế nào để phân loại các loài đa chiều…(Ouithavon, 2009)

 Loài phát sinh

“Loài là một nhóm nhỏ nhất các cá thể mang một phần đặc điểm của tổ tiên và của bố mẹ”, (Cracraft, 1983) Cracraft cho rằng nếu cách ly sinh sản không được coi là vấn đề chính trong sự khác biệt phân loại thì đó phải là hoạt động sơ khai và sinh sản ngẫu nhiên Theo khái niệm này, loài được ghi nhận rất nghiêm ngặt về tình trạng của chúng, chẳng hạn như thông tin quá trình tiến hóa Theo đó, hai đơn vị phân loại thân thuộc có thể giao phối và vẫn được xem là loài nếu như chúng có những đặc điểm riêng biệt nhau (Ouithavon, 2009)

1.4 Các khái niệm về phát sinh loài

Ngày nay, các đặc tính loài kế thừa từ tổ tiên, được lưu giữ thông qua trình tự DNA đã bổ sung thêm thông tin cho hình thái học, cung cấp những hiểu biết tốt hơn về phát sinh loài Điều này giúp cho chúng ta hiểu hơn về lịch sử của loài cũng như mối quan hệ giữa loài này với các loài khác Phát sinh loài hay cây tiến hóa là một cấu trúc toán học được sử dụng để mô hình hóa thực tế lịch sử tiến hóa của các nhóm trình tự hay các sinh vật

1.4.1 Cây phát sinh loài

Một cây phát sinh loài gồm có các node (điểm) được nối với nhau bởi các

“nhánh” Cấu trúc của nó bao gồm: “điểm tận cùng” là thông tin đại diện cho nhóm trình tự hay loài sinh vật, vẫn đang tồn tại hoặc đã tuyệt chủng; “điểm trung gian” thể

hiện các tổ tiên giả thuyết; “gốc” thể hiện tổ tiên của tất cả trình tự trên cây tiến hóa Nghiên cứu phát sinh loài tập trung vào mức độ cấu trúc của loài, cụ thể là mối quan hệ giữa các loài trong nhóm cao hơn (chẳng hạn như chi) Page và Holmes (1998) giải thích rằng cây phát sinh loài phân thành ba dạng phân loại cơ bản dựa vào tên chính thức của các nhóm, bao gồm:

 Monophyletic: tất cả các loài trong nhóm là hậu duệ từ một tổ tiên chung và tổ

tiên này không là tổ tiên của bất kì nhóm nào khác

 Polyphyletic: những loài trong nhóm này là hậu duệ từ một vài tổ tiên mà tổ tiên

này cũng là tổ tiên của những loài trong nhóm khác

 Paraphyletic: đây là nhóm không chứa những loài là hậu duệ từ những tổ tiên

chung gần nhất của các loài thành viên

Hình 3: Phân loại cây phát sinh loài theo Page và Holmes (1998)

1.4.2 Các thuật ngữ dùng trong cây phát sinh loài (Page và Holmes, 1998)

Cây phát sinh loài bao gồm một tập hợp các trình tự bao hàm sự tiến hóa khác nhau Có vài cách khác nhau để biểu diễn những thay đổi tiến hóa trên cây phát sinh loài thông qua các thuật ngữ

 Plesiomorphy: sinh vật có trình tự thông tin tương đồng với tổ tiên chung của tất

cả những trình tự đã nghiên cứu trước đó

 Apomorphy: ngược lại với plesiomorphy, là nhánh sinh vật có những khác biệt

cơ bản so với tổ tiên chung

 Autapomorphy: tương tự như apomorphy, nhưng là những tình trạng đặc tính

tồn tại duy nhất

 Synapomorphy: tương tự như apomorphy, nhưng chia sẻ những tình trạng tồn tại

với nhau và không tìm thấy những loài thân cận

 Homoplasy: sinh vật có những trình tự di truyền tương tự nhau, được thừa

hưởng một cách độc lập từ những tổ tiên của chúng Những sinh vật này không thấy rõ mối quan hệ tiến hóa do những điểm tương đồng không phản ánh được mối quan hệ tổ tiên

