giám sát sự lưu hành của virus cúm a h5n1 trên gia cầm sống bán tại các chợ thuộc một số tỉnh phía bắc bằng phương pháp rt pcr

Các phân ñoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có ñộ dài tương ñối ổn ñịnh giữa các chủng virus cúm A, bao gồm: Phân ñoạn 5 gen NP kích thước kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

VÕ MẠNH CƯỜNG

GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN GIA CẦM SỐNG BÁN TẠI CÁC CHỢ THUỘC MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT - PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

VÕ MẠNH CƯỜNG

GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN GIA CẦM SỐNG BÁN TẠI CÁC CHỢ THUỘC MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT - PCR

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất

kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ

rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả luận văn

Võ Mạnh Cường

Tôi xin chân thành cảm ơn sự dạy dỗ, chỉ bảo ân cần của các Thầy, Cô giáo trong khoa Thú y, Ban quản lý ñào tạo và các Thầy, Cô giáo trong trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, trong thời gian tôi học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám ñốc, cùng cán bộ công chức Cơ quan Thú y vùng I, Chi cục Thú y các tỉnh nghiên cứu ñã tạo ñiều kiện và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè ñồng nghiệp và gia ñình ñã ñộng viên giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu ñể hoàn thành luận văn này

Tự ñáy lòng mình, Tôi chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ quý báu ñó

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả luận văn

Võ Mạnh Cường

1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và Việt Nam 3

1.3.2 Nét ñặc trưng cấu trúc hệ gen virus cúm gia cầm 11

1.3.5 Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus 17

1.6.2 Dựa vào triệu chứng, bệnh tích 23

3.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm, tỷ lệ tiêm vaccine phòng bệnh, tình

hình dịch cúm gia cầm H5N1 trên ñịa bàn nghiên cứu 37 3.1.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm trên ñịa bàn nghiên cứu 37 3.1.2 Kết quả tiêm phòng vaccine cúm gia cầm trên ñịa bàn của 5

3.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên ñịa bàn của 5 tỉnh/thành phố từ

3.2 Kết quả giám sát cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.2.1 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.2.2 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.2.3 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.2.4 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.2.5 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.2.6 Tổng hợp kết quả giám sát cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống

bán tại các chợ ñầu mối của các tỉnh/thành phố 68

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BNN & PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

DANH MỤC BẢNG

1.1 Số lượng các ca nhiễm cúm gia cầm type A/H5N1 trên người 5 1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trong 5 năm (2008 - 2012) 10

2.3 Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Real Time RT - PCR 36 3.1 Tổng ñàn gà và vịt trên ñịa bàn của 5 tỉnh/thành phố 39 3.2 Kết quả tiêm phòng vaccine cúm gia cầm trên ñịa bàn của 5

3.5 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.6 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.7 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.8 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.9 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.10 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.11 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.12 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên ñàn gia cầm sống bán tại

3.13 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

3.14 Tổng hợp kết quả giám sát cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống

DANH MỤC HÌNH

1.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào vật chủ 191.4 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loại vật chủ của virus 212.1 Các bước chiết tách RNA bằng Qiagen Rneasy Mini Kit 343.1 Tổng ñàn gà và vịt trên ñịa bàn của 5 tỉnh/thành phố từ năm 2010

3.8 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các

MỞ ðẦU Tính cấp thiết

Chăn nuôi gia cầm giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế Nông nghiệp Việt Nam Những năm gần ñây, chăn nuôi là một trong những ngành có bước phát triển mạnh, ngày càng chiếm vị trí trong sự chuyển dịch cơ cấu kinh tế, xoá ñói giảm nghèo và làm giàu nông thôn Tuy nhiên những năm gần ñây, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gia cầm nói riêng ñã gặp không ít khó khăn Nhiều dịch bệnh xảy ra buộc phải tiêu hủy toàn ñàn gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi và nền kinh tế nước nhà Dịch bệnh không chỉ xảy ra trên vật nuôi mà còn lây sang người và gây tử vong ðặc biệt bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao (Highly Pathogenicity Avian Influenza - HPAI)

Khi mới xuất hiện ở Việt Nam vào năm 2003, bệnh cúm gia cầm ñã thể hiện là một căn bệnh có tính lây lan nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng ðợt dịch bệnh ñầu tiên xảy ra từ ngày 27/12/2003 ñến 30/04/2004, chỉ trong vòng hơn 4 tháng dịch ñã làm cho 2.574 xã/phường thuộc 381 huyện/quận của 57 tỉnh/thành phố mắc bệnh Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và tiêu hủy lên tới 43,9 triệu con (Nguyễn Tuấn Anh, 2006) Trong thời gian gần ñây, mặc dù chúng

ta ñã có nhiều biện pháp phòng chống dịch nhưng bệnh vẫn ñang xảy ra trên phạm vi rộng và ngày càng nguy hiểm hơn, ñặc biệt là số lượng người mắc và tử vong ngày càng tăng Năm 2003 ở Việt Nam chỉ có 3 người nhiễm và cả 3 người ñều tử vong; trên thế giới có 4 người nhiễm và cả 4 người ñều tử vong ðến 04/06/2013, ở Việt Nam có tới 125 người nhiễm trong ñó có 62 người tử vong (tỷ

lệ tử vong chiếm 49,60%), trên thế giới có 630 người nhiễm trong ñó có 375 người tử vong (chiếm tỷ lệ 59,52%) (WHO, 2013)

Với ñặc ñiểm virus gây bệnh có nhiều subtype khác nhau và khả năng tổ hợp biến chủng ñã làm cho căn bệnh ngày càng trở nên nguy hiểm hơn gây nhiều thiệt hại cho người chăn nuôi, ñe dọa tính mạng con người ñồng thời gây không

ít khó khăn cho việc khống chế dịch bệnh ðặc biệt trong những tháng ñầu năm

2013 ở Trung Quốc phát hiện subtype mới H7N9 gây nhiễm cho người, làm 11 người mắc và 5 ca tử vong

Gia cầm sống ñược xác ñịnh là nguồn bệnh lưu trữ Ở Việt Nam, gia cầm bán tại các chợ có nguồn gốc từ nhiều ñịa phương khác nhau và thường không rõ xuất xứ Việc vận chuyển gia cầm ñáp ứng nhu cầu cao của thị trường vào mùa ñông, ñặc biệt dịp tết Nguyên ñán là một nguyên nhân làm tăng nguy cơ dịch bùng phát Vật mang bệnh thầm lặng ñóng vai trò trong những ổ dịch trên già cầm và trên người (Wan và cs, 2011) Chính vì vậy việc giám sát gia cầm sống bán tại các chợ là biện pháp tốt ñể theo dõi, ñánh giá lưu hành virus trong vùng, thậm chí là trên cả nước Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Giám sát sự lưu hành của virus cúm A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các chợ thuộc một số tỉnh phía Bắc bằng phương pháp RT - PCR”

Mục tiêu của ñề tài

- Xác ñịnh ñược sự lưu hành virus cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các chợ của 5 tỉnh/thành phố bao gồm: tỉnh Ninh Bình, Nam ðịnh, thành phố Hà Nội, Phú Thọ và tỉnh ðiện Biên

