nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm a h5n1 clade 7 phân lập ở việt nam

Những ựóng góp mới của ựề tài - đã xác ựịnh ựược các ựặc tắnh sinh học của virus cúm gia cầm ựộc lực cao H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam, như ựặc tắnh kháng nguyên, ựộc lực, khả năng n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN TÙNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT

CÚM A/H5N1 CLADE 7 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NGÀNH: KÝ SINH TRÙNG VÀ VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

HÀ NỘI, NĂM 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN TÙNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT

CÚM A/H5N1 CLADE 7 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: KÝ SINH TRÙNG VÀ VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan: công trình khoa học này là của tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan: mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện ñề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án ñều ñược cảm ơn Các thông tin trích dẫn trong luận án ñều chính xác và ñược nêu rõ nguồn gốc

Hà nội, tháng 12 năm 2013

Tác giả

ii Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện ựề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận ựược sự giúp ựỡ của nhiều tổ chức và cá nhân Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú y, Trường đại học Nông nghiệp

Hà Nội ựã tạo ựiều kiện cho tôi ựược theo học chương trình ựào tạo nghiên cứu sinh tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh ựạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn ựoán Thú y ựã tạo ựiều kiện thuận lợi và giúp ựỡ cho tôi hoàn thành ựề tài nghiên cứu của mình

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật Ờ Truyền nhiễm, khoa Thú y, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, ựã giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ long biết ơn sâu sắc ựến Thầy giáo, PGS TS Nguyễn Bá Hiên, Khoa Thú y, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS Nguyễn Văn Cảm Ờ Hội Thú y , là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện ựề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn ựến những ựồng nghiệp công tác tại các tổ chức và

cơ quan quốc tế như FAO, CDC, USDA ựã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như các nguyên liệu cần thiết ựể tôi thực hiện nghiên cứu

Tôi luôn biết ơn gia ựình, bạn bè và ựồng nghiệp ựã luôn bên cạnh, ựộng viên và giúp ựỡ tôi hoàn thành nghiên cứu và luận án

Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Tác giả

Nguyễn Tùng

1.2.1 ðặc ñiểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm 10

1.2.3 ðặc ñiểm tiến hóa và hình thành genotype của virus cúm gia cầm

giai ñoạn 1996-2008

20

1.2.4 Tính thích ứng ña vật chủ của virus cúm A/H5N1 29 1.2.5 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 30 1.2.6 ðộc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm 32 1.2.7 Triệu chứng lâm sàng của gia cầm mắc bệnh cúm 34

1.4.1 Tình hình sử dụng vắc-xin cúm gia cầm trên thế giới 39 1.4.2 Tình hình sử sụng vắc-xin cúm gia cầm tại Việt Nam 41

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1.2 Xác ñịnh ñặc tính di truyền học của virus cúm A/H5N1 clade 7 46

2.1.3 Xác ñịnh một số ñặc tính sinh học của virus A/H5N1 clade 7 46

2.1.4 Xác ñịnh ñặc tính kháng nguyên (tính tương ñồng kháng nguyên) 46

iv Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

3.1 Phân lập và giám ựịnh virus cúm gia cầm H5N1 clade 7 59 3.2 Xác ựịnh ựặc tắnh di truyền của virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7

phân lập ở Việt Nam

62

3.2.1 Giải trình tự gen HA (H5) và phân tắch cây phả hệ sử dụng chuỗi

gen H5

62 3.2.2 Giải trình tự gen NA(N1) và phân tắch cây phả hệ dựa trên chuỗi

nucleotide của gen N1

71

3.2.3 Giải trình tự gen M và phân tắch cây phả hệ dựa trên chuỗi

nucleotide của gen M

78 3.3 Xác ựịnh một số ựặc tắnh sinh học của chủng virus A/H5N1 clade

7 A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

84

3.3.1 Tắnh thắch ứng trên phôi gà (xác ựịnh chỉ số EID50) 84 3.3.2 Tắnh thắch ứng trên tế bào xơ phôi gà (xác ựịnh chỉ số TCID50) 89 3.3.3 Kết quả xác ựịnh ựộc lực của virus cúm A/H5N1clade 7 92 3.3.4 Kết quả ựánh giá ựộ bài thải virus trên ựộng vật thắ nghiệm 103 3.3.5 đánh giá khả năng nhiễm ựa phủ tạng của virus cúm

A/H5N1clade 7

106

3.3.6 Xác ựịnh ựặc tắnh kháng nguyên của các chủng virus cúm A/H5N1

clade 7 phân lập ở Việt Nam

113

3.3.7 đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin Re-1 ựối với virus cúm

A/H5N1HA clade 7 trên gà

116

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tên ñầy ñủ

CDC Center of Disease Control and Prevention

CEF Chicken Embryo Fibroblast

EID50 Embryo Infection Dose 50%

ELD50 Embryo Lethal Dose 50%

FAO Food and Agriculture Organisation

HI Hemagglutination Inhibition

HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza

IHC Immuno Histochemistry

LPAI Low Pathogenic Avian Influenza

MDCK Mardine Darby Canine Kidney

MDEF Muscovy Duck Embryo Fibroblast

MEGA Molecular Evolution Genetic Analysis

NCBI National Center for Biotechonology Information

NCVD National Centre for Veterinary Diagnostics

NS Non-strutural protein

OIE Office International des Epizooties

PB1 Polymerase basic protein 1

PB2 Polymerase basic protein 2

RNA Ribonucleic acid

RRT-PCR Realtime Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction TCID50 Tissue Culture Infection Dose 50%

WHO World Health Organisation

vi Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

virus cúm A/ H5N1 phát hiện ở Lạng Sơn

62

3.3 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 dùng ựể so sánh và lập cây

phát sinh loài dựa trên gen H5

66

3.4 So sánh mức ựộ khác biệt về di truyền trên gen HA của 5 chủng

virus A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu

69

3.5 Danh sách các chủng virus A/H5N1 sử dụng ựể so sánh và lập cây

phát sinh loài dựa trên N1

74

3.6 So sánh mức ựộ khác biệt về di truyền trên gen N1 của 5 chủng

virus cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu

77

3.7 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 sử dụng ựể so sánh và lập

cây phát sinh loài dựa trên gen M

80 3.8 So sánh mức ựộ khác biệt về di truyền trên gen M của 5 chủng virus

cúm A/H5N1 clade 7 với một số chủng tham chiếu

83

3.10 Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus

3.13 Các axit amin vùng Ộcleavage siteỢ của virus cúm H5N1 ựộc lực cao

clade 7 và một số chủng virus tham chiếu

93

3.14 Kết quả ựánh giá ựộc lực của virus cúm A/H5N1clade 7 trên gia

cầm

95

3.16 đánh giá ựộ bài thải virus khi gây nhiễm bằng virus A/chicken/

Vietnam/NCVD-016/2008

103

3.17 Kết quả xét nghiệm RRT-PCR ựối với một số loại phủ tạng gà gây

bệnh bằng virus A/H5N1 clade 7 và chuyển ựổi sang nồng ựộ virus

107

3.18 Phân bố bệnh tích vi thể và nhuộm IHC phát hiện kháng nguyên

virus cúm H5N1A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

109

3.19 Kết quả xác ñịnh ñặc tính kháng nguyên của virus cúm A/H5N1

clade 7 phân lập ñược bằng phản ứng HI

115

3.20 Kết quả theo dõi thí nghiệm công cường ñộc gà tiêm vacxin cúm gia

cầm H5N1 Re-1

118

viii Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

1.5 Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên Haemalutinin và Neurminidase 15 1.6 Sơ ñồ minh họa ñột biến ñiểm của các phân ñoạn genvirus cúm A 20 1.7 Sơ ñồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm

A/H5N1và H3N2

20

1.8 Cây phả hệ dựa trên gen HA các virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao 22 1.9 Sự tiến hóa của các clade virus A/H5N1 theo thời gian 23 1.10 Sự phân bố của các clades virus cúm gia cầm trên thế giới từ 2003-

chủng virus A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam

71

3.4 Cây phả hệ dựa trên gen N1 các virus A/H5N1 clade 7 73 3.5 Cây phả hệ dựa trên gen M các virus A/H5N1 clade 7 79 3.6 Kiểm tra ñặc tính gây ngưng kết hồng cầu(phản ứng HA) 87 3.7 Kết quả kiểm tra bệnh tích phôi bsau khi gây nhiễm bằng chủng virus

cúm A/H5N1 clade 7 phân lập tại Việt Nam

3.10 Môt số hình ảnh thể hiện bệnh tích ñại thể ở gà gây bệnh bằng

virus A/H5N1 clade 2.3.4 và 2.3.2

99

3.11 Diễn biến sống/chết của gà sau khi gây nhiễm bằng chủng virus

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008

100

3.12 Phân bố virus ở các cơ quan phủ tạng qua xét nghiệm RRT-PCR

(chuyển ñổi sang log10)

107

3.13 Một số hình ảnh nhuộm hóa mô miễn dịch phủ tạng gà gây bệnh 110 3.14 Một số hình ảnh bệnh tích vi thể trên phủ tạng gà ñược gây bệnh 111

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

1

MỞ ðẦU

Việt Nam là một ñất nước nông nghiệp với khoảng 70% dân số sống ở nông thôn và gắn liền với lĩnh vực sản xuất nông nghiệp như trồng trọt và chăn nuôi Trong những năm gần ñây, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia cầm nói riêng ñang ngày càng phát triển và dần chiếm vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta Trong những năm qua do các tiến bộ kỹ thuật về giống, thức ăn, quản lý, thú y cùng với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà nước làm cho ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta phát triển với tốc ñộ tương ñối cao Sự phát triển ñó ñã mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân, tạo nhiều cơ hội việc làm và nâng cao ñời sống vật chất tinh thần cho người dân, góp phần xóa ñói giảm nghèo và tạo cơ hội vươn lên làm giàu cho nhiều hộ gia ñình ñồng thời góp phần vào nền kinh tế quốc gia

Tuy nhiên, bên cạnh với sự phát triển ñó cũng có rất nhiều thách thức cho ngành chăn nuôi ñó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh, trong ñó phải kể ñến bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao thuộc

họ Orthomyxoviridae gây ra ðây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc ñộ

lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh

Bệnh cúm gia cầm xảy ra lần ñầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm 2003 ñầu năm 2004 ñược ghi nhận là do virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao (HPAI) Kể từ ñó cho ñến nay dịch cúm gia cầm H5N1 vẫn liên tục xảy ra ở Việt Nam tuy nhiên quy mô dịch ñã thay ñổi trở nên nhỏ và lẻ tẻ

Cũng trong những năm qua, ở các nước trong khu vực châu Á như Nhật Bản, Hàn quốc, Trung quốc, Lào Thái lan, Indonesia… dịch cúm gia cầm cũng xảy ra Việc khống chế dịch cúm gia cầm ñã ñược tiến hành một cách mạnh mẽ,

ñã giảm thiểu ñi nhiều những thiệt hại mà virus này gây ra nhưng những nguy cơ bệnh tái phát vẫn luôn tồn tại

Virus cúm A/H5N1 ñộc lực cao không những nguy hiểm cho gia cầm mà còn rất nguy hiểm ñối với con người Từ năm 2003 cho ñến nay, thế giới ñã ghi nhận virus cúm gia cầm ñã gây nhiễm lên người ở 15 nước, với 602 ca bệnh và

355 người ñã chết (WHO,2012)

Virus cúm A/H5N1 cĩ đặc tính là biến chủng rất nhanh và đến nay đã cĩ nhiều biến chủng H5N1 đã được phát hiện và phân lập ở nhiều nước khác nhau

từ châu Á sang châu Âu ðặc biệt ở Việt Nam chúng ta đã cũng đã phát hiện được nhiều chủng virus A/H5N1 khác nhau được phân loại vào các nhánh (clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1…(Cục Thú y, 2012)

ðầu năm 2008 Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương đã phát hiện và phân lập được một số chủng virus A/H5N1 mới thuộc clade 7 từ gà nhập lậu ở biên giới Virus cúm A/H5N1 mới này trước đĩ mới chỉ được phát hiện ở gà Trung quốc và từng được phát hiện trên người năm 2003 Trung Quốc đã sản xuất vacxin (Re-4) từ chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 và đã sử dụng phịng bệnh ở một số địa phương từ năm 2006 (Chen và cs, 2008) Với thực tế cĩ rất nhiều gà nhập lậu vào Việt Nam qua biên giới cho thấy nguy cơ virus này sẽ xâm nhập và nhiễm cho các đàn gia cầm của Việt Nam và cĩ nguy cơ đối với cả con người

Vì vậy việc tiến hành nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus này như khả năng sinh bệnh đối với các đối tượng gia cầm khác nhau, khả năng bảo hộ của vacxin hiện hành đối với đối với gia cầm chống lại virus trên là cần thiết Từ

đĩ cĩ những phương án chủ động tích cực để đối phĩ nếu virus này xâm nhập vào đàn gà nội địa nước ta

ðứng trước thực tế trên chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số

đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam”

Nhằm gĩp phần cung cấp thơng tin làm cơ sở cho việc xây dựng biện pháp phịng chống bệnh cúm gia cầm

Mục tiêu của đề tài

- Xác định đặc tính di truyền học, tính kháng nguyên và độc lực của cúm A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam năm 2008;

- Xác định được hiệu lực của vacxin H5N1 Re-1, gĩp phần xây dựng biện pháp phịng chống bệnh cúm gia cầm

Ý nghĩa khoa học của đề tài

ðây là một trong những nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam cĩ hệ thống về đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 clade 7

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

Ý nghĩa thực tiễn của ựề tài

- Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc hiểu biết rõ hơn về một số ựặc tắnh sinh học của virus cúm gia cầm

- Kết quả nghiên cứu có thể ựược sử dụng làm tiền ựề ựể tiếp tục nghiên cứu các virus cúm gia cầm thể ựộc lực cao H5N1, cũng như cúm gia cầm ựộc lực thấp, và các loại virus cúm khác trên ựộng vật