Hình 4: Những mối quan hệ giữa loài tổ tiên và loài hiện tại

 Chỉ số bootstrap: là tần số xuất hiện của một nhóm (cluster) trên số lần giản đồ được thiết lập Đơn vị tính là % (phần trăm) Theo Felsenstein (1985), bootstrap

là một công cụ hỗ trợ cho việc xây dựng cây phát sinh loài Chỉ số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự gần gũi các thành viên trong nhóm của cây phát sinh loài

 Chỉ số CI (Consistency Index): là tỷ số đo tương thích giữa một cây bất kỳ nào

đó trong tổng số các cây được phân tích có tổng số nhánh ít nhất Giá trị CI biến động trong khoảng 1.0 (tương thích tối đa) tiệm cận đến 0 (ít tương thích nhất) Giá trị CI càng lớn thì kết quả có mức độ tin cậy càng cao

 Khoảng cách di truyền: Khoảng cách di truyền giữa hai chuỗi trình tự là số sự kiện tiến hóa xuất hiện kể từ khi hai chuỗi phân tách từ một tổ tiên chung

Khoảng cách di truyền là cơ sở cho việc xây dựng cây phát sinh loài dựa trên phương pháp khoảng cách Tính khoảng cách di tuyền khi so sánh các trình tự (DNA, polypeptide) phải căn cứ vào nhiều yếu tố, đặc biệt là mô hình thay thế nucleotide (dùng trong phân tích DNA) và ma trận thay thế acid amin (trong phân tích polypeptide)

1.4.3 Xây dựng cây phát sinh loài

Phân tích thông tin di truyền trong nghiên cứu phát sinh loài rất quan trọng trong nghiên cứu lịch sử tiến hóa của sự sống Nhiệm vụ cơ bản của tiến hóa phân tử là chuyển đổi thông tin di truyền trong trình tự DNA thành cây phát sinh loài Có hai phương pháp thường được sử dụng dựa trên những dữ liệu đã được xử lý:

 Phương pháp khoảng cách: đầu tiên là chuyển đổi các trình tự thành những đơn

vị khoảng cách “pair–wise”, sau đó nhập các đơn vị này vào ma trận xây dựng cây phát sinh loài

 Phương pháp tách biệt: xây dựng cây dựa trên vị trí nucleotide một cách trực tiếp

1.4.3.1 Phương pháp khoảng cách (Page và Holmes, 1998)

Trong các phương pháp khoảng cách, khoảng cách tiến hóa của nucleotide thay thế giữa hai đơn vị phân loại, tính cho tất cả các cặp của các đơn vị phân loại và cây phát sinh loài được xây dựng bằng cách sử dụng một thuật toán dựa trên một số mối quan hệ chức năng trong số các giá trị khoảng cách

 Goodness of fit measures: phương pháp này tạo ra cây tốt nhất cho khoảng cách quan sát đầu tiên, bước thứ hai tạo ra cây có tổng chiều dài nhánh là tối thiểu

 Phương pháp ME (Minimum Evolution): cây tiến hóa ME là cây có tổng chiều dài nhánh thấp nhất Tuy nhiên, chiều dài trong trường hợp này được tính toán

từ khoảng cách pair–wise giữa những trình tự thì ít hơn từ vị trí của các nucleotide Một cây tương đồng được thiết lập trước tiên Sau đó, cây này sẽ được tính toán và sắp xếp lại tạo ra một cây tiến hóa ngắn hơn

 Phương pháp NJ (Neighbor‒Joining): là phương pháp được sử dụng rộng rãi để xây dựng cây tiến hóa dựa trên sự kết hợp giữa tốc độ tính toán và tính duy nhất của kết quả Phương pháp này là một phương pháp phân nhóm chứ không phải phương pháp tối ưu Tuy nhiên, đây là một phương pháp hữu ích để kiểm chứng cây tiến hóa tối thiểu cũng được xem như dạng đơn giản của phương pháp tiến hóa tối thiểu Điểm chính của phương pháp này là hai đơn vị phân loại được kết nối với nhau bằng một node nội bộ riêng lẻ thành một cây chia hai nhánh không

có gốc Như vậy, hai loài được coi là có quan hệ thân thuộc nếu chúng được liên kết bằng một node nội bộ riêng lẻ

