NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH CÁC GEN GÂY BỆNH CỦA HELICOBACTER PYLORI TỪ MẪU SINH THIẾT DẠ DÀY

ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn H.pylori được phát hiện đầu tiên bởi Marshall và Warren nǎm 1982 từ mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày người.. Một vài gen độc lực có lẽ giữ vai trò trong sự phát sinh

HỌC VIỆN QUÂN Y TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU SINH Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ

HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

1 Hoàng Ngọc Cường DH38A

2 Trương Hữu Hoàng DH38A

3 Hoàng Thị Minh DH38A 4.Hoàng Văn Tú DH38A 5.Nguyễn Đông Hưng DH38A

Hà Nội – 2008

HỌC VIỆN QUÂN Y TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU SINH Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ

HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

1 Hoàng Ngọc Cường DH38A

2 Trương Hữu Hoàng DH38A

3 Hoàng Thị Minh DH38A 4.Hoàng Văn Tú DH38A 5.Nguyễn Đông Hưng DH38A

Hà Nội – 2008

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn H.pylori được phát hiện đầu tiên bởi Marshall và Warren nǎm

1982 từ mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày người Nhiều nghiên cứu tiếp theo đã cho thấy vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng và là nguyên nhân chính trong bệnh sinh của viêm loét dạ dày - tá tràng và ung thư dạ dày Các nghiên cứu về dịch tễ học cho thấy khoảng một nửa dân số thế giới đang bị nhiễm vi khuẩn này (Trích biên bản hội thảo quốc tế về nhiễm trùng H.pylori ở Dublin, Ireland, 7/1992)

Hầu hết những người nhiễm Helicobacter pylori đều không có triệu chứng,

và chỉ có một tỉ lệ nhỏ những bệnh nhân nhiễm phát triển thành bệnh loét dạ dày (PUD - peptic ulcer diseases), một số ít hơn tiến triển thành ung thư dạ dày (Rudi et al., 2000; Nomura et al 1994) Điều này có thể do một vài chủng H pylori mang nhiều độc tố hơn các chủng khác (Tovey et al., 2006) Sự biến đổi của biểu hiện lâm sàng có liên quan đến một vài yếu tố như yếu tố độc lực của chủng, yếu tố miễn dịch của cơ thể chủ và những ảnh hưởng của môi trường, hoặc là sự kết hợp của các yếu tố trên (Atherton et al., 1997) Một vài gen độc lực có lẽ giữ vai trò trong sự phát sinh bệnh, cagA gene (chiếm khoảng 68% các chủng) và vacA gene (hầu như có mặt trong tất cả các chủng) được tìm thấy có mối liên quan nhiều với mức độ của bệnh (Yamazaki et al., 2005) Sự tác động của 2 yếu tố độc lực chính này trên tế bào biểu mô dạ dày làm sáng tỏ hệ thống phức tạp của sự tương tác tế bào được kích hoạt bởi vi khuẩn này (Moss ad Sood 2003) Những bệnh nhân viêm tá tràng, loét tá tràng, và loét dạ dày hầu hết nhiễm chủng mang gen cagA - vacA, giả thuyết chúng giữ một vai trò quan trọng trong phát sinh bệnh (Censini et al., 1996) Vì vậy việc phát hiện những chủng mang gen cagA - vacA có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác dự phòng

và điều trị các bệnh lý dạ dày

Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán và phát hiện gene độc lực của Helicobacter pylori đã khá phổ biến trên thế giới, tuy nhiên tại Việt Nam việc ứng dụng công nghệ này chưa nhiều và các công trình

mới chỉ dừng lại ở việc phát hiện các gene độc lực bằng các phản ứng riêng lẻ

mà không phát hiện được những chủng mang nhiều gene độc lực cùng một lúc, điều này gây tốn kém và không đáp ứng được nhu cầu điều trị.Vì vậy chúng tôi

tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kĩ thuật PCR chẩn đoán các gen gây bệnh của H.pylori từ mẫu bệnh phẩm sinh thiết dạ dày” với các mục tiêu sau:

-Xây dựng qui trình tách chiết DNA tổng số của H.pylori từ mảnh sinh thiết dạ dày

-Xây dựng qui trình kĩ thuật Multiplex-PCR xác định các gen gây bệnh của H.pylori

-Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kĩ thuật PCR xác định gen gây bệnh của H.pylori

-Ứng dụng kĩ thuật PCR xác định kiểu gen của H.pylori gây bệnh trên bệnh nhân bị bệnh lý dạ dày tá tràng(ung thư, loét dạ dày)

