Đánh giá đa dạng di truyền liên quan đến tính kháng đạo ôn, bạc lá của một số nguồn gen lúa địa phưong miền bắc việt nam

Nước ta ñược xem là trung tâm của ña dạng sinh học thực vật trong ñó có cây lúa, thông qua các nghiên cứu về tiến hóa và sự ña dạng di truyền của các loài thuộc chi lúa Oryza, các nhà kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-*** -

NGUYỄN KIẾN QUỐC

ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN LIÊN QUAN ðẾN TÍNH KHÁNG ðẠO ÔN, BẠC LÁ CỦA MỘT SỐ NGUỒN GEN LÚA ðỊA PHƯƠNG

MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: TS Lã Tuấn Nghĩa

HÀ NỘI, 2012

Lời cảm ơn Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lã

Tuấn Nghĩa, người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ và hỗ trợ tôi trong

suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này;

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới quí thầy cô và cán bộ công tác tại Ban ñào tạo Sau ñại học-Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã dạy dỗ và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập;

Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ và anh, chị em trong Bộ môn ða dạng sinh học Nông nghiệp-Trung tâm Tài nguyên thực vật ñã giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học vừa qua;

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã nhiệt tình ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2012

Học viên

Nguyễn Kiến Quốc

Lời cam ñoan

Tôi xin cam ñoan ñã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này Kết quả nghiên cứu ñạt ñược ñều xuất phát từ việc thực hiện các nội dung ñề tài luận văn, mang tính khách quan và trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam ñoan trên!

Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2012

Học viên

Nguyễn Kiến Quốc

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABC ATP-Binding Cassette

DNA Deoxyribonucleotide Acid

EST Expressed sequence tag

MAS Marker Assissted Selection

MGR Major Gene Resistance

PCR Polymerase Chain Reaction

PIC Polymorphism Information Content

RGA Resistance Gene Analog

SNP Single Nucleotide Polymorphism

SSR Simple Sequence Repeat

STS Sequence-Acetic acid-EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số giống và gen kháng ñạo ôn (Kinoshita và cs., 1994; 1995) 14 Bảng 1.2 Một số giống và gen kháng bạc lá (NIAS, 2010) 17 Bảng 2.1 Danh sách các mẫu nguồn gen lúa nghiên cứu 43

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng SSR-PCR (thể tích 10µl/tube) 50

Bảng 3.1 Kết quả ñánh giá tính kháng/nhiễm ñạo ôn của các mẫu

nguồn gen lúa

56

Bảng 3.2 Kết quả ñánh giá tính kháng/nhiễm bạc lá của các mẫu

nguồn gen lúa

64

Bảng 3.3 Số băng ADN, số loại alen và hệ số PIC của 30 cặp mồi SSR

liên kết với khả năng kháng ñạo ôn

73

Bảng 3.4 Số băng ADN, số loại alen và hệ số PIC của 32 cặp mồi SSR

liên kết với khả năng kháng bạc lá

76

DANH MỤC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Lịch sử tiến hóa các loài lúa trồng (Chang và Smorith, 1979) 7

Hình 3.1 Các nguồn gen lúa trước khi lây nhiễm 52 Hình 3.2 Kết quả lây nhiễm nòi H12 & H14 lên các mẫu nguồn gen lúa 53 Hình 3.3 Mức ñộ kháng/nhiễm của các mẫu nguồn gen lúa nghiên cứu

với 02 nòi nấm bệnh H12 & H14 Trong ñó R: kháng; MR:

kháng trung bình; MS: nhiễm nhẹ; S: nhiễm

54

Hình 3.4 Kết quả lây nhiễm chủng Is.5 & Is.6 lên các mẫu nguồn gen

lúa Trong ñó: A: Chiêm nhỡ BN2; B: Lúa cứng Nghệ An;

C IRBB5; D: IR24

60

Hình 3.5 Mức ñộ kháng/nhiễm của các mẫu nguồn gen lúa nghiên cứu

với 02 chủng vi khuẩn Is.5 & Is.6 Trong ñó R: kháng; MR:

kháng trung bình; MS: nhiễm nhẹ; S: nhiễm

61

Hình 3.6 Hình ảnh nhận dạng ADN tổng số của các mẫu nguồn gen lúa

Trong ñó: Lamda 50ng/µl; 1-58 các mẫu giống lúa nghiên cứu (bảng 2.1)

Hình 3.8 Kết quả phản ứng PCR của các mẫu nguồn gen lúa với 30

cặp mồi SSR liên kết với tính kháng ñạo ôn (ô ñen-có alen ghi nhận, ô trắng-không có alen ghi nhận)

68

Hình 3.9 Kết quả nhận dạng kiểu gen của các mẫu nguồn gen lúa bằng

chỉ thị SSR (RM240; RM453; RM2887) liên kết với khả năng kháng ñạo ôn Trong ñó: M là: DNA 100 ladder; 1-23 thứ tự các mẫu giống lúa nghiên cứu (bảng 2.1)

74

Trang

Hình 3.10 Kết quả nhận dạng kiểu gen của các mẫu nguồn gen lúa bằng

chỉ thị SSR-RM208 liên kết với khả năng kháng bạc lá

Trong ñó: M là: Ladder 100; 1-46 thứ tự các mẫu giống lúa nghiên cứu (bảng 2.1)

75

Hình 3.11 Kết quả nhận dạng kiểu gen của các mẫu nguồn gen lúa bằng

chỉ thị SSR-RM138 liên kết với khả năng kháng bạc lá

Trong ñó: M là: Ladder 100; 1-46 thứ tự các mẫu giống lúa nghiên cứu (bảng 2.1) (tiếp)

77

Hình 3.12 Cây phân nhóm Euclidean-UPGMA dựa trên ñặc ñiểm hình

thái kháng ñạo ôn của các mẫu nguồn gen lúa

78

Hình 3.13 Cây phân nhóm SM-UPGMA dựa trên kiểu gen SSR liên kết

với khả năng kháng ñạo ôn của các mẫu nguồn gen lúa

80

Hình 3.14 Sơ ñồ phân nhóm Eucledean-UPGMA dựa trên kiểu hình

kháng bạc lá của các mẫu nguồn gen lúa

82

Hình 3.15 Sơ ñồ phân nhóm SM-UPGMA dựa trên kiểu gen kháng bạc

lá của các mẫu nguồn gen gen lúa

84 Hình 3.16 Mối liên kết giữa biểu hiện kiểu hình và kiểu gen kháng ñạo ôn 85 Hình 3.17 Mối liên kết giữa biểu hiện kiểu hình và kiểu gen kháng bạc lá 82

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 4

4 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài 4

Trang

Trang

1.5 THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU đA DẠNG DI

TRUYỀN NGUỒN GEN LÚA

33 1.5.1 Nghiên cứu ựa dạng nguồn gen lúa bằng chỉ thị hình thái 33 1.5.2 Nghiên cứu ựa dạng di truyền bằng chỉ thị ADN 34 1.5.3 Nghiên cứu ựa dạng di truyền liên quan ựến tắnh kháng

1.5.3.1 đa dạng di truyền liên quan ựến tắnh kháng ựạo ôn 39 1.5.3.2 đa dạng di truyền liên quan ựến tắnh kháng bạc lá 40 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.1 đánh giá tắnh kháng ựạo ôn, bạc lá 44 2.1.2 đánh giá ựa dạng di truyền các nguồn gen lúa 44 2.1.3 Xác ựịnh mối liên kết giữa kiểu hình và kiểu gen kháng 45

2.3.1.1 Phương pháp xác ựịnh nòi có ựộc tắnh cao 45

kháng ñạo ôn

72

3.2.4 ða dạng di truyền liên quan ñến khả năng kháng bạc lá 74 3.2.4.1 Số băng ADN và số loại alen thể hiện 75 3.2.4.2 Hệ số PIC của các mồi SSR liên quan ñến khả năng

kháng bạc lá

75

Trang

3.3 MỐI LIÊN KẾT GIỮA KIỂU HÌNH VÀ KIỂU GEN KHÁNG 77 3.3.1 Mối liên kết giữa kiểu hình và kiểu gen kháng ñạo ôn 77 3.3.2 Mối liên kết giữa kiểu hình và kiểu gen kháng bạc lá 81