 Phương pháp UPGMA (Unweighted Pair‒Group Method with Arithmetic mean): đây là phương pháp đơn giản nhất để xây đựng cây tiến hóa Phương pháp này ban đầu được sử dụng trong những bản ghi xây dựng nhưng nó cũng được dùng để dựng cây tiến hóa khi tỷ lệ tiến hóa gần như không đổi Trừ khi tỷ

lệ thay đổi vị trí thông tin di truyền là một hằng số, UPGMA thường cho một cấu trúc liên kết không chính xác

1.4.3.2 Phương pháp tách biệt (Page và Holmes, 1998)

Phương pháp này hoạt động trực tiếp trên những trình tự hoặc dữ liệu đặc điểm riêng và hạn chế hoạt động trên những khoảng cách “pair–wise” Do đó, phương pháp này sẽ hạn chế tình trạng thiếu sót thông tin khi những trình tự ở quá xa nhau

 Phương pháp MP (Maximum Parsimony): phương pháp này sẽ chọn lựa cây tiến hóa thỏa điều kiện là số lượng đặc tính bị biến đổi phải thấp nhất để giải thích những dữ liệu đã quan sát được Phương pháp MP giả định cho rằng cây tiến hóa tốt nhất mô tả tiến trình tiến hóa tốt nhất chính là cây mô tả được các loài ít thay đổi nhất tức là có ít đột biến nhất, cây vì thế có điểm thấp nhất theo một tiêu chuẩn định sẵn

 Nhóm phương pháp ML (Maximum Likelihood): nhóm phương pháp này dựa trên một hàm toán học tính toán xác suất khả năng một cây tiến hóa được tạo

thành từ dữ liệu đã quan sát Hàm này cho phép việc tích hợp các quá trình tiến hóa của đặc tính thành mô hình xác suất Phương pháp ML chọn lựa cây tiến hóa tối đa mà khi quan sát các dữ liệu dưới một mô hình nào đó có xác suất tối

đa

1.5 Một số marker phân tử

1.5.1 DNA ty thể (mtDNA)

Mỗi ty thể có khoảng 12‒15 phân tử DNA dạng vòng trong chất nền DNA của

ty thể (mtDNA) cũng có cấu trúc sợi xoắn kép theo mô hình Watson-Crick và giống DNA của vi khuẩn (DNA dạng trần, không có histon và có cấu tạo vòng) DNA ty thể chứa hệ gen mã hóa cho khoảng 13 protein của riêng ty thể Các dạng mRNA, tRNA, rRNA trong ty thể đều được phiên mã từ DNA ty thể và chúng là cơ sở để ty thể tự tổng hợp lấy một số protein của mình Hệ gen của ty thể được sắp xếp rất hiệu quả: không có intron, vùng “trống” do khung đọc mở chồng lên nhau nhỏ Vùng kiểm soát

là vùng không mã hóa chính, có chức năng điều hòa quá trình phiên mã ở chuỗi nặng

và chuỗi nhẹ cũng như quá trình sao chép chuỗi nặng

Hình 5: Cấu trúc DNA ty thể của người

DNA ty thể được xem như một marker phân tử nhờ những ưu điểm sau (Ouithavon, 2009):

 Tỷ lệ đột biến của DNA ty thể cao gấp 10 lần so với DNA trong nhân do cơ chế sửa sai trong quá trình sao chép không hiệu quả Chính vì vậy DNA ty thể rất hữu ích cho việc phân tích mối quan hệ di truyền của từng cá thể trong nhóm của cùng một loài hoặc đánh giá mối quan hệ giữa các cá thể (mối quan hệ tiến hóa) giữa các loài khác nhau, từ đó có thể biết được khoảng cách tiến hóa giữa các loài Khi một loài nào đó có mối quan hệ tiến hóa càng xa thì số lượng sự khác biệt trở nên lớn hơn

 Những vùng khác nhau của DNA ty thể có mức độ tiến hóa khác nhau Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn vùng gen thích hợp với từng mục tiêu nghiên cứu