- Xác ñịnh ñược subtype virus cúm gia cầm ñang lưu hành tại 5 tỉnh/thành phố

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Cung cấp thông tin về sự lưu hành virus cúm A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các chợ và một số yếu tố ảnh hưởng ñến mức ñộ lưu hành của virus

- Nhằm góp phần chủ ñộng trong công tác phòng chống dịch bệnh cúm gia cầm H5N1

- Là cơ sở ñịnh hướng và xây dựng kế hoạch cho chương trình tiêm phòng vaccine cúm gia cầm H5N1 ñạt hiệu quả cao

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm về bệnh cúm gia cầm

Cúm gia cầm (Avian Influenza), là một bệnh truyền nhiễm cấp tính gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều subtype khác nhau (Alexander, 1993) ðây là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên gia cầm, ñộng vật

có vú và có thể lây sang cho người gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và kinh tế mỗi quốc gia nói chung Bệnh cúm gia cầm ñặc trưng với tỷ lệ

ốm và chết cao, chết nhanh với các triệu chứng sốt cao, những biểu hiện bệnh lý

ở các cơ quan

Trước ñây, bệnh ñược gọi là bệnh dịch tả gà, Từ hội nghị quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm Beltsville Mỹ, năm 1981 ñã thay thế bằng bệnh cúm truyền nhiễm ñộc lực cao ở gia cầm HPAI Tên này dùng ñể chỉ các virus cúm type A có ñộc lực mạnh, lây lan nhanh và có tỷ lệ tử vong cao

1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới

Bệnh cúm gia cầm ñược Porroncito mô tả ñầu tiên khi nghiên cứu ổ dịch trên gia cầm ở Italia vào năm 1878 với tên gọi là Dịch tả gà nó ñược nhìn nhận là một bệnh nguy hiểm Năm 1955 virus gây bệnh mới ñược xác ñịnh thuộc type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và các loại chim khác (Lê Văn Năm, 2004)

Vào năm 1971 bệnh ñược mô tả kỹ qua ñợt dịch cúm khá lớn trên gà tây ở

Mỹ Các năm tiếp theo bệnh ñược phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Nam Phi ðặc biệt năm 1983 - 1984 ở Mỹ, dịch cúm gia cầm do chủng H5N2 ở bang Pennsylvania, Virginia, New Jersey làm chết và tiêu hủy hơn 19 triệu con gà Cũng trong thời gian này tại Ireland người ta phải tiêu hủy 270.000 con vịt, tuy không có triệu chứng lâm sàng nhưng ñã phân lập ñược virus H5N8 và bệnh ñược loại trừ một cách nhanh chóng (Phạm Sỹ Lăng, 2004)

ðến năm 2004, bệnh cúm gia cầm xảy với quy mô lớn, tốc ñộ bùng phát nhanh ở các nước châu Á với tổng số 11 quốc gia (Tô Long Thành, 2004) Dịch

xuất hiện ựầu tiên ở Hàn Quốc từ ựầu tháng 12/2003, sau ựó xảy ra nhiều nước khác với diễn biến khá phức tạp đến cuối tháng 2/2004 ựã có 10 nước công bố dịch là Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông, đài Loan và Pakistan Chủng virus ựộc lực cao ựã ựược phân lập và ựịnh type là H5N1; ựây là type chủ yếu, bên cạnh ựó còn có H5N2 ở đài Loan và H7N3, H9N2 ở Pakistan Ngoài ra, tại một số nước khác phân lập ựược một số chủng khác như H6 ở Nam Phi, chủng H10N7 ở Ai Cập, H7N3 ở Canada, H7N2

ở Hoa Kì (Tô Long Thành, 2006) Trong ựợt dịch này khoảng 120 triệu gia cầm gồm gà, gà tây, gà sao, gà lôi, vịt, ngan, ngỗng, chim cút, bồ câu và một số chim hoang dã ựã bị nhiễm bệnh và nằm trong vùng dịch phải tiêu hủy Cùng với diễn biến bệnh trên gia cầm, hàng trăm người cũng bị lây nhiễm, trong ựó có trên 20 người bị chết (WHO, 2013)

Dịch cúm gia cầm ngày càng lan rộng Tại Thái Lan, ựợt dịch thứ nhất kéo dài từ ngày 23/01/2004 ựến giữa tháng 03/2004, tiêu hủy 30 triệu con đợt dịch thứ hai xuất hiện từ ngày 03/07/2004 ựến 14/02/2005 Ở Indonesia dịch xuất hiện ựợt dịch thứ hai vào ngày 23/03/2005 Tháng 02/2004 một số nước ựã tuyên bố khống chế ựược dịch, nhưng một số nước dịch lại tái phát dịch lần 2 như Thái Lan, Campuchia, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam Có thể nói ựây là lần ựầu tiên trong lịch sử bệnh cúm gia cầm xảy ra nhanh trên diện rộng với diễn biến khá phức tạp

Ngoài thiệt hại về kinh tế, tắnh ựến 04/06/2013 trên thế giới có 630 người mắc bệnh do virus cúm type A/H5N1 trong ựó có 375 người ựã tử vong (chiếm

tỷ lệ 59,52%) Tỷ lệ số người chết/số người mắc tại các nước tương ứng như sau: Azerbaijan 5/8, Bangladesh là 1/7, Campuchia 27/32, Trung Quốc 30/45, Djibouti 0/1, Ai Cập 63/173, Indonesia 160/192, Iraq 2/3, Lào 2/2, Myanmar 0/1, Nigeria 1/1, Pakistan 1/3, Thái Lan 17/25, Thổ Nhĩ Kỳ 4/12 và Việt Nam 125 người mắc, làm 62 người chết vì bệnh cúm gia cầm (bảng 1)

đặc biệt trong 06 tháng ựầu năm 2013, dịch ựã xảy ra tại Campuchia làm

11 người mắc và làm 8 người chết; Trung Quốc 2 người mắc và 2 người chết; Ai Cập là 4 người mắc và 3 người chết; Việt Nam dịch cúm type A/H5N1 xảy ra ở ựồng bằng sông Cửu Long làm 2 người mắc và 1 người chết

Bảng 1.1 Số lượng các ca nhiễm cúm gia cầm type A/H5N1 trên người

Năm Quốc gia

ra tại các tỉnh Tiền Giang và Long An Sau thời ñiểm này, bệnh ñã lây lan nhanh

từ tỉnh này sang tỉnh khác thuộc miền Trung, Tây Nguyên và các tỉnh phía Bắc

ðây là ñợt dịch ñầu tiên xảy ra tại Việt Nam nên ngành Thú y gặp nhiều khó khăn trong công tác khống chế bệnh ðồng thời dịch lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ bệnh xuất hiện cùng một lúc, ở nhiều ñịa phương khác nhau ñã gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi Chính vì thế, chỉ trong 2 tháng ñợt dịch ñã làm cho gia cầm của 2.574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 51 tỉnh/thành phố của Việt Nam bị mắc bệnh Tổng số gia cầm bị chết do bệnh và bị tiêu hủy hơn 43,9 triệu con và thủy cầm là 13,5 triệu con Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu hủy (Nguyễn Tuấn Anh, 2006)