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Lúa gạo là nguồn cung cấp lương thực chính cho hơn một phần ba dân số thế giới [100] và là cây lương thực số một tại Việt Nam Lúa gạo ñược trồng ở trên 112 nước trên thế giới, ñặc biệt ở khu vực châu Á

Theo số liệu do FAO (2004) cung cấp, diện tích trồng lúa trên thế giới ước tính khoảng 155 triệu hecta, sản lượng ñạt 625 triệu tấn/năm Việt Nam

có diện tích trồng lúa khoảng 7,5 triệu hecta, trong ñó hai vùng sản xuất chính

là ñồng bằng sông Cửu Long (~3,8 triệu hecta) và ñồng bằng sông Hồng (~1,2 triệu hecta) với sản lượng ñạt trên 34,5 triệu tấn/năm [85]

Trong những năm gần ñây, nước ta ñã có những bước tiến vượt bậc về sản xuất lúa gạo (là một trong ba nước xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới) nhờ vào việc sử dụng các giống lúa có năng suất cao và áp dụng các tiến bộ của khoa học kỹ thuật ñể thâm canh tăng vụ Tuy nhiên, việc thâm canh (về thời gian và mức ñộ) ñã khiến áp lực của chọn lọc tự nhiên lên bệnh hại tăng nhanh, nhiều nòi, chủng bệnh hại mới xuất hiện ðây là một trong những nguyên nhân dẫn tới hiện tượng cân bằng giữa các nguồn gen kháng, chống

chịu và sâu bệnh hại (bệnh ñạo ôn, bạc lá,.v.v.) bị phá vỡ ðiều này ñã ñặt ra

yêu cầu, cần có những chiến lược nghiên cứu ñể tìm ra những nguồn gen kháng, chống chịu mới thiết lập lại sự cân bằng (www.http://agriviet.com)

[113] Bảo tồn, khai thác và sử dụng các nguồn gen lúa ñịa phương (bản ñịa),

hoang dại,.v.v là một trong những hướng ñi ñúng ñắn trong việc phát hiện ra những nguồn gen mang alen kháng, chống chịu

Tài nguyên di truyền thực vật nói chung và tài nguyên di truyền cây trồng nói riêng là một phần quan trọng của ña dạng sinh học và là cơ sở sinh học ñể ñảm bảo nền an ninh lương thực

Nước ta ñược xem là trung tâm của ña dạng sinh học thực vật trong

ñó có cây lúa, thông qua các nghiên cứu về tiến hóa và sự ña dạng di truyền

của các loài thuộc chi lúa Oryza, các nhà khoa học ñã khẳng ñịnh miền Bắc

Việt Nam nằm trong khu vực xuất xứ và ña dạng di truyền của loài lúa

trồng Châu Á (Oryza sativa) [28], rất nhiều giống lúa ñịa phương ñã ñược

phát hiện là nguồn gen quý có thể cung cấp cho công tác chọn tạo giống Tuy nhiên việc ñánh giá, khai thác và sử dụng các nguồn gen này vẫn còn rất hạn chế

Những giống lúa ñịa phương luôn có những ưu ñiểm nhất ñịnh mà những giống lúa khác như giống lai tạo, nhập nội và những giống ñang trồng phổ biến không thể có ñược như về ñặc tính kháng sâu bệnh, về tính phù hợp với từng ñiều kiện canh tác của từng ñịa phương, về phẩm chất gạo,.v.v Vì vậy, việc nghiên cứu tình hình sâu, bệnh hại trên các giống lúa

ñó là rất quan trọng nhằm phục vụ cho sản xuất và làm vật liệu nghiên cứu tiếp theo ñể lai tạo ra giống lúa có khả năng kháng, chống chịu với sâu bệnh hại [16]

Trong nhiều năm qua việc nghiên cứu di truyền tính chống chịu của các nguồn gen lúa ñịa phương (bản ñịa) ñều sử dụng các phương pháp ñánh giá truyền thống dựa trên phân tích các tính trạng hình thái Phương pháp ñánh giá isozyme và ñánh giá nhờ chỉ thị phân tử ñã ñược tiến hành nghiên cứu về bệnh ñạo ôn [12], bạc lá [5],.v.v và bước ñầu ñã thu ñược những kết quả rất khả quan

Nghiên cứu khả năng chống chịu với các tác nhân sinh học và phi sinh học của các nguồn gen lúa có ý nghĩa ựặc biệt quan trọng trong công tác bảo tồn, khai thác, sử dụng và chọn tạo giống Khi các ựặc tắnh quý của giống ựược ựánh giá và xác ựịnh, chúng có thể ựược khai thác trực tiếp hoặc ựưa vào trong các giống lúa cải tiến và như vậy chúng ta sẽ chọn tạo ựược những giống lúa mới, vừa ựảm bảo năng suất, chất lượng vừa có khả năng chống chịu tốt Bệnh ựạo ôn và bạc lá là hai trong số những loại bệnh hại phổ biến

và rất nghiêm trọng ựối với sản xuất lúa; việc phân tắch, ựánh giá và xác ựịnh các gen kháng ựạo ôn, bạc lá trong lúa là việc làm rất cần thiết và có ý nghĩa

khoa học cũng như thực tiễn cao Vì vậy, "đánh giá ựa dạng di truyền liên

quan ựến tắnh kháng bệnh ựạo ôn, bạc lá của một số nguồn gen lúa ựịa phương miền Bắc Việt Nam", ựể xác ựịnh những nguồn vật liệu phục vụ cho

công tác bảo tồn, khai thác, sử dụng và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ựạo ôn, bạc lá ở nước ta

2 Mục ựắch và yêu cầu của ựề tài

2.1 Mục ựắch

đánh giá, phân tắch và xác ựịnh ựược một số mẫu nguồn gen có khả

năng kháng/nhiễm ựạo ôn, bạc lá

2.2 Yêu cầu của ựề tài

đánh giá khả năng kháng; phân tắch ựa dạng di truyền; xác ựịnh alen kháng ựạo ôn, bạc lá và mối liên kết giữa kiểu hình và kiểu gen kháng ựạo ôn, bạc lá của 58 mẫu nguồn gen lúa ựịa phương thu thập ở miền Bắc Việt Nam

từ ựó xác ựịnh các nguồn gen kháng/nhiễm phục vụ công tác bảo tồn, khai thác, sử dụng và chọn tạo giống kháng ựạo ôn, bạc lá

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Bộ dữ liệu về kiểu gen và kiểu hình kháng/nhiễm ñạo ôn, bạc lá của

58 mẫu nguồn gen lúa;

- Cung cấp nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống kháng ñạo ôn, bạc lá thông qua Ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, An Khánh, Hoài ðức, Hà Nội;

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả ñánh giá khả năng kháng/nhiễm; phân tích ña dạng di truyền và xác ñịnh alen kháng ñạo ôn, bạc lá của 58 mẫu nguồn gen lúa là cơ sở khoa học ñể giới thiệu các nguồn gen lúa ñịa phương mang alen kháng như là nguồn vật liệu di truyền mới phục vụ cho công tác chọn tạo giống kháng ñạo

ôn, bạc lá

4 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài

4.1 ðối tượng nghiên cứu

58 mẫu nguồn gen lúa thu thập ở miền Bắc Việt Nam và ñược bảo quản trong Ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia tại Trung tâm Tài nguyên thực vật,

An Khánh, Hoài ðức, Hà Nội

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Giới hạn của ñề tài là ñánh giá khả năng kháng/nhiễm; phân tích ña dạng di truyền và xác ñịnh alen kháng ñạo ôn, bạc lá của 58 mẫu nguồn gen lúa thu thập ở phía Bắc Việt Nam