 Ở động vật, DNA ty thể di truyền theo dòng mẹ ở hầu hết các loài, do đó nó rất hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền phả hệ theo dòng mẹ Bên cạnh đó, DNA ty thể còn là cơ sở nghiên cứu tổ tiên chung của các loài sau một quá trình tiến hóa lâu dài do không xảy ra quá trình tái tổ hợp

 DNA ty thể được xem như một marker trung tính do những đột biến xảy ra trên DNA ty thể không làm ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của sinh vật Vì vậy, đột biến xảy ra trên ty thể không làm mất đi những kiểu gen của sinh vật đã được chọn lọc trong quá trình tiến hóa

1.5.2 Gene cytochrome b

Cytochrome b là một thành viên trong họ cytochrome (a, b và c) Mỗi phân tử mang 2 nhân heme có khối lượng khoảng 40 kDa và hấp thu ánh sáng ở bước sóng 556‒560 nm (Keilin, 1925) Cytochrome b có vai trò vận chuyển điện tử trong quá trình hô hấp ở ty thể

Gen cytochrome b được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu tiến hóa vì quá trình đột biến xảy ra chậm chạp Nhiều phần của gen cytochrome b được bảo tồn do chức năng của nó còn hạn chế Mặc dù gen cytochrome b đột biến chậm nhưng tỷ lệ những đột biến im lặng lại xảy ra rất cao Vì vậy, cytochrome b có tính ổn định và biến đổi

phù hợp để nghiên cứu sâu hơn về những mối quan hệ tiến hóa Phần lớn những vị trí hay xảy ra biến động nằm trong vùng mã hóa cho màng vận chuyển, các gốc amin và gốc cacboxyl ở vùng đầu tận (Ouithavon, 2009)

Hình 6: Cấu trúc của protein cytochrome b

1.5.3 Vùng kiểm soát (control region)

Vùng kiểm soát của DNA ty thể là vùng không mã hóa, chứa trình tự sao chép chuỗi nặng và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Ở động vật, vùng kiểm soát là trình tự nằm giữa đầu 5’ ở chuỗi nhẹ của tRNAPro và đầu 3’ ở chuỗi nặng của tRNAPhe Vì vùng kiểm soát nằm trong vùng thường xuyên xảy ra các biến động về

số lượng nucleotide (thêm nucleotide, mất nucleotide hay lặp đoạn) nên chiều dài biến thiên từ 880–1400 cặp nucleotide Vùng kiểm soát còn được gọi D‒loop

Vùng kiểm soát được chia làm 3 vùng với hai chức năng chính Vùng kiểm soát

II là vùng trình tự bảo tồn do tỷ lệ đột biến xảy ra chậm chạp Vùng I và vùng III là vùng gần đầu tận 5’ và 3’ nên có tỷ lệ đột biến cao Ở động vật có vú, vùng kiểm soát I nằm ở đầu 5’ mang trình tự liên quan đến sự kết thúc giả định (TAS) Vùng kiểm soát

Vùng nội bào

Vùng ngoại bào

trung tâm mang những đoạn trình tự bảo tồn giữa các loài, thậm chí là giữa hai loài cách xa nhau về mặt tiến hóa Những vùng bảo tồn này còn được gọi là “hộp trình tự bảo tồn” (CSB, B‒F box) Đây là vùng trình tự nhận biết đặc hiệu cho quá trình sao mã

và phiên mã Quá trình kéo dài chuỗi nặng trong sao mã sẽ chấm dứt khi gặp trình tự CBS và TAS Vùng kiểm soát III nằm ở đầu 3’ là vùng linh động nhất vùng này mang các “hộp trình tự bảo tồn” (CBS1, CBS2, CBS3), vùng sao chép của chuỗi nặng và các promoter điều khiển quá trình phiên mã xảy ra ở cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (HSP và LSP) (Ouithavon, 2009)

Hình 7: Cấu trúc vùng kiểm soát của ty thể ở động vật có vú

Ở nhiều loài sinh vật, vùng kiểm soát có tốc độ tiến hóa nhanh hơn các vùng gen khác của ty thể Vì vậy, vùng kiểm soát được sử dụng trong các nghiên cứu xác định cấu trúc dân số loài, mối quan hệ thân thiết giữa các loài… Từ đó giúp giải quyết các vấn đề liên quan đến quan hệ phát sinh loài(Ouithavon, 2009)

