Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống và phát triển của trứng, phôi động vật ở nhiệt độ thấp

Tác ñộng của khử nước, chất bảo quản lạnh và nhiệt ñộ thấp lên sự sống của phôi cá tra.... Tác ñộng của khử nước, chất bảo quản lạnh và nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn.... Ảnh hư

bộ giáo dục và đào tạo

trường đại học nông nghiệp hà nội

-

NGUYỄN THỊ HỒNG

ẢNH HƯỞNG CỦA KHỬ NƯỚC LấN SỰ SỐNG

VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TRỨNG, PHễI ðỘNG VẬT

Ở NHIỆT ðỘ THẤP

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Hà nội - 2012

bộ giáo dục và đào tạo

trường đại học nông nghiệp hà nội

- NGUYỄN THỊ HỒNG

ẢNH HƯỞNG CỦA KHỬ NƯỚC LấN SỰ SỐNG

VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TRỨNG, PHễI ðỘNG VẬT

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện

và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác, các số liệu trong luận văn là trung thực và chính xác

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn ñầy ñủ, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 20

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Bùi Xuân Nguyên, người ñã tận tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện và hướng dẫn trực tiếp ñề tài luận văn của tôi cho tới khi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới PGS.TS Nguyễn

Bá Mùi, người ñã tận tình chỉ bảo và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các cô, chú, anh chị em thuộc phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới T.S Nguyễn Thị Ước, T.S Nguyễn Việt Linh, T.S Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thị Hiệp, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Thị Thơm, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Thị Mến ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hóa sinh và Sinh lý ñộng vật, tập thể cán bộ, giáo viên khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình ñã ñộng viên, ủng hộ, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn Thạc sỹ này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 20

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ

GV : (geminal vesicle): trứng ở giai ñoạn bóng mầm

MII : (metaphase II): trứng ở giai ñoạn trung kỳ II

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iv

MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC ðỒ THỊ x

PHẦN I MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục tiêu của ñề tài 2

1.3 Ý nghĩa của ñề tài 2

PHẦN II TỔNG QUAN 5

2.1 Khử nước - cơ chế chống chịu lạnh và bảo tồn sự sống 5

2.2 Khả năng khử nước của trứng, phôi ñộng vật thủy sản và ñộng vật có vú 11

2.2.1 Cơ chế tác ñộng của khử nước lên trứng, phôi ñộng vật thủy sản và ñộng vật có vú 11

2.2.2 Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật thủy sản 13

2.2.3 Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật có vú 15 2.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật có vú và thủy sản 18

2.3.1 Cơ chế tác ñộng của nhiệt ñộ thấp lên trứng, phôi ñộng vật thủy sản và ñộng vật có vú 18

2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng, phôi cá 19

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… v

2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn 21

2.4 Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật 22

2.4.1 Nguyên lý và phương pháp bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật 22

2.4.2 Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi cá 26

2.4.3 Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật có vú, lợn 29

PHẦN III ðỐI TƯỢNG - NỘI DUNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 ðối tượng, thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 33

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 33

3.1.2 Thời gian nghiên cứu 33

3.1.3 ðịa ñiểm nghiên cứu 33

3.2 Nội dung nghiên cứu 33

3.2.1 Tác ñộng của khử nước, chất bảo quản lạnh và nhiệt ñộ thấp lên sự sống của phôi cá tra 33

3.2.2 Tác ñộng của khử nước, chất bảo quản lạnh và nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn 34

3.3 Phương pháp nghiên cứu 35

3.3.1 Phôi cá tra 35

3.3.2 Trứng lợn 38

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 43

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Ảnh hưởng của khử nước, chất bảo quản lạnh và nhiệt ñộ thấp lên sự sống của phôi cá tra 45

4.1.1 Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của phôi cá tra ở nhiệt ñộ phòng 45

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vi

4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của phôi cá tra 47

4.1.3 Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của phôi cá tra ở nhiệt ñộ thấp 52 4.1.4 Ảnh hưởng của các chất bảo quản lạnh riêng lẻ ở nhiệt ñộ phòng và nhiệt ñộ thấp 59

4.1.5 Ảnh hưởng của khử nước kết hợp chất bảo quản lạnh ở nhiệt ñộ phòng và nhiệt ñộ thấp (0, - 20oC) 67

4.2 Ảnh hưởng của khử nước, chất bảo quản lạnh và nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn 72

4.2.1 Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng lợn ở nhiệt ñộ phòng72 4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn 77

4.2.3 Ảnh hưởng của khử nước ở nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn 78

4.2.4 Ảnh hưởng của các chất bảo quản lạnh riêng lẻ và kết hợp khử nước lên tỷ lệ trứng thành thục 81

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 87

5.1 Kết luận 87

5.2 ðề nghị 88

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Mối tương quan giữa khử nước và nhiệt ñộ cơ thể 5

Bảng 3.1 Phân loại trứng theo Leibried – Rutledge và cs (1987) trước khi ñem nuôi 40

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của sự khử nước lên sự phát triển của phôi cá tra ở nhiệt

ñộ phòng (n = 3) 45

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của phôi cá tra (n = 3) 47

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của sự khử nước lên sự phát triển của phôi cá tra ở nhiệt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… viii

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của sự khử nước ở nhiệt ñộ phònglên sự thành thục của trứng lợn (n = 3) 72

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên tỷ lệ trứng lợn thành thục 77

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của sự khử nước ở nhiệt ñộ 4oC lên sự thành thục của trứng lợn 78

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của các chất bảo quản lạnh riêng lẻ và kết hợp khử nước lên sự thành thục của trứng lợn 83

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… ix

Hình 2.3: Nguyên tắc ñông lạnh cực nhanh 25

Hình 4.1: Hình ảnh phôi cá tra khử nước và không khử nước ở nhiệt ñộ phòng 48

Hình 4.2: Hình ảnh phôi cá tra sống, chết và cá tra nở sống, nở chết 55

Hình 4.3: Hình ảnh trứng lợn ñối chứng, khử nước và trứng thành thục 76

Hình 4.4: Hình ảnh trứng lợn khử nước ở nhiệt ñộ thấp 83

Hình 4.5: Hình ảnh trứng lợn sau xử lý với các chất bảo quản lạnh ở nhiệt ñộ phòng, trứng sau MAT – II 86

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… x

DANH MỤC ðỒ THỊ

STT Tên các ñồ thị Trang

ðồ thị 4.1 Ảnh hưởng của khử nước ở nhiệt ñộ phòng lên tỷ lệ nở của phôi cá tra

50

ðồ thị 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên tỷ lệ nở của phôi cá tra 50

ðồ thị 4.3 Ảnh hưởng của khử nước ở 0oC lên tỷ lệ nở của phôi cá tra 58

ðồ thị 4.4 Ảnh hưởng của khử nước ở -20oC lên tỷ lệ nở của phôi cá tra 58

ðồ thị 4.5 Ảnh hưởng của các chất bảo quản lạnh riêng lẻ nồng ñộ 3M trong 15’ lên tỷ lệ nở sống bình thường của phôi cá tra 66

ðồ thị 4.6 Ảnh hưởng của chất bảo quản lạnh riêng lẻ và kết hợp khử nước lên tỷ lệ nở của phôi cá tra ở nhiệt ñộ phòng 67

ðồ thị 4.7 Ảnh hưởng của chất bảo quản lạnh riêng lẻ và kết hợp khử nước lên tỷ lệ nở của phôi cá tra ở nhiệt ñộ 0oC 71

ðồ thị 4.8 Ảnh hưởng của khử nước ở nhiệt ñộ phòng lên tỷ lệ trứng lợn thành thục 72

ðồ thị 4.9 Ảnh hưởng của khử nước ở nhiệt ñộ 4oC lên tỷ lệ trứng lợn thành thục 80

ðồ thị 4.10 Ảnh hưởng của các chất bảo quản lạnh riêng lẻ và kết hợp khử nước lên tỷ lệ trứng lợn thành thục 81

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

PHẦN I MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Nước ñóng vai trò quan trọng trong duy trì toàn bộ cấu trúc, chức năng của màng và các ñại phân tử hóa sinh Tuy nhiên, khử nước gần như toàn bộ hay sống ở trạng thái bào xác (Anhydrobiosis) giúp cho các loài ñộng vật bậc thấp (trùng bánh xe, loài ñi chậm, tôm biển, giun tròn) có thể tồn tại trong ñiều kiện sống khắc nghiệt của thiên nhiên khi nhiệt ñộ môi trường thấp hoặc cao hơn nhiều so với nhiệt ñộ cơ thể