ðến ñầu tháng 2/2004, bệnh cúm gia cầm ñã lan ra hầu như khắp cả nước với diễn biến phức tạp Trung bình 1 ngày có khoảng 13 - 230 xã thuộc 15 - 20 huyện phát sinh ổ dịch mới trong cả nước Số gia cầm phải tiêu hủy lên tới 2 - 3 triệu con/ngày, ngày cao ñiểm lên tới 4 triệu con Số lượng các ổ dịch cao nhất vào ngày 6/2/2004 Sau ngày 29/2/2004 không có thông báo về các ổ dịch mới, không còn gia cầm bị tiêu hủy và ngày 30/3/2004, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (BNN & PTNT) ñã công bố hết dịch cúm gia cầm trên toàn quốc Như vậy, trong ñợt dịch ñầu tiên này có 57/61 tỉnh, thành phố trong cả nước có dịch

Có 4 tỉnh không có dịch là Tuyên Quang, Phú Yên, Khánh Hòa và Bình Thuận Hầu hết ở các tỉnh có dịch ñều có trên 10% số xã có dịch Theo thống kê của Trần Hữu Cổn (2004) và Nguyễn Tiến Dũng (2005) cho ñến ñợt dịch cuối, ñồng bằng sông Hồng và ñồng bằng sông Cửu Long là những khu vực tỷ lệ số xã có gia cầm bị mắc bệnh cao nhất

và 20.000 chim cút (Bùi Quang Anh, 2005)

ðợt dịch thứ 3: từ tháng 12/2004 ñến tháng 5/2005

Bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao ñã xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh/thành phố Trong ñó có 15 tỉnh phía Bắc và 21 tỉnh phía Nam Thời ñiểm xuất hiện nhiều ổ dịch nhất là vào tháng 1/2005 với 143 ổ dịch xảy ra trên

31 tỉnh/thành phố Tổng số gia cầm chết và tiêu hủy của ñợt dịch này là 460.320 con gà, 825.000 vịt, ngan và 551.000 chim cút (Nguyễn Tuấn Anh, 2006)

ðợt dịch thứ 4: từ 01/10/2005 ñến 12/2005

Từ ñầu tháng 10/2005 ñến 15/12/2005 dịch ñã tái phát ở 285 xã/phường thuộc 100 huyện/quận của 24 tỉnh/thành phố Số gia cầm ốm, chết và tiêu hủy là 3.735.620 con, trong ñó có 1.245.282 con gà, 2.005.557 con vịt, 484.781 chim cút, bồ câu, chim cảnh (Nguyễn Tuấn Anh, 2006)

ðợt dịch thứ 5: từ ngày 06/12/2006 ñến ngày 04/03/2007

Ở những tháng ñầu của năm 2007, dịch bệnh ñã xảy ra tại 83 phường/xã thuộc 33 quận/huyện của 11 tỉnh/thành phố Bắt ñầu từ tỉnh Cà Mau, sau ñó lan

ra ở các vùng lân cận Tổng số gia cầm bị bệnh là 99.040 con trong ñó có 11.950

gà, 87.090 vịt và ngan Sau thời gian trên dịch bệnh vẫn tiếp tục diễn ra trên nhiều ñịa phương khác Và theo số liệu thống kê trong năm 2007, dịch bệnh ñã xảy ra trên 283 phường/xã thuộc 115 quận/huyện của 33 tỉnh/thành phố Tổng số

gia cầm mắc bệnh là 62.207 con, số gia cầm chết và tiêu hủy là 314.268 con

Như vậy, so với các năm trước thì dịch bệnh ñã có xu hướng giảm xuống

về phạm vi mắc bệnh cũng như số lượng mắc bệnh

Dịch cúm gia cầm năm 2008

ðầu năm 2008 dịch cúm gia cầm mới chỉ xảy ra trên tỉnh Trà Vinh sau ñó dịch ñã xảy ra trên các tỉnh khác như Thái Nguyên, Tuyên Quang, Quảng Bình, Hải Dương, Nam ðịnh, Nghệ An, Hà Tĩnh và nhiều tỉnh khác Trong năm 2008 dịch ñã xảy ra trên 83 xã/phường thuộc 55 huyện/quận của 28 tỉnh/thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh là 13.532 con và tổng số gia cầm tiêu hủy là 90.317

con (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

Dịch cúm gia cầm năm 2009

Tính từ ñầu năm 2009 ñến ngày 22/12/2009 cả nước ñã có 129 ổ dịch tại

71 xã/phường của 35 huyện/quận thuộc 18 tỉnh/thành phố Các tỉnh/thành phố phát dịch cúm gia cầm là: Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, ðiện Biên, ðồng Tháp, Hậu Giang, Khánh Hòa, Nghệ An, Ninh Bình, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Nguyên, Thanh Hóa, thành phố Hà Nội, Vĩnh Long và Cao Bằng Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 112.847 con, trong ñó gà 24.686 con (chiếm 21,87%), vịt 85.038 con (chiếm 75,35%) và ngan 3.123 con

(chiếm 2,76%) (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

Qua những số liệu trên ta thấy năm 2009 dịch bệnh ñã giảm về phạm vi (số xã/phường) tuy nhiên số lượng gia cầm chết và tiêu hủy năm 2009 tương ñương năm 2008 và bằng 1/3 so với năm 2007

Dịch cúm gia cầm năm 2010

Trong năm 2010, cả nước ñã có 62 xã/phường của 36 huyện/quận thuộc

23 tỉnh/thành phố phát dịch cúm gia cầm bao gồm: Bắc Cạn, Bắc Ninh, Bến Tre,

Cà Mau, ðắk Lắk, ðiện Biên, ðồng Tháp, Gia Lai, Hà Giang, Hà Tĩnh, Khánh Hòa, Kon Tum, Lạng Sơn, Nam ðịnh, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Bình, Thái Nguyên, Tuyên Quang Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 75.769 con, trong ñó gà là 21.938 con (chiếm 28,95%), vịt là 52.809 con (chiếm 69,70%) và ngan là 1.022 con (chiếm 1,34%) Dịch xảy ra mạnh nhất là tỉnh Hà Tĩnh, có số gia cầm tiêu hủy cao nhất 14.199 con chiếm 16,24%, tỉnh Cà Mau dịch xảy ra trong 12 xã/phường

của 5 huyện/thị trấn với số gia cầm phải tiêu hủy là 7.499 con chiếm 8,58% (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

gà, 70.020 vịt và 1.165 ngan Tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 151.356 con, trong ñó có 60.787 gà, 89.204 vịt và 1.365 ngan Tỉnh Quảng Ngãi có dịch xảy ra mạnh nhất với 14 xã/phường của 5 huyện/thị trấn với tổng số gia cầm buộc phải tiêu hủy là 48.783 con (chiếm 30,92%), số gia cầm mắc bệnh là 44.432 con (chiếm 38,07%), sau ñó ñến các tỉnh Nghệ An, Quảng Trị (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

Dịch cúm gia cầm năm 2012

Năm 2012, dịch bệnh cúm gia cầm diễn biến ngày thêm phức tạp với những biến ñổi nhiều về cấu trúc gen và ñộc lực Năm 2012 tăng mạnh về số tỉnh/thành phố có dịch xảy ra, với 32 tỉnh/thành phố bao gồm: Bắc Cạn, Bắc Giang, Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, ðắk Lắk, ðiện Biên, ðồng Tháp, Hà Nam,