ðịa ñiểm: Bộ môn ða dạng sinh học Nông nghiệp, Trung tâm Tài

nguyên thực vật;

Thời gian: - Tháng 1 năm 2011 ñến 10 năm 2012;

- Có sự kế thừa kết quả nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY LÚA VIỆT NAM

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Về nguồn gốc lúa trồng, ựã có nhiều tác giả ựề cập tới nhưng cho tới nay vẫn chưa có những dữ liệu chắc chắn và thống nhất

Makkey cho rằng vết tắch cổ xưa nhất ựược tìm thấy trên các di chỉ ựào ựược ở vùng Penjab (Ấn độ) cách ựây khoảng 200 năm;

Vavilov (1926) phân loại các loài Oryza thành 04 nhóm: Sativa,

Granulata, Coarctata và Rhynchoryza, ựồng thời khẳng ựịnh nguồn gốc của Oryza sativa là một trường hợp của nhóm Oryza sativa f.spontanea xuất xứ ở

Ấn độ, đông Dương hoặc Trung Quốc;

Chowdhury và Ghosh cho rằng những hạt thóc hóa thạch ựược tìm thấy

ở vùng Hasthiapur (Uttar Pradesh-Ấn độ) vào khoảng năm 1000-750 năm trước công Nguyên là cổ nhất của thế giới;

Grist, Gutchtchin, Ghose, Erughin và nhiều tác giả khác thì cho rằng đông Dương là cái nôi của lúa trồng, từ ựó lan dần lên phắa Bắc đinh Dĩnh (Trung Quốc) dựa vào lịch sử phát triển lúa hoang ở trong nước cho rằng lúa trồng có xuất xứ ở Trung Quốc Một số nhà nghiên cứu Việt Nam lại cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở Miền nam Việt Nam và Campuchia;

Sampath và Rao (1951) [92] cho rằng sự hiện diện của nhiều loại lúa hoang dại ở Ấn độ và đông Nam Á chứng tỏ rằng Ấn độ và đông Dương là nơi xuất xứ của lúa trồng;

Tuy có nhiều ý kiến, nhưng căn cứ vào các tài liệu lịch sử, di tắch khảo

cổ, ựặc ựiểm sinh thái học của cây lúa trồng và sự hiện diện rộng rãi của các

loài lúa hoang dại, ựã khẳng ựịnh nguồn gốc cây lúa là ở vùng ựầm lầy đông Nam Á, rồi từ ựó lan dần ựi các nơi

Về tổ tiên lúa của 02 loài lúa trồng hiện nay là Oryza sativa L (Châu Á) và Oryza glaberrima Steud (Châu Phi), cũng có rất nhiều ý kiến trái chiều

khác nhau

Theo Oka và Chang (1962) cho rằng tổ tiên của Oryza sativa là loài lúa hoang phổ biến Oryza sativa f.spontanea, và suy luận rằng các giống lúa có hạt trắng không râu ựến từ Ộvar.rufipongonỢ của lúa hoang, các giống lúa ở vùng nước sâu và vùng mặn là từ Ộvar.coarctataỢ, giống ỘAusỢ và AmanỢ (Indonesia) là từ Ộvar.bengaliensisỢ và các giống lúa có chất lượng cao hương thơm là từ Ộvar.abuensisỢ [80];

Sampath và Rao (1951) [92] cho rằng O perennis Moench (kể cả O

longistaminata) là tổ tiên của cả 2 loài lúa trồng Oryza sativa L và Oryza glaberrima Steud.;

Bùi Huy đáp (1980) [3] cho rằng Oryza fatua có khả năng là tổ tiên

trực tiếp của lúa trồng hiện nay;

Chang và Smorith (1979) ựã tổng kết nhiều tư liệu nghiên cứu và ựưa

ra cơ sở tiến hóa của các loài lúa trồng hiện nay ở Châu Á và Châu Phi (Hình 1.1) [28]

Thông qua nghiên cứu về tổ tiên, nguồn gốc xuất xứ của lúa trồng,

chúng ta có thể phân loại lúa trồng như sau: Họ Poaceae, trước ựây gọ là họ Hòa thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza

sativa và Oryza glaberrima Ngày nay, các nhà phân loại thực vật học ựều

nhất trắ là chi Oryza có 23 loài trong ựó có 21 loài hoang dại và 2 loài lúa trồng (Oryza sativa L và Oryza glaberrima Steud.) Trong ựó, loài Oryza

sativa L ñược gieo trồng rộng khắp trên thế giới, ñược chia thành 03 loài phụ

là Indica, Japonica và Javanica

Hình 1.1 Lịch sử tiến hóa các loài lúa trồng [28]

1.1.2 Tài nguyên di truyền lúa Việt Nam

1.1.2.1 Tài nguyên lúa hoang dại

Lúa châu Á (Oryza sativa L.), là một trong những loài cây trồng, ña

dạng phổ biến và lâu ñời nhất trên toàn thế giới, ñược ñại diện bởi 03 phân

loài là Indica, Japonica và Javanica

Việt Nam ñược xem là trung tâm của ña dạng sinh học trong ñó có cây

lúa ðất ñai phì nhiêu, khí hậu nhiệt ñới gió mùa (nóng ẩm, lượng mưa

cao,.v.v.) là những ñiều kiện thích hợp cho cây lúa phát triển; bên cạnh ñó,

Việt Nam có 54 dân tộc cùng sinh sống, mỗi dân tộc có tập quán canh tác và

sở thích về phẩm chất lúa gạo khác nhau Sự ña dạng về văn hóa dân tộc là một trong những nguyên nhân quan trọng tạo nên sự ña dạng về tài nguyên di truyền lúa

Thông qua các nghiên cứu về tiến hóa và sự ña dạng di truyền của các

loài thuộc chi lúa Oryza, các nhà khoa học ñã khẳng ñịnh miền Bắc Việt Nam nằm trong khu vực xuất xứ của loài lúa trồng Châu Á (Oryza sativa L.)

(Chang và Smorith, 1979) [28], rất nhiều giống lúa ñịa phương ñã ñược phát hiện là nguồn gen quý có thể cung cấp cho công tác chọn tạo giống lúa mới

(giống kháng, chống chịu,.v.v.) Theo một số kết quả nghiên cứu, hiện nay ở Việt Nam 04 loài lúa hoang dại: Oryza rufipogon, Oryza nivara, Oryza

officinalis, Oryza granulata Trong các nguồn gen thuộc 04 loài lúa hoang dại

này, một số nguồn gen có khả năng kháng, chống chịu với một số sâu (rầy

nâu, rầy lưng trắng,.v.v.), bệnh (virus, bệnh ñạo ôn, bạc lá,.v.v.) hại và ñiều

kiện bất thuận (mặn, hạn, lạnh, nóng,.v.v.); ñặc biệt một số nguồn gen còn có

khả năng quang hợp trong ñiều kiện ánh sáng tán xạ,

Trong ñịnh hướng phát triển ngành nông nghiệp, giống là khâu cần ñược quan tâm hàng ñầu Ngay từ thời kỳ văn minh lúa nước sông Hồng, ở Việt Nam ñã có rất nhiều nguồn gen lúa hoang dại Qua hàng ngàn năm, những nguồn gen lúa hoang dại này ñã ñược thuần chủng và lưu truyền qua

các thế hệ, trở thành những giống lúa truyền thống có giá trị (Tám Thơm Hải

Hậu, Tám xoan Quế Võ,v.v.)