Trong quá trình tiến hóa, cùng với sự thay ñổi môi trường sống và phương thức sống, khả năng khử nước ở ñộng vật cũng thay ñổi Các loài ñộng vật phát triển hơn, hình thành các cơ chế ñiều khiển nhiệt ñộ cơ thể phức tạp thay thế cho cơ chế nguyên thủy dựa trên khả năng khử nước (Nguyen, 1989) [80]

Nghiên cứu vai trò khử nước là một hướng nghiên cứu quan trọng trong bảo quản lạnh giao tử và phôi ñộng vật Khử nước trước khi làm lạnh giúp ngăn cản sự tạo thành tinh thể ñá, tác nhân gây phá vỡ tế bào trong quá trình ñông lạnh – giải ñông, tăng cường bảo vệ cấu trúc tế bào và phôi trong quá trình ñông lạnh Ngày nay, các phương pháp bảo quản lạnh trứng và phôi ở nhiệt ñộ thấp (-196oC) ñã ñược phát triển ở một số loài dựa trên kết quả nghiên cứu về kết hợp khử nước và xử lý với các chất chống ñông (Wittingham và cs,1972 [74]; Leibo, 1980 [29]; Mazur và Schneider, 1986 [37]; Nguyen và cs, 1983 [43]; Valdez và cs, 2005 [70]) Các công trình nghiên cứu này cho thấy trứng và phôi nhiều loài có khả năng chống chịu áp lực thẩm thấu và biến ñổi hệ số trao ñổi qua màng tế bào khi xử lý với dung

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 2

dịch ưu trương, và nhờ ựó có thể duy trì ựược sự sống khi bảo quản trong ni

Bảo quản lạnh trứng nhiều loài ựộng vật có vú ựã thành công nhưng bảo quản lạnh trứng lợn vẫn còn gặp nhiều khó khăn đặc trưng của trứng lợn chứa lượng lớn lipid trong tế bào chất và ựiều này là trở ngại chắnh làm hạn chế hiệu quả của bảo quản lạnh

Trong công trình này chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài: ỘẢnh hưởng của khử nước lên sự sống và phát triển của trứng, phôi ựộng vật ở nhiệt ựộ thấpỢ trên hai mô hình trứng lợn và phôi cá tra

1.2 Mục tiêu của ựề tài

đánh giá khả năng khử nước của phôi cá tra, trứng lợn ở nhiệt ựộ phòng và nhiệt ựộ thấp

Tìm hiểu quy luật ảnh hưởng tương hỗ giữa khử nước, chất chống ựông, nhiệt ựộ thấp lên sự sống của phôi cá tra và trứng lợn

Tìm hiểu và ựề xuất các tổ hợp khử nước kết hợp với các chất chống ựông phù hợp với việc bảo quản lạnh trứng lợn, phôi cá tra

1.3 Ý nghĩa của ựề tài

Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các thông tin về khả năng khử nước và tìm hiểu các quy luật ảnh hưởng của nó lên sự sống và phát triển của trứng, phôi ựộng vật giữa các loài có vị trắ khác nhau trong bậc thang tiến hóa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3

Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các thông tin có cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu bảo quản lạnh trứng lợn và phôi cá tra

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

PHẦN II TỔNG QUAN

2.1 Khử nước - cơ chế chống chịu lạnh và bảo tồn sự sống

Nước ñóng vai trò quan trọng trong duy trì toàn bộ cấu trúc, chức năng của màng và các ñại phân tử hóa sinh Tuy nhiên, trong tự nhiên sự sống thiếu nước ñã ñược Anthony von Leeuwenhoek khám phá ra vào năm 1702 trên một loài của bdelloid rotifer, Philodina roseola, có thể chống chịu vài tháng trong trạng thái sấy khô Sau ñó, giáp xác, một vài rotifer sống ở ñất, tardigrade, nematodes, hạt giống cây trồng cũng ñược chỉ ra có khả năng sống

ở trạng thái “anhydrobiosis” ñặc trưng cho hiện tượng khử nước gần như toàn

bộ, hay là sống ở trạng thái bào xác (sống thiếu nước) (Crowe J.H và Crowe L.M, 1982) [9]

Khả năng khử nước có tương quan với nhiệt ñộ cơ thể của các loài Dựa vào bảng 2.1 cho ta có thể nhận thấy trong quá trình tiến hóa, khả năng khử nước giảm dần theo sự giảm của thang dao ñộng nhiệt ñộ cơ thể có thể thích nghi

Bảng 2.1 Mối tương quan giữa khử nước và nhiệt ñộ cơ thể

Bào tử vi khuẩn

100

Tardigrdes_loài ñi chậm

Insect: ấu trùng loài chân ñốt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 6

(Trích theo Nguyen, 1989 [80])

ðể duy trì ñược sự sống dưới ñiều kiện nhiệt ñộ thấp, các cơ thể sống

có hai chiến lược ñề kháng lạnh: một là tránh ñông lạnh, hai là thích nghi ñông lạnh

Những ñộng vật chọn chiến lược tránh ñông lạnh phải giải quyết sự ñe dọa của ñông lạnh gây chết dưới ñiểm ñông lạnh của dịch cơ thể Sự ngăn cản ñông lạnh ñược thực hiện bởi hai cơ chế: ngăn cản sự hình thành tinh thể nước

có kích thước lớn gây sự phá vỡ cấu trúc tế bào và giảm sự phụ thuộc vào ñiểm ñông lạnh Sự thích nghi với chiến lược tránh ñông lạnh bao gồm: 1) sự loại trừ khả năng hình thành tinh thể nước; 2) tổng hợp protein trễ nhiệt ñặc biệt (chống ñông lạnh) và bổ sung vào dịch cơ thể ñể ngăn cản sự phát triển của tinh thể nước; 3) tổng hợp tích lũy những chất bảo quản lạnh có khối lượng phân tử thấp với nồng ñộ cao [mức glycerol biến ñổi từ 15% lên 25% trọng lượng là hiếm thấy] ñể ñưa ra ñiểm ñông lạnh phụ thuộc và giảm ñiểm làm chậm ñông và 4) khử nước ñể giảm thành phần của nước có thể bị ñông lạnh và tăng hiệu quả của nồng ñộ chất bảo quản lạnh (Kenneth B.S và Janet M.S, 1988) [27]

Những cơ thể sống tránh ñông lạnh có hai cơ chế chính là tổng hợp peptide chống ñông (Antifreeze peptides, AFP) và hạ ñiểm ñóng băng

Ở cơ chế thứ nhất, sự mô tả ñầu tiên của vật liệu protein có thể khống chế

sự làm lạnh quá mức trong dịch mô vào năm 1964 Từ ñó, những peptide và glycopeptide ñã ñược biệt lập từ nhiều loài cá (loài cá ở Nam Cực) và côn trùng (sống qua mùa ñông) Sự có hiệu lực của những AFP trong làm giảm ñiểm ñông lạnh của nước (và dịch cơ thể) là thật sự ñáng chú ý Ảnh hưởng của AFP liên quan tới một sự ngăn cản của ñá cấu tạo nhân trong dịch cơ thể làm lạnh quá mức Những AFP cũng có một tác ñộng ñáng kể lên hình thái tinh thể ñá hình thành trong những dung dịch chứa chúng Mặc dù nghiên cứu nhiều về phương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7

thức hoạt ñộng của AFP cá, tất cả ñều chỉ ra chúng có thể giảm một nhiệt ñộ làm lạnh quá mức lên tới 1,5oC trong những dung dịch có nước loãng

Cơ chế thứ hai, hạ ñiểm ñông lạnh, ñược quan sát bởi những côn trùng sống qua mùa ñông Cơ chế này dựa trên nhiệt tan chảy, phản ánh sự có mặt của các chất tan trong nước huyết tương Huyết tương của loài bọ cánh cứng

Uloma impressa phải chứa nồng ñộ ñáng kể của chất tan, tích lũy trong suốt

thời gian hóa cứng và ñược chuyển hóa trong khi hồi phục hóa cứng; lượng của chúng cho ñiểm tan chảy của -9,9oC Glycerol ñã ñược xác ñịnh như một chất làm giảm nhiệt tan chảy chung, và nồng ñộ ảnh hưởng có thể giải thích

sự giảm nhiệt ñược quan sát

Hiện tượng tránh ñông lạnh ở những ñộng vật sống trong ñiều kiện khí hậu tự nhiên ñược cho là chỉ ñông lạnh nước ngoại bào Quá trình thích nghi làm tăng sức chống chịu nhiều vì nước không ñông lạnh trong tế bào chất Những yêu cầu cho sự thành công của thích nghi ñông lạnh tự nhiên bao gồm: 1/ tinh thể ñá phải ñược giữ với các thành phần ngoại bào, tổn thương từ tinh thể ñá phải ñược giảm tới mức tối thiểu; 2/ tốc ñộ ñông lạnh phải chậm và ñược khống chế ñể hạn chế biến ñổi áp lực thẩm thấu lên tế bào, tạo thời gian cho sự phân phối lại ion và những trao ñổi chất tan khác giữa khoảng trong và ngoài tế bào, và cho phép khống chế ñộ co của màng tế bào; 3/ sự giảm thể tích tế bào

và khử nước không vượt quá giới hạn tổn thương phải ñược ngăn ngừa; 4/ tế bào phải sống và duy trì cân bằng nội mô trong tình trạng thiếu máu cục bộ một thời gian dài bởi sự hình thành ñá bao quanh bên ngoài tế bào