Hà Tĩnh, Hải Dương, Hòa Bình, Khánh Hòa, Kiên Giang, Kon Tum, Nam ðịnh, Nghệ An, Ninh Bình, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Thái Bình, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Tiền Giang, Tuyên Quang, Vĩnh Long, thành phố Hà Nội và thành phố Hải Phòng Tổng số 296 xã/phường của 112 huyện/thị trấn có dịch Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 616.109 con trong ñó có 117.946 gà (chiếm 19,14%), 479.859 vịt (chiếm 77,89%) và 18.304 ngan (chiếm 2,97%) Tỉnh Quảng Ngãi xảy ra dịch mạnh nhất với 34 xã/phường của 8 huyện/thị trấn với 12.220 con gia cầm mắc bệnh (chiếm 4,21%), số gia cầm buộc phải tiêu hủy là 105.515 con (chiếm 17,50%), sau ñó là các tỉnh Hà Tĩnh, Nghệ An (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

Từ 2008 - 2012, trung bình mỗi năm có khoảng 118 xã/phường tại 58 huyện/thị trấn thuộc 25 tỉnh/thành phố có dịch Số gia cầm mắc bệnh, chết tiêu hủy là hơn 212.000 con, chủ yếu là vịt chiếm 72,30%, gà chiếm 25,03% và ngan

là 2,67% Như vậy, bình quân mỗi năm, mỗi tỉnh có dịch có khoảng 5 xã/phường

có dịch và tiêu hủy khoảng 8.500 con gia cầm bệnh

Có thể nói rằng dịch cúm gia cầm ngày càng diễn ra phức tạp trên phạm vi toàn quốc Do vậy công tác phòng chống dịch ngày càng phải chặt chẽ, chủ ựộng hơn, ý thức người dân cũng phải nâng cao hơn

Tình hình dịch cúm gia cầm diễn biến trong 5 năm (từ 2008 ựến 2012) ựược thể hiện tại bảng 1.2

Bảng 1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trong 5 năm (2008 - 2012) Giai ựoạn Số tỉnh Số huyện Số xã Gà Vịt Ngan Tổng

(Nguồn: Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

1.3 Virus học bệnh cúm gia cầm type A

1.3.1 Cấu trúc của virus cúm gia cầm

Virus cúm gia cầm (Avian Influenza Virus) thuộc họ Orthomyxoviridae

Bộ gen virus cúm gồm một sợi ựơn RNA Hạt virus (virion) có dạng hình khối tròn, hình trứng hoặc hình khối kéo dài có ựường kắnh 80 - 120 nm đôi khi virus

có hình sợi kéo dài ựến vài ộm Phân tử lượng của hạt virus khoảng 4,6 - 6,4 dalton Virus ựược bọc bên ngoài bằng các protein và có màng lipit ở ngoài cùng

Bề mặt ngoài phủ bằng hệ thống protein bao gồm protein có phản ứng ngưng kết hồng cầu Hemagglutinin (H), protein enzym cắt thụ thể - Neurominidase (N) ñây

là những kháng nguyên có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ và có tính

ña dạng cao (Alexander,1996; Capua và Marrangon, 2000) (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc của virus cúm gia cầm

Capsid bên ngoài nhân của virus ñược cấu tạo từ protein, cấu trúc ñối xứng xoắn, ñộ dài 130 - 150 nm, ñường kính 9 - 15 nm tạo thành giới hạn vòm của mỗi phân ñoạn và liên kết với nhau một cách riêng biệt

1.3.2 Nét ñặc trưng cấu trúc hệ gen virus cúm gia cầm

Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A

Hệ gen của virus cúm chứa duy nhất axit ribonucleic (RNA) một sợi Sợi RNA có ñộ dài 10.000 - 15.000 nucleotide tùy loại virus, chúng không ñược nối với nhau tạo thành một sợi RNA hoàn chỉnh mà ñược chia thành 7 - 8 phân ñoạn, mỗi một phân ñoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho các protein khác nhau (Alexander, 1993) (hình 1.2)

Các phân ñoạn 1, 2 và 3 là những phân ñoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có ñộ dài ổn ñịnh và

có tính bảo tồn cao, bao gồm:

Phân ñoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp protein

enzyme PB2, là tiểu ñơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi ñầu phiên mã RNA virus Protein PB2 có khối lượng phân tử khoảng 84.000dalton (Murphy và Webster, 1996) Gần ñây, ñã phát hiện thêm một protein (PB1 - F2) ñược mã hóa bởi một khung ñọc mở khác của PB1,

có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình)

(Uiprasertkul và cs, 2007)

Phân ñoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp

enzyme PB1 - tiểu ñơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster, 1996)

Phân ñoạn 3 (gen PA) có kích thước 2.233 bp, là phân ñoạn gen bảo tồn

cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử khoảng 83.000dalton PA là một tiểu ñơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên

mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus (Luong và Palese, 1992)

Các phân ñoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein HA và NA , có tính kháng nguyên ñặc trưng theo từng chủng virus, bao gồm:

Phân ñoạn 4 (gen HA) có ñộ dài thay ñổi tuỳ theo từng chủng virus cúm

A (ở A/H1N1 là 1.778 bp, ở H9N1 là 1.714 bp, ở H5N1 là khoảng 1.704 - 1.707 bp) ðây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 HA1 nối với HA2 bằng một số amino acid mang tính kiềm ñược mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, ñó là

ñiểm cắt của enzym protease, và ñây là vùng quyết ñịnh ñộc lực của virus (Bosch

và cs, 1979; Gambotto và cs, 2008)

Phân ñoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài

thay ñổi theo từng chủng virus cúm A (chủng A/H6N2 là 1.413 bp, chủng A/H5N1 thay ñổi khoảng từ 1.350 - 1.410 bp) (Nguyễn Thị Bích Nga, 2006) ðây

là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.000dalton Các nghiên cứu gen NA của virus cúm cho thấy phần ñầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến ñổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay ñổi này liên quan ñến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều ñối tượng vật chủ khác nhau (Castrucci và Kawaoka, 1993; Baigent và McCauley, 2001; Wagner

và cs, 2002) ðặc trưng biến ñổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng ñột biến trượt - xóa một ñoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau ñó là 60 nucleotide, làm cho

ñộ dài vốn có trước ñây của NA (N1) là 1.410 bp còn 1.350 bp (Castrucci và

Kawaoka, 1993; Lê Thanh Hòa, 2006; Keawcharoen và cs, 2005)

Các phân ñoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có ñộ dài tương ñối ổn ñịnh giữa các chủng virus cúm A, bao gồm:

Phân ñoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1.556 bp, mã hóa tổng hợp

nucleoprotein - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ NP là một protein ñược glycosyl hóa, có ñặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân ñoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56.103 dalton (trên thực tế là 50 - 60x103 dalton) (Luong và Palese, 1992; Murphy và Webster, 1996; Salzberg, 2007)

Phân ñoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1.027 bp, mã hóa cho protein