- Khuyến cáo cho việc sử dụng vacxin cúm phù hợp với nhánh virus mới lưu hành trong thực tế

- Chủ ựộng trong công tác phòng ngừa sự xâm nhập của chủng virus cúm mới vào nội ựịa

Những ựóng góp mới của ựề tài

- đã xác ựịnh ựược các ựặc tắnh sinh học của virus cúm gia cầm ựộc lực cao H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam, như ựặc tắnh kháng nguyên, ựộc lực, khả năng nhân lên trên ựộng vật cảm nhiễm, môi trường nuôi cấy

- đã xác ựịnh ựược ựặc tắnh di truyền, cụ thể là giải trình tự các gen H5, NA-N1 và gen Matrix (M) của virus cúm A/H5N1 clade 7

HA đánh giá ựược khả năng bảo hộ của vacxin H5N1 ReHA 1 với virus cúm A/H5N1 clade 7 tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

1.1.1 Lịch sử bệnh trên thế giới

Cúm gia cầm lần ựầu tiên ựược phát hiện ở Italia vào năm 1878 với tên gọi là dịch hạch gà (Fowl plague) (Stubb và cs, 1965) Nhưng mãi tới năm 1901 mới xác ựịnh ựược yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới năm 1955 mới xác ựịnh ựược nguyên nhân chắnh xác nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm type A thông qua kháng thể bề mặt A/H7N1 và A/H7N7 gây chết nhiều ở gà và gà tây và các loài ựộng vật khác (Beard và cs, 1998)

đã xuất hiện 8 ựại dịch cúm trong thế kỉ XVII, 5 ựại dịch trong thế kỉ

XX đại dịch cúm lần ựầu tiên ựược xác nhận ựã xảy ra vào những năm 1510 và

1580 Kể từ ựó ựến năm 2003, trên toàn thế giới ựã có những ựợt dịch lớn như:

- Năm 1918 Ờ 1919, một ựại dịch cúm ựã nổ ra với mức ựộ trầm trọng ựã gây tử vong khoảng 20 Ờ 40 triệu người trên toàn thế giới Vào thời kì ựó, chưa

có các phương pháp phòng thắ nghiệm ựể giám ựịnh tác nhân gây bệnh Các số liệu có sức thuyết phục sau này cho thấy ựại dịch này do virus cúm type A/H1N1

- Cúm Châu Á Ờ Asian Flu do virus cúm type A/H2N2 gây nên, bắt ựầu

từ Hong Kong năm 1957;

- Cúm Hong Kong Ờ Hong Kong Flu do virus cúm type A/H3N2, xảy ra năm 1968;

- Cúm Nga Ờ Russia fluỢ do virus cúm type A(H1N1) xảy ra năm 1977 Trong ựó, ựại dịch cúm ỘChâu ÁỢ và ỘHong KongỢ , người ở mọi lứa tuổi ựều mắc và tỉ lệ tử vong cao ựặc biệt ựối với người trên 65 tuổi và người có tiền

sử về bệnh tim phổi (Kilbourne, 2006)

Chủng virus cúm A/H5N1ựược phát hiện lần ựầu tiên gây bệnh dịch trên

gà tại Scotland vào năm 1959 và có thể là biến thể H5N1 ựầu tiên trên thế giới

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà N

Năm 1997 ở Hong Kong,

trên gia cầm và lây sang ngư

triệu gia cầm ựã bị tiêu hu

/H5N1gây bệ

Từ cuối năm 2003 ựến 2012, dịch cúm gia cầm H5N1 b

nước châu Á, trong ựó có Việt Nam, lây lan nhanh chóng v

phát hàng năm ở nhiều n

lãnh thổ xuất hiện dịch cúm gia c

Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Qu

Ngoài ra, có 7 nước và vùng lãnh th

gồm: Pakistan, Hoa Kì, Canada, Nam Phi, Ai C

triều tiên và đài Loan Tắnh ự

thổ bùng phát dịch cúm l

(WHO, 2008)

Các nước có

Hình 1.1 Bản ựồ phân b

p Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

Hong Kong, lần ựầu tiên virus cúm gia cầm H5N1 ựã gây ra

m và lây sang người làm 18 ngưòi nhiễm bệnh, 6 người ch

tiêu huỷ nhằm ngăn chặn dịch lây lan đây là lệnh ựược trên người (Wu và cs, 2008)

ừ cuối năm 2003 ựến 2012, dịch cúm gia cầm H5N1 bùng phát

ớc châu Á, trong ựó có Việt Nam, lây lan nhanh chóng và liên t

ở nhiều nước trên thế giới đến nay ựã có nhiều nư

h cúm gia cầm H5N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, Malaysia, Hong Kong, Việt Nam

à vùng lãnh thổ có dịch cúm gia cầm nhưng khác ch

ì, Canada, Nam Phi, Ai Cập, Cộng hoà dân ch

ên và đài Loan Tắnh ựến tháng 4-2012 ựã có tổng số 55 nước, v

ịch cúm làm 250 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu hu

/H5N1trên gia cầm hoặc chim hoang dã /H5N1trên người

Bảng 1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo cho WHO ñến 4/2012 (WHO 2012)

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

7

đặc biệt, ựã có nhiều người nhiễm và bị tử vong do virus cúm H5N1, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 của các nước báo cáo với Tổ

chức Y tế thế giới (WHO) từ tháng 12/2003 ựến 12/4/2012, ựã có tới 602 trường

hợp mắc cúm H5N1, trong số ựó 355 trường hợp ựã tử vong chiếm tới 58.9% Indonesia, Việt Nam và Ai Cập là 3 nước có số người tử vong và nhiễm cao nhất

do virus cúm A/H5N1trên thế giơi, và ựang ựược Tổ chức Y tế Thế giới-WHO xác ựịnh là quốc gia Ộựiểm nóngỢ có thể xảy ra dịch cúm mới ở người trong tương lai cần ựược quan tâm ngăn chặn, do virus cúm A/H5N1có ựược các ựiều kiện thuận lợi ựể tiến hoá thắch nghi và lây nhiễm trên người (WHO, 2008)

1.1.2 Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện lần ựầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 (Bùi Quang Anh, 2005; BCđQG, 2005) do virus cúm gia cầm H5N1 ựộc lực cao (HPAI) gây ra Sau ựó liên tục tái phát và thường vào lúc chuyển mùa, nhất là vụ đông Ờ Xuân Theo Cục Thú y, tắnh tới năm 2010 thì có 6 ựợt dịch (epidemic) cúm gia cầm H5N1 xảy ra:

- đợt 1: từ tháng 12/2003 ựến tháng 3/2004: dịch bệnh ựã xảy ra ở 2.574

xã, phường, 381 huyện, thị thuộc 57 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 43,9 triệu con (gà: 30,4 triệu; thuỷ cầm: 13,5 triệu) Trong năm 2003 có 3 ca tử vong ở người do virus cúm H5N1

- đợt 2: từ tháng 4 ựến tháng 11/2004: dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ

ở các hộ gia ựình chăn nuôi gia cầm, bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32 huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành Thời gian cao ựiểm nhất là tháng 7, sau