Một số thích nghi ñông lạnh thành công ñã ñược xác ñịnh: 1/ sử dụng những protein cấu tạo nhân tinh thể ñặc biệt ñể giảm và khống chế sự hình thành tinh thể ñá và vai trò có thể của protein trễ nhiệt trong ngăn cản sự kết tinh lại; 2/ sự thích nghi cho ñiều chỉnh thể tích tế bào và cho sự ñảm bảo cho

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8

các thành phần trong tế bào chống lại tác ñộng của nồng ñộ ñông lạnh; 3/ sự thay ñổi trao ñổi chất tế bào ñể giữ sự sống ở nhiệt ñộ âm và/ hoặc trạng thái ñông lạnh như là sự giảm trao ñổi chất, một khả năng tốt cho ñời sống kỵ khí,

và thay ñổi trong thành phần cấu tạo màng tế bào và loại enzyme cho phép duy trì chức năng ở nhiệt ñộ thấp

Chiến lược thích nghi ñông lạnh của các cơ thể sống dựa trên thích nghi với ñông lạnh ngoại bào và khử nước ñông lạnh Sự thích nghi lạnh nhờ vào sự tổng hợp các chất hạ ñiểm ñông lạnh Những chất ñược bắt gặp thường xuyên

là ñường và rượu thu từ tinh bột Những chất chuyển hóa amino acid và những trung gian khác nhau cũng liên quan tới sự thúc ñẩy sự thích nghi lạnh Tăng nồng ñộ của những chất tan có khối lượng phân tử thấp không chỉ hạ ñiểm ñông lạnh của dịch mô mà còn giảm lượng nước tổng số có thể ñông lạnh Những thay ñổi theo mùa trong chất tan và sự trao ñổi chất của ấu trùng

ruồi thích nghi lạnh Eurosta solidaginis ñã ñược ghi nhận ðiểm ñặc biệt

ñáng chú ý nhất là sự tăng mức sorbitol và glucose (gấp hai lần ñộ lớn), mặc

dù một vài chất chuyển hóa glycogen khác và amino acid cũng chỉ ra sự tăng nồng ñộ ñáng kể Trong trạng thái cứng, ấu trùng có thể sống ở nhiệt ñộ hạ thấp xuống -40oC, mặc dù sự ñông lạnh ngoại bào ñược quan sát ở -8oC Những côn trùng khác chỉ ra mối tương quan tương tự giữa tích lũy polyhydroxy và nhiệt ñộ ñông lạnh

Sự sản xuất glycerol bắt ñầu trong suốt tháng 8 và 9, thời gian dài trước khi côn trùng trải qua phơi bày trong lạnh ñầu tiên Mức glycerol ñạt tới giá trị bình ổn 650mM trong huyết tương trước khi tổng hợp sorbitol bắt ñầu Glucose và sorbitol chỉ ñược sản xuất sau khi phơi bày vào lạnh lần ñầu tiên

và chúng ñạt mức của chúng giữa mùa ñông khi nhiệt ñộ ñạt tới ñiểm cấu tạo nhân ngoại bào (-8oC)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9

Glycerol ñã ñược sản xuất trong giai ñoạn sớm của mùa thu, không thể

bị chuyển hóa và duy trì trong huyết tương qua mùa ñông, có lẽ vì sự có mặt của enzyme glycerol kinase Ngược lại, sorbitol là một chất bảo quản có thể biến ñổi: trong suốt thời kì ấm ngắn ngủi, nó ñược biến ñổi lại thành glycogen

Sự thích nghi với tinh thể ñá trong khoảng dịch ngoại bào tạo thành một phần của chiến lược sống qua mùa ñông của những loài ñộng vật từ những nhóm phát sinh loài khác nhau Gồm có nhiều loài của côn trùng sống trên cạn, một vài loài hai mảnh, chân bụng, giun ñốt, giun tròn sống ở vùng

bờ biển nơi thủy triều lên xuống, một vài loài ếch ngủ ñông trên cạn

Sự thích nghi lạnh xuất hiện ở 3 nhóm chính: ñộng vật không xương sống ở biển, côn trùng và ếch

ðộng vật không xương sống ở biển:

Trong suốt mùa ñông, sự sống ở vùng bờ biển nơi thủy triều lên xuống

có thể ñưa vào nhiệt ñộ âm trong không khí 2 lần/ ngày tác ñộng lên những ñộng vật không xương sống cư trú

Sự chống chịu lạnh ở ñộng vật không xương sống ở biển phải cung cấp những nhân tố của sự sống và sinh lý trong môi trường tại ñó, chẳng hạn tính thích nghi lạnh là một chiến lược logic ðộng vật không xương sống ở biển là những loài thích nghi thẩm thấu (osmocomformer), cho nên cả việc khử nước lẫn việc tích lũy ở nồng ñộ cao các chất chống ñông có khối lượng phân tử thấp ñều không giúp gì trong việc nâng cao khả năng thích ứng với ñông lạnh hoặc ñề kháng với những tác ñộng của ñông lạnh Tuy nhiên, tế bào ñược thích ứng tốt với cách cư xử với stress thấm lọc và có những cơ chế ñiều chỉnh thể tích tế bào cái mà có thể ñặt sử dụng hiệu quả trong giải quyết với nồng ñộ ñông lạnh

Côn trùng:

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 10

Nhiều cơn trùng sống trên cạn đề kháng lạnh, thí dụ về tính thích nghi lạnh cĩ thể tìm thấy ở tất cả các giai đoạn sống

Tính thích nghi lạnh cĩ phát triển cao nhất ở Insecta Sự sống đơng lạnh từ -25oC đến -30oC là phổ biến, một số lồi ở Bắc Cực cĩ mức nhiệt độ gây chết thấp hơn từ -55oC hay thậm chí -70oC Xử lý trước với đơng lạnh ở -

30oC cĩ thể cho phép một số lồi sống khi nhúng vào nitơ lỏng

Những cacbohydrate khối lượng phân tử thấp được tích lũy như là chất bảo quản lạnh trong hầu hết chứ khơng phải tất cả các lồi cơn trùng Glycerol

là phổ biến nhất, sorbitol xuất hiện thường xuyên, và ribitol, threitol, erythritol, trehalose và sucrose cũng được xác định Cơn trùng thích nghi đơng lạnh thường xuyên sử dụng một cặp hoặc một hệ thống nhiều chất bảo quản lạnh, glycerol và sorbitol đang là sự kết hợp phổ biến nhất

Ở những cơn trùng tránh đơng lạnh, khử nước tăng sức chịu đựng lạnh bằng tăng nồng độ chất bảo quản lạnh, cái mà hạ thấp điểm làm chậm đơng (supercooling point, SCP) của chúng Nồng độ chất tan thay đổi tỷ lệ nghịch với thành phần nước (64), và hạ thấp điểm SCP gây bởi khử nước cĩ thể được

dự đốn từ sự giảm SCP thẩm thấu của cơn trùng ðể giảm chắc chắn trong thành phần nước, tăng nồng độ osmol và hạ SCP là hay nhất ở cơn trùng với nồng độ chất tan cao (Karl Erik Zachariassen, 1985 [26])

Ở những cơn trùng thích nghi đơng lạnh, khử nước khơng cần thiết cung cấp một sự tăng chất bảo quản lạnh Khử nước làm nồng độ của chất bảo quản tăng, nhưng nồng độ ion nội bào và những chất tan protein cĩ hại tăng lên cân xứng Tuy nhiên nếu nồng độ chất tan gây tổn thương được điều chỉnh

ở mức độ thấp trong suốt quá trình khử nước, kết quả là một hiệu quả đơng lạnh Ở những cơn trùng thích nghi đơng lạnh, cơ chế này cĩ lẽ khơng quan trọng, bởi vì chúng dường như khơng làm giảm số lượng rõ rệt nước trong suốt sự thích nghi lạnh (Karl Erik Zachariassen, 1985 [26])

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

Ếch:

Bốn loài ếch Bắc Mỹ ngủ ñông trên ñất thích nghi với ñông lạnh ngoại bào Sự giới hạn sự sống ñông lạnh của những loài ếch sống trên cạn là khá hẹp nhưng ñủ cho sự sống của những loài ñược chọn trong vùng ngủ ñông ñược bảo vệ

Khử nước là một phản ứng thích nghi giúp các loài ñộng vật bậc thấp

có thể tồn tại trong ñiều kiện sống khắc nghiệt khi nhiệt ñộ môi trường thấp hoặc cao hơn nhiều so với nhiệt ñộ cơ thể Trong quá trình tiến hóa, khả năng khử nước của các loài ñộng vật giảm dần theo chiều tiến hóa Các loài ñộng vật bậc cao có những hình thành những cơ chế khác ñể ñiều tiết cơ thể chống lại nhiệt ñộ thấp

Các loài ñộng vật thủy sinh, chẳng hạn cá, hình thành những peptide chống ñông (AFP) ñể ngăn cản dịch cơ thể ñóng băng trong ñiều kiện nhiệt ñộ của môi trường thấp Tuy nhiên, ñộng vật có vú không có khả năng này, thay

vào ñó là một loạt cơ chế phức tạp ñiều khiển nhiệt ñộ cơ thể

2.2 Khả năng khử nước của trứng, phôi ñộng vật thủy sản và ñộng vật có vú

2.2.1 Cơ chế tác ñộng của khử nước lên trứng, phôi ñộng vật thủy sản và ñộng vật có vú

Những nghiên cứu (Oda và cs, 1992 [45]; Agca và cs, 2000 [1]) ñã chỉ

ra rằng sock áp lực gây chết tế bào và cần ñược xem xét khi chuẩn bị một chuẩn ñông lạnh Sock áp lực xuất hiện khi một tế bào nhanh chóng ñược chuyển từ dung dịch ưu trương sang dung dịch ñẳng trương Tế bào sẽ phình

ra khi nước vào nhanh chóng và ñiều này có thể gây tan tế bào Phản ứng sinh

lý của tế bào với dung dịch không ñẳng trương là trải qua biển ñổi thể tích Trong suốt quá trình ñông lạnh, sự thay ñổi thể tích xuất hiện trong khi nhúng vào chác chất bảo quản lạnh khi ñông lạnh, giải ñông và quá trình di chuyển

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 12

của chất bảo quản lạnh Nếu những thây ựổi ựó lớn và ựột ngột, màng tế bào

bị tổn thương gây chết tế bào

Khử nước có thể gây ảnh hưởng có hại cho tế bào bởi làm biến ựổi cấu trúc bộ khung tế bào và ựổi chỗ nhiễm sắc thể Ảnh hưởng này ựược cho là mạnh hơn với trứng ở metaphase II (MII) bởi vì sự có mặt của thoi vô sắc Nếu thoi vô sắc bị phá vỡ, sự thụ tinh thông thường không xuất hiện bởi vì nhiễm sắc thể bị phân tán điều này xảy ra trong sự di phân tách trong suốt quá trình hợp giao tử và phôi hầu hết thường là thể bội không chỉnh Trong trường hợp chất bảo quản lạnh (CPAs), khử nước mạnh có thể phá vỡ sợi actin và sự sắp ựặt vi cấu trúc hình ống của thoi vô sắc Bên cạnh sự phá vỡ

bộ khung tế bào, màng tế bào cũng có thể bị ảnh hưởng bởi khử nước mạnh

đó là giảm khả năng của màng tế bào vì thế khi tế bào trở lại ựiều kiện ựẳng trương, tế bào không còn mở rộng tới thể tắch thông thường của nó và sự tan

tế bào xuất hiện Giảm ựiều này của màng tế bào ựược cho là kết quả từ sự hợp nhất của màng trong tế bào thực vật Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sự sống của trứng trong suốt quá trình khử nước của bảo quản sử dụng chất bảo quản lạnh (Allison E.Moisan, 2006 [2])

Nghiên cứu của Mullen SF và cs (2007) [40] trên trứng lợn nuôi thành thục in vitro cũng chỉ ra khử nước và xử lý với dung dịch nhược trương có nồng ựộ chênh lệch cao với dung dịch ựẳng trương làm tăng tỷ lệ trứng có thoi vô sắc bất thường để xác ựịnh ảnh hưởng của biến ựổi áp lực lên hình dạng thoi vô sắc MII, từng trứng ựược xử lý trong các dung dịch có osmotic khác nhau (35, 75, 150, 225, 290, 700, 1100, 1500,1900, 2300, 2700, và 3150 mOsm) trong 10Ỗ/ 38oC ựể tránh ảnh hưởng của nhiệt ựộ lên thoi vô sắc Sau

ựó, trứng ựược ựưa lại vào dung dịch ựẳng trương khoảng 10Ỗ ựể cho phép thu ựược thể tắch thông thường, sau ựó ựưa vào môi trường nuôi Kết quả chỉ ra

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

khi nồng ñộ của dung dịch càng chênh lệch với dung dịch ñẳng trương thì làm tăng tỷ lệ trứng có thoi vô sắc MII bất thường Hầu hết trứng có thể duy trì cấu trúc thoi vô sắc bình thường khi nhúng vào dung dịch có nồng ñộ từ 150 –

1900 mOsm Kết quả chỉ ra rằng tỷ lệ cao (gần 80%) trứng có thể duy trì cấu trúc thoi vô sắc thông thường sau khi nhúng vào các dung dịch có nồng ñộ

150 – 1100 mOsm

2.2.2 Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật thủy sản

Shinsuke Seki và cs (2011) [63] ñã nghiên cứu khả năng ñông lạnh trứng cá ngựa vằn giai ñoạn III (zebrafish) ñánh giá bởi khả năng thụ tinh và khả năng nở Khi trứng ñược nhúng vào dung dịch nhược trương 60’ ở 25oC,

tỷ lệ thành thục, thụ tinh và nở giảm trong dung dịch có nồng ñộ 0,16Osm/kg hoặc thấp hơn Khi trứng cá ñược nhúng vào dung dịch ưu trương (chứa sucrose) ở 25oC trong 30’, tỷ lệ thành thục giảm ở dung dịch có nồng ñộ osmol là 0,51Osm/kg, nhưng tỷ lệ nở giảm ở dung dịch có nồng ñộ osmol thấp hơn 0,40Osm/kg

Khử nước làm giảm sự phát triển của trứng cá khi xử lý với dung dịch không ñẳng trương Tuy nhiên, tính nhạy cảm của trứng và phôi ñộng vật thủy sản với xử lý khử nước phụ thuộc loài và giai ñoạn phát triển

Trái lại, một xu hướng kích thích sự phát triển của phôi cá dưới ñiều kiện khử nước ñã ñược chỉ ra bởi nghiên cứu của Tingaud-Sequeira A và cs

(2009) [67] Nghiên cứu này tiến hành trên phôi của cá biển Fundulus

heteroclitus, ñược thích ứng với sống ngoài không khí Các tác giả này ñã

nghiên cứu liệu phôi của chúng có khả năng ñiều khiển sự phát triển dưới ñiều kiện khử nước Nghiên cứu ñã chỉ ra rằng phôi blastula ñược ñể trong không khí dưới ñộ ẩm bão hòa có khả năng kích thích sự phát triển, và do ñó

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 14

thời gian nở ñược thúc ñẩy với khía cạnh phôi tiếp tục ñược ngâm trong nước biển Phôi ñể trong không khí ở những giai ñoạn phát triển sau không nở cho tới khi ñược thêm nước, trong khi sự phát triển không ngừng lại Phôi ñể trong không khí tránh ñược khử nước có thể bởi vì ñộ dài của vỏ trứng, mặc

dù nó trải qua sự bay hơi mất nước

Số lượng lớn cá kilifish Austrofunduluslimnaeus chống chịu sống trong

môi trường ao hồ ở sa mạc gần biển và vùng ñảo savanna của Venezuela Sự sống trong ñiều kiện khô không thực hiện ñược bởi dạng trưởng thành hay gần trưởng thành nhưng thực hiện ñược bởi phôi ñang ở kì nghỉ hoạt ñộng có lẽ bởi khả năng chống chịu sự khô hạn Jason E Podrabsky và cs (2001) [20] ñã nghiên cứu sự sống của phôi cá với stress khử nước: sự tránh khử nước và vỏ

bọc sợi tinh bột của trứng Phôi giai ñoạn nghỉ của Austrofunduluslimnaeus sống

trong ñiều kiện khô bởi giảm mất nước bay hơi Trên 40% phôi giai ñoạn nghỉ II sống 113 ngày trong ñiều kiện ñộ ẩm 75,5% Một sự mất nước sớm từ khoảng trống perivitelline xuất hiện trong suốt ngày 1 – 2, nhưng sau ñó, tỷ lệ mất nước giảm gần bằng không Không có sự khử nước trong mô phôi ñược chỉ ra dựa trên sự quan sát trên kính hiển vi và sự giữ lượng nước lớn trong phôi ñược ñánh giá bởi phép ño nhiệt lượng khác biệt Sự chống chịu cao với sự khô hạn không có tiền lệ với các loài có xương sống trong nước Quang phổ học hồng ngoại chỉ ra phân tử bên trong thường xuyên kết nối thông qua β-sheet (14%)trong bao trứng (màng ñệm) ñã hydrat hóa Những β-sheet kết nối tăng tới 36% trên sự khử nước của bao trứng Thú vị, bao trứng ñược cấu thành bởi sợi protein với ñặc trưng của sợi dạng tinh bột luôn luôn liên quan với các bệnh của người Những ñiểm ñặc biệt ñó bao gồm tỷ lệ cao của β-sheet nội phân tử, sự bắt màu dương tính và lưỡng chiết quang xanh lá cây với ñỏ Congo, và sự tìm ra những sợi với ñường kính 4 – 6 nm Sự chống