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất lúa gạo cũng có những biến ñổi ñể thích ứng với nhu cầu của thực tế Tuy nhiên, vấn

ñề bảo tồn quỹ gen ñang ñược ñặt ra ngày một bức thiết trước thực tế phát triển Trong ñó, sự xói mòn quỹ gen, suy giảm ña dạng sinh học trong quá trình cải biến và thâm canh giống cây trồng là một trong những mối lo ngại cần ñược quan tâm nhất Theo một số nghiên cứu, với tốc ñộ xói mòn quỹ gen xảy ra nhanh và rộng khắp như hiện nay thì trong 50 năm tới hầu như không còn sự ña dạng Công tác chọn tạo giống thích ứng với nhu cầu thực tế sản xuất của các nhà chọn tạo giống sẽ gặp rất nhiều khó khăn, bởi sẽ có rất ít

nguồn vật liệu có khả năng tạo những biến dị di truyền phù hợp với mục tiêu

Do vậy, nguy cơ xói mòn quỹ gen ựang là một thách thức lớn ựối với cả nhân loại nói chung và Việt Nam nói riêng

1.1.2.2 Tài nguyên lúa trồng

Việt Nam ựược xem là một trong những nơi xuất xứ của cây lúa trồng châu Á [20] Theo đào Thế Tuấn (1996), cho biết trên lãnh thổ Việt Nam tồn tại ba nhóm giống lúa cổ truyền có ựặc tắnh di truyền khác nhau [17]:

- Nhóm giống lúa Việt Thái ở vùng núi phắa Bắc, chủ yếu là lúa nương đây là một trong những nhóm giống lúa có sự ựa dạng di truyền cao nhất thế giới;

- Nhóm giống lúa Việt mang ựặc tắnh thâm canh ở vùng ựồng bằng sông Hồng đây là nhóm lúa có những tài nguyên ựặc trưng cho tài nguyên di truyền lúa Việt Nam như: lúa Chiêm, lúa Tám thơm Lúa Chiêm có những nguồn gen quý nổi tiếng thế giới như gen kháng ựạo ôn, gen chịu ựất chua phèn, chịu ựất nghèo lân, chịu rét thời kỳ mạ và thời kỳ lúa trỗ Nguồn gen kháng ựạo ôn của bộ giống lúa chiêm Tẻ tép ựược Viện nghiên cứu lúa Quốc

tế và nhiều quốc gia trồng lúa khác sử dụng rộng rãi trong ựầu thập kỷ 58 ựể lai tạo nhiều giống lúa cao sản Lúa chiêm chỉ còn tồn tại ắt trong sản xuất nhưng giá trị nguồn gen của lúa chiêm là vô cùng quý giá Lúa Tám thơm là một trong ba nhóm giống lúa thơm chắnh trên thế giới;

- Nhóm giống Việt-Kh'mer mang ựặc tắnh quảng canh của vùng ựồng bằng sông Cửu Long Tài nguyên di truyền lúa thuộc nhóm này có các nguồn gen ựặc trưng là lúa nổi, lúa chịu nước sâu, lúa chịu ựất chua phèn, lúa chịu mặn, lúa có dạng hạt thon dài thắch hợp cho xuất khẩu

Trên thực tế, sản xuất lúa gạo ở Việt Nam vẫn là một trong những hoạt ựộng kinh tế ựứng hàng ựầu Những cánh ựồng lúa trải dài từ khắp

miền núi, ñồng bằng ñến cao nguyên, hình thành nên nhiều vùng thâm canh cây lúa Khu vực ñồng bằng sông Hồng, ñồng bằng sông Cửu Long,.v.v ñược coi là những vựa lúa lớn nhất cả về diện tích, sản lượng và chất lượng của Việt Nam

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều giống lúa mới có năng suất cao nhưng bị hạn chế về chất lượng và khả năng chống chịu sâu, bệnh hại; các giống lúa ñịa phương có năng suất không cao nhưng lại có chất lượng tốt; ñặc biệt là các ñặc tính quý như khả năng kháng và

chống, chịu sâu bệnh hại cao; các ñiều kiện bất thuận (mặn, hạn, nóng, lạnh,

ngập lụt,.v.v.) ðiều này ñã ñặt các nhà khoa học phải chọn lựa giữa các giống

lúa ñịa phương (giống lúa cũ) hay giống cải tiển Trong giai ñoạn cần ñảm

bảo về an ninh lương thực, các giống lúa cải tiến với lợi thế về năng suất (giống lúa cao sản) ñược ưu tiên phát triển Hiện nay, các giống lúa cao sản ñã

và ñang bộc lộ những yếu kém nhất ñịnh về tính kháng; chống, chịu sâu, bệnh hại và các ñiều kiện bất thuận cũng như chất lượng kém; xã hội không ngừng phát triển, khi nhu cầu từ ăn no ñã chuyển thành ăn ngon,.v.v ñã ñặt ra của dẫn tới và chất lượng không còn ñáp ứng ñược yêu cầu của thực tế

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học ñã phần nào khắc phục ñược những nhược ñiểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống Thông qua việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống (MAS),

các nhà chọn tạo giống ñã kết hợp ñược các ñặc tính quý (chống chịu, kháng

sâu bệnh hại và chất lượng,.v.v.) của các loại lúa hoang dại, lúa ñịa phương

(lúa truyền thống) vào trong cùng cá thể lúa cải tiến (có năng suất cao)

Những giống mới ñược tạo ra mang lại nhiều sự lựa chọn tốt hơn: chống chịu,

kháng với sâu, bệnh hại; ñiều kiện bất thuận (mặn, hạn, nóng, lạnh,.v.v.) và có

năng suất, chất lượng tốt;.v.v [12]

1.2 BỆNH HẠI CHÍNH TRÊN LÚA

Từ cuối thế kỷ 20 ñến nay, nông nghiệp thế giới ñã ñạt ñược những thành tựu to lớn, sản lượng và năng suất cây trồng không ngừng ổn ñịnh và ngày một nâng cao Tuy vậy, do những tác ñộng của sự thay ñổi khí hậu sự biến ñộng của dịch hại ñã dẫn ñến những thiệt hại ñáng kể về năng suất và phẩm chất cây trồng ở nhiều vùng trên thế giới [8]

Trên thế giới, thiệt hại hàng năm do sâu bệnh ước tính khoảng 11,6%; ở Việt Nam, tổn thất do bệnh hại là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn ñến sản xuất nông nghiệp nói chung và lúa nói riêng (Vũ Triệu

Mân, 2007) ðối với sản xuất lúa, bệnh ñạo ôn (do nấm Pyricularia grisea hay Magnaporthe oryzae) và bạc lá (do vi khuẩn Xanthomonas oryzae) gây ra

là hai trong những loại phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng nhất [8]

1.2.1 Bệnh ñạo ôn hại lúa

Bệnh ñạo ôn ở lúa do nấm Magnaporthe oryzae (Faivre-Rampant và

cs., 2011) [35] gây ra, ñược ghi nhận và mô tả ở Trung Quốc vào năm 1637, tiếp ñó tại các nước khác như Nhật Bản (1704), Ý (1828), Hoa Kì (1876),.v.v ðây là bệnh có phổ phân bố rộng, gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và chất lượng lúa Hiện có khoảng hơn 80 quốc gia khác nhau có lúa bị nhiễm ñạo ôn ðặc biệt, những quốc gia có khí hậu ôn hoà, ñộ ẩm cao, sẽ tạo ra môi trường thuận lợi cho nấm bệnh phát tán và phát triển mạnh

Tổ chức FAO ước tính, thiệt hại do ñạo ôn gây ra làm giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7-17,5%, thậm chí có những nơi thiệt hại lên tới 80% [12] Theo nghiên cứu của Moffat (1994) [70], thiệt hại do bệnh ñạo ôn gây ra cho người dân trồng lúa ở vùng Nam Á, Nhận Bản, Philippines lên tới 5 tỉ USD/năm

Theo Viện lúa quốc tế (IRRI), mỗi năm Ấn độ mất hơn 266.000 tấn lúa (khoảng 0,8% tổng sản lượng) do bệnh ựạo ôn; ở Nhật Bản, bệnh ựạo ôn có thể gây hại cho 865.000 ha trồng lúa; tại Philipines, bệnh ựã làm giảm năng

suất trên 50% sản lượng [12]