ựó giảm dần, ựến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ựiểm phát dịch Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 84.078 con (gà: 55.999, vịt: 8.132) Trong năm 2004, có

29 ca H5N1 ở người, có 20 ca tử vong

- đợt 3: từ tháng 12/2004 ựến tháng 5/2005: dịch ựã xuất hiện ở 670 xã tại

182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố Số gia cầm tiêu huỷ là 470.495 gà, 825.689 vịt, ngan Trong năm 2005, có 61 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 ở người, trong

ựó có 19 ca tử vong

- ðợt 4: từ tháng 10/2005 ñến 01/2006: dịch xảy ở cả 3 miền với 24 tỉnh, thành tái phát Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3.972.763 con, trong ñó, gà: 1.338.523; thuỷ cầm và loài khác: 2.135.081

Hình 1.2 Biểu ñồ biểu diễn dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 theo

Từ 5/2007 ñến 8/2007, dịch xảy ra ở 167 xã, phường của 10 huyện, thị thuộc 23 tỉnh, thành Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.894 con (21.525 gà, ; 264.549 vịt và 8.775 ngan) Sau khi bị khống chế trong vòng 1 tháng, ñến tháng 10/2007, dịch lại tái ở 15 xã, phường của 9 huyện, quận, thị trấn thuộc 6 tỉnh, thành phố

Năm 2007 có 8 ca bị nhiễm virus cúm A/H5N1 ở người, trong ñó có 5 người chết

Trường ðại Học Nơng Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nơng nghiệp

9

- ðợt 6: từ đầu năm 2008: xảy ra rải rác với 74 đàn gia cầm tại 57 xã, phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 60.090 con, trong đĩ cĩ 23.498 gà, 36.592 thuỷ cầm Năm 2008 cĩ 6 ca mắc H5N1 ở người và 5 trong số 6 ca đã tử vong

Năm 2009, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 68 xã, phường, thị trấn của 34 huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy trên 127.000 con Năm 2009 cĩ 5 ca mắc H5N1 ở người và tỷ lệ tử vong là 100% (5/5)

Năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở ít nhất 63 xã, phường của 37 huyện, quận thuộc 24 tỉnh, thành phố, làm hơn 76.000 con gia cầm mắc bệnh, chết và buộc phải tiêu hủy, trong đĩ chủ yếu là vịt (chiếm hơn 70%) Trong năm

2010, cĩ 7 ca mắc H5N1 ở người và cĩ 2 ca tử vong (http://www.cucthuy.gov.vn)

1.2 Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm ở Việt Nam

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện ở Việt nam từ cuối năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Khơng, 2004) Từ đĩ đến nay đã cĩ nhiều nghiên cứu về virus và bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu dịch tễ bệnh, khảo sát sự lưu hành của virus, các phương pháp chẩn đốn, nghiên cứu ứng dụng vacxin, xác định hàm lượng kháng thể sau tiêm phịng, điều tra mức độ nhiễm bệnh và giám định phân tử và phân nhĩm hệ phả virus gây bệnh, nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm vacxin

Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hĩa của virus cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 Những chuỗi gen giúp xác định subtype H5, subtype N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và cơng bố trên Ngân hàng gen (Lê Thanh Hịa, 2006, Dung Nguyen T và cs, 2008) Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhĩm với virus A/H5N1 phân lập tại Trung Quốc (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Thanh Hịa, 2006; Muramoto và cs, 2005)

Các biến chủng H5N1 của Hong Kong, Trung Quốc phân lập những năm 1997 -

2001 và Hàn Quốc, đài Loan (phân lập năm 2003) ựều có nguồn gốc từ chim cút

và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng đông (Trung Quốc), ựó là các biến chủng thuộc dòng Quảng đông (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Thanh Hòa, 2006; Lê Trần Bình và cs, 2006) Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm A/H5N1type A thuộc thế hệ mới ựã có biến ựổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1

từ vùng ựịa lý Nam Trung Quốc và Hong Kong (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lee và cs, 2007; Simmons và cs, 2007) Các chủng phân lập những năm 2004-

2006 ựã ựược nghiên cứu khá chi tiết về góc ựộ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng ựịnh virus A/H5N1 vùng Nam

và đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Malaysia), có những ựặc tắnh sinh học nhất ựịnh khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hong Kong (Lee và cs, 2007, Chen và cs, 2006) Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, ựã và ựang làm phức tạp thêm vấn ựề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương ựồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch (Nguyễn Mạnh Kiên và cs, 2008, Lê Thanh Hòa và cs, 2008; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Dung Nguyen T và cs, 2008)

Vietnam-Thailand-Nghiên cứu vấn ựề gen học kháng nguyên liên quan ựến vacxin và miễn dịch, ựã ựược Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chắ Minh, Viện Thú y trung ương tiến hành ựó là việc thu thập gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt Nam các năm 2004 - 2008, và so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của các chủng cường ựộc ựương nhiễm và vacxin của Việt Nam và thế giới (Lê Thanh Hòa, 2004; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Lê Trần Bình và cs, 2006; Lê Thanh Hòa, 2006; Dung Nguyen T và cs, 2008) Năm 2007, xuất hiện thêm chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) tại Việt Nam, qua phân tắch gen giữa các chủng phân lập tại Nghệ An (Việt Nam), A/Dk/Vietnam/NA114/2007(H5N1) và A/Dk/ Vietnam/NA72/2007(H5N1), thuộc dòng Phúc Kiến) với các chủng H5N1 thuộc phân dòng Quảng đông, bao

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

11

gồm một số chủng làm vacxin ựang sử dụng, chỉ ựạt 94% (Lê Thanh Hòa và cs,

2008, Nguyễn Mạnh Kiên và cs, 2008) Nhận ựịnh hỗn hợp virus gây bệnh và phân hóa kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng ựã ựược xác nhận qua phân tắch hàng chục chủng thu nhận từ nhiều vùng khác nhau trong cả nước (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2004; Dung Nguyên T và cs, 2008) điều này ảnh hưởng ựến dịch tễ, chẩn ựoán, phòng trừ và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên (Simmons và cs, 2007; Alexander, 2007), cũng như vai trò miễn dịch của các chủng cổ ựiển ựang làm vacxin tại Việt Nam và thế giới (vacxin H5N1, chủng gốc: A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1); vacxin H5N2, chủng gốc: A-Turkey-ENG-N28(73)(H5N2); vacxin TrovacAIV-H5, chủng gốc: A-Tk-IRE-1378(83)(H5N8)); vacxin H5N2, chủng gốc: A-Ck-MEX-Hidalgo-232(94)(H5N2)) và vacxin H5N1 thế hệ mới chủng NIBRG-14, sử dụng chủng gốc: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hiện nay ựang ựược Việt Nam nghiên cứu sản xuất (Lê Trần Bình và cs, 2006; Nguyễn Thị Lan Phương và Lê Văn Hiệp, 2006;

Lê Trần Bình và cs, 2007)