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 15

chịu cao của phôi giai ựoạn nghỉ II với stress nước là không liên quan tới thay ựổi cá thể trong bao noãn

Carlos A Martắnez-Palacios và cs (2004) [7] tìm hiểu ảnh hưởng của môi

trường muối lên sự sống và phát triển của trứng và ấu trùng cá Chiristoma estor

estor Jordan 1880 Những cụm gồm 100 trứng ựược tách ra và ựặt vào bể có

thông khắ chứa 2L nước lọc với các nồng ựộ muối khác nhau là 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 % ở 25oC Trong 24h ựầu tiên, mỗi cụm ựược ựánh ựược kiểm tra lại ựể chắc chắn tất cả trứng ựã ựược thụ tinh.Trứng chết hoặc không thụ tinh ựược loại

bỏ và thay thế với những trứng sống ựược xử lý trong cùng nồng ựộ muối Bể của 100 trứng ựã thụ tinh ựược giữ trong nước 24h và sau ựó lặp 3 lần Sự phát triển của trứng cao trong nước mới, cao nhất ở nồng ựộ 1% và giảm rõ rệt ở những nồng ựộ muối cao hơn Sự nở thành công tăng nhiều bởi nuôi ở các nồng

ựộ muối vừa phải nhưng nở cho phép trong nước mới

Nhìn chung, xử lý khử nước gây hại cho sự phát triển của trứng, phôi ựộng vật thủy sản Tuy nhiên, với nồng ựộ và thời gian xử lý phù hợp, khử nước giúp kắch thắch sự phát triển

2.2.3 Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng, phôi ựộng vật có vú

đã có những nghiên cứu ựã kiểm tra cơ chế thẩm thấu của trứng và phôi ựộng vật có vú Tới nay, hầu hết các báo cáo ựã làm trên chuột (Leibo,

1980 [29]; Toner và cs, 1991 [68]; Oda và cs, 1992 [45]; Pedro và cs, 1997 [46]) hoặc bò (Ruffing và cs, 1993 [58]; Agca và cs, 2000 [1]) Trong những nghiên cứu ựó, ảnh hưởng của biến ựổi áp lực (osmotic stress) lên sự thụ tinh

và sự phát triển phôi ựược kiểm tra trên trứng chưa thành thục và thành thục (Allison E.Moisan, 2006 [2])

Arav và cs (1993) [3] ựã tiến hành thắ nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của biến ựổi áp lực và ựộc tắnh (cytotoxic) của các nồng ựộ chất bảo quản

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 16

không thấm (sucrose và trehalose) khác nhau (0; 0,25; 0,5 và 1M) lên sự phát triển của trứng bò Trứng bò ñược khử nước trong dung dịch PBS chứa các nồng ñộ ñường trên trong 10’ ở 22oC, sau ñó phức hợp trứng – cumulus ñược nuôi thành thục và thụ tinh in vitro Kết quả cho thấy tỷ lệ thụ tinh thông thường sau khi nhúng vào dung dịch 0,25 và 0,5M sucrose có sự khác biệt rõ rệt (P < 0,01) so với nồng ñộ tương tự của trehalose (54 và 44% so với 70 và 62%) Sự khác biệt rõ hơn khi nhúng vào dung dịch sucrose 1M và trehalose 1M, chỉ có 32% trứng thụ tinh bình thường với sucrose trong khi 63% trứng thụ tinh bình thường với trehalose ðiều này cho thấy nhúng trứng bò vào dung dịch trehalose kém gây hại hơn nhúng vào dung dịch sucrose

Agca Y và cs (2000) [1] ñánh giá ảnh hưởng của biến ñổi áp lực lên sự phát triển của phức hợp trứng – cumulus bò giai ñoạn gesminal vesicle (GV)

và metaphase II (MII) bằng cách nhúng vào các dung dịch muối natri clorid (NaCl) không ñẳng trương (75, 150, 600, 1200, 2400, 4800 mOsm/kg) trong 10’ sau ñó ñưa trở lại dung dịch ñẳng trương và tiến hành nuôi Kết quả chỉ ra ảnh hưởng rõ rệt tới sự thành thục phát triển của cả trứng ở 2 giai ñoạn phát triển trên Trứng ở giai ñoạn GV nhạy cảm với biến ñổi áp lực hơn trứng ở giai ñoạn MII (P < 0,05) Không có trứng bò ở GV phát triển ñến blastocyst khi nhúng vào hai dung dịch muối ưu trương 2400 và 4800 mOsm/kg Trong khi ñó, trứng ở giai ñoạn này có khả năng phát triển tới blastocyst khi nhúng vào dung dịch muối nhược trương 75 và 150 mOsm/kg, tuy nhiên tỷ lệ thấp hơn so với ñối chứng (9 và 13% so với ñối chứng là 25%) Trứng ở giai ñoạn MII giảm sự phát triển rõ rệt tới blastocyst khi nhúng vào dung dịch muối

4800 mOsm/kg, chỉ có 4% Ở những nồng ñộ muối còn lại thì tỷ lệ phát triển tới blastocyst không khác nhau rõ rệt (13 – 20%), nhưng thấp hơn so với ñối chứng (29%) Nhúng trứng ở giai ñoạn GV vào các dung dịch không ñẳng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17

trương làm tăng tỷ lệ thụ tinh ña tinh trùng (P < 0,05) trong khi trứng ở MII không bị ảnh hưởng rõ rệt

Jing Huang và cs (2008) [21] nghiên cứu kiểm tra ảnh hưởng của ñường ñơn (glucose), ñường ñôi (sucrose) và polysaccharide (Ficoll và

Lycium barbarum polysaccharide, LBP) ở những nồng ñộ khác nhau, sử dụng

ethylene glycol (EG) như chất bảo quản lạnh thấm qua màng, lên sự thành thục in vitro của trứng lợn chưa thành thục (GV) ñông lạnh – giải ñông Tổng

số 1145 trứng ñược thu bằng hút nang từ 496 buồng trứng lợn thu từ lò mổ sử dụng phương pháp ñông lạnh 5 bước Sau khi giải ñông và loại bỏ chất bảo quản lạnh, trứng ñược nuôi 44h ở 39oC, ñộ ẩm bão hòa và 5% CO2 Trứng ñược nhuộm DAPI và sự thành thục nhân ñược kiểm tra Tỷ lệ thành thục cao nhất thu ñược trong 1,5M glucose (8,62%), 0,75M sucrose (20%) và 3,0 g/ml Ficoll (13,79%) và 0,1 g/ml FBP (20,69%) Tỷ lệ thành thục sử dụng 0,75M sucrose hoặc 0,1 g/ml FBP cao hơn có ý nghĩa so với sử dụng 1,5M glucose, nhưng không có sự khác biệt rõ rệt sử dụng 3,0 g/ml Ficoll Phần trăm trứng ñạt tới Metaphase II trong nhóm bảo quản lạnh thấp hơn rõ rệt so với ñối chứng kết quả chỉ ra rằng LBP là một chất bảo quản lạnh không thấm hiệu quả và 0,75M sucrose hay 0,1 g/ml LBP có thể sử dụng trong dung dịch ñông lạnh nhanh cho trứng lợn chưa thành thục

Nghiên cứu của Mullen SF và cs (2007) [40] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của biến ñổi áp lực lên khả năng phát triển của trứn lợn nuôi thành thục in vitro