ñệm (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 ñược tạo ra bởi những khung ñọc mở khác nhau của cùng một phân ñoạn RNA), cùng với

HA và NA có khoảng 3.000 phân tử M trên bề mặt capsid của virus cúm A, có

mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin (Scholtissek và cs, 2002)

Protein M1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao

bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus

(Luong và Palese, 1992; Murphy và Webster, 1996; Basler, 2007) Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11.000dalton, là protein chuyển màng - kênh ion (ion channel) cần thiết cho khả năng lây nhiễm

của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Scholtissek và cs, 2002)

Phân ñoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non

structural protein), có ñộ dài ổn ñịnh nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein) Vai trò bảo vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng

virus sinh ra sẽ bị khiếm khuyết (Murphy và Webster, 1996; Sekellick và cs,

2000) NS1 có khối lượng phân tử là 25x103 dalton), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác ñộng lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai ñoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử khoảng 14.000dalton, ñóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm ñể lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus

mới (Sekellick và cs, 2000; Zhu và cs, 2008)

Trong các ñoạn trên, ñoạn RNA có trọng lượng nhỏ nhất mang mật mã cho 2 loại protein không cấu trúc là NS1 và NS2, chúng dễ dàng tách ñược ở các

tế bào bị nhiễm Tất cả 8 ñoạn của sợi RNA có thể tách và phân biệt dễ dàng qua phương pháp ñiện di

1.3.3 Kháng nguyên của virus cúm gia cầm

Dựa trên yếu tố ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination - HA) và trung hòa (Neuraminidase - NA) là những kháng nguyên có vai trò trong miễn dịch bảo

hộ và có tính ña dạng cao mà virus cúm type A ñược phân type ðến nay, có tất

cả 16 loại gen H (H1 ñến H16) và 9 loại gen N (N1 ñến N9), mỗi một hợp gen H

và N tạo nên 1 biến chủng gây bệnh (Murphy và Webster 1996)

Haemagglutination (HA) một ñặc tính kháng nguyên quan trọng của virus

cúm là khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loại động vật mà thực chất là

sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt virus với thụ thể cĩ trên

bề mặt hồng cầu làm cho hồng cầu ngưng kết lại với nhau tạo mạng ngưng kết qua cầu nối virus Từ đặc tính kháng nguyên này cĩ thể sử dụng các phản ứng ngưng kết hồng cầu HA và ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI trong việc chẩn đốn bệnh HA là một loại kháng nguyên vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định tính độc lực của virus cúm type A, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus vào cơ thể nhiễm, là cơ sở để điều chế các vaccine phịng bệnh cúm hiện nay (Bosch và cs, 1982)

Neuraminidase (NA) là một enzyme cĩ bản chất là glycoprotein mang

tính kháng nguyên trên bề mặt virus cúm Cĩ 9 gen N trong đĩ N1 và N2 cĩ liên quan đến các vụ dịch ở người Neuraminidase cĩ tác dụng hỗ trợ giải phĩng virus

ra khỏi tế bào vật chủ Neuraminidase cắt liên kết giữa gốc sialic acid tận cùng khỏi phân tử carbonhydrate của tế bào và virus, từ đĩ ngăn cản quá trình kết hợp của virus và cho phép giải phĩng các hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm

Nguy hiểm nhất là kháng nguyên virus cúm type A cĩ khả năng tổ hợp biến chủng dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên Chúng cĩ hai khả

năng đột biến (Ito và Kawaoka, 1998)

ðột biến điểm (cịn gọi là đột biến ngẫu nhiên hoặc hiện tượng trơi dạt -

antigenic drift) ðây là kiểu đột biến xảy ra thường xuyên, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N tạo ra những thay đổi nhỏ về trình tự nucleotide của gen mã hĩa cho kháng nguyên H và kháng nguyên N Kết quả là tạo ra các phân type cúm hồn tồn mới cĩ tính thích ứng lồi vật chủ khác nhau và mức độ độc lực gây bệnh khác nhau Chu kỳ của bệnh cúm hàng năm phụ thuộc vào sự kết hợp của tốc độ biến đổi, thời gian ủ bệnh và sự biến đổi theo mùa của khí hậu

ðột biến tái tổ hợp di truyền (cịn gọi là đột biến cĩ tính chuyển đổi -

antigenic shift) Hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng đột biến điểm Một số chủng virus chỉ gây bệnh cho gia cầm mà khơng gây bệnh cho người (Ian, 1982; Kawaoka, 1991) Một số chủng khác lại chỉ gây bệnh cho người mà khơng gây bệnh cho gia cầm Trong một số trường hợp, cả virus cúm

người và virus cúm gia cầm có thể cùng nhiễm vào ñộng vật thứ 3 (có thể là lợn) Hiện tượng tái tổ hợp gen chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại virus cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus ðột biến này là

sự tổ hợp di truyền xảy ra ñịnh kỳ trong ñó có sự sắp xếp lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau ðiều ñó ñã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus ñời con so với virus bố mẹ Khi nhiều virus khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, các thế hệ virus ñược sinh ra từ sự tái tổ hợp của các gen bố mẹ xuất phát từ nhiều virus khác nhau Do hạt virus cúm A

có cấu trúc là 8 ñoạn gen nên về lý thuyết từ 2 virus có thể xuất hiện 256 kiểu tổ hợp của virus thế hệ sau (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004)

Khi phân tích 156 chủng virus cúm A lưu hành trong thời kỳ 1999 - 2004 tại New York, các nhà khoa học ñã phát hiện một số chủng thay ñổi ít nhất 4 lần trong một thời gian ngắn ðiều ñó cho thấy các chủng virus cúm có thể biến ñổi lớn trong mỗi mùa, gây khó khăn lớn cho công tác phòng chống Khi nghiên cứu

di truyền học của virus H5N1 các nhà khoa học của Việt Nam cũng nhận thấy chúng có nhiều thay ñổi Trong các ñàn vịt nuôi của Việt Nam không chỉ mang virus cúm gia cầm H5N1 mà còn có nhiều loại virus cúm gia cầm khác như H3, H4, H7, H8, H9 và H11 (Nguyễn Tiến Dũng, 2004)

Khi xâm nhập nhiễm vào cơ thể ñộng vật, virus cúm A kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể ñặc hiệu Trong ñó, quan trọng hơn cả là kháng thể kháng

HA, chỉ có kháng thể này mới có vai trò trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra (Klenk, 1983)

Kháng thể ñặc hiệu của kháng nguyên HA có khả năng trung hòa các loại virus tương ứng, chúng là kháng thể trung hòa có khả năng triệt tiêu virus gây bệnh Nó có thể phong tỏa sự ngưng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên

HA Do vậy thụ thể của hồng cầu không bám vào ñược ñể liên kết tạo thành mạng ngưng kết Người ta gọi phản ứng ñặc hiệu KN - KT có hồng cầu tham gia

là phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu HI (Hemagglutination Inhibition test)

1.3.4 ðộc lực của virus cúm gia cầm

ðể ñánh giá ñộc lực của virus cúm gia cầm người ta sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng ñã gây nhiễm virus với tỉ lệ pha loãng 1/10, sau ñó ñánh giá mức ñộ nhiễm của gà