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TÌNH HÌNH NHIỄM HELYCOBACTER PYLORI TRÊN THẾ GIỚI

VÀ TRONG NƯỚC

1 1 Tình hình nhiễm H Pylori

Mặc dù nhiễm trùng H pylori mới được phát hiện cách đây không lâu sau những công bố của Marshall và Warren những nghiên cứu tiếp theo về dịch tễ học đã làm mọi người kinh ngạc khi “ hầu như nửa dân số thế giới bị nhiễm H pylori ”( hội thảo quốc tế về nhiễm trùng H.pylori,Dublin,Ireland,1992) Các nghiên cứu cho thấy H pylori phân bố khắp các khu vực, quốc gia trên thế giới nhưng mức độ lưu hành H pylori giữa các vùng, các quốc gia khác nhau phụ thuộc nhiều yếu tố trong đó tình trạng kinh tế xã hội là yếu tố quan trọng nhất Nhìn chung tỉ lệ nhiễm H pylori ở các nước phát triển thấp hơn so với các nước đang phát triển, nhưng ở cả hai nhóm nước đều có sự gia tăng về mức độ lưu hành theo tuổi

* Ở các nước phát triển:

Các nghiên cứu dịch tễ học ở các nước phát triển cho thấy tỉ lệ nhiễm

H pylori khoảng 20% ở độ tuổi dưới 40 và 50% ở độ tuổi từ 60 trở lên Tỉ lệ huyết thanh dương tính với H pylori thấp hơn 10% ở các trẻ dưới 10 tuổi, nhưng tỉ lệ nhiễm trùng gia tăng theo tuổi hàng năm ở trẻ em khoảng 0,5%-

1,0% Ở người lớn tỉ lệ nhiễm trùng gia tăng theo tuổi hàng năm thấp hơn ở trẻ

em, từ 0,3%-0,5% [Bruce E và CS, 1997; Graham và CS, 1991] nhưng lại có bước nhảy về mức độ lưu hành cao sau tuổi Đó chính là tỉ lệ nhiễm ở thời thơ

ấu của họ, thời điểm mà tình trạng kinh tế xã hội của các nước phương Tây còn thấp [Graham DY và CS,1991;Marshall BJ và CS,1984]

* Ở các nước đang phát triển:

Tỉ lệ nhiễm HP ở các nước đang phát triển cao hơn hẳn các nước phát triển Trẻ

bị nhiễm từ rất sớm, tỉ lệ 50% ở trẻ dưới 5 tuổi và tăng lên đến 70%-90% ở người trưởng thành Tỉ lệ nhiễm mới của ở trẻ hàng năm là 10% ở lứa tuổi từ 2 đến 8 [Marshall BJ và CS,1984; Mergaud F và CS, 1989] Tuy nhiên tỉ lệ nhiễm không giống nhau trong các nước đang phát triển:

Huyết thanh dương tính với H pylori ở Algeri là 43% ở trẻ em và đạt tới 92%

ở người lớn độ tuổi 40 đến 49 [Pradip K.Bardhan, 1997] Ở Nam Phi tỉ lệ H pylori dương tính là trên 50% ở độ tuổi dưới 10 và 94% ngay ở độ tuổi 30 [ Pradip K.Bardhan, 1997] Ngay trong cùng một quốc gia mà tỉ lệ H pylori dương tính cũng khác nhau giữa các khu vực và các đối tượng: ở Chile số liệu giữa các vùng ở người lớn là 43%-92%, ở trẻ em là 6%-100% trên các đối tượng khác nhau [Guillmermo F và CS, 1997] Ở Bangladesh cho thấy H pylori dương tính 61% ở trẻ 1-3 tháng tuổi, giảm xuống 33% ở trẻ 10-15 tháng và lại tăng lên đến 84% ở trẻ 5-8 tuổi [Sarker SA và CS, 1997] Như vậy dịch tễ học H pylori

bị chi phối bởi nhiều yếu tố

Tháng 06/1994 chi nhánh quốc tế của nhóm nghiên cứu về ung thư của WHO định nghĩa H pylori là tác nhân gây ung thư ở người Khoảng 50% dân số thế giới được đánh giá nhiễm H pylori Tỉ lệ lưu hành H pylori trong huyết thanh nói chung tăng theo tuổi: 5-27% ở thời thơ ấu và >70% ở người >50 tuổi Ước tính khoảng 8-10% dân số thế giới bị loét dạ dày tá tràng (LDDTT), trong đó LDD chiếm khoảng một phần tư Ở các nước châu Âu, tỷ lệ LDDTT khoảng 5-10% dân số