ðể xác ñịnh ảnh hưởng của xử lý biến ñổi áp lực lên khả năng phát triển in vitro, trứng ñược lấy ngẫu nhiên cho vào các dung dịch xử lý với nồng ñộ tương ứng (75, 150, 225, 290, 460, 650, 880, 1410 và 2080 mOsm) trong 10’ Trứng sau ñó ñược ñưa trở lại dung dịch ñẳng trương trong 10’ sau ñó ñưa vào môi trường nuôi Nhúng vào dung dịch không ñẳng trương cũng ảnh hưởng tới khả năng phát triển cảu trứng Trung bình, 21% trứng có thể phát triển tới blastocyst khi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 18

nuôi trứng in vitro mà không nhúng vào dung dịch không ñẳng trương, xử lý trứng với dung dịch nhược trương hoặc ưu trương có thể làm một nửa trứng mất khả năng phát triển tới blastocyst Tuy nhiên, khi mức stress nhược trương tăng,

tỷ lệ trứng mất khả năng phát triển tới blastocyst không có sự khác nhau rõ rệt Khi xử lý với dung dịch ưu trương kết quả giảm khả năng phát triển trung bình phụ thuộc nồng ñộ, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

2.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật có

tế bào da (Sherman, 1962 [61]) hay phôi (Willadsen và cs, 1976 [72]; Whittingham và cs,1979 [74]; Rall và cs, 1980 [50]), những tế bào chịu ñựng

sự có mặt của một ít tinh thể ñá trong tế bào tốt, nước phải ñược loại ra, phần tối thiểu, ñể ngăn cản sự hình thành tinh thể ñá quá giới hạn trong suốt quá trình làm lạnh và làm ấm

Trong quá trình làm lạnh, các tinh thể ñá hình thành bên trong tế bào Những tinh thể này sẽ phá vỡ màng tế bào và gây tổn thương nội bào trong quá trình giải ñông

Ngoài tác ñộng tạo tinh thể nước phá vỡ cấu trúc màng tế bào, nhiệt ñộ thấp có thể ảnh hưởng phá hoại tế bào và phôi do tác ñộng gây shock nhiệt Trong quá trình ñông lạnh nhanh và cực nhanh, nhiệt ñộ có thể giảm với tốc

ñộ vài trăm tới vài ngàn ñộ/ phút Màng tế bào có cấu trúc dễ nhảy cảm với

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

các thay ñổi nhanh thang nhiệt ñộ và dễ bị phá hủy ngay cả khi các tinh thể nước chưa hình thành

2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng, phôi cá

Nhiệt ñộ thấp ñược chỉ ra là làm giảm, thậm chí làm mất khả năng sống

và phát triển của trứng, phôi cá (Tiantian Zhang và David M Rawson,1995 [66]; Shinsuke Seki và cs, 2011 [63]; Brian và Terry, 2001 [5]; Valdez và cs, 2005) [70] Tuy nhiên, tính nhạy cảm lạnh của trứng và phôi cá còn tùy thuộc loài và giai ñoạn phát triển

Tiantian Zhang và David M Rawson (1995) [66] ñã nghiên cứu tính nhạy

cảm lạnh của phôi cá ngựa vằn (Brachydanio rerio) ở 10 giai ñoạn phát triển

Giai ñoạn phát triển sớm của phôi nhạy cảm nhất với làm lạnh, với khoảng 50% của phôi 3, 7, 15, 20, và 27h (giai ñoạn tim ñập) bị chết sau khi nhúng vào 0oC trong 0,2; 4; 14; 16; và 20h Phôi giai ñoạn tim ñập ñề kháng với nhiệt ñộ 0oC trong khoảng 10h mà không bị ảnh hưởng, nhưng sự sống của phôi giảm rõ rệt ở nhiệt ñộ âm Trong khi phôi giai ñoạn 27 tới 40h chỉ ra tính nhạy cảm tương tự nhau với làm lạnh, tỷ lệ sống là 56,9 ± 12,1 tới 54,5 ± 5,5%, phôi giai ñoạn sắp

nở (45 tới 49h) có tính nhạy cảm lạnh tăng dần với tỷ lệ sống giảm dần từ 28,4 ± 6,3 xuống 11,7 ± 4,6% sau khi bảo quản 18h ở 0oC Sự sống của phôi ñược làm lạnh chậm giảm dần với thời gian bảo quản và nhiệt ñộ Không có phôi sống sau khi nhúng vào 0oC trong 72h hoặc -20oC trong 1h

Tsai và cs (2009) [66] ñã nghiên cứu tính nhạy cảm lạnh của nang trứng

ngựa vằn (Danio rerio) giai ñoạn sớm Thí nghiệm ñược tiến hành trên nang

trứng giai ñoạn I (giai ñoạn phát triển nguyên thủy), giai ñoạn II (hình thành vỏ) và giai ñoạn III (giai ñoạn sinh noãn hoàng – vetillogenesis) ñược nhúng vào dung dịch ñệm KCl và môi trường L-15 trong thời gian lên tới 144h ở -1oC trong bể nước nhiệt ñộ thấp Lô ñối chứng ñược giữ ở 28oC Kết quả chỉ ra rằng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 20

giai ñoạn I và II kém nhạy cảm lạnh hơn giai ñoạn III Nghiên cứu cho thấy giai ñoạn sớm của nang trứng có khả năng tốt hơn cho bảo quản lạnh

Shinsuke Seki và cs (2011) [63] ñã tiến hành thí nghiệm ñánh giá tính nhạy cảm lạnh của trứng cá ngựa vằn giai ñoạn III (zebrafish) Trứng ñược nuôi trong môi trường Leibovitz ở 25oC ñược sục trong 4ml môi trường ñược làm lạnh trước ở 5, 0 hoặc -5oC và giữ ở nhiệt ñộ phòng trong 30’ Lô ñối chứng, trứng ñược giữ ở 25oC trong 30’ Khi trứng ñược làm lạnh ở -5oC trong 30’, tỷ lệ thành thục (42%) giảm rõ rệt so với ñối chứng (84%) Ở nhiệt

ñộ này, tỷ lệ thụ tinh và nở trung bình (20% và 15%) giảm so với ñối chứng (53% và 41%) mặc dù giảm không có ý nghĩa Kết quả này chỉ ra rằng trứng

cá ngựa vằn chưa thành thục nhạy cảm với nhiệt ñộ -5oC hoặc thấp hơn

ðể xác ñịnh liệu nhiệt ñộ thấp có ảnh hưởng tới chu kì phát triển phôi

của cá tra Ictalurus punctatus, Brian và Terry (2001) [5] ñã tiến hành thí

nghiệm trên trứng cá tra ñã thụ tinh Những trứng này ñược nuôi ở 5 mức nhiệt ñộ: 4, 11, 16, 21 và 26oC Trứng ñược nuôi ở nhiệt ñộ thấp kéo dài thời gian phát triển phôi ở 16 (244%) và 21oC (56%) khi so sánh với ñối chứng ở 26oC Tất cả trứng nuôi ở 4 và 11oC chết trong 24 – 48h nuôi Giai ñoạn phát triển có ảnh hưởng rõ rệt tới tỷ lệ nở ở 16, 21 và 26oC Trứng ñược giữ ở 16oC trước khi hình thành trục phôi chết trong 48h Ấu trùng từ trứng nở ở 16oC không phát triển hoàn thiện và chết khi ñưa ra nhiệt ñộ 26oC ñể kiểm tra sự phát triển Valdez và cs (2005) [70] ñã tiến hành nghiên cứu tính nhạy cảm lạnh của phôi cá medaka ở những giai ñoạn phát triển khác nhau (2-4 tế bào, 8-16 tế bào, phôi dâu, phôi nang và giai ñoạn phôi vị sớm) Phôi ñược ñể trong dung dịch Hanks Chúng ñược làm lạnh ở các mức nhiệt ñộ khác nhau (thông thường

là 0oC) và giữ trong các mức thời gian khác nhau (thông thường là 20’) sau ñó nuôi 14 ngày ñể ñánh giá sự sống (dựa vào khả năng nở) Phôi ở giai ñoạn 2-4

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

tế bào nhạy cảm nhất tới làm lạnh 0oC, nhưng tính nhạy cảm giảm khi sự phát triển tăng Tỷ lệ sống của phôi 2-4 tế bào bị ảnh hưởng sau 2’ làm lạnh ở 0oC, mặc dù tỷ lệ giảm dần dần khi thời gian làm lạnh tăng, 38% phôi vẫn sống sau 40’ làm lạnh Phôi ở giai ñoạn này nhạy cảm với làm lạnh tới 0 hoặc -5oC nhưng kém nhạy cảm ở 5 hay 10oC Tỷ lệ sống của phôi 2-4 tế bào sau khi lặp lại làm lạnh nhanh và làm ấm tương tự khi giữ lạnh Khi giai ñoạn phôi vị sớm (gastrula) ñược bảo quản ở 0 hoặc 5oC, tỷ lệ nở không giảm sau 12 và 24h làm lạnh, nhưng sau ñó giảm từ từ khi bảo quản kéo dài, tuy nhiên, thậm chí 3 – 10% phôi nở sau khi bảo quản lạnh 10 ngày Nghiên cứu cho thấy mặc dù phôi medaka giai ñoạn muộn hơn sẽ có khả năng bảo quản lạnh nhưng tổn thương lạnh cũng không ñáng sợ với giai ñoạn phôi sớm hơn