Ở Việt Nam, thiệt hai do bệnh ựạo ôn gây ra hàng năm vào khoảng 25% (NIPP, 1992) [73] và thường tập trung ở ựồng bằng Bắc bộ và Trung bộ Với tác hại như trên, bệnh ựạo ôn trở thành một trong những bệnh có diện phân bố rộng nhất và ựược xem là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất cho tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới

10-1.2.2 Bệnh bạc lá hại lúa

Bệnh bạc lá ở lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây

ra, cùng với bệnh ựạo ôn là hai trong những loại bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng ựến nền sản xuất lúa gạo trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng [29] Bệnh ựược biết ựến như là một trong những loại bệnh xuất hiện sớm nhất trên thế giới; những người nông dân thuộc vùng Fukuoka, Kyushu, Nhật Bản phát hiện và ghi nhận từ những năm 1884, sau ựó bệnh lan và gây thiệt hại nghiêm trọng ựến mùa màng ở vùng Nam

và đông Nam châu Á (IRRI, 1989) [48] Tại châu phi, bệnh xuất hiện ở vùng Mali lần ựầu tiên vào cuối những năm 1970, sau ựó bệnh lan và trở nên phổ biến, bệnh ựặc biệt gây hại nghiên trọng ở các vùng ựất trồng lúa trũng và ẩm thấp tại các quốc gia châu Phi;.v.v [27]; [78]; [23]; [77] Cho ựến nay, bệnh ựã ựược tìm thấy và ghi nhận ở châu Á, châu Úc, các nước

Mỹ Latin, châu Phi,.v.v [69]; [33]; [44] Ở một số nơi thuộc ựông bắc châu Á và Ấn ựộ, bệnh bạc lá có thể tàn phá nghiêm trọng và gây thiệt hại mùa màng từ 50%-74% năng suất [44]; [94]

Ở Việt Nam, bệnh ñã ñược phát hiện từ lâu trên các giống lúa cũ; ñặc biệt từ những năm 1965-1966 trở lại ñây bệnh thường xuyên phát hoại một cách nghiêm trọng ở các vùng trồng lúa trên các giống nhập nội có năng suất cao cấy trong vụ chiêm xuân và ñặc biệt vụ mùa [8]

Mức ñộ, tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ bị bệnh của cây sớm hay muộn và mức ñộ bị bệnh nặng hay nhẹ bệnh làm cho lá lúa ñặc biệt

là lá ñòng sớm tàn, nhanh chóng khô chết, bộ lá sơ xác, tỷ lệ hạt lép cao, năng suất giảm sút rõ rệt [8]

1.3 GEN KHÁNG ðẠO ÔN, BẠC LÁ

1.3.1 Gen kháng ñạo ôn

Gen kháng ñạo ôn là gen mã hóa cho một loại protein biểu hiện tính ñộc ñối với nòi nấm gây bệnh Gen kháng ñạo ôn phần lớn là ñơn gen, trội Ngoài ra cũng có những gen trội không hoàn toàn hoặc gen lặn nhưng rất ít [80] Mỗi gen kháng ñạo ôn chỉ có thể kháng với một hoặc vài loài nấm gây bệnh Thông thường mỗi giống lúa kháng chỉ mang một gen kháng Vì vậy, khả năng kháng thấp, muốn giống kháng tốt, bền vững thì giống phải quy tụ ñược nhiều gen kháng

Gen kháng ñạo ôn ở lúa chia thành: gen kháng chính và gen kháng phụ Gen kháng chính biểu hiện thông qua hiệu quả chất lượng, di truyền ñơn giản

và ñặc thù chủng Gen kháng phụ là những gen mà hoạt ñộng của chúng mang tính bổ trợ ñóng góp vào khả năng kháng của cây chủ, nhờ những gen này mà phạm vi phát triển của bệnh ñược giới hạn Những gen kháng phụ ngày càng ñược quan tâm hơn khi những cá thể mang gen kháng chính có sự biểu hiện kém bền về tính kháng Những gen kháng phụ ñược quan tâm gồm các gen

kháng theo locus kiểm soát tính trạng số lượng (QTL - Quantitative Trait

Locus) của bệnh ñạo ôn

Có khoảng 38 gen chủ lực ñã ñăng ký và ñược ñịnh vị trên hầu hết nhiễm sắc thể, ngoại trừ nhiễm sắc thể 1, 3, 10 và tập trung nhiều trên nhiễm sắc thể 6, 11 và 12 Những nghiên cứu gần ñây cho biết có hơn 40 gen chủ lực kháng bệnh ñạo ôn ñã ñược ñịnh vị trên bản ñồ gen (Sallaud và cs., 2003) [91]

Bảng 1.1 Một số giống và gen kháng ñạo ôn (Kinoshita, 1994; 1995) [56]; [57]

mang gen

Nhiễm sắc thể

Mối quan hệ giữa các gen

Tác giả

gen Pi-k

Mackill và Bonman, 1992; Inukai và cs.,

1994

Pi-z5 {Pi-2(t)} 5173 6 liên quan với

gen Pi-z

Mackill và Bonman, 1992;

Tuy nhiên, một số trong những gen kháng này có thể là giống nhau hoặc

có quan hệ alen Ví dụ như: Pi-29(t) nằm trên nhiễn sắc thể số 8, liên kết chặt với Pi-11(t), Pi-30(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 11, liên kết chặt với Pi-a, Pi-

31(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 12, liên kết chặt với Pi-31(t), Pi-tq6 và Pi-21(t)

(Tabien và cs.,2000; Fuentes và cs., 2001) [98]; [39]; Theo Sallaud và cs.,

(2003) [91] một số gen nhiều alen như Pi-z có các alen Pi-zt, Pi-z5; Pi-ta có 2 alen; Pi-k có 5 alen; Liu (2005), chỉ ra rằng trên nhiễm sắc thể số 1 gen Pi-37

có 4 alen như: Pi-37-1, Pi-37-2, Pi-37-3, Pi-37-4, cả 04 alen này ñều liên kết chặt với các gen: Pi-ta, Pi-b, Pi-9, Pi-2, Piz-t và Pi-36 (Liu và cs., 2005) [65]

Một số gen kháng ñạo ôn ñược kiểm tra lại, kết quả kiểm tra lại ñã gây nhiều khó khăn trong việc xác ñịnh gen kháng ñạo ôn mới (Sallaud và cs., 2003) [91] Vì vậy, cần phải tiến hành nghiên cứu trên nhiều cá thể với nhiều loại chỉ thị và thử trên nhiều chủng nấm khác nhau mới có thể xác ñịnh chính xác gen kháng ñạo ôn mới (Bảng 1.1)

Việc ñọc trình tự nucleotide của các gen kháng cho phép phân biệt một cách chính xác các gen trong nhóm alen ñể tìm ra gen kháng ñạo ôn mới Kết quả ñọc trình tự của các gen kháng ñạo ôn cũng cho thấy: hầu hết các gen

ñược nhận biết là có chung các vùng như nhắc lại giàu leucine (Leucine Rich

Repeat - LRR); vị trí liên kết nucleotide (Nucleotide Binding Site - NBS); và

protein kitinase (PK) (Lã Tuấn Nghĩa, 1999; Sallaud và cs., 2003) [9]; [91]

1.3.2 Gen kháng bạc lá

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae, ñược biết

ñến là một trong những loại bệnh gây thiên hại lớn nhất ñối với nền sản xuất lúa gạo trên thế giới (Chen và cs., 2002) [29] Năm 1971, Flor ñã ñưa ra học

thuyết: mỗi gen ñơn quy ñịnh tính kháng trên cây chủ (host plants) thì có một

gen tương ứng ở vi khuẩn gây bệnh (pathogen factors) quy ñịnh tính không ñộc ñối với gen ñó (Flor, 1971) [37] hay mỗi một gen không ñộc (Avirulence

Resistance Gene – AVR gen) của một nòi vi khuẩn gây bệnh tương ứng sẽ có một gen kháng với một nòi vi khuẩn gây bệnh ñó (Resistance gene – R gen)

nằm trong giống kháng (Trần Nguyễn Hà, 2008) [4]