1.5.4 Gen 16S rRNA

Phân tử 16S rARN có cấu trúc đặc biệt do nó có thể hình thành cấu trúc bậc 2 và tạo thành 4 domains Nó có cuộn gấp lại nhờ những liên kết từ những đoạn xa nhau và thường nhỏ hơn 8 bp Những đoạn cặp đôi này thường không hoàn chỉnh và có những đoạn phồng ra do bị lồi lên cấu trúc bậc 2 của một phân tử 16S rARN (Thụ, 2005)

Trên đoạn gen 16S rARN xác định được các vùng ổn định (universal) là các

vùng có sự biến đổi rất ít giữa các loài và các vùng biến đổi (variable) là những vùng

có sự khác nhau giữa các loài, chủng Có 8 vùng biến đổi và mỗi vùng có chiều dài khoảng 18‒20 nucleotide Giữa hai vùng có những vùng có biến đổi ít và được gọi là vùng bán bảo tồn (semi-conserved) Ribosome có mặt ở mọi hình thức sống, trình tự

gen 16S rRNA rất ít thay đổi theo thời gian Vì vậy, 16S rRNA đóng vai trò quan trọng

trong việc nghiên cứu phát sinh loài, đặc biệt là ở các loài vi khuẩn

1.5.5 Intron vùng nhân

Intron là trình tự nằm trong DNA nhưng không mã hóa cho protein và không hiện diện ở mRNA trưởng thành Ở eukaryote, sự hiện diện của intron là tăng đáng kể chiều dài, kích thước và khối lượng của gen Mặc dù intron được xem là không có chức năng và bị cắt bỏ trong quá trình biểu hiện gen nhưng trình tự intron gần vùng nối giữa intron‒exon lại có tính bảo tồn cao Hầu hết các đoạn intron ở eukaryote được nhận diện nhờ trình tự các nucleotide bắt đầu và kết thúc “GT…AG” Quá trình cắt ghép intron có vai trò rất quan trọng trong biểu hiện gen Với các vị trí cắt ghép khác nhau,

từ một gen có thể tạo ra nhiều protein khác nhau

Ở eukaryote, phần lớn intron là “spliceosomal intron” hay “intron nhân” do được cắt ghép bởi spliceosome Ở ty thể vi khuẩn và hầu hết các sinh vật prokaryote đều không có sự hiện diện của intron Chính sự vắng mặt này đã dẫn đến giả thuyết

“intron–muộn” cho rằng các intron chỉ mới nhập bào hoặc sống nội cộng sinh trong tế bào eukaryote Trải qua thời gian dài, intron đã chèn vào và tồn tại cùng với DNA của

tế bào eukaryote, tương tự như trường hợp giả thuyết ty thể (Page and Holmes, 1998)

1.5.6 Protein kinase C

Protein kinase C (PKC) là một họ enzyme kinase liên quan đến quá trình kiểm soát chức năng của các protein khác thông qua con đường phosphoryl hóa nhóm hydroxyl của amino acid serine và threonine trên phân tử protein Các protein kinase C

có vai trò quan trọng trong con đường truyền tín hiệu của tế bào Nồng độ diacylglycerol (DAG) hay ion canxi (Ca2+) tăng cao là tín hiệu hoạt hóa của họ protein này (Mellor, 1998)

Họ protein kinase C được chia thành ba nhóm (Nishizuka, 1995):

 Nhóm hoạt hóa nhờ nồng độ diacylglycerol và ion canxi cao

 Nhóm hoạt hóa không phụ thuộc vào ion canxi

 Nhóm hoạt hóa nhờ phosphatidylserine không phụ thuộc canxi và diacylglycerol

Protein kinase C iota (PKCi) là enzyme hoạt hóa nhờ phosphatidylserine không phụ thuộc canxi và diacylglycerol Ở người, PKCi là enzyme cần thiết trong quá trình truyền tin thông qua con đường Ras ở các tế bào ung thư phổi và ung thư biểu mô ruột

Ở các tế bào ung thư tụy và ống động mạch tụy cũng có sự biểu hiện vượt mức của PKCi Sự biểu hiện của PKCi quy định quá trình tạo thành mạch, xâm lấn và di căn của các tế bào ung thư ống động mạch tụy theo chiều thẳng (Scotti, 2010)