Vấn ựề chẩn ựoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các subtype HA và NA ựã ựược các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới Phát hiện nhanh H5N1 và các subtype khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử ựã ựược xây dựng thành phương pháp (Chan và cs, 2007; WHO, 2008) Nghiên cứu vacxin và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng ựã có những ựóng góp nhất ựịnh về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vacxin di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam (Gao và cs, 2006; Bạch Thị Như Quỳnh, 2006; Lu và cs, 2006; Ge và cs, 2007)

Về nghiên cứu sản xuất vacxin, Viện Công nghệ sinh học tiến thực hiện ựề tài ỘNghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vacxin cúm A/H5N1 cho gia cầmỢ

và Ộđánh giá chất lượng vacxin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14Ợ trong giai ựoạn 2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú

y, Xắ nghiệp thuốc Thú y trung ương (VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có ựược vacxin sản xuất từ chủng NIBRG-14 (Lê Trần Bình,

2007) ðây là chủng vacxin ñược tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược tại Viện Tiêu chuẩn và Kiểm ñịnh sinh học Quốc gia (Vương quốc Anh) Kết quả là ñã xây dựng ñược các quy trình sản xuất giống, sản xuất vacxin, kiểm nghiệm và bảo quản vacxin cúm A/H5N1 và kiểm nghiệm miễn dịch ñạt chất lượng bằng phương pháp huyết thanh học và thử thách cường ñộc (Nguyễn Thị Lan Phương

và Lê Văn Hiệp, 2006; Lê Trần Bình, 2007) Hiện nay, vacxin này ñã ñược chuyển giao sản xuất tại NAVETCO với tên thương phẩm là NAVETCO-VIFLUVAC Song song với những nội dung nghiên cứu về cúm gia cầm ở gia cầm, các cơ sở y tế gồm bệnh viện, viện nghiên cứu (Bệnh viện Nhi trung ương, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vacxin Nha Trang) ñều có những triển khai các lĩnh vực nghiên cứu liên quan ñến cúm A/H5N1 trên người (Nguyễn Thị Kim Tiến, 2005; Dinh và cs, 2006; Chan và cs, 2007; Hatta và cs, 2007)

1.3 Cúm gia cầm và các ñặc ñiểm của virus cúm gia cầm

Cúm gia cầm (Avian Influenza-AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra ðây là nhóm virus có biên ñộ vật chủ rộng, ñược phân chia thành nhiều subtype khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA (De Wit, 2008) Nhóm virus cúm A có 16 subtype HA (từ H1 ñến H16) và 9 subtype

NA (từ N1 ñến N9) Sự tổ hợp (reassortment) giữa các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau Mặt khác, virus cúm A có ñặc tính quan trọng là dễ dàng ñột biến trong gen/hệ gen (ñặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao ñổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ dẫn ñến việc tạo nên nhiều subtype có ñộc tính và khả năng gây bệnh khác nhau

Họ Orthomyxoviridae ñã ñược phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, ñó là: nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

13

cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein (GP)(Ito và cs, 1998; Murphy và Webster, 1996)

1.3.1 ðặc ñiểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm

Hình thái và cấu trúc của virus cúm gia cầm type A ñuợc Kawaoka và Murphy (1988) mô tả khá chi tiết Qua kính hiển vi ñiện tử, virion có dạng hình khối tròn, hình trứng, hoặc dạng khối dài, ñường kính khoảng 80 – 120 nm Nhiều khi virus có dạng hình sợi dài ñến vài µm Phân tử lượng của hạt virus

khoảng 250 triệu Dalton

Hình 1.3 Hình ảnh virus cúm A (A)Hình ảnh mô phỏng; (B) Hình thái dưới kính hiển vi ñiện tử (http://micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html)

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipit kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm ñược ñặc hiệu hóa gắn vào các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày ñặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có ñường kính 4 - 6 nm, ñó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là

glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender

và cs, 1999; Zhao và cs, 2008) Có sự phân bố không ñồng ñều giữa các phân tử

NA và HA (tỉ lệ khoảng 1 NA/4 HA), ñây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy

và Webster, 1996; Uiprasertkul và cs, 2007)

Hệ gen của virus cúm A là RNA sợi ñơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân ñoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ capsid, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong ñó phân ñoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân ñoạn NS

mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân ñoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1

và PB1-F2 (Ito và cs, 1998; Conenello và cs, 2007) (Hình 1.3.)

- Phân ñoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein

enzyme PB2, là tiểu ñơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi ñầu phiên mã RNA virus Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84.103 Da (trên thực tế là 87.103 Da) (Murphy và Webster, 1996) Tính thích nghi nhiệt ñộ cơ thể loài vật chủ ñược cho là có liên quan ñến vị trí axit amin 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu

- thích ứng nhiệt ñộ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở virus thích nghi trên người là Lys - thích ứng nhiệt ñộ cơ thể người khoảng 37oC) (Subbarao và cs, 1998; Wang và cs, 2009)

- Phân ñoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp

enzyme PB1 - tiểu ñơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster, 1996) Gần ñây, ñã có phát hiện thêm một protein (PB1-F2) ñược mã hóa bởi một khung ñọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình) (Tumpey và cs, 2002)

- Phân ñoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân ñoạn gen bảo tồn

cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83.103 Da (trên thực tế là 96.103 Da) PA là một tiểu ñơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus (Luong và Palese, 1992)

- Phân ñoạn 4 (gen HA) có ñộ dài thay ñổi tuỳ theo từng chủng virus cúm

A (ở A/H1N1 là 1778 bp; ở H9N1 là 1714 bp; ở H5N1 là khoảng 1704 - 1710 bp) ðây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2 Vùng nối giữa HA1 và HA2

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

15

gồm một số axit amin mang tính kiềm ñược mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, ñó là ñiểm cắt của enzym protease, ñây là vùng quyết ñịnh ñộc lực của virus (Bosch và cs, 1981; Gambotto và cs, 2008) Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu không ñược glycosyl hóa) và 77.103 Da (nếu ñược glycosyl hóa, trong ñó HA1 là 48.103 Da và HA2 là 29.103 Da) (Keawcharoen và cs, 2005; Luong và Palese, 1992)

- Phân ñoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ NP là một protein ñược glycosyl hóa, có ñặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân ñoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56.103 Da (trên thực tế là 50 - 60.103 Da) (Luong và Palese, 1992; Murphy và Webster, 1996; Rӧmer-Oberdӧrfer và cs, 2008)

- Phân ñoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài

thay ñổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay ñổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) (Lê Thanh Hòa, 2004) ðây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 50.103 Da (trên thực tế là 50 - 60.103 Da) Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần ñầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến ñổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay ñổi này liên quan ñến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều ñối tượng vật chủ khác nhau (Castrucci và Kawaoka, 1993; Baigent và Mc Cauley, 2001; Uiprasertkul và cs 2007) ðặc trưng biến ñổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng ñột biến trượt-xóa một ñoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau ñó là 60 nucleotide, làm cho ñộ dài vốn có trước ñây của NA(N1) là 1410 bp còn 1350 bp (Castrucci và Kawaoka, 1993; Lê Thanh Hòa, 2006; Kaewcharoen và cs, 2005)