Ở Mỹ có khoảng 4-10% dân số bị LDDTT

Viêm loét dạ dày-tá tràng (DD-TT) là bệnh lý phổ biến Tại Mỹ, tỉ lệ mắc

bệnh tính trong suốt cuộc đời, khoảng 12% ở nam giới và 10% ở nữ giới Bệnh

có tỉ lệ tử vong thấp, nhưng gây đau đớn và tốn kém cho bệnh nhân

Ước tính có khoảng 5-10% dân số trên thế giới bị bệnh đau dạ dày Riêng bên Mỹ có đến 25 triệu người bị bịnh, số đàn ông và đàn bà bịnh ngang nhau Ở Việt Nam tỉ lệ này là 7% Tuy nhiên, điểm quan trọng nhất mà y học ngày nay mới phát hiện ra đó là có đến hơn 70% số dân có nguy cơ bị nhiễm chứng bệnh này và nguyên nhân chính đã được xác định là vi trùng Helicobacter Pylori

1.2 Tình hình bệnh lý dạ dày do Helicobacter Pylori trong nước

Việt Nam cũng nằm trong khu vực có tỉ lệ nhiễm H.pylori cao nhưng chưa

có một nghiên cứu dịch tễ học qui mô nào mô tả bức tranh đầy đủ về nhiễm trùng H.pylori ở Việt Nam Theo kết quả xét nghiệm huyết thanh học, Phùng Đắc Cam, tỉ lệ lưu hành kháng thể kháng H.pylori ở nhóm người có bệnh dạ dày

- tá tràng là 98,2%, ở nhóm khỏe mạnh là 77,4% Tỉ lệ nhiễm mới ở cả 2 nhóm

là 6,5-7,3% (13)

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Khánh Trạch trên 528 người ở Thanh Hóa, Hà Nội, Nha Trang thấy tỉ lệ nhiễm H.pylori (xác nhận bằng phương pháp ELISA) ở người khỏe mạnh trong cộng đồng là 75%; trong đó, nam chiếm 76,4%; nữ 74,7%

2 HÌNH THỂ VÀ CẤU TRÚC GENOME CỦA HELICOBACTER PYLORI

2.1 Phân loại và danh pháp:

Helicobacter pylori ban đầu gọi là Campylobacter like organism do chúng

có hình thái giống một nhóm tác nhân gây bệnh đường ruột khác đã biết là Campylobacter Sau đó Goodwin và cộng sự đã đề nghị xếp nó vào một giống mới là giống Helicobacter Tháng 6 năm 1989, tạp chí quốc tế về hệ thống học vi khuẩn đã chấp nhận giống vi khuẩn mới là Helicobacter, từ đó Campylorbacter pylori được gọi là Helicobacter pylori Hiện nay theo hệ thống học vi khuẩn, giống Helicobacter là một giống thuộc phân lớp epsilon, trong ngành proteobacteria Sau khi phát hiện về H.pylori người ta còn phát hiện ra 21 loài thuộc giống Helicobacter cư ngụ trên các động vật khác và khả năng còn phát

hiện ra nhiều vi khuẩn khác nữa thuộc nhóm này

2.2 Hình thể và cấu trúc:

Helicobacter Pylori có hình cong, xoắn nhẹ, gram âm, đường kính 0,3-1,0

µm, dài 1,5-5 µm, trên tiêu bản nhuộm có hình chữ S, dấu ~,dấu ?, hình cánh cung trên các nuôi cấy lâu ngày

Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có 4 - 6 roi, đầu mút hình củ hành Nhờ

có roi, vi khuẩn có thể di chuyển được trong lớp chất nhày của niêm mạc dạ dày

Vi khuẩn có hệ thống men phân giải ure và hệ thống các enzym gồm urease, oxidase, catalase, phosphatase kiềm, γ glutamyl, transferase, ANDase … trong

đó men urease có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của vi khuẩn

Men urease có hệ thống gen gồm có C, D, A, B, I, F, G, H; trong đó gen

A, B là gen cấu trúc; còn gen F, G, H là gen hoạt tính giữ vai trò hoạt động của men Men urease giữ vai trò thủy phân urea để tạo ra NH3 và CO2, tạo ra vi môi trường kiềm bảo vệ cho H.pylori khỏi bị tác dụng của acid dạ dày Men urease làm tổn thương các tế bào niêm mạc dạ dày do các ion H+ sinh ra nhờ cân bằng với NH3 và nước khuếch tán vào thành dạ dày làm tổn thương niêm mạc H.pylori sản xuất ra protein bề mặt có tính chất hóa ứng động đối với bạch cầu đơn nhân và đa nhân

(Một số hình ảnh H Pylori)