2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn

Sự tác ñộng của nhiệt ñộ thấp lên sự phát triển của trứng lợn ñã ñược kiểm tra trên trứng giai ñoạn Germinal vesicle stage (GV) (Rui-Hua Liu và cs, 2003a [59]) và trứng thành thục Metaphase II stage (MII) (Rui-Hua Liu và cs, 2003b [60]) Nhiệt ñộ thấp làm giảm sự thành thục nhân, thành thục tế bào chất, giảm sự hình thành thoi vô sắc và gây tổn thương

Sự thành thục của trứng lợn ñược kiểm tra sau khi trứng ñược làm lạnh

ở giai ñoạn GV (Rui-Hua Liu và cs, 2003a [59]) COCs thu từ nang có kích cỡ trung bình ñược làm lạnh ở 24oC hoặc 4oC khoảng 5, 30 hoặc 120’ Sau khi làm ấm lại, COCs ñược nuôi trong môi trường thành thục ở 39oC, 5% CO2trong 44h Sự hình thành thoi vô sắc (xác ñịnh bởi nhuộm miễn dịch và kính hiển vi), sự thành thục nhân (nhuộm orcein) và sự thành thục tế bào chất (phân tích glutathione nội bào) của trứng ñược kiểm tra sau nuôi thành thục Khi trứng ñược làm lạnh ở 24oC trong những khoảng thời gian khác nhau, một khuynh hướng giảm sự hình thành thoi vô sắc, sự thành thục nhân và sự thành

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 22

thục tế bào chất ñược chỉ ra, nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với ñối chứng Khi trứng ñược làm lạnh ở 4oC, cả sự thành thục nhân và tế bào chất cũng như sự hình thành thoi vô sắc bị ức chế ở hầu hết trứng phụ thuộc thời gian Những kết quả ñó chỉ ra rằng trứng lợn rất nhạy cảm với sự giảm nhiệt trước khi ñưa vào nuôi Trứng ñược làm lạnh trước khi nuôi thành thục ngăn cản sự hình thành thoi vô sắc, sự thành thục nhân và tế bào chất Ảnh hưởng của làm lạnh lên cấu trúc thoi vô sắc và sự sắp xếp nhiễm sắc thể của trứng lợn thành thục in vitro ñã ñược Rui-Hua Liu và cs (2003b) [60] nghiên cứu Cấu trúc thoi vô sắc và sự sắp xếp nhiễm sắc thể ñược kiểm tra sau khi trứng ñược làm lạnh ở MII COCs ñược thu từ nang kích cỡ trung bình ñược nuôi trong môi trường thành thục ở 39oC, 5% CO2 trong 44h Ở thời ñiểm kết thúc nuôi, trứng ñược tách cumulus và làm lạnh tới 24 hoặc 4oC trong

5, 30, 120’ Sau khi ñược làm lạnh, trứng ñược cố ñịnh ngay ñể kiểm tra thoi

vô sắc và sự sắp xếp nhiễm sắc thể (NST) hoặc ñược ñưa lại vào môi trường nuôi trong 2h ñể kiểm tra sự hồi phục dây tơ vô sắc Hầu hết trứng (65-71%) làm lạnh tới 24oC chỉ ra những thoi vô sắc giải trùng hợp một phần nhưng 81- 92% trứng làm lạnh ở 4oC không có thoi vô sắc sau khi làm lạnh trong 120’ Làm lạnh cũng gây ra sự dị thường NST, ñược chỉ ra bởi sự phân tán NST trong tế bào chất Sự hạn chế phục hồi thoi vô sắc ñược chỉ ra trong những trứng ñược làm lạnh tới 4 và 24oC bất kể thời gian làm lạnh Những kết quả ñó chỉ ra rằng thoi vô sắc trong trứng lợn MII rất nhạy cảm với sự giảm nhiệt ñộ

Cả thoi vô sắc và NST ñều bị tổn thương trong suốt quá trình làm lạnh, và tổn thương nhiều không phục hồi lại ñược bởi nuôi trứng sau khi làm lạnh

2.4 Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật

2.4.1 Nguyên lý và phương pháp bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 23

Nguyên lý của bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật: 1) khống chế trạng

thái nước, 2) giảm tác ñộng của nhiệt ñộ thấp, shock nhiệt và 3) sử dụng hiệu quả tổ hợp các chất chống ñông, khử nước và nhiệt ñộ thấp

1) Khống chế trạng thái nước:

Nước là yếu tố quan trọng quyết ñịnh kết quả của bảo quản lạnh ðể ngăn cản sự hình thành tinh thể ñá trong quá trình làm lạnh và làm ấm, nước phải ñược loại khỏi tế bào ở mức tối ña có thể

Tinh thể ñá ñược hình thành trong suốt quá trình làm lạnh nhanh khi không ñủ thời gian ñể nước thoát ra khỏi tế bào Do ñó, những tinh thể ñá lớn hình thành trong các thành phần nội bào Những tinh thể này sẽ phá vỡ màng

tế bào và gây tổn thương nội bào Nếu trứng ñược khử nước trước khi những tinh thể ñá lớn hình thành trong nhân và tế bào chất thay vào ñó là nhiều tinh thể nhỏ hơn, tinh thể ñá hình thành bên ngoài tế bào thì sẽ không gây tổn thương nhiều cho tế bào Vì vậy, khử nước của trứng xuất hiện trong quá trình bảo quản lạnh là cần thiết cho sự sống của trứng

Khử nước trước làm lạnh ñã ñược chỉ ra là có tương hợp với sự sống của một vài loại tế bào ñông lạnh – giải ñông, chẳng hạn tế bào da, tế bào bị khô một phần trong không khí trước khi ñông lạnh (Taylor và Gerstner, 1954 [65]) hoặc tế bào máu co lại sau khi nhúng vào dung dịch ưu trương chứa sucrose - dung dịch không thấm - ở nhiệt ñộ phòng (Mazur và cs, 1974 [36]) 2) Giảm tác ñộng của nhiệt ñộ thấp, shock nhiệt:

Sucrose ñược biết là một chất không thấm qua màng, có thể sử dụng ñể tiến hành khử nước phôi và tế bào Ngoài ra, sucrose cũng có tác ñộng bảo vệ màng khỏi ảnh hưởng của shock nhiệt Thí nghiệm của Nguyen (1989) [80], Gerard và cs ( 1991) [18] cho thấy cấu trúc xương và màng phôi có thể bị phá

vỡ hoàn toàn khi nhiệt ñộ môi trường chứa phôi hạ ñến -20oC, nhưng có thể

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 24

ñược bảo tồn nguyên vẹn và phục hồi hoạt ñộng bình thường nếu phôi ñược

xử lý khử nước và bảo vệ màng bằng dung dịch sucrose

3) Sử dụng hiệu quả tổ hợp các chất chống ñông, khử nước và nhiệt ñộ thấp: Khi kết hợp với những tác ñộng bảo vệ cung cấp bởi một hợp chất thấm như glycerol hay dimethylsulphoxide (DMSO), khử nước trước ñông lạnh cũng có thể tăng sự sống của nguyên bào sợi hoặc phôi chuột (Smorag và cs,1981 [65]; Massip và Van der Zwalmen, 1982 [70])

Các phương pháp bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật gồm có:

1/ Phương pháp ñông lạnh chậm: Năm 1971, Whitingham và cs [73] công bố kết quả nghiên cứu ñông lạnh phôi chuột trên cơ sở kết hợp các chất chống ñông và khử nước với thiết bị hạ nhiệt tự ñộng (Hình 2.1)

Hình 2.1: Biến ñổi nhiệt ñộ theo quy trình ñông lạnh chậm và giải ñông chậm

của Whitingham và cs (Nguyen và cs, 1984 [42])

2/ Phương pháp ñông lạnh nhanh: Mười năm sau thí nghiệm của Whitingham, Nguyen và Renard ñã ñề xuất và thực nghiệm thành công nguyên lý ñông lạnh nhanh trên mô hình phôi thỏ và phôi bò (Nguyen và cs,

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 25

3/ Phương pháp ựông lạnh cực nhanh (vitrification): Nguyên lý khử nước bộ phận ựã ựược Rall và Fahy (1985) [51] sử dụng ựể phát triển phương pháp ựông lạnh cực nhanh