Các phân ñoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có ñộ dài tương ñối ổn ñịnh giữa các chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân ñoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho

protein ñệm (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 ñược tạo ra bởi những khung ñọc mở khác nhau của cùng một phân ñoạn RNA), cùng với HA và NA có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A,

có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin (Scholtissek và cs, 2002) Protein M1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus (Luong và Palese, 1993; Murphy và Webster, 1996; Basler, 2007) Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11.103 Da (trên thực tế là 15.103 Da), là protein chuyển màng - kênh ion (ion channel) cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Scholtissek

và cs, 2002)

- Phân ñoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non

structural protein), có ñộ dài ổn ñịnh nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng (Murphy và Webster, 1996; Sekellick và cs, 2000) ðộc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) này ñược tìm thấy ở biến chủng A/H5N1/97 (Tian và cs, 2005), trong tự nhiên, việc ñột biến xóa ñi một phần gen có liên quan ñến giảm ñộc lực (Zhou và cs, 2007) NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27.103 Da (trên thực tế là 25.103 Da), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác ñộng lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai ñoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.103 Da (trên thực tế là 12x103 Da), ñóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm ñể lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới

(Sekellick và cs, 2000; Zhu và cs, 2008)

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

17

Hình 1.4 Mô hình hệ gen virus cúm A (Stubb, 1965)

Các phân ñoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên ñặc trưng theo từng chủng virus cúm A Nói cách khác protein HA và NA cho phép xác ñịnh subtype của virus cúm A nói chung và virus cúm gia cầm nói riêng

Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1 ) có hệ gen ñược cấu trúc từ

8 phân ñoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA, tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các ñột biến ñiểm trong các phân ñoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao ñổi các phân ñoạn gen giữa các chủng virus cúm ñồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn ñến thay ñổi ñặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới (Suarez và Schultz-Cherry, 2000)

1.3.2 Kháng nguyên của virus cúm gia cầm

Virus cúm type A ñược xác ñịnh subtype dựa trên cơ sở kháng nguyên (protein) bề mặt là HA (Hemagglutinin-viết tắt là H) và NA (Neuraminidase-viết tắt là N) có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ Hemagglutinin ñược coi

là yếu tố vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên, vừa quyết ñịnh ñộc lực của virus cúm A

1.3.2.1 Protein HA (Hemagglutinin)

Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I

(lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro),

kháng thể ñặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết ñó, ñược gọi là kháng

thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody) Có 16 subtype HA ñã ñược phát hiện (H1 - H16), subtype H16 mới ñược tìm thấy ở virus gây bệnh cho hải âu ñầu ñen - Thụy ðiển, 1999), ba subtype (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan ñến các ñại dịch cúm trong lịch sử (Murphy và Webster, 1996) Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi ñộng quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender và cs, 1999; Wagner và cs, 2002) Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 ñơn phân (trimer), mỗi ñơn phân (monomer) ñược tạo thành từ hai tiểu ñơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các ñơn phân sau khi tổng hợp ñã ñược glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu ñơn vị HA2, phần ñầu tự do hình chỏm cầu ñược tạo bởi dưới ñơn vị HA1 chứa ñựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào ñích (Bosch và cs, 1981; Wagner và

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

19

trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào ñích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết ñịnh sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner và cs, 2002; Wasilenko và cs, 2008) Vị trí axit amin 226 (aa226) của HA1 ñược xác ñịnh là vị trí quyết ñịnh phù hợp gắn HA với thụ thể ñặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A

lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở

góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô ñường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ

tự nhiên của virus cúm A) Ngoài ra, một số vị trí axit amin khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ ñến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Luong và Palese, 1993) ðặc biệt, một số chủng virus cường ñộc A/H5Nx; A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong ñường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) (Bauer và cs, 2006; Hui, 2008; Wasilenko và cs, 2008)

Trình tự mã hóa chuỗi nối, và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí axit amin liên quan ñến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, ñược coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA (Luong và Palese, 1993) Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra ñáp ứng miễn dịch dịch thể ñặc hiệu với từng type HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, ñược coi là protein vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên, vừa quyết ñịnh ñộc lực của virus, là ñích của bảo

vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở ñiều chế các vacxin phòng cúm hiện nay (Bosch và cs, 198; Horimoto và Kawaoka, 2001; Matrosovich và cs, 1999)

1.3.2.2 Protein NA (neuraminidase)

Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18),

là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein ñược gắn trên bề mặt capsid

của virus cúm A, mang tính kháng nguyên ñặc trưng theo từng subtype NA (Baigent và Mc Cauley, 2001; Uiprasertkul và cs, 2007) Có 9 subtype (từ N1 ñến N9) ñược phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, hai subtype N1 và N2 ñược tìm thấy ở virus cúm người liên quan ñến các ñại dịch cúm trong lịch sử (Wasilenko và cs, 2008) Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề mặt capsid hạt virus Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, ñầu tự do (chứa vùng hoạt ñộng) gồm 4 dưới ñơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Castrucci và Kawaoka, 1993) Protein NA có vai trò là một enzyme cắt ñứt liên kết giữa gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, ñẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào Mặt

khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai ñoạn “hòa màng”, ñẩy

nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Uiprasertkul và cs, 2007) Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô ñường hô hấp, tạo ñiều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không ñặc hiệu Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác ñộng trên của NA ñều tham gia làm gia tăng ñộc lực gây bệnh của virus cúm

A ở cơ thể vật chủ Do ñó, NA là ñích tác ñộng của các thuốc, hóa dược ức chế virus không ñặc hiệu hiện nay, ñặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào ñích, bảo vệ cơ thể (Aoki và cs, 2007; Castrucci và Kawaoka, 1993)

Bên cạnh ñó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể ñặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus ñương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA (Doherty và cs, 2006) Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các ñích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

21

với virus cúm A, và là cơ sở ñiều chế các vacxin phòng cúm hiện nay cho người

và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người (Suarez và Schultz-Cherry, 2000; Wu và cs, 2008)

1.3.2.3 Các phương thức biến ñổi kháng nguyên

Có ba phương thức chủ yếu làm biến ñổi kháng nguyên ở virus cúm A (Wu và cs, 2008)

a Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các ñột biến ñiểm xảy ra

các phân ñoạn gen/hệ gen của virus Do virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc,

không có cơ chế “ñọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã

và sao chép ở nhân tế bào ñích Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn ñến các

enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm (ñột biến giãn nở), làm mất ñi hoặc thay thế (ñột biến trượt-xóa) (Lê Thanh Hòa và cs, 2006) một hay

nhiều nucleotide mà không ñược sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi ñơn mới của virus (Conenello và cs, 2007; Murphy và Webster, 1996) Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các ñột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay ñổi các axit amin trong trình tự của protein ñược mã hóa biểu hiện, dẫn ñến thay ñổi thuộc tính của protein, hoặc ñược tích lũy trong phân ñoạn gen xảy ra ñột biến (ñột biến ñiểm) Tần suất xảy ra ñột biến ñiểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với