Kích cỡ toàn bộ gen (genom) của Helycobacter Pylori nằm trong khoảng 1,6-1,73 Mb chức năng của hơn 60 gen khác nhau trong bản đồ gen của HP đã được xác định, một số gen liên quan đến gây bệnh được đặc biệt quan tâm là

CagA và VagA

- Gen VagA mã hóa cho độc tố VagA ( vacuolating toxin A) gây tổn thương tế bào niêm mạc và hình thành nên những không bào ( hốc) trong tế bào Gen này có ở tất cả các chủng Helycobacter Pylori nhưng vagA chỉ xuất hiện khoảng 40%-50% số chủng lưu hành [Bruce E.Dunn và CS, 1997; Zhongming Ge và Diane E.Taylor, 1999] Độc tố này được hoạt hóa ở độ pH thấp và có tính bền vững với acid và pepsin Gen vacA (gen mã hóa cho độc

tố VacA) không có một vị trí cố định trên bộ gen nhưng luôn nằm cách xa

tiểu đảo sinh bệnh và thay đổi tùy thuộc từng chủng H.pylori Phần giữa của

gen (m - middle) có hai alen m1 và m2, và vùng tín hiệu (s - signal) cũng được phân loại thành các alen s1, bao gồm s1a, s1b và s2 Những thay đổi khác nhau của gen này rất quan trọng đối với khả năng bài tiết độc tố gây rỗng hoạt động của vi khuẩn, trong đó kiểu gen s1/m1 có khả năng bài tiết độc tố mức độ cao, kiểu gen s1/m2 bài tiết độc tố ở mức độ vừa phải, trong khi đó kiểu gen s2/m2 thì không có khả năng bài tiết độc tố, không thấy chủng nào có kiểu gen s2/m1 Những nghiên cứu gần đây cũng thấy rằng, chủng có chứa gen vacA s1a có mối liên quan lớn hơn với việc thâm nhiễm bạch cầu hạt và tế bào lympho ở niêm mạc hang vị hơn những chủng có chứa kiểu gen s1b hoặc s2 Chủng chứa gen vacA m1 có mối liên quan lớn hơn trong tổn thương biểu mô dạ dày hơn chủng có gen m2 Bệnh loét hành tá tràng thường thấy ở những bệnh nhân chứa chủng có kiểu gen s1a hơn là ở những bệnh nhân có chưa chủng s1b và s2

- Gen cagA mã hóa cho một loại protein liên quan đến độc tính mang tên cagA ( cytotoxin-associated gen A ), gen này cũng có mặt ở hầu hết các chủng phân lập được nhưng chỉ biểu hiện ở 50%-70% các chủng lâm sàng [Leen-Jan van Doorn và CS, 2001] Những chủng có biểu hiện đồng thời cả cagA và vagA thường gây ra những tổn thương nặng ở niêm mạc cả invitro

và invivo, có vai trò gây bệnh rõ rệt, những chủng này được gọi là “ chủng độc ” và được xếp vào type I, phân biệt với type II ( không có cagA và vagA ) ít có khả năng gây bệnh hơn [Helena Enroth và Lars Engstrand, 2001;

Zhongming Ge và Diane E.Taylor, 1999] Người ta gọi là CagA vì độc tố này

có tính kháng nguyên rất mạnh và cơ thể người bệnh nhiễm chủng H.pylori

sản xuất Cag A sẽ nhanh chóng xuất hiện kháng thể kháng Cag A Gen Cag A

thường có trên những chủng vi khuẩn bài tiết độc tố gây rỗng tế bào Mặc dù

gen Vac A, gen sản xuất ra độc tố gây rỗng, không phải là một phần trong

tiểu đảo sinh bệnh (PAI) nhưng người ta thấy độc tố gây rỗng (Vac A) sẽ

không được H.pylori bài tiết nếu không có sự hiện diện của PAI Trên thực

nghiệm khi người ta vô hiệu hóa gen Cag A và thấy trong khi phần còn lại

của PAI vẫn nguyên vẹn thì vi khuẩn vẫn có khả năng bài tiết độc tố gây

rỗng

- Gen iceA mới được phát hiện gần đây, chức năng chưa hoàn toàn sáng tỏ

chỉ quan sát thấy, nhưng điều đặc biệt là sự biểu hiện của nó chỉ quan sát thấy

khi H pylori tiếp xúc với tế bào niêm mạc của người [Leen-Jan van Doorn

và CS, 2001]

Ngoài ra còn một số gen quan trọng của H pylori cùng với chức năng của

chúng như:

abcdABCD : tham gia vào hoạt tính của eanzym urease

babA/B : mã hóa cho điểm bám trung gian của

H pylori với té bào niêm mạc dạ dày

ureA/B : gen cấu trúc của urease

GyrA : kháng ciprofloxacin

(Nguồn : Leen-Jan van Doom, 2001 ; Zhongming Ge, 1999)