Phần lớn các gen này ñã ñược phát hiện từ loài phụ Indica, hoặc từ lúa hoang dại O longistaminata, O rufipogon, O minuta và O officinalis, chỉ có một số ít ñược phát hiện từ loài phụ Japonica (Lee và cs., 2003) [57] Riêng

ba gen lặn xa15, xa19 và xa20 ñược tạo ra bởi ñột biến cảm ứng (Ogawa,

1996; Lee và cs., 2003) [79]; [63]

Phát triển từ học thuyết của Flor (1971), khi xuất hiện khoảng 30 nòi

(race) X oryzae pv oryzae với mức ñộ gây hại khác nhau trên lúa trồng (Oryza sativa L.), các nhà khoa học ñã tiến hành xác ñịnh các gen kháng và

ñã xác ñịnh ñược trên 33 gen kháng chính (major gene with resistance-MGR) với các mức ñộ khác nhau từ Xa1 ñến Xa25, xa33 trên các nhiễm sắc thể số 4 (Xa1, Xa2, Xa12 và Xa14), 5 (xa5), 6 (Xa7), 8 (xa13), 11 (Xa3, Xa4, Xa10,

Xa21, Xa22 và Xa23) và 12 (Xa25); trong 33 gen kháng chính ñược tìm thấy,

có 23 MGR ở trạng thái trội (Xa) và 10 MGR ở trạng thái lặn (xa); các gen

này có thể tác ñộng riêng lẻ hoặc liên kết chặt với nhau ñể cùng biểu hiện ra ngoài kiểu hình kháng, chống chịu bạc lá (Chen và cs., 2002; Sarra và cs., 2010; ) [29]; [94]

Cũng theo học thuyết của Flor (1971), chúng ta có thể xác ñịnh thêm ñược rất nhiều gen kháng bạc lá ở trạng thái ‘ngủ nghỉ” trên các vùng còn lại

của bộ nhiễm sắc thể trước sự biến ñổi ngày càng phức tạp của bệnh (sự xuất

hiện nòi, chủng mới với các mức ñộ gây hại ngày càng nghiêm trọng)

Như vậy 33 gen kháng bạc lá nói trên ñã ñược nghiên cứu và ñịnh vị trên các nhiễm sắc thể (Bảng 1.2) Hầu hết các gen kháng này ñã ñược lập bản

ñồ ở mức ñộ phân tử

Bảng 1.2: Một số giống và gen kháng bạc lá (NIAS, 2010) [76]

TT Gen kháng Giống

mang gen

mang gen

Những kết quả nghiên cứu này là các công cụ hữu hiệu cho chương trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, tạo ñiều kiện ñáng kể cho việc khai thác

và sử dụng gen kháng một cách có hiệu quả Việc quản lý bệnh bạc lá lúa là một trong những chủ ñề ñược rất nhiều nhà chọn tạo giống quan tâm (Frank

và Yang, 2009) [38]; cũng giống như bệnh ñạo ôn hại lúa, việc sử dụng giống kháng là một trong những biện pháp ñem lại hiệu quả cao nhất trong công tác quản lý bệnh bạc lá lúa

1.4 CHỈ THỊ TRONG ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN

ða dạng sinh học là vấn ñề rất ñược quan tâm hiện nay Gìn giữ và bảo tồn ña dạng sinh học là mục tiêu sống còn trong việc duy trì cân bằng sinh

thái, ñảm bảo môi sinh của các sinh vật trên Trái ñất (Somasundaram và Kalaiselvam, 2007) [96]

ða dạng di truyền là kết quả của quá trình biến ñổi trong vật chất di truyenf sinh vật (trình tự ADN, số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể) theo các con ñường tự nhiên (lai, phân ly-tái tổ hợp,.v.v.) hay bởi bàn tay con người (lai-chọn tạo giống, gây ñột biến, ñột biến tự nhiên,.v.v.) Tất cả những quá trình này gây nên những biến ñổi trong gen và tần số alen, dẫn ñến những thay ñổi trong kiểu hình của vi sinh vật

ða dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa hết sức quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp Từ những kết quả ñánh giá ña dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì ña dạng sinh học hoặc hỗ trợ quá trình lai-chọn tạo giống thông qua chọn lựa cặp

bố mẹ trong các phép lai nhằm thu ñược ưu thế lai cao nhất Trên nhiều ñối tượng thực vật, nghiên cứu ña dạng di truyền ñã ñược thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, thông qua các dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần protein và hoạt chất (chị thị hóa sinh) hay sự khác biệt (ña hình) trong ADN (chỉ thị ADN) Mỗi loại chỉ thị ñều có những ưu-nhược ñiểm cũng như khả năng ñánh giá mức ñộ ña dạng di truyền khác nhau Trong ñó, chỉ thị hình thái ñược sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban ñầu trong ñánh giá phân loại sinh vật, còn chỉ thị hóa sinh và ñặc biệt chỉ thị ADN hiện nay ñược sử dụng rộng rãi nhất không chỉ trong ñánh giá ña dạng di truyền

mà còn là công cụ hữu hiệu hỗ trợ công tác chọn tạo giống

1.4.1 Chỉ thị hình thái

Trước ñây, sự ña dạng giữa các cá thể trong quần thể và giữa các quần thể ñược xác ñịnh thông qua ñánh giá các ñặc ñiểm hình thái nổi trội (hình dạng, kích thước, ñặc ñiểm các bộ phận,.v.v.) Với ưu ñiểm như dễ dàng tiếp

cận và nghiên cứu, không ñòi hỏi thiết bị ñặc biệt cũng như quy trình thực hiện phức tạp, chỉ thị hình thái ñược sử dụng khá rộng rãi trong nghiên cứu ña dạng di truyền thực vật Trong ñánh giá và chọn tạo giống truyền thống, chỉ thị hình thái ñược áp dụng phổ biến và khá hiệu quả ở một số loại cây trồng như lúa, ngô, ñậu tương,.v.v

Tuy nhiên, còn có những nhược ñiểm ảnh hưởng ñến tính chính xác cũng như hiệu quả của chỉ thị hình thái Thứ nhất, số lượng chỉ thị rất hạn chế (so với các loại chỉ thị khác) trong khi các ñặc ñiểm hình thái lại chịu tác ñộng rất lớn của môi trường cũng như phụ thuộc vào giai ñoạn sinh trưởng phát triển của ñối tượng nghiên cứu Mức ñộ tin cậy của công tác ñánh giá ña dạng

di truyền phụ thuộc vào số lượng các chỉ thị ñược xét tới, do số lượng chỉ thị hình thái không ñủ nhiều nên kết quả thu ñược cũng không chính xác Bên cạnh ñó, do tính biến thiên của các ñặc ñiểm hình thái theo ñiều kiện môi trường và giai ñoạn sinh trưởng nên kết quả thường có sự sai lệch giữa các lần ñánh giá hoặc trong ñiều kiện ñánh giá khác nhau Thứ hai, việc ñánh giá kiểu hình mang tính chất thông kê nên cần ñược thực hiện trên số lượng lớn ñối tượng ñể ñảm bảo ñộ chính xác Chính vì vậy sẽ cần diện tích ñất ñai lớn cũng như nhiều nhân lực và thời gian ñể gieo trồng và ñánh giá kiểu gen nên chỉ thị hình thái không thể là thước ño chính xác ñể ñánh giá tính ña dạng di truyền giữa các cá thể, nhất là khi không phải toàn bộ các gen ñều thể hiện ra kiểu hình có thể ño ñếm ñược

Hiện nay, tuy có nhiều nhược ñiểm và trong bối cảnh chỉ thị ADN ñược

sử dụng phổ biến hơn, nhưng chỉ thị hình thái vẫn ñược áp dụng khá hiệu quả trong ñánhg giá ña dạng di truyền (ñặc biệt ñối với các ñối tượng mà chỉ thị phân tử chưa có nhiều) hoặc trong nghiên cứu lập bản ñồ liên kết phục vụ chọn tạo giống cây trồng như ở lúa, ngô (Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2005) [10]