ñể cho ñiểm (chỉ số IVPI: Intravenous Pathogenicity Index) ðiểm tối ña là 3 với virus có ñộ ñộc lực cao nhất, theo quy ñịnh của Ủy ban châu Âu Bất cứ virus cúm nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên thuộc nhóm HPAI - ñộc lực cao (Nguyễn

Tiến Dũng, 2004; OIE, 1992)

Trong thực tế, virus cúm gây bệnh ở chim ñược phân chia theo tính gây bệnh với 2 mức ñộ ñộc lực khác nhau: loại ñộc lực cao HPAI, và loại ñộc lực thấp (LPAI - Low Pathogenic Avian Influenza), cả hai loại ñều cùng tồn tại trong

tự nhiên (Klenk và cs, 1983; Alexander, 2007)

HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng Trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng ñồng HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsine (Webster, 1998; Alexander, 2007)

LPAI: là khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng ñiển hình và không làm chết vật chủ ðây là những virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao ñổi gen với các chủng virus có ñộc lực cao ñồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành virus ñộc lực cao nguy hiểm (Webster, 1998; Alexander, 2007)

Cho ñến nay, hầu như các vụ dịch lớn ñều do virus HPAI gây ra thường là virus có kháng nguyên H5, H7, H9 Riêng H5 và H7 thường có nguồn gốc từ virus ñộc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút ñộc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn (Alexander, 1996)

1.3.5 Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus

Virus cúm A/H5N1 có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô ñường

hô hấp, hơn nữa ñây là loại virus sống kí sinh nội bào bắt buộc nên quá trình

xâm nhiễm và nhân lên chủ yếu xảy ra ở ñường hô hấp, ñường tiêu hóa của cơ

thể nhiễm (Murphy và Webster, 1996; Nicholson và cs, 2003), có những nét ñặc

trưng như sau:

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A ñược mở ñầu bằng sự kết hợp của

HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, cuối cùng giải phóng

hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm

Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, ñây là ñặc ñiểm khác biệt so với nhiều virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ) Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các ñại phân tử, rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ (Webster, 1998; Uiprasertkul và cs, 2007)

Sau khi ñược giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus

sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA - dependent RNA transcription) Phức hợp protein -RNA của virus ñược vận chuyển vào trong nhân tế bào (Basler, 2007)

Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương

từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA - polymerase Các sợi này không ñược

adenine hóa (gắn thêm các adenine - gắn mũ) ở ñầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với

nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và ñược vận chuyển ra bào tương tế bào ðồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân ñoạn gen của virus, và ñược enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide adenin ở ñầu 5’- sau ñó ñược vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt ñể tổng hợp nên các protein của virus

Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp ñược vận chuyển gắn

lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy

chồi” của virus NP sau khi tổng hợp ñược vận chuyển trở lại nhân tế bào ñể kết

hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng các RNP của virus ñược hợp nhất

với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi

liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này

và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác (Murphy và Webster, 1996; Nayak và cs, 2004)

Hình 1.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào vật chủ

1.3.6 Sức ñề kháng của virus

Virus cúm type A tương ñối nhạy cảm với các hóa chất và các tác nhân vật lý Các hạt virus tồn tại thích hợp pH trong khoảng 6,5 - 7,9, ở pH quá kiềm hay quá acid thì khả năng lây nhiễm của virus giảm Lớp vỏ bên ngoài có bản chất là lipid nên dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, các chất tẩy rửa và các chất sát trùng: fomaldehyde, phenol, β - propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine Người ta thường dùng các hóa chất này như các chất sát trùng hữu hiệu ñể tẩy uế chuồng trại, dụng cụ và các thiết bị chăn nuôi (Capua, 2000)

Virus bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại ñược 15 ngày ánh sáng thường Tia tử ngoại bất hoạt ñược virus mà không phá hủy ñược kháng nguyên virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ bị tiêu diệt hoàn toàn ở 1000C và 600C

trong 30 phút Trong phân gia cầm ở nhiệt ñộ thấp, virus tồn tại ít nhất 3 tháng; trong phủ tạng có thể tồn tại 24 - 39 ngày, nếu bảo quản ở nhiệt ñộ -700C thì có thể tồn tại hàng năm Trong thức ăn, nước uống bị ô nhiễm virus có khả năng tồn tại hàng tuần ðây chính là nguồn mang mầm bệnh nguy hiểm và tiềm tàng ñể làm lây lan dịch bệnh (Lê Văn Năm, 2004; Murphy và Webster, 1996)

1.4 Truyền nhiễm học

1.4.1 ðộng vật cảm nhiễm

Tất cả các loại gia cầm và chim hoang dã (ñặc biệt là thủy cầm di trú) ñều mẫn cảm với virus cúm type A Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút) Phần lớn các loại gia cầm non ñều mẫn cảm Ngoài ra, virus cúm type A có thể gây bệnh cho các loài ñộng vật có vú như lợn, ngựa, thú hoang dã và người

Mỗi một loại ký chủ có vai trò khác nhau trong việc lưu trữ, phân tán và lây bệnh Có 3 loại ký chủ:

Ký chủ lưu trữ hay mang mầm bệnh: ñây là ký chủ thường nhiễm virus nhưng không phát bệnh hoặc phát bệnh rất nhẹ hoặc con non mắc bệnh, còn con trưởng thành có thể tạo miễn dịch Trong trường hợp này, các loại thủy cầm ñược coi là ký chủ mắc bệnh, tuy nhiên còn phụ thuộc vào ñộc lực của virus

Ký chủ hứng chịu: ñây là loại ký chủ mẫn cảm với virus cúm và ñào thải virus ra môi trường ngoài Loại ký chủ này khi bị nhiễm thường phát bệnh rất nặng và các loại gà (gà, gà tây, gà lôi, ñà ñiểu )

Ký chủ lệch: là loại ñộng vật hiếm khi bị nhiễm virus Khi bị nhiễm bệnh nặng thì không hoặc bài thải rất ít virus ra môi trường bên ngoài

1.4.2 Con ñường truyền lây

Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus ñược nhân lên trong ñường hô hấp

và ñường tiêu hóa Sự truyền lây bệnh ñược thực hiện theo hai phương thức trực tiếp và gián tiếp:

Lây trực tiếp do vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung ñược bài tiết từ ñường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn, nước uống bị nhiễm Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần

hoặc những công cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển ðây là phương thức lây truyền chủ yếu (hình 1.4)

Hình 1.4 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loại vật chủ của virus

Như vậy virus cúm dễ lây truyền tới những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi ðối với các virus cúm ñộc lực cao thì sự lây truyền chủ yếu qua phân, ñường miệng (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004)

1.4.3 Mùa phát bệnh

Bệnh cúm gia cầm xảy ra quanh năm, nhưng thường tập trung vào vụ ñông xuân từ tháng 10 năm trước ñến tháng 2 năm sau Khi có những biến ñổi bất lợi về ñiều kiện thời tiết như nhiệt ñộ lạnh, ñộ ẩm cao, thời tiết biến ñổi ñột ngột, làm giảm sức ñề kháng tự nhiên của con vật Mặt khác thời ñiểm này có mật ñộ chăn nuôi cao nhất trong năm, các hoạt ñộng buôn bán vận chuyển, giết

mổ gia cầm diễn ra cao nhất trong năm cũng là ñiều kiện thuận lợi ñể dịch bệnh phát sinh và lây lan