Các nghiên cứu về sinh học phân tử đã cho thấy trật tự gen của H.pylori

thay đổi rất đa dạng giữa các chủng, mỗi một chủng ký sinh trên dạ dày người

lại mang một đặc điểm khác nhau, thậm chí cùng một chủng trước và sau điều

trị đã thấy xuất hiện một số thay đổi trong DNA của nhiễm sắc thể hoặc của

plasmid hoặc cả hai [Brown LM, 2000; Helena Enroth và CS,1999] tính đa

dạng trong chuỗi gen của các chủng H pylori do có những vùng trong đó mang

đặc tính đột biến và tái tổ hợp cao [Ge Wang và CS, 1999] Điều này giúp H

pylori thích nghi cao với môi trường, đồng thời cũng giải thích khả năng kháng lại kháng sinh nhanh chóng của chúng trong quá trình đièu trị và tạo ra một số khác biệt trong các kỹ thuật chẩn đoán kháng thể

Người ta dựa vào các gen Cag A, Vac A để chia ra các typ H.pylori

như sau:

- Typ I là H.pylori có cả gen Cag A, Vac A sản xuất ra protein Cag A và

protein Vac A có độc tính là typ có liên quan nhiều với tổn thương nặng nề ở

dạ dày

- Typ II là H.pylori không có cả gen Cag A, Vac A nên không sản xuất ra

protein Cag A và protein Vac A có độc tính

- Typ III là H.pylori không có gen Cag A, nhưng có gen Vac A

- Typ IV là H.pylori không có gen Vac A nhưng có gen Cag A

Ngoài độc tố tế bào, H.pylori còn có thể tác động đến quá trình hình thành và bài tiết các thành phần của dịch vị H.pylori hoạt hóa các bạch cầu

đa nhân đã bộc lộ HLADR và các thụ cảm thể interleukin 2 trên bề mặt tế

bào và sản xuất ra các superoxid, interleukin 1, yếu tố hoại tử u α H.pylori

sản xuất ra protease làm phân hủy các glycoprotein- lipid của lớp chất nhày dẫn đến làm giảm độ nhày và độ quánh của lớp chất nhày; do đó mặc dù vi khuẩn làm tăng tổng hợp và bài tiết chất nhày nhưng chất lượng chất nhày dạ

dày giảm, khả năng bảo vệ niêm mạc của chất nhày cũng giảm H.pylori

cũng sản xuất một chất bám dính làm vi khuẩn dễ bám vào bề mặt niêm mạc hơn tạo điều kiện cho vi khuẩn cư trú và phát triển

2.3 Vị trí cƣ trú của H.pylori

Vi khuẩn H.pylori ở trong môi trường của acid của dịch vị làm lỏng lớp

chất nhày che phủ niêm mạc dạ dày; tạo ra môi trường riêng thích hợp cho

vi khuẩn tồn tại và phát triển Ở niêm mạc dạ dày, H.pylori thường cư trú ở

khe giữa các tế bào biểu mô ở phần sâu nhất của lớp chất nhày Đôi khi,

người ta cũng thấy H.pylori ở trong tế bào Ngoài niêm mạc dạ dày, H.pylori

còn có thể cư trú ở niêm mạc tá tràng, niêm mạc thực quản khi có dị sản

niêm mạc dạ dày Một số nghiên cứu nhận thấy H.pylori tồn tại được ở môi

trường quanh bào tương tế bào với pH thích hợp từ 4-8; tuy nhiên trong

khoảng pH từ 4- 6 thì vi khuẩn H.pylori chỉ có thể tồn tại chứ không phân

chia được

2.4 Nuôi cấy

H pylori thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, chúng thường được nuôi trong điều kiện có 5% O2 , 10%CO2, 85%N2, Nhiệt độ 35-370C và độ ẩm cao Phần lớn các môi trường nuôi H pylori đều sử dụng máu ngựa hoặc máu cừu tươi, môi trường chọn lọc có nhiều kháng sinh như vancomycin, trimethoprim và amphotericin B để ức chế tạp nhiễm(Fred M Sutton và CS) Sau 3-5 ngày nuôi cấy (có thể đến 14 ngày) có thể nhận thấy các khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám trong, đường kính 0,5-1mm, không tan máu hoặc tan máu anpha Trên tiêu bản nhuộm Gram, hình thể đa số là hình cong, mức độ xoắn không điển hình như trên tiêu bản trực tiếp từ mảnh sinh thiết, có cả trực khuẩn Sau 7 ngày nuôi cấy,

có thể thấy các thể hình cầu

2.5 Đường lây,nguồn lây

Nguồn truyền nhiễm của H pylori chủ yếu là người, một số tác giả đề cập đến cừu và khỉ rhesus cũng có thể là nguồn truyền nhiễm(Dore MP và CS,Hazel