1.4.2 Chỉ thị sinh hóa

Protein và các hoạt chất trao ñổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện ở gen sinh vật Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có thể giúp xác ñịnh những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khác nhau Bush và cs (1978) khẳng ñịnh ñiện di truyên gel là phương pháp hữu hiệu có thể giúp phân biệt, nhận diện giữa các loài và phân loại sinh vật Các protein, sản phẩm trao ñổi chất,v.v ñược sử dụng như những chỉ tiêu ñánh giá, phân biệt các sinh vật ñược gọi là chỉ thị sinh hóa Chỉ thị hóa sinh ñược sử dụng phổ biến nhất là các isozyme (các enzyme có trình tự amino acid khác nhau nhưng cùng xúc tác cho một phản ứng hóa học) Isozyme ñược trích ly, tinh sạch và ñiện di trên gel Các thành phần trong gel biến tính (thường là SDS) phá vỡ các cấu trúc bậc cao của chuỗi amino acid và khi ñó dưới tác ñộng của ñiện trường, các isozyme biến tính sẽ phân tách trên gel dựa trên khối lượng và ñộ tích ñiện Từ sự ña hình giữa các băng ñiện di thu ñược

sẽ giúp nhận diện từng cá thể và ñánh giá ñược sự ña dạng trong quần thể nghiên cứu (trích dẫn theo Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2010b) [13]

So với chỉ thị hình thái, chỉ thị hóa sinh ñáng tin cậy hơn bổi mỗi protein là sản phẩm của một gen, do ñó có sự ña hình các protein cũng phản ánh gián tiếp sự ña hình trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, ñối với các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi (ñặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen (protein, enzyme,.v.v.) không cho sự ña hình rõ ràng ðây là một nhược ñiểm của chị thị hóa sinh cùng với tính không ñộc lập với ñiều kiện môi trường, do quá trình biểu hiện gen thay ñổi ở các ñiều kiện sinh trưởng khác nhau) và số lượng chỉ thị ña hình không phong phú Bởi vậy trong hầu hết trong những nghiên cứu ña dạng di truyền ngày nay, chỉ thị ADN ñược sử dụng phổ biến hơn cả

1.4.3 Chỉ thị ADN

ðầu những năm 80 của thế kỳ 20, kỹ thuật RFLP ra ñời và ñược biến ñến là loại chỉ thị mới-chỉ thị ADN thế hệ ñầu tiên-với những ưu ñiểm vượt trội so với những chỉ thị hình thái và sinh hóa ñang ñược sử dụng trong ñánh giá ña dạng di truyền lúc ñó (Botstein, 1980) [26] Tuy nhiên mốc ñánh dấu quan trọng nhất của công nghệ chỉ thị phân tử nói riêng và sinh học nói chung

chính là phát minh phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chains

Reapeat-PCR) của Karl Mullis (1983) Với khả năng tạo ra vô số bản sao của một ñoạn

ADN chỉ từ một vài phân tử ADN ban ñầu, ñây là phát minh mang tính bước ngoặt, làm thay ñổi hoàn toàn cách thức tiếp cận-nghiên cứu sinh học và là cơ

sở nền tảng ra ñời cho thế hệ chỉ thị phân tử tiếp theo (trích dẫn theo Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2010b) [13]

PCR là phản ứng nhân gen in-vitro, dựa trên hoạt tính của loại enzyme

DNA polymerase chịu nhiệt Phản ứng PCR chuẩn có 03 giai ñoạn nhiệt ñộ ñược kiểm soát bởi máy gia nhiệt Thành phần phản ứng bao gồm:

1 ðệm phản ứng, thường chứa Tris-HCl, KCl và MgCl2;

2 Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt có khả năng gắn nucleotied vào ñầu 3’ của ñoạn mồi với ADN khuôn sợi ñơn;

3 04 loại dexyribonucleotide triphosphate (dNTP): dATP, dCTP, dGTP, dTTP;

4 02 ñoạn mồi oligonucleotide ñược thiết kế bổ sung ñặc hiệu với ñoạn ADN cần nhân lên;

5 ADN khuôn

Nguyên lý của phản ứng PCR ñược thể hiện ở hình 1.2:

Hình 1.2 Nguyên lý phản ứng PCR

Dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR, sử dụng các loại mồi oligonucleotide khác nhau (mồi ngẫu nhiên, mồi ñặc hiệu) nhằm nhân lên các vùng trình tự ADN, nhiều chỉ thị ADN ñã ñược phát triển và ứng dụng trong nghiên cứu ña dạng di truyền như RAPD (Williams và cs., 1990; Caetanos-Anolles và cs., 1991), SSR (Litt và Luty, 1989), AFLP (Zabeau và cs., 1993), SNP (Lai và cs., 1998),.v.v các chỉ thị này ñã ñược ứng dụng và mang lại những kết quả ñáng tin cậy, có giá trị không chỉ với nghiên cứu ña dạng di truyền mà còn với nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp khác Nghiên cứu tổng hợp của Joshi (1999) [53] và Weising (2005) [106] ñã

ñề ra những ñặc ñiểm và cũng là tiêu chuẩn cho các loại chỉ thị ADN như sau:

1 Có mức ñộ ña hình cao;

2 Di truyền ñồng trội (cho phép phân biệt cá thể ñồng hợp tử-dị hợp tử);

3 Phân ñịnh rõ ràng giữa các alen;

4 Tần suất xuất hiện trong hệ gen cao;

5 Phân bố ñều trên hệ gen;

6 Có trạng thái trung tính (không chịu tác ñộng ña gen);

7 Dễ dàng tiếp cận ñánh giá;

8 Có thể phân tích nhanh và dươn giản;

9 Kết quả có thể trao ñổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu;

10 Có khả năng tái lặp cao;

11 Có chi phí phát triển và thực hiện thấp

Cho ñến nay, có thể khẳng ñịnh rằng không một chỉ thị ADN nào có thể ñáp ứng ñược ñầy ñủ các tiêu chuẩn (có ñộ ña hình cao; di truyền ñồng trội; ñịnh rõ ràng các alen; tần suất xuất hiện trong hệ gen cao;.v.v.) theo nghiên cứu tổng hợp của Joshi (1999) [53] và Weising (2005) [106] Tuy nhiên, hoàn toàn có thể chọn lựa trong số những chỉ thị này một hay vài chỉ thị mang những ñặc ñiểm ñáp ứng ñược yêu cầu nghiên cứu với từng ñối tượng cụ thể

Các chỉ thị ADN có thể ñược phân chia theo nhiều tiêu chí khác nhau, dựa trên cơ sở kỹ thuật hay tính chất di truyền của chỉ thị (trội hay ñồng trội),.v.v Dựa trên cơ sở kỹ thuật, có thể phân chia các chỉ thị ADN thành các nhóm sau:

1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN;

2 Chỉ thị dựa trên phản ứng PCR;

3 Chỉ thị dựa trên trình tự ADN;

4 Chỉ thị microrray

Mặc dù hiện nay số lượng chỉ thị ADN rất phong phú với nhiều biến thể khác nhau nhưng nhìn chung chỉ có một số loại ñược sử dụng phổ biến trong nghiên cứu ña dạng di truyền

1.4.3.1 Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai ADN

Trong số các chỉ thị ADN, RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism-có nghĩa là ña hình ñộ các ñoạn cắt giới hạn), là chỉ thị thế hệ

ñầu tiên, ñược phát triển sớm nhất và ban ñầu ñược sử dụng trong nghiên cứu

di truyền ở người (Botstein, 1980) [26] Trong hệ gen vi sinh vật thường xảy

ra các quá trình làm thay ñổi trình tự ADN như các ñột biến ñiểm, ñột biến thêm-bớt ñoạn DNA (với số lượng từ vài chục ñến vài trăm cặp nucleotide) hay sự sắp xếp lại các ñoạn nhiễm sắc thể trong quá trình phân ly-tái tổ hợp Những biến ñổi này có làm tăng, giảm hoặc dịch chuyển các vị trí giới hạn (vị trí nhận biết các en zyme giới hạn) Khi sử dụng các enzyme giới hạn ñể cắt ADN hệ gen, những thay ñổi của vị trí nhận biết sẽ tạo ra các mảnh ADN có kích thước khác nhau (Henry và cs., 2006) [45]