ñộ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác (Prel và cs, 2008; Wagner và cs, 2002) Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới ñược sinh ra ñều chứa ñựng một ñột biến ñiểm trong hệ gen của nó, và các ñột biến này ñược tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một subtype virus mới có những ñặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch (Hình 1.6)

Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân ñoạn gen kháng nguyên NA và

HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các axit amin mới, hoặc làm thay ñổi cấu trúc dẫn ñến thay ñổi ñặc tính của protein ñó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới thay ñổi ñộc lực gây bệnh hay ñặc tính kháng nguyên mới (Wasilenko và cs, 2008, Macken và cs, 2006; Chen và cs, 2008)

b Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao ñổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm, và rất ít ở một số virus RNA

gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao Hệ gen gồm 8 phân ñoạn gen riêng biệt của virus cúm A ñược 2 chủng virus cúm A khác nhau khi ñồng nhiễm trong một tế bào trao ñổi cho nhau, ñể có thể xảy ra sự hoà

trộn (reassort) hoặc trao ñổi (swap) các phân ñoạn gen của hai chủng virus ñó

trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA

hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban ñầu Kết quả

là ñã tạo ra thế hệ virus mới có các phân ñoạn gen kết hợp, và ñôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng ñộc lực gây bệnh (Hình 1.7) (Hilleman, 2002; Macken và cs, 2006; Chen và cs, 2006)

c Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate

(oligosaccharide) vào với axit amin Asparagine (N) ở một số vị trí nhất ñịnh

trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm Thông thường chuỗi oligosaccharide ñược gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagine; X = axit amin bất kì, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine) (Baigent và McCauley, 2001) ðây là những vị trí ñược cho là gắn kết với các kháng thể ñược cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra ñột biến ñiểm hình thành bộ

mã của Asparagine, tạo tiền ñề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay ñổi biểu hiện ñặc tính kháng nguyên của

HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác ñộng miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ

và ñiều hoà sự nhân lên của virus (Baigent và McCauley, 2001)

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của

virus cúm A, khi ñồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau ðây cũng chính là vấn ñề ñáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng

gây bệnh ñược cho người, và rất có thể A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

23

NA, hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A ựã thắch nghi ở người, ựể tạo ra một biến chủng virus mới thắch ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một ựại dịch cúm mới và ựặt ra một ựịnh hướng mới trong phòng chống (Hilleman, 2002; Guan và cs, 2002; Li và cs, 2004; Kim và cs, 2008)

đỘT BIẾN đIỂM Không có cơ chế

ựọc-sửa bản sao

Quá trình sao chép nhân lên

dưới xúc tác của RNA polymerase

Sao chép trong

tế bào chủ

Dịch mã Protein ựột biến

TẾ BÀO

Hình 1.6 Sơ ựồ minh họa ựột biến ựiểm

của các phân ựoạn genvirus cúm A

Hình 1.7 Sơ ựồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm

A/H5N1và H3N2 (Lê Thanh Hòa và cs, 2006)

1.3.3 đặc ựiểm tiến hóa và hình thành genotype của virus cúm gia cầm giai ựoạn 1996-2008

1.3.3.1 Sự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 và phân loại Clade dựa trên phân tắch hệ phả gen HA

Năm 1996, H5N1 ựược phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng đông (Trung Quốc) và chủng này ựược coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong 12 năm qua (Xu và cs, 1999) Chủng virus nguyên thủy này, lúc ựó cung cấp nguồn gen HA(H5) cho tiến trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hong Kong năm 1997, và nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hong Kong ựược kiến tạo từ virus cúm A có ở chim cút (Guan và cs, 2002) Riêng nguồn gen NA(N1) còn chưa biết ựược lấy từ ựâu, nhưng cấu trúc của gen có hiện tượng xóa ựi 57 nucleotide mã

hóa cho 19 axit amin, tại vùng ựầu N của protein neuraminidase, và ựột biến Ộxóa genỢ này của N1 có liên quan ựến tắnh thắch ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia

cầm trên cạn và người (Matrosovich và cs, 1999) đối với gen HA(H5) ựột biến giãn nở chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hóa cho các axit amin kiềm (Arginine và

Lysine) có liên quan ựến tiến trình tăng cường ựộc lực, và ở các chủng thuộc dòng Quảng đông (Guangdong-like sublineage), các axit amin thông thường là -RRRKK- (Claas và cs, 1998; Matrosovich và cs, 1999)

Sau một năm gây bệnh tại Hong Kong, do toàn bộ ựàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1 nguyên thủy gốc Quảng đông không còn gia cầm cạn ựể gây bệnh, người ta tưởng chúng ựã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái

tổ hợp hình thành biến chủng mới (Cauthen và cs, 2000; Wasilenko và cs, 2008) Trong các năm 1997 - 2002, một số biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều ựặc tắnh kháng nguyên khác nhau của subtype H5 ựược hình thành tạo nên nhóm kháng nguyên (clade) 1 có ựộc lực cao với gà nhưng thấp ựối với vịt, ựể rồi bị ựào thải trong những năm 2001 - 2002 (Guan và cs, 2002; Lee và cs, 2007) Tiếp tục, trong năm 2002 - 2003, gen HA(H5) có những ựột biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift), ựể rồi tạo nên biến chủng có tắnh gây bệnh cực kỳ cao, ựặc biệt ựối với vịt, và lây sang người (Guan và cs, 2002; Sturm-Ramirez và cs, 2005) đặc tắnh thắch ứng gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng với ựộc lực tăng cường ựối với ựa vật chủ bao gồm vịt, gà, ngan, ngỗng, chim cút, chim hoang dã và người, ựể rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập các nước phắa Nam châu Á trong ựó có Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Lào, CampuchiaẦ(Guan và cs, 2002; Pantin-Jackwood, 2007)

Có thể nói, sau giai ựoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 ựã ựạt ựến mức

ựộ hoàn thiện về ựặc tắnh gây bệnh và thắch ứng ựa vật chủ, trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao ựối với gia cầm và người trong các năm 2004 - 2005 (Lee và cs, 2007; Smith và cs, 2006) Tuy nhiên, xét về di truyền học và tắnh kháng nguyên, các chủng H5N1 giai ựoạn 1997 - 2002 vẫn mang tắnh ựồng nhất kháng nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng đông (Chen và cs, 2004),

và bắt ựầu phân hóa ở giai ựoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (De Jong và Hien, 2006) Sự xuất hiện của genotype Z với tắnh gây bệnh ác liệt trong những năm này ở các nước đông Nam Á là bằng chứng của sự ựột biến Ộlệch kháng nguyênỢ của cúm A/H5N1 (Lee và cs, 2007; WHO, 2004)

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà N

Hình 1.8 Cây phả hệ

p Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

/H5N1 ñ (WHO, 2008)