M Mitchell 2001), nhưng việc phân lập được H pylori là không phổ biến Mặc

dù phân bố của H.pylori là khắp thế giới nhưng đường lây của chúng vẫn chưa hiểu được một cách đầy đủ Đường lây truyền chủ yếu là từ người sang người qua đường tiêu hoá Phương thức lây được đề cập nhiều nhất là đường phân-miệng, đương miệng-miệng và đường dạ dày miệng(hay còn gọi là đường chất nôn-miệng) , nhưng đường nào là quan trọng thì vẫn còn nhiều tranh luận

3 VAI TRÒ CỦA H.PYLORI VỚI BỆNH LÝ VIÊM LOÉT DẠ DÀY VÀ LOÉT HÀNH TÁ TRÀNG

3.1 Vai trò của H.pylori với bệnh lí viêm dạ dày và loét hành tá tràng

Viêm dạ dày là tình trạng viêm ở niêm mạc dạ dày Dựa vào triệu chứng viêm dạ dày, chia thành hai loại chính là viêm dạ dày cấp và mạn tính

Vi khuẩn H.pylori có thể gây viêm dạ dày ruột cấp tính rồi dẫn đến viêm

dạ dày mạn tính Tuy nhiên, tổn thương viêm dạ dày cấp do H.pylori thường

thoảng qua và khó phát hiện

Viêm dạ dày mạn tính hiện nay sử dụng phương pháp phân loại của Strickland và Mackay chia thành:

Viêm dạ dày mạn tính typ A là bệnh ít phổ biến có đặc trưng viêm chủ yếu

ở vùng thân và đáy dạ dày, vùng hang vị ít khi gặp Bệnh gây ra do thiếu yếu

tố nội tại của dạ dày, dẫn đến giảm hấp thu vitamin B12,giảm tiết acid, liên quan đến bệnh thiếu máu ác tính Viêm dạ dày typ A ít liên quan với nhiễm

chặt chẽ giữa nhiễm H.pylori với viêm dạ dày mạn tính typ B Tỷ lệ nhiễm

H.pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày từ 44 - 92% tùy tác giả và nơi nghiên cứu

Cơ chế tổn thương do H.pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính:

- Men urease của H.pylori thủy phân ure tạo thành amoni clorid (NH4Cl);

là một chất độc với tế bào niêm mạc; nó ức chế hiện tượng thức báo Các men catalase, lipase, glycoproteinase có thể phân hủy chất nhày, làm

H.pylori xâm nhập sâu hơn và bộc lộ các thụ cảm thể để H.pylori có thể

bám chặt vào tế bào niêm mạc dẫn đến phá hủy tế bào

- H.pylori tiết ra các độc tố tế bào làm hủy tế bào niêm mạc như Cag A, và

Vac A

- Phản ứng miễn dịch của tế bào niêm mạc do thâm nhiễm tế bào viêm sản xuất ra các độc tố trung gian làm tổn thương tế bào niêm mạc dạ dày

3.2 Vai trò của H.pylori trong loét hành tá tràng

Loét hành tá tràng là một bệnh phổ biến, đa nguyên nhân Người ta thấy có 10% dân số châu Âu bị loét hành tá tràng Ở Việt Nam, theo một số thống kê tỉ lệ loét

hành tá tràng từ 10 - 15% Nguyên nhân chủ yếu gây loét hành tá tràng được giả thuyết là do tăng tiết acid, do dùng thuốc chống viêm không steroid và do nhiễm

H.pylori Tỉ lệ loét hành tá tràng có nhiễm H.pylori có thể từ 90 - 100% tùy theo

thống kê

Cơ chế loét hành tá tràng trong nhiễm H.pylori, được giả thuyết như sau:

Do H.pylori kích thích tế bào viền làm tăng tiết acid Niêm mạc hang

vị dạ dày có tế bào G có nhiệm vụ tiết gastrin Đây là một chất kích thích tiết acid Niêm mạc hang vị cũng có tế bào D có vai trò sản xuất somatostatin Chất

này có tác dụng ức chế tiết gastrin và giảm sản xuất acid Khi nhiễm H.pylori,

các độc tố cytokin và chất phản ứng viêm kích thích làm tế bào D giảm tiết somatostatin dẫn đến phản ứng tăng tiết gastrin máu và tăng tiết acid Lượng acid xuống tá tràng tăng gây dị sản niêm mạc dạ dày tại hành tá tràng Vùng dị sản này phát triển dẫn đến tăng tiết chất nhày; tạo điều kiện cho vi khuẩn