1.5 Triệu chứng và bệnh tích

1.5.1 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh từ vài giờ ñến 3 ngày tùy thuộc vào số lượng, ñộc lực của virus, ñường nhiễm bệnh, loài cảm nhiễm virus gây bệnh Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thể dài hơn ñến 7 ngày

và lâu nhất là 14 ngày

Biểu hiện triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus,

số lượng virus; loài, tuổi, giới tính của loài nhiễm, ñiều kiện môi trường (nhiệt

ñộ, ánh sáng, không khí ) chế ñộ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ

trước khi nhiễm bệnh, sự bội nhiễm của VSV khác như: E.Coli, virus Newcastle,

virus Gumboro Nhìn chung, khi mắc bệnh ñàn gia cầm sẽ có triệu chứng:

Toàn ñàn suy sụp, ũ rủ, lông xù, xơ xác Nếu nhiễm virus ñộc lực cao thì

gà chết ñột ngột, không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ tử vong cao có khi ñạt ñến 100% trong vài ngày;

Có các biểu hiện về ñường hô hấp thường xuất hiện ñầu tiên và khá ñiển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vảy mỏ, chảy nhiều nước mũi, nước mắt;

Mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng và có chiều hướng lan xuống cổ

1.5.2 Bệnh tích

Bệnh tích rất ña dạng, với các ñặc trưng chủ yếu sau:

Mào, yếm sưng to, tím sẫm, phù mí mắt;

Phù keo nhầy và xuất huyết cơ ñùi (phần giáp ñầu gối);

Da chân xung huyết, ñỏ sẫm;

Dạ dày cơ xuất huyết, ñôi khi xuất huyết dạ dày tuyến;

Niêm mạc khí quản, đường tiêu hĩa viêm cata và viêm tơ huyết;

Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy Dịch nhầy cĩ thể đơng đặc;

Ruột viêm cata và xuất huyết Hạch ruột sưng;

Các cơ quan nội tạng như màng bao tim, màng gan, màng ruột viêm tơ huyết; Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử màu vàng, màu xám;

Mỡ vành tim xuất huyết, gà trống xuất huyết bên trong dịch hồn;

Gà mái đẻ viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non;

Tuyến tụy xuất huyết và hoại tử Tuyến tụy chuyển sang màu vàng cĩ vết sẫm

1.6 Các phương pháp chẩn đốn

Việc chẩn đốn cúm gia cầm do nhiễm virus cúm type A chủ yếu phải phân lập và định danh virus kết hợp với chẩn đốn dựa vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, dịch tễ học và một số phản ứng huyết thanh học

1.6.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ

Bệnh cúm gia cầm cĩ tính lây truyền nhanh và mạnh

Lồi mắc bệnh thường là gia cầm và chim Chim hoang dã là nguồn truyền lây bệnh

Một số động vật cĩ vú cũng cĩ thể mắc bệnh: người, lợn, ngựa

1.6.2 Dựa vào triệu chứng, bệnh tích

Dựa vào triệu chứng

Gia cầm bị bệnh thường bị xù lơng, ũ rũ, bỏ ăn, giảm đẻ;

ðầu, mặt sưng, phù quanh mắt Mào yếm sưng, xuất huyết;

Mắt bị viêm kết mạc và cĩ thể bị xuất huyết;

Chân giữa vùng bàn và khuỷu bị xuất huyết;

Cĩ các triệu chứng ở đường hơ hấp;

Nếu virus cĩ độc lực cao thì gà cĩ thể chết nhanh, gà thường chết trong

vịng 24 giờ - 48 giờ sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên

Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhầy;

ðường tiêu hĩa xuất huyết;

Gà đẻ buồng trứng xuất huyết hoặc bị viêm, cĩ nhiều trứng non vỡ

1.6.3 Phân lập virus

ðây là phương pháp chẩn đốn cơ bản cĩ ý nghĩa quyết định

ðể phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, não, lách Sau khi xử lí bệnh phẩm ta tiêm vào phơi gà 9 - 11 ngày tuổi, ấp

37oC trong 7 ngày thì thu hoạch trứng (virus cũng cĩ thể phân lập trên mơi trường tế bào)

Sau khi phân lập được virus từ mơi trường tế bào hoặc trên phơi trứng thì

cĩ thể giám định virus bằng các phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI test)

để giám định subtype H và N

Gần đây phương pháp Real - Time PCR (RT - PCR) trực tiếp sử dụng nguồn gen của virus cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm đã được đưa vào ứng dụng cho phép chẩn đốn nhanh, chính xác, với độ tin cậy cao và phân biệt được sự hiện diện của các chủng virus cúm A gây bệnh chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm xét nghiệm Ngồi ra cịn cĩ các phương pháp chẩn đốn khác như: kỹ thuật ELISA, kỹ thuật khuếch tán trên thạch

Phịng bệnh đối với vùng chưa cĩ dịch xảy ra hoặc nguy cơ cĩ dịch

Trong thời gian xảy ra dịch ở các địa phương khác thì các trại chăn nuơi gia cầm giống áp dụng các biện pháp an tồn sinh học nhằm ngăn cản mầm bệnh

đưa vào Dụng cụ chăn nuơi, xe chuyên chở, dụng cụ bảo hộ lao động và con người ra vào trại phải được vệ sinh, khử trùng Thức ăn, nước uống, chất độn chuồng phải đảm bảo khơng chứa mầm bệnh

Trên các trục đường giao thơng chính thành lập các chốt kiểm dịch tạm thời nhằm ngăn chặn việc dịch chuyển gia cầm, sản phẩm gia cầm từ các địa phương cĩ dịch vào Các phương tiện giao thơng ra vào phải được tiêu độc

Tăng cường kiểm tra, giám sát phát hiện bệnh và tiêu hủy tất cả gia cầm, sản phẩm gia cầm cĩ nguồn gốc từ các địa phương đang cĩ dịch ðồng thời tiến hành tổ chức dập dịch nhanh chĩng khi cịn ở diện hẹp

Khống chế dịch ở các địa phương đang cĩ dịch xảy ra

Là bệnh cĩ tính lây lan nhanh, do vậy chúng ta cần tiến hành chẩn đốn phát hiện bệnh một cách nhanh chĩng và chính xác dựa trên triệu chứng, bệnh tích điển hình ðồng thời tiến hành lấy mẫu xét nghiệm

Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm, do vậy sự bùng phát của bệnh vẫn tuân theo những quy luật chung của quá trình sinh dịch Do vậy khống chế bệnh chính là tác động vào các khâu của quá trình sinh dịch nhằm phá vỡ vịng truyền lây tác nhân gây bệnh, đĩ là 3 yếu tố: nguồn bệnh, động vật cảm thụ, yếu

tố truyền lây bệnh truyền nhiễm nĩi chung Theo khuyến cáo của tổ chức OIE thì

có xu hướng biến ñổi nội gen nhằm tăng tính gây bệnh và thay ñổi thành phần nội gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và các chủng vaccine ñược tạo ra Do vậy, vấn ñề này phải ñược hết sức chú ý trong nghiên cứu và sản xuất vaccine