Về nguyên lý, chỉ thị RFLP dựa trên sự phân cắt ADN hệ gen bằng các enzyme giới hạn và sản phẩm cắt giới hạn có thể ñược phát hiện bởi quá trình lai Southern với các mẫu dò ñánh dấu phóng xạ (ñoạn trình tự ADN ñẵ hiệu ñược thiết kế ñể có thể bắt cặp bổ sung và qua ñó phát hiện ñược trình từ ADN mục tiêu) sau khi ñiện di trên gel agarose (Somasundaram và Kalaiselvam, 2007) [96] RFLP là chỉ thị ñồng trội do có thể phát hiện ñược cacs alen khác nhau của một locus trong hệ gen nhân, hệ gen ti thể hay hệ gen lục lạp bằng

một mẫu dò ñặc hiệu Qua kết quả của phản ứng lai chúng ta có thể xác ñịnh ñược sự ña hình giữa các mẫu ADN khác nhau (Peer và Wachter, 1994) [83]

Lai axit nucleic gồm 2 kiểu, lai ADN (DNA hybridization) hay còn gọi

là lai Southern và lai ARN (RNA hybridization) hay còn gọi là lai Northern

Về nguyên tắc lai Northern cũng tương tự như lai Southern, chỉ khác là lai Northern ñược thực hiện giữa mẫu dò với ARN thông tin (mARN) và trong phép lai này không có bước xử lý enzyme giới hạn

ðể thực hiện một quy trình lai axit nucleic cần tiến hành rất nhiều khâu thao tác phức tạp, trên nhiều loại vật liệu khác nhau: tách chiết thu ADN khuôn, xử lý mẫu bằng enzyme giới hạn, ñiện di và chuyển ADN lên màng lai, chuẩn bị mẫu dò, cuối cùng thực hiện lai và phát hiện tín hiệu Do vậy, kỹ thuật này có giá thành cao, mất nhiều thời gian và công sức ðiều này làm cho việc ứng dụng nó ít nhiều bị giới hạn

Tuy có hạn chế nhưng RFLP vẫn ñược ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng phát hiện hiệu quả gen ñích dựa trên mẫu dò ðồng thời RFLP là chỉ thị ñồng trội, giúp phân biệt ñược cá thể ñồng hợp tử và dị hợp tử của quần thể F2 Chính vì thế kỹ thuật này ñược sử dụng trong lập bản ñồ gen, phân lập gen, xác ñịnh số bản sao của một gen, phân tích cấu trúc và chức năng gen, xác ñịnh nồng ñộ và kích thước mARN,.v.v, ñặc biệt nhất là nó thường ñược sử dụng trong các trường hợp cần kiểm chứng ñộ tin cậy của các chỉ thị khác (Lã Tuấn Nghĩa, 2005) [10]

RFLP là chỉ thị ñược dùng phổ biến trong lập bản ñồ di truyền Ở lúa việc sử dụng chỉ thị phân tử ñể lập bản ñồ di truyền ñã ñược tiến hành từ rất sớm Năm 1988, Couch và cs., ñã thiết lập bản ñồ liên kết gen ñầu tiên trên

cây lúa bằng chỉ thị phân tử RFLP, với 135 locus Bản ñồ ñã phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài tổng cộng là 1,389 cM trên hệ gen cây lúa từ cặp

lai IR34583 (Indica) và Bulu Dalam (Javanica)

ðối với bệnh ñạo ôn, từ những năm 1985 bản ñồ gen kháng ñạo ôn ñầu tiên ñã ñược thiết lập bởi Inbe và Matsumoto dựa trên các chỉ thị RFLP Tiếp theo là hàng loạt các bản ñồ gen kháng ñạo ôn mới ñã ñược xây dựng: Wang

và cs., (2001); Sallaud và cs., (2003),.v.v [104]; [91]

1.4.3.2 Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ñược Kary Mullis phát minh ra vào năm 1985 Bản chất của kỹ thuật PCR là sự tổng hợp nhân tạo ADN, tạo ra số lượng lớn các ñoạn ADN mới, với sự tham gia của các thành phần chính gồm: ADN khuôn, dNTP, mồi (primer), enzyme polymerase tổng hợp ADN (Taq), MgCl2 và ñệm PCR Kỹ thuật PCR hiện ñã ñược hoàn thiện tới mức tự ñộng hoá trên cơ sở tìm ra enzyme

tổng hợp ADN có khả năng chịu nhiệt cao từ vi khuẩn Thermus aquaticus

và việc chế tạo thành công máy chu kì nhiệt

Kỹ thuật PCR ñóng vai trò quan trọng trong việc nhân bản các ñoạn ADN ñích Do vậy, nó trở thành một khâu quan trọng trong nhiều kỹ thuật nghiên cứu phân tử mà ñặc biệt là trong các kỹ thuật về chỉ thị phân tử Số lượng chỉ thị phân tử phụ thuộc vào phản ứng PCR ngày càng nhiều

bổ sung với nó Phản ứng sau ñó xảy ra với sự tham gia của enzyme Taq, dNTP

và các thành phần khác

Về cơ bản chỉ thị RADP là một chỉ thị trội, do ñó chỉ thị này không phân biệt ñược giữa những cá thể ñồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2 Tuy nhiên ñây lại là một kỹ thuật ñơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém Do vậy, kỹ thuật này ñược ứng dụng rộng rãi trong việc lập bản ñồ di truyền, phân tích và xác ñịnh mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể, nhằm phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại Chúng cũng ñược sử dụng như những chỉ thị phân tử ñể xác ñịnh những gen kiểm soát hoặc có liên quan ñến một tính trạng nào ñó ở cây trồng, ví dụ như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virut ở cà chua Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này ñó là rất nhạy cảm với các yếu tố tham gia phản ứng, ñặc biệt là nhiệt ñộ gắn mồi ðể hạn chế nhược ñiểm này cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các ñiều kiện thí nghiệm và tiến hành các thí nghiệm một cách ñồng bộ (Lã Tuấn Nghĩa, 1999) [9]

1.4.3.2.2 Chỉ thị AFLP

AFLP (Amplification Fragment Length Polymorphism) nghĩa là ña hình

chiều dài các ñoạn ADN ñược nhân bản chọn lọc Kỹ thuật AFLP là sự kết hợp giữa sử dụng enzym giới hạn với khuếch ñại PCR và phát hiện ña hình

AFLP ñược phát minh bởi Zabeau và Vos (1993) (trích dẫn theo Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2010a) [12]

Về nguyên tắc của kỹ thuật: ñầu tiên ADN tổng số ñược cắt ñồng thời bởi hai loại enzym giới hạn thường là MseI (enzym nhận biết 6 nucleotide) và EcoRI (enzym nhận biết 4 nucleotide) Khi xử lý với enzyme giới hạn, ADN

bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau, mỗi mảnh ñều biết trước trình tự nucleotide ở hai ñầu cắt Tiếp ñó dựa vào trình tự ở ñầu cắt, thiết kế các ñoạn gắn (adapter) và gắn chúng vào mỗi ñầu Cuối cùng dựa vào trình tự adapter ñể thiết kế mồi PCR Mồi ñược thiết kế gồm hai phần: một phần có trình tự bổ sung với adapter và phần kia là những nucleotide ñược gắn thêm

vào tuỳ ý (thông thường từ 1 ñến 3 nucleotide) Với mồi thiết kế như vậy thì

chỉ có những ñoạn ADN có trình tự ở hai ñầu bổ sung với trình tự mồi mới ñược nhân lên

Hình 1.3 Nguyên lý của kỹ thuật AFLP