RT

-196oC

-30oC

Clacsic slow programable freezing

Rapid freezing

( Nguyen, Renard,1983, 1984 )

Hình 2.2: Sơ ựồ khử nước, thời gian và biến ựổi nhiệt ựộ trong các kiểu ựông lạnh chậm, ựông lạnh nhanh và ựông lạnh cực nhanh (Nguyen và cs, 1984 [42])

Hình 2.3: Nguyên tắc ựông lạnh cực nhanh

đông lạnh nhanh phôi ựộng vật gồm có sự giảm những dung dịch chất bảo quản lạnh thấm nồng ựộ cao Những chất bảo quản lạnh ựó ựược biết là

đông lạnh nhanh

Nguyen và Renard 1983, 1984

Chương trình ựông lanh chậm

(A) Sống? (B)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26

có tính ñộc với tế bào ở trạng thái không ñông lạnh Trong thí nghiệm của M El-Gayar và cs (2011) [10], họ dự ñịnh giảm số lượng chất bảo quản lạnh thấm qua màng tế bào tới mức tối thiểu bởi khử nước một phần tối thiểu phôi bào trước khi nhúng vào dung dịch ñông lạnh nhanh Sucrose ñược biết là một chất không thấm qua màng có tác dụng thấm lọc và do ñó phù hợp với mục ñích của nghiên cứu này Kết quả nghiên cứu chỉ ra nhúng vào sucrose trước khi ñông lạnh nhanh làm hại khả năng sống của phôi chuột hơn là bảo

vệ chúng nhưng ngược lại thêm sucrose vào dung dịch ñông lạnh nhanh thì không làm hại khả năng sống của phôi chuột

2.4.2 Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi cá

Lahnsteiner F (2008) [28] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của những chất bảo quản lạnh nội bào (DMSO, 1,2-propanediol, glycerol, ethylene glycol, methanol, N,N-dimethylacetamide) và ngoại bào (glucose và sucrose) lên sự

sống và chỉ số hình thái phôi cá ngựa vằn (Danio rerio) Kết quả chỉ ra những

chất bảo quản lạnh ngoại bào kém ñộc hơn các chất bảo quản lạnh nội bào Giai ñoạn phát triển sớm thì nhạy cảm với chất bảo quản lạnh hơn là giai ñoạn muộn Tất cả dung dịch ñông lạnh nhanh ñược kiểm tra cho kết quả vượt quá sức chống chịu của phôi Sức chống chịu của phôi cá ngựa vằn với chất bảo quản lạnh có thể thay ñổi cao, trong một sự thay ñổi nồng ñộ có thể gây chết 50% phôi Noãn hoàng không có sự thay ñổi các chỉ số hình thái rõ rệt Nghiên cứu chỉ ra khử nước noãn hoàng là không thể và những dung dịch ñông lạnh nhanh vượt trên giới hạn chống chịu của phôi dường như không chắc chắn rằng sự thành công của ñông lạnh nhanh phôi cá ngựa vằn có thể xảy ra Dưới những cân nhắc ñó thì ñông lạnh chậm có thể là ý tưởng tốt hơn khi những nồng ñộ thấp hơn của chất bảo quản lạnh ñược sử dụng và phôi có thể khử nước trong suốt quá trình ñông lạnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27

Rahman SM và cs (2011) [49] ñã ñánh giá ảnh hưởng của xử lý biến ñổi áp lực và hóa học ñể cải thiện tính thấm của chất bảo quản lạnh DMSO tới phôi cá Japanese whiting Tính thấm chất bảo quản lạnh thấp là một trong những yếu tố chính cản trở bảo quản lạnh thành công phôi cá Phôi cá giai ñoạn phân ñốt và kéo dài ñuôi ñược xử lý với dung dịch ñường ưu trương (1M trehalose và sucrose) khoảng 2 – 6’ hoặc 1 chất thấm (2 – 6 mg/ml pronase) khoảng 30 – 120’ và sau ñó pha với 10 – 15% DMSO trong nước biển nhân tạo hoặc dung dịch nước chứa muối vô cơ (0,125 – 0,5M MgCl2 và CaCl2) Khả năng sống của phôi sau xử lý ñược ñánh giá từ tỷ lệ nở và nồng

ñộ DMSO nội bào ñược ño bởi HPLC Xử lý với trehalose khoảng 3’ trước khi cho vào DMSO tăng tính thấm của chất bảo quản lạnh lên 45% mà không ảnh hưởng tới sức sống của phôi, trong khi ñó pronase không có ảnh hưởng ñáng kể lên tính thấm của chất bảo quản lạnh Sự xâm nhập của DMSO vào phôi ñược tăng lên 143 – 170% trong sự có mặt của muối hữu cơ so với nước biển Sự kết hợp xử lý với trehalose và MgCl2 hiệu quả hơn trong ñiều khiển tính thấm của DMSO (191% so với phôi không xử lý) Phôi giai ñoạn kéo dài ñuôi chống chịu kém với những xử lý ñó nhưng có tính thấm DMSO cao hơn Tóm lại, sử dụng trehalose (như một chất khử nước) và MgCl2/CaCl2 (như phương tiện trong quá trình thấm) ñẩy mạnh chất bảo quản thấm qua và có thể hứa hẹn cho bảo quản lạnh thành công phôi cá

Tiantian Zhang và David M Rawson (1995) [66] ñã nghiên cứu tính nhạy cảm lạnh của phôi cá ngựa vằn (Brachydanio rerio) ở 10 giai ñoạn phát triển Ảnh hưởng của chất bảo quản lạnh tới tính nhạy cảm lạnh cũng ñược nghiên cứu Sự có mặt của sucrose hoặc trehalose làm tăng rõ rệt tính chống chịu của phôi với làm lạnh Methanol là chất bảo quản lạnh tối ưu cho bảo quản lạnh không ñông lạnh của phôi ở nhiệt ñộ 0oC và nhiệt ñộ âm Nồng ñộ

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 28

tối ưu của methanol khi bổ sung với sucrose 0,1M phụ thuộc vào từng mức nhiệt ựộ: 1M ở 0oC, 2M ở -5oC, 3M ở -10 oC, và 5M ở -15 oC, với tỷ lệ sống của phôi tương ứng là 30,2 ổ 3,5; 28,6 ổ 5,8; 27,3 ổ 12,1 và 14,3 ổ 4,2% sau khi bảo quản 48, 24, 6 và 1h Sự giảm khả năng sống của phôi có thể liên quan tới tổn thương lạnh, tắnh ựộc của chất bảo quản, stress áp lực thẩm thấu, hoặc tác nhân khác

Bảo quản lạnh phôi cá vẫn là một vấn ựề chưa ựược giải quyết đông lạnh chậm phôi cá ựường như là không thể do nhiệt ựộ hình thành tinh thể ựá trong cấu tạo nhân cao Vì thế, hầu hết các nghiên cứu tập trung vào các thắ nghiệm ựông lạnh nhanh sử dụng các loài cá nước ngọt và nước mặn và các chế ựộ ựông lạnh nhanh khác nhau (Robles và cs, 2003a [55]; Cabrita và cs,

2006 [6]; Chen và Tian, 2005 [8]) Tất cả các protocol ựều thất bại, phôi ựông lạnh Ờ giải ựông không thể tiếp tục phát triển thành ấu trùng Do ựó, những kỹ thuật ựặc biệt như ựưa vào trong phôi những protein chống ựông (Robles và cs, 2003b [56]; Robles và cs, 2007 [57]), tiêm chất bảo quản lạnh vào noãn hoàng (Janik và cs, 2000 [19]), ựông lạnh những phôi có sức ựề kháng lạnh cao (những loài thắch nghi lạnh) (Robles và cs, 2003b [56]; Hagedorn và cs, 1997 [22]) và ựưa aquaporin-3 vào trong màng tế bào (Hagedorn và cs, 2002 [23])

ựã ựược kiểm tra Tuy nhiên, những kỹ thuật này cũng không thành công trong sản xuất phôi sống sau ựông lạnh Ờ giải ựông Tắnh thấm màng thấp của noãn hoàng và sự hình thành tinh thể ựá trong suốt giải ựông ựược cho là những bước mấu chốt trong bảo quản lạnh (Hagedorn và cs, 1998 [25]) Nhiều nghiên cứu ựã sử dụng thời gian cân bằng rất ngắn trong dung dịch chất bảo quản lạnh Tuy nhiên, do tắnh thấm màng thấp nên phôi cá cần ựược nhúng trong dung dịch chất bảo quản lạnh ở nồng ựộ và thời gian cao nhất có thể chống chịu Phôi cá có thành phần nước cao để giảm sự hình thành tinh thể ựá thì khử