/H5N1 ñộc lực cao

Cuối năm 2005, có nhiều dưới dòng của virus cúm A/H5N1 cùng lúc ựược hình thành, ựó là sự xuất hiện phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc, Hong Kong, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan (Lee và cs, 2007; Sim và cs, 2005, Simmons và cs, 2007), tràn sang Trung Á, châu Âu và châu Phi có tắnh gây bệnh cao ựối với người (Ducatez và cs, 2007; Pantin-Jackwood, 2007; Zhao và cs, 2008) Các chủng thuộc dưới dòng Phúc Kiến có cấu trúc gen NA(N1) không thay ựổi nhiều, nhưng gen HA(H5) có motif axit amin ở vùng nối của ựiểm cắt protease là -RRRK-, giảm mất một Lysine (K)

so với các chủng dưới dòng Quảng đông (Simmons và cs, 2007), và do vậy kể từ

2006 ựến nay, nhiều chủng/dòng virus cúm A/H5N1 cùng tồn tại gây bệnh, trong ựó có nước ta (Dung Nguyen T và cs, 2008) Trong các năm 2006 - 2008, tuy bình diện dịch cúm gia cầm không ác liệt như những năm 2003-2005, nhưng

do xuất hiện nhiều chủng A/H5N1 có biến ựộng kháng nguyên và ựộc lực, vấn ựề dịch tễ học cúm A/H5N1 có thể ựã trở nên phức tạp hơn (Zhao và cs, 2008; Gambotto và cs, 2008)

Phân tắch phát sinh loài ựược thực hiện bằng nhiều cách tiếp cận trên dựa trên tất cả các trình tự gen H5 HA (ựã ựược công bố) tiến hóa từ virus H5N1 A/goose/Guangdong/96 Kết quả ban ựầu cho thấy virus H5N1 ựang lưu hành có thể ựược nhóm lại thành nhiều loại "clades" virus dựa trên các ựặc ựiểm phát sinh loài và trình tự tương ựồng của gen HA(H5)

đến nay, hệ thống thống nhất danh mục H5N1 ựã xác ựịnh ựược 10 clades ban ựầu riêng biệt của virus (số 0-9) (Nhóm công tác tiến hóa H5N1 WHO / OIE / FAO, 2008), chúng ựược gọi là clades lớp thứ nhất Việc xác ựịnh clade ựược cần ựáp ứng ba tiêu chắ ựịnh nghĩa nhánh cụ thể sau ựây ựược phát triển bởi nhóm công tác tiến hóa H5N1 WHO / OIE / FAO:

- Nằm trong cùng một nốt nhánh (clade);

- Tạo thành nhóm ựơn ngành với giá trị bootstrap ≥ 60 tại nốt nhánh (dựa trên giá trị boostrap 1000 lần);

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

Hình 1.10 Sự phân bố của các clade virus cúm gia cầm trên thế giới từ

2003-2009 (Pfeiffer và cs, 2011)

Cho ựến nay tất cả 10 clade của virus cúm gia cầm ựộc lực cao H5N1 ựã ựược phát hiện và phân lập ở khu vực đông Á có thể cùng hoặc ở các thời ựiểm khác nhau (Pfeiffer và cs, 2011) Về trình tự gen, hầu hết các virus cúm A/H5N1của khu vực đông Á ựều bắt nguồn từ Trung Quốc và Hong Kong và cũng ựược tìm thấy tại Nhật Bản và Hàn Quốc Một số clade không phát hiện thấy ở đông Á là clade 2.1.2 và 2.1.3 Dường như chúng ựã tiến hóa ở Indonesia sau khi tổ tiên của chúng xâm nhập từ tỉnh Hồ Nam của Trung Quốc năm 2002-

2003 (Wang và cs, 2008) Một số clade cho ựến nay chỉ mới phát hiện thấy ở Trung Quốc (vắ dụ các clade 4, clade 6 và clade 9) trong khi các clade khác có liên quan ựến các vụ dịch chắnh (clade 1 ở khu vực sông Mê Kông từ năm 2004-

2005, clade 2.1 ở Indonesia năm 2004, clade 2.2 lan rộng từ châu Á sang châu

Âu và châu Phi từ năm 2005, và clade 2.3.4 ựã tấn công các nước Việt Nam, Lào

và Thái Lan từ năm 2005) ựều ựã ựược phân lập ở Trung Quốc trước khi ựược phát hiện thấy ở những nơi khác Clade 7 cũng mới chỉ xuất hiện ở Trung Quốc

từ năm 2007 trở về trước

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà N

Hình 1.11 Thời gian xu

Virus A/H5N1 gây nên d

Tuy nhiên, qua ñiều tra, ngư

cầm sống Việt Nam từ năm 2001 (Nguyen và cs, 2001) Phân tích phát sinh loài các virus cúm ñã từng phát hi

có 6 clade HA khác nhau c

lưu hành ở Việt Nam (Wallace và cs 2007)

hệ thống danh pháp quố

ñược xác ñịnh trước ñó: clade 0

giống virus HK821(A/

(A/Dk/China/E319-2/03); clade 2.3 4

clade 3-giống virus GX22

F1(A/swine/Fujian/F1/01)

thân ñược phân lập trướ

thân này có thể ñược coi là t

xâm nhập vào Việt Nam

gia cầm chỉ ra rằng một s

hơn, trong khi nhữ

hơn Ví dụ, sau khi ñượ

lưu hành tại Việt Nam kho

năm 2004 (Wallace và cs 2007)

p Hà Nội – Luận văn tiến sĩ khoa học nông nghiệp

i gian xuất hiện của các clade H5N1 ở Việt Nam từ

(Wallace và cs 2007)

Virus A/H5N1 gây nên dịch cúm gia cầm ở Việt Nam từ cuố

u tra, người ta ñã từng phát hiện thấy virus A/H5N1 năm 2001 (Nguyen và cs, 2001) Phân tích phát sinh loài

ng phát hiện ở Việt Nam từ năm 2001-2007, ñã th

có 6 clade HA khác nhau củ /H5N1 ñộc lực cao từng xu

(Wallace và cs 2007) Sáu clade HA này khi phân tích theo

ốc tế rất tương ñồng với các virus A/H5N1 ti

c ñó: clade 0 - giống virus HK97(A/HK/483/97);

A/Dk/ HK/821/02); clade 2.3.2 - giống virus E319 ); clade 2.3 4 - giống virus FJ584 (A/Ck/Fujian/584/05);

ng virus GX22 (A/Dk/GX/22/01); clade 5-gi

swine/Fujian/F1/01) Sáu clade virus này nằm cùng nhóm với các virus ti

ớc ñây tại Trung Quốc và Hồng Công và các virus ti

c coi là tổ tiên của các dòng virus cúm gia cầm ñ

t Nam Thời ñiểm phân lập ñược các clade virus A/H5N1

t số dòng virus ñã lưu hành trong vòng mộững dòng khác tiếp tục lưu hành tại Việt Nam

ợc phát hiện lần ñầu tiên trong năm 2003, virus clade 5khoảng 1 năm và ñược thay thế bằng clade 1

(Wallace và cs 2007)

ừ 2001-2007

ối năm 2003 /H5N1 ở chợ gia năm 2001 (Nguyen và cs, 2001) Phân tích phát sinh loài

ã thấy ít nhất

ng xuất hiện và Sáu clade HA này khi phân tích theo

i các virus A/H5N1 tiền thân ñã

HK/483/97); clade 1 -

ng virus E319 Ck/Fujian/584/05); giống virus