ðối với bệnh truyền nhiễm, vaccine ñược coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch ðối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm ñược bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người Kháng thể ñặc hiệu có thể ñược cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và ñó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus ñương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm ñúng ñối tượng khi chúng xâm nhập vào Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới

Vaccine truyền thống bao gồm vaccine vô hoạt ñồng chủng và dị chủng:

Vaccine vô hoạt ñồng chủng (Homologous vaccine) ñó là các loại vaccine ñược

sản xuất chứa những chủng virus cúm gia cầm giống như chủng gây bệnh trên thực ñịa (Kishida, 2005) Nhược ñiểm của loại vaccine này là không thể phân biệt gia cầm ñược tiêm chủng với gia cầm tiếp xúc với mầm bệnh trên thực ñịa,

trừ khi có những con chưa ñược tiêm chủng ñược nhốt trong chuồng Vaccine vô

hoạt dị chủng (Heterologous vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực ñịa, nhưng có kháng nguyên NA khác chủng virus thực ñịa (OIE, 1992) Ví dụ: vaccine vô hoạt H5N2 của Intervet (Hà Lan) và của Weiker (Trung Quốc)

Vaccine thế hệ mới: là loại vaccine ñược sản xuất dựa trên sử dụng kỹ

thuật gen loại bỏ các vùng “gen ñộc” ñang ñược nghiên cứu và sử dụng, bao

gồm: Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng virus ñậu gia cầm làm vector tái tổ hợp với gen H5 và N1 phòng virus type H5N1 và H7N1 Vaccine dưới ñơn vị chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền sử dụng adenovirus hoặc

Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, được tổ hợp kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus tạo nên virus tái tổ hợp Ví dụ: vaccine sống virus tái tổ hợp TrovacAIV - H5 của Merial lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Iraland/83 (H5N2), sử dụng cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi và đã được sử dụng tại Việt Nam

Vaccine DNA: là sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA,

NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đĩ là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo

chứa đầy đủ hệ gen, trong đĩ các gen kháng nguyên H5 cĩ vùng "độc" đã

được biến đổi bằng kỹ thuật gen

Theo quan điểm của OIE và FAO thì nên cĩ chiến lược sử dụng vaccine phịng, chống dịch cúm gia cầm, bao gồm 5 cơng đoạn là: An tồn sinh học, nâng cao nhận thức người dân, giám sát và chẩn đốn, loại bỏ gia cầm bệnh và sử dụng vaccine (Lê Văn Năm, 2007)

1.8 Cơng tác chống dịch bệnh

Trong cơng tác thú y, giám sát ổ dịch tập trung vào các biện pháp sau: Tập trung thực hiện quy hoạch về chăn nuơi, quản lý con giống, quản lý đàn thuỷ cầm, lập số đăng ký theo dõi; thực hiện An tồn sinh học trong chăn nuơi

Thực hiện cơng tác giám sát từ người chăn nuơi - trưởng thơn (xĩm) - Thú

y xã, phường và Ban chỉ đạo cấp xã - Trạm thú y và Ban chỉ đạo cấp huyện - Chi cục thú y và Ban chỉ đạo cấp tỉnh

Quản lý đàn gia cầm: Trong từng thời điểm, BNN & PTNT cĩ văn bản quy định cụ thể trong việc quản lý đàn gia cầm:

ðối với đàn gà bị tiêu huỷ do mắc bệnh cúm gia cầm, chỉ được nuơi trở lại sau 60 ngày tính từ khi tiêu huỷ con gà cuối cùng;

Tạm thời dừng ấp trứng sản xuất con giống, nuơi mới vịt, ngan, ngỗng và chim cút theo hướng dẫn số 321/BNN-CN ngày 4/02/2005 của BNN & PTNT

Phân cơng quản lý: quản lý đàn gia cầm giống do cục Chăn nuơi; cục Thú

y thẩm định các cơ sở chăn nuơi gia cầm thuộc Bộ quản lý, cơ sở chăn nuơi cĩ vốn đầu tư nước ngồi

Thẩm ñịnh ñiều kiện vệ sinh thú y tái lập ñàn: chi cục Thú y thẩm ñịnh cơ

sở chăn nuôi giống thuộc cấp tỉnh quản lý, cơ sở chăn nuôi tư nhân có trên 3.000 con Trạm thú y cấp huyện thẩm ñịnh các cơ sở chăn nuôi có số lượng từ 500 ñến 3.000 con

Theo dõi dịch bệnh: Thú y các cấp chịu trách nhiệm theo dõi dịch bệnh trên ñịa bàn phụ trách; trưởng thôn, bản chịu trách nhiệm theo dõi tình hình chăn nuôi gia cầm và dịch bệnh của ñàn gia cầm nuôi trên ñịa bàn Trách nhiệm của người chăn nuôi khi tái lập ñàn, nuôi mới, nhập giống gia cầm phải ñăng ký với cấp quản lý chăn nuôi gia cầm (BNN & PTNT, 2005)

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- ðiều tra tình hình chăn nuơi gia cầm, tỷ lệ tiêm vaccine phịng bệnh cúm gia cầm, tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trên địa bàn nghiên cứu

- Giám sát sự lưu hành bệnh cúm type A/H5N1 trên gia cầm sống bán tại các chợ đầu mối của 5 tỉnh/thành phố nghiên cứu

2.2 ðịa điểm và thời gian nghiên cứu

- Mẫu được lấy tại các chợ đầu mối của 5 tỉnh/thành phố gồm: Ninh Bình, Nam ðịnh, Phú Thọ, ðiện Biên và thành phố Hà Nội

- Thí nghiệm được thực hiện tại: Phịng thí nghiệm - Trạm chẩn đốn xét nghiệm bệnh động vật - Cơ quan Thú y vùng I (Cục Thú y)

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 09/2011 đến tháng 06/2013

2.3 Nguyên liệu

2.3.1 ðối tượng nghiên cứu

- Vịt, ngan sống bán tại các chợ đầu mối trên địa bàn các tỉnh/thành phố trong phạm vi nghiên cứu

- Các mẫu swab ngốy ổ nhớp và khí quản từ vịt, ngan sống được lấy mẫu xét nghiệm

2.3.2 Các loại mơi trường, hĩa chất sử dụng

- Mơi trường bảo quản mẫu swab

- Bộ kít chiết tách RNeasy Mini kit - Cat Qiagen No 74104 - 70106 do hãng Qiagen của ðức sản xuất

- Các primers, probe do Trung tâm chẩn đốn Thú y trung ương cung cấp

- ðối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) với virus H5N1

2.3.3 Thiết bị, dụng cụ trong phịng thí nghiệm

- Buồng cấy an tồn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh âm sâu 800C,

tủ lạnh âm 200C, hệ thống bơm hút chân khơng dùng trong chiết tách RNA, máy

RT - PCR Bio - Rad IQ5 cĩ kết nối với hệ thống máy tính,…

- Bộ micropipet các cỡ, ống pacol, ống eppendorf, đầu typ các cỡ,…