1.6 Các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài phân tử của heo rừng

Bộ gen DNA ty thể của một số loài heo bản địa của một số nước trên thế giới (Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ý,…) đã được giải trình tự bằng nhiều phương pháp khác nhau trong đó phương pháp PCR và giải trình tự bộ gene DNA ty thể là phương pháp phổ biến dễ sử dụng (Chen, 2011) Việc giải toàn bộ trình tự DNA ty thể hoặc giải trình tự một số vùng trên DNA ty thể như vùng kiểm soát (Lum, 2006),

cytochrome b (Jiang, 2008),… giúp xác định những biến dị cũng như cây phát sinh loài

giữa các loài heo bản địa trên thế giới, từ đó xác định được mức độ đa dạng cũng nguồn gốc của loài heo trên thế giới (Giuffra, 2000)

Năm 2002, Kim và cộng sự đã phân tích vùng D–loop của các loài gia súc và chỉ ra rằng loài Bershire có nguồn gốc từ Châu Á Sử dụng phương pháp NJ để phân tích đoạn trình tự D–loop ở các loài heo rừng Nhật Bản, Watanobe (2003) nhận thấy tổ tiên của các loài heo rừng Nhật Bản có nguồn gốc từ vùng Nam Á và Đông Bắc Á Nghiên cứu cũng chỉ ra vùng phân bố rộng lớn của tổ tiên các loài heo rừng ngày nay Chúng phân bố rộng khắp Châu Á, Châu Âu, Bắc Phi và là tổ tiên của ít nhất 16 loài heo rừng ngày nay Kijas (2001) tìm thấy sự khác biệt giữa loài heo rừng Thụy Điển và

Mỹ Sơn (Trung Quốc) là 1.21 ± 0.09% Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2011) cũng chỉ ra mối quan hệ tiến hóa giữa heo rừng Ryukyu và Lanyu với các loài gia súc khác

có những điểm rất gần gũi nhau ở trình tự vùng D–loop Cả heo rừng Ryukyu và Lanyu đều là những nhánh của heo rừng Châu Á xuất hiện từ rất sớm

Năm 1999, Watanobe và Okumura đã phân tích trình tự cytochrome b và vùng

D–loop của heo rừng Nhật Bản, heo rừng Ryukyu cùng với các loài heo rừng và heo nhà khác Bằng các phương pháp phân tích cây tiến hóa, nhóm nghiên cứu đã cho thấy nguồn gốc khác biệt của heo rừng Ryukyu so với loài heo rừng Nhật Bản Ryukyu có nguồn gốc từ loài heo rừng Châu Á và có tổ tiên khác xa với tổ tiên của heo rừng Nhật

Bản Ramayo và cộng sự (2010) đã nghiên cứu cytochrome b và vùng D‒loop của heo

rừng ở vùng Primorsky (Nga) Những kết quả thu được từ phân tích trình tự cho thấy các loài heo rừng ở vùng này có quan hệ gần gũi Bảy trong số 14 loài heo rừng ở đây

có nguồn gốc từ một loài heo rừng Trung Quốc

Hiện nay, một số nghiên cứu trên heo rừng thuần Việt Nam đã được tiến hành Vùng D-loop của DNA heo rừng Việt Nam ở một số tỉnh miền Bắc đã được giải trình

tự và xác định các biến dị giữa các loài heo bản địa cũng như so sánh loài heo Việt Nam với loài heo của Nhật Bản (Ishiguro, 2008) Microsatellites cũng được sử dụng để đánh giá, so sánh tính đa hình cũng như mức độ đa dạng di truyền của một số loài heo rừng miền Bắc với Châu Âu (Thuy, 2006) Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng heo

rừng khu vực miền Trung, miền Nam cũng như trình tự cytochrome b và 16S trong

đánh giá biến dị và đa dạng di truyền vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu đầy đủ

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng cytochrome b và 16S của

DNA ty thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên và phân tích điểm đa hình cũng như những khác biệt di truyền của heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên so với một

số loài heo rừng các nước khác Kết quả nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo như bảo tồn hay sử dụng nguồn gen heo rừng Tây Nguyên trong công tác lai tạo giống