H.pylori có thể cư trú và phát triển Vi khuẩn H.pylori cũng kích thích gây phản

ứng viêm tại chỗ như làm thoái hóa, hoại tử rụng, trợt, long Nhiễm H.pylori

mạn tính và tăng tiết acid quá mức làm các vết trợt hợp lại tổn thương sâu thêm, cuối cùng dẫn đến loét hành tá tràng

3.3 Vai trò của H.pylori trong loét dạ dày

Loét dạ dày là một bệnh phổ biến, tuy tỉ lệ mắc bệnh thấp hơn loét hành tá tràng Bệnh hay gặp ở lứa tuổi trên 60, muộn hơn loét hành tá tràng khoảng 10 năm Nam hay gặp hơn nữ Tổn thương loét dạ dày cũng xuyên qua niêm mạc đến lớp

hạ niêm mạc và thường có viêm dạ dày rộng bao quanh ổ loét Loét dạ dày mặc

dù có liên quan với tăng tiết acid và pepsin nhưng tốc độ tiết acid thường giảm

so với người không loét; có khoảng 10 - 20% bệnh nhân loét dạ dày kết hợp với loét hành tá tràng Bệnh loét dạ dày xảy ra được giải thuyết là do sức đề kháng niêm mạc dạ dày giảm hoặc tổn thương trực tiếp niêm mạc dạ dày Nguyên nhân

loét dạ dày thường được cho là do nhiễm H.pylori, dùng thuốc chống viêm

không steroid (NSAID), rượu, acid, kiềm, stress, dịch tá tràng trào ngược

Tỷ lệ nhiễm H.pylori ở bệnh nhân loét dạ dày khoảng 70,7 - 90% tùy từng tác

giả và nơi nghiên cứu, thấp hơn ở loét hành tá tràng Ổ loét có thể ở mọi vùng

của dạ dày như: hang vị, bờ cong nhỏ, bờ cong lớn dạ dày Sau khi dùng thuốc

điều trị diệt H.pylori, những bệnh nhân loét dạ dày có nhiễm H.pylori thường liền sẹo Nhiễm H.pylori hình như làm cho loét dạ dày dễ tái phát hơn, người ta nhận thấy nếu còn H.pylori ở dạ dày, tỉ lệ loét dạ dày tái phát có thể tới 50% trong khi ở nhóm không có H.pylori tỉ lệ loét tái phát chỉ có 8,5%

* Cơ chế loét dạ dày do H.pylori

Có nhiều cơ chế giải thích loét dạ dày do H.pylori, tuy nhiên các tác giả đều thống nhất cho rằng H.pylori làm thay đổi cấu trúc chất nhày nhờ men urease, từ

đó dẫn đến thoái hóa niêm mạc rồi đến loét dạ dày Theo Sidebotham R.H và

Baron J.H thì H.pylori sản xuất men urease làm biến các cấu trúc hình cầu của

chất nhày thành các cấu trúc hình phiến Từ đó làm biến thể chất nhày, phá hỏng hàng rào niêm mạc tạo điều kiện để hình thành ổ loét Còn theo Capper thì

H.pylori làm tăng khuyếch tán ion H+ vào lớp niêm mạc dạ dày kết hợp với giảm sản xuất và bài tiết chất nhày dẫn đến thoái hóa niêm mạc và hình thành

loét Những yếu tố bổ sung, ủng hộ cơ chế loét dạ dày do H.pylori còn là loét dạ

dày thường có viêm dạ dày kết hợp, mà tổn thương viêm dạ dày thì có liên quan

chặt chẽ với nhiễm H.pylori

4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH LÝ DẠ DÀY DO HELYCOBACTER PYLORI HIỆN NAY

Hiện nay người ta chia ra 2 nhóm phương pháp chẩn đoán là nhóm phương pháp không xâm phạm (như:test thở với C phóng xạ,phương pháp huyết thanh,xét nghiệm nước bọt, .) và nhóm phương pháp xâm phạm(như: phương pháp tế bào học,phương pháp mô bệnh học, urease test, phương pháp PCR, phương pháp nuôi cấy, )

4.1 Các phương pháp không xâm phạm:

4.1.1 Test thở CO2 phóng xạ :

Đây là một test không có hại Được coi là phương pháp tốt nhất để theo dõi và diệt trừ H.pylori Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp là khá cao (95-100%) Nguyên tắc của phương pháp là cho bệnh nhân uống một dung dịch

ure phóng xạ Nếu có H Pylori, urese do vi khuẩn sản xuất ra sẽ phân tích ure

phóng xạ thành CO2 để giải phóng ra CO2 phóng xạ trong vòng 1 giờ Các mẫu khí thở ra có thể thấy C13_C14 bằng một máy đếm nhấp nháy

4.1.2 Các test huyết thanh :

Cơ sở của test này là việc phát hiện ra các kháng thể trong huyết thanh của bệnh nhân bị nhiễm H pylori.Kháng thể tăng cao ở người bị nhiễm H pylori và giảm rõ khi H.Pylori được diệt trừ và tăng lại nếu như bị tái nhiễm.Hiện nay đây vẫn được coi là loại xét nghiệm phù hợp nhất cho các nghiên cứu dịch tễ học hiện nay, có các xét nghiệm huyết thanh học thong dụng chẩn đoán H.pylori gồm có: ELISA, Immunoblot, và xét nghiêm huyết thanh với máu toàn phần Trong đó, ELISA cho kết quả tốt nhất Những test này vẫn chưa phổ biến và thường cho kết quả sai ở giai đoạn cửa sổ

4.2 Các phương pháp xâm phạm:

Các phương pháp này thường phải dùng nội soi để sinh thiết hoặc là qua mổ dạ dày

4.2.1 Khảo sát tế bào học:

Đây là phương pháp cho kết quả nhanh chóng, được thực hiện bằng cách chải quét hoặc ấn mẫu sinh thiết lên lam kính rồi cố định bằng cồn hoặc để khô

tự nhiên sau đó được nhuộm:

+ Hoặc bạc Warrthin starry,hoặc nhuộm huỳnh quang acridine orange: vi khuẩn hiện lên rõ nét, rất dễ nhận thấy Song phương pháp này tốn kém và đòi

4.2.3 Cấy tổ chức sinh thiết:

Đây là một phương pháp chuẩn để tham khảo và để khảo sát kháng sinh đồ, tuy có khó khăn nhưng là phương pháp đặc hiệu nhất (95-98%)

-Phương pháp này gây chảy máu dạ dày, và có thể lây nhiễm chéo

-Vi khuẩn chỉ có thể phân lập từ những mảnh sinh thiết dạ dày, song không bao giờ từ dịch vị

-Cấy phải lâu tới 7 ngày trong môi trường ưa khí

-Nếu dùng thuốc kháng H2 trước 1 ngày,gây tê nhiều trước khi nội soi thì cho kết quả không chính xác

4.2.4 Test usease nhanh :

Đây l một loại test nhanh, đơn giản và rẻ tiền, có độ nhạy và độ đặc hiệu tốt

Nó dựa trên nguyên lý H pylori sản xuất ra nhiều urease có hoạt tính rất cao để phân huỷ ure Một trong những test đó là CLO test (Campylobacter Like organism test), đặt một mảnh sinh thiết tổ chức trong một test môi trường có ure, một chỉ thị pH(độ phenol) và một tác nhân kìm vi khuẩn

Nếu có H P, urease của vi khuẩn sẽ thuỷ phân, ure và amoniac được sản xuất ra nó làm cho pH của dung dịch trở thành kiềm và làm đổi màu của dung dịch từ vàng chuyển sang đỏ trong 20 phút đến 30 phút

Thử nghiệm urease tốt nhất được đọc trong 24h đầu,ngoài thời gian đó, độ đặc hiệu sẽ giảm vì xuất hiện hoạt tính urease của tổ chức mô và vi khuẩn bội nhiễm khác Khi số lượng vi khuẩn ít có thể xuất hiện âm tính giả

4.2.5 Kỹ thuật sinh học phân tử

Vào những năm cuối của thế kỷ XX, sinh học đã có sự phát triển nhảy vọt

nhờ sự ra đời của nhiều phương pháp khuếch đại

in vitro có chọn lọc, trong đó thành tựu nổi bật nhất phải kể đến phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Phương pháp này hoàn toàn mới trong việc phân tích ADN do Kary Mullis và cộng sự phát minh

* Cơ sở lý thuyết của PCR

Phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotit Mỗi nucleotit gồm một gốc phosphate, đường deroxyribose và một trong 4 bazơ (adenine, cytozine, guanine, thymine) Hai mạch kết hợp với nhau nhờ liên kết hydro hình thành giữa các bazơ bổ sung nằm trên hai mạch đơn A bổ sung với T, G bổ sung với C Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là 5' phosphate, đầu kia là đầu 3' OH (hướng quy ước là 5'-