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Thiết bị

Hình 8: Một số thiết bị sử dụng (a) hệ thống chụp kết quả điện di; (b) máy luân nhiệt Bảng 1: Một số thiết bị sử dụng trong đề tài

2.1.2 Dụng cụ

Hình 9: Một số dụng cụ sử dụng (a) micropipette; (b) khuôn đổ gel Bảng 2: Một số dụng cụ sử dụng trong đề tài

2.1.3 Hóa chất

Hình 10: Kit PureLink TM Spin Column Bảng 3: Một số hóa chất sử dụng trong đề tài

1 Kit PureLinkTM Spin Column Invitrogen

5 Agarose

6 Ethidium Bromide

7 TAE buffer

2.2 Phương pháp

2.2.1 Quy trình thí nghiệm

Các thí nghiệm thực hiện trong đề tài được tóm tắt trong sơ đồ sau:

Hình 11: Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm

2.2.2 Đối tượng nghiên cứu – Phương pháp thu mẫu

Đối tượng nghiên cứu là mẫu mô tai heo Các mẫu mô tai heo được thu nhận từ

các cá thể heo rừng ở những địa phương khu vực Tây Nguyên Địa điểm thu nhận mẫu

mô tai heo được tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 4: Địa điểm thu nhận mẫu heo rừng

3 Trại Thành Đạt, quốc lộ 20,

4 19 Nguyễn Chí Thanh, Bảo Lộc 14, 15, 19 Hộ dân chăn nuôi

5 187 Lam Sơn, Lộc Sơn, Bảo Lộc 16 Hộ dân chăn nuôi

7 Khu vực Tánh Linh‒Bảo Lộc 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Môi trường tự nhiên

8 Lạc Dương, Lâm Đồng 8, 9, 10, 11 Môi trường tự nhiên

Hình 12: Một cá thể heo rừng lai thu nhận ở khu vực Lâm Đồng

Các mẫu mô tai heo sau khi thu nhận được rửa sạch bằng dung dịch muối sinh

lý 0,9% Sau đó, mẫu mô được trữ ở -200C trong eppendorf 1,5ml và chuyển nhanh về

phòng thí nghiệm để thực hiện thí nghiệm

2.2.3 Thu nhận DNA

Quy trình thu nhận DNA từ mẫu mô tai heo được thực hiện theo bộ kit

PureLinkTM Spin Column của Invitrogen

Hình 13: Sơ đồ tóm tắt quy trình tách chiết

2.2.3.1 Chuẩn bị mẫu mô tai heo

 Cắt nhỏ vụn mẫu mô tai heo

 Thêm 180 µl PureLink™ Genomic Digestion Buffer và 20 µl Proteinase K

(trong bộ kit), vortex kỹ

 Ủ qua đêm ở nhiệt độ 550C

 Thêm 20 µl RNase A (theo bộ kit) vào dung dịch ủ mẫu, hòa trộn kỹ và ủ ở

nhiệt độ phòng trong 2 phút

 Thêm 200 µl PureLink™ Genomic Lysis/Binding Buffer, vortex

 Thêm 200 µl 100% ethanol, vortex kỹ trong 5 giây

2.2.3.2 Tách rửa DNA

 Chuyển 640 µl dung dịch vào cột tách chiết DNA

 Ly tâm 10000g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

 Loại bỏ dịch, chuyển cột ly trích qua tube mới

 Thêm 500 µl dung dịch Wash buffer 1 vào cột và ly tâm 10000g trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng

 Loại bỏ tube cũ, chuyển cột qua tube mới

 Thêm 500 µl dung dịch Wash buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 vòng/phút, trong

3 phút ở nhiệt độ phòng

 Loại bỏ tube cũ, chuyển cột qua tube mới

2.2.3.3 Thu nhận và bảo quản DNA

 Thêm 50 µl dung dịch PureLink™ Genomic Elution Buffer vào cột và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 1 phút

 Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

 Loại bỏ cột, thu nhận dung dịch trong tube

 Dung dịch trong tube có chứa DNA, được bảo quản